Nanotoxikologie & NeoSino
Testung
Medizinische Universität Graz
Zentrum für Medizinische
Grundlagenforschung (ZMF)
Prof. Dr. Eleonore Fröhlich
Allgemeines


Nanopartikel: Gebilde von <100 nm in einer
Dimension
Nanotoxikologie beschreibt, dass sich die
(schädlichen) Eigenschaften im NanoGrößenbereich von denen der
entsprechenden Rohmaterialien
unterscheiden
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Workshop NeoSino
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Nanopartikel - Applikationen







Kopierer/Drucker
Beschichtungen/Klebstoffe/Lacke
Autoreifen
Kosmetik
Sonnenschutz
Nahrungsmittelzusätze
Medizinprodukte (z.B. Medikamente,
Kontrastmittel, regenerative Medizin)
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Workshop NeoSino
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Verbraucherprodukte





Kosmetik, Sonnenschutz – TiO2, ZnO, CeO2
Nahrungsmittelzusätze – SiO2 (Ketchup)
Brillen – anorganisch/organische
Hybridpolymere
Gewebe – organische Polymere
Katalysatoren – Metalle und Metallhybride
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Workshop NeoSino
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Medizinische Produkte
Applikation
Produkt
Appetitzügler
Zytostatika
Megace ® ES
AbraxaneTM, Doxil ®, Emend ®
Cholesterinsenkung
Hormonersatz
Immunsuppressiva
TriCor ®
EstrasorbTM
Rapamune ®
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Workshop NeoSino
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Eigenschaften
Vorteile
Nachteile
NP können Substanzen
an Wirkungsorte bringen
NP schützen
pharmakologische
Wirkstoffe vor Abbau
NP können Zellbarrieren
überwinden
Sie haben eine große
Oberfläche und sind daher
besonders reaktiv
NP verstärken die Wirkung Nanopartikel aggregieren
von Therapien
gerne
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Feinstaub
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Workshop NeoSino
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Feinstaub
Inhalation > 10µg/m3 PM10
 Mortalität



Insgesamt: + 300%
Kardiovaskuläre Todesfälle: + 120%
Hospitalisierungen:




COPD: + 250%
Pneumonien: + 150%
Asthma: + 170%
Kardiovaskuläre Probleme: + 80%
Zusammenfassung aus >100 verschiedenen Studien
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Workshop NeoSino
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Eintrittspforten




Hornhaut des Auges
(Arbeitsplatz, Umwelt)
Lunge (Arbeitsplatz, Umwelt)
Verdauungstrakt
(Nahrungsmittel,
Medikamente, Zahnpasta)
Haut (Arbeitsplatz,
Kosmetika)
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Workshop NeoSino
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Eintrittspforten
Die Lunge besitzt
die dünnste Barriere
des Körpers
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Workshop NeoSino
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Effekte der Nanopartikel

Zellschädigung:
 Mechanische Schädigung der Zellmembran
 Induktion des programmierten Zelltodes
(Apoptose)

Beeinflussung des Immunsystems:
 Bindung von Proteinen → Immunantwort
 Aktivierung von Makrophagen → Entzündung
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Workshop NeoSino
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Untersuchungen
Gewebezellen
 Vitalität, Zellfunktionen
 Organellenschädigung
 Chronische Effekte
Blut
 Erythrozytenintegrität
 Gerinnung
 Funktion der Immunzellen
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Workshop NeoSino
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Neosino Testung
Toxikologische Parameter
 Effekte auf Zellteilung
 Zellschädigung
 Erythrozytenschädigung
 Unspezifische Aktivierung des Immunsystems
Testung
 ‚ŋeosino SMC tonicum Mineralkomplex Trinkampullen’
 Nanopartikel suspendiert in Wasser
 Testbereich: empf. Maximaldosis wird zu 100%
aufgenommen und im Plasma verteilt
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Workshop NeoSino
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Zelluläre Schädigung - Testprinzip



Zellen besitzen bestimmte Enzyme
Die Aktivität dieser Enzyme wird quantifiziert
Ein Abfall der Gesamtaktivität lässt auf eine
Beeinträchtigung der Zellen schließen
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Workshop NeoSino
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Zelluläre Schädigung




Anzüchten der Zellen
Behandlung mit Testsubstanz 4h und 24h
Mikroskopische Beurteilung der Zellen
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)
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Workshop NeoSino
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Zelluläre Schädigung
Eahy926 treated for 24 h with
Neosino
140
120
100
80
60
40
20
0
% of control
% of control
EAhy926 mit 20 nm Carboxyl
Polystyrolpartikeln
0
25
50
140
120
100
80
60
40
20
0
75 100 125 150 175 200 225
µg/ml
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0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
µl/ml
Workshop NeoSino
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4,5
Membranschaden- Testprinzip




Zellen besitzen in ihrem Zellinneren Enzyme
Durch Schädigung der Zellmembran können
sie aus der Zelle heraus in den Überstand
gelangen
Die Aktivität dieser Enzyme im Überstand
wird quantifiziert
Ein Anstieg der Gesamtaktivität lässt auf
eine Schädigung schließen
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Workshop NeoSino
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Membranschaden
EAhy 926 treated for 24h with Neosino
50
50
40
40
% of control
% of control
EAhy926 treated with Carboxyl polysytene particles
30
20
10
0
30
20
10
0
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
0
µg/ml
29.05.2010
Workshop NeoSino
0,5
1
1,5
2
2,5
ml/ml
3
3,5
4
4,5
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Hemolyse - Testprinzip



Erythrozyten enthalten den roten
Blutfarbstoff Hämoglobin
Durch Schädigung der Membranen tritt
Hämoglobin aus
Ein Anstieg der Färbung im Überstand lässt
auf eine Schädigung schließen
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Workshop NeoSino
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Hemolyse



Isolieren der Erythrozyten (Blutbank)
Behandlung mit Testsubstanz
Bestimmung der Hämoglobinkonzentration
im Überstand
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Workshop NeoSino
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Hemolyse
Hämolyse mit NeoSino
120
Hemolyse (%)
100
80
60
40
20
0
Triton X (1%)
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Neosino
(4µl/ml)
Neosino
(2µl/ml)
Neosino
(1µl/ml)
Workshop NeoSino
Neosino
(0,5µl/ml)
Neosino
(0,25µl/ml)
Wasser
(4µl/ml)
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Lymphozytenaktivierung - Testprinzip



T-Lymphozyten gehören zur zellulären
Abwehr des erlernten Immunsystem
Sie vermehren sich, wenn sie mit einem als
‚fremd‘ erkannten Signal in Kontakt kommen,
um dieses besser bekämpfen zu können
Eine erhöhte Zellzahl weist auf eine
Stimulation der zellulären Abwehr hin
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Workshop NeoSino
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Lymphozytenaktivierung

Isolieren der Leukozyten (Blutbank)
Anreicherung der Lymphozyten
Kultivierung mit der Testsubstanz

Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)


Blut
Plasma + Plättchen
Lymphozyten
Ficoll
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Granulozyten + Erythrozyten
Workshop NeoSino
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Lymphozytenaktivierung
Lymphozytenstimulation mit NeoSino
Relative Lumineszence Units
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
unstimuliert CD3/ 28 stim.
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CP 26nm
NeoSino 2µl NeoSino 1,5µl NeoSino 1µl
Workshop NeoSino
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Makrophagenaktivierung- Testprinzip



Makrophagen gehören zum angeborenen
Immunsystem
Sie wandern auf einen Reiz hin und locken
dann andere Immunzellen an, um eine
Entzündungsreaktion einzuleiten
Eine vermehrte Wanderung auf die
Testsubstanz weist auf eine Stimulation der
unspezifischen Immunabwehr hin
29.05.2010
Workshop NeoSino
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Makrophagenaktivierung

Zugabe der Zellen im oberen Teil des durch
einen Filter getrennten Kulturgefäßes

Zugabe der Testsubstanz in den unteren Teil

Inkubation - Zellen wandern

Bestimmung der Zellzahl
(oder Zellleistung) in der unteren Kammer
29.05.2010
Workshop NeoSino
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Makrophagenaktivierung
Chemotaxis NeoSino
90000
Relative Luminescence Units
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
N
29.05.2010
P 50ng/ml
NeoSino 2µl
Workshop NeoSino
NeoSino 1,5µl
NeoSino 1µl
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Ox. Stress Schutz - Testprinzip



Zellen werden angezüchtet und mit
Wasserstoffperoxid geschädigt
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)
in An- und Abwesenheit der Testsubstanz
Anstieg der Zellzahl weist auf schützende
Wirkung der Testsubstanz hin
29.05.2010
Workshop NeoSino
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NeoSino bei Zellschädigung
EAhy926 treated for 24 h with 100 µM H2O2 and Neosino
20
% of control
15
10
5
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
µl/ml
29.05.2010
Workshop NeoSino
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Bessere Zellfunktion - Testprinzip



Zellen werden für 5 Tage in Mangelmedium
(2% statt 10% fötales Rinderserum) kultiviert
Bestimmung der Zellzahl (oder Zellleistung)
in An- und Abwesenheit der Testsubstanz
Anstieg der Zellzahl weist auf schützende
Wirkung hin
29.05.2010
Workshop NeoSino
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NeoSino in Mangelmedium
EAhy (2% FBS, Neosino for 5 days)
200
180
% of control
160
140
120
31.03.2010
100
11.05.2010
80
60
40
20
0
untreated
29.05.2010
Mitodamage
0,5µl/ml
1µl/ml
Workshop NeoSino
2µl/ml
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Zusammenfassung


Neosino zeigt in den etablierten
Testverfahren keinen toxischen Effekt
Bei nicht optimalen Wachstumsbedingungen
zeigt Neosino einen geringen, aber
nachweisbaren, schützenden Effekt
29.05.2010
Workshop NeoSino
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29.05.2010
Workshop NeoSino
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