Pharmakogenomik
Dr. Peter Ahnert
[email protected]
http://www.uni-leipzig.de/~ahnert
07.11.2007
1/37
Übersicht
• Definition “Pharmakogenomik”
• Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung
• Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung
• Assoziationsstudien
• Genetische Variabilität
• Struktur von Assoziationsstudien
• Kandidatengen-Selektion
• SNP-Auswahl
• Genotypisierung
• Datenanalyse
• Genomweite Studien
• Beispiele
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Pharmakogenomik – Eine Definition
• Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie
(genomweiter) Genetik (Genomik).
mit
• Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren
Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf
Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die
Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und
Therapien zu unterstützen.
Basiert auf humaner genetischer Variabilität in:
•
•
•
•
Krankheitsätiologie and Pathogenese
Wirkstoff - Target Interaktionen
Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen
Wirkstoffmetabolismus
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http://www.ornl.gov/hgmis/medicine/pharma.html
Pharmakologie zu Pharmakogenomik
Pharmakologie:
Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die
es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben.
Probleme:
• Wirkstoffentwicklung ist teuer
• Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig
• Wirkstoffe werden für
“Durchschnittsbürger”entwickelt
– 10 - 70% non-responders
– ~ 100.000 Todesfälle in den USA pro Jahr
– Frauen
– Kinder
Lösung:
Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen
entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung
von Individuen zu diesen Gruppen.
Pharmakogenomik!?
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Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung
Ziele:
• Verständnis von Krankheitsmechanismen
 Drug Targets
• Biomarker
• Marker für Toxizität und Wirksamkeit
• Marker für Differentielle Diagnostik
 Unterstützung von Therapie-Entscheidungen
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Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung
Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung:
Biologie &
Klinische & Biologische
Medizinische
Krankheitsmodelle
Forschung
Identifizierung
von Drug Targets
Identifizierung von „Krankheitsgenen“ & -mechanismen
Präklinische Forschung:
Wirkstoff-Screening
& KandidatenIdentifikation
in vitro Validierung
in vivo Validierung
Toxikologische Analyse
Klinische Studien:
Phase I
Phase II
Phase III
Phase IV
Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung
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Individualisierte Medizin
Rationale für Pharmakogenomik
Alle Erkrankungen beruhen zumindest
teilweise auf Veranlagung …
Umwelteinflüsse
Erbanlagen
Hämophilie
Down-Syndrom
HFI
Diabetes
Asthma
Rheumatoide Arthritis
Infektionskrankheiten
...
Lungenkrebs
Motorradunfall
Knochenbrüche
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Spielen Genetische Ursachen eine Rolle?
• Zwillings und Geschwisterstudien
• Genomweite Kartierungsstudien
• Mechanistische Studien
• Kandidaten-Gen Assoziationsstudien
• Tiermodelle
Zur Identifizierung von:
- Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen
- Wirkstoff Targets
- Diagnostischen Markern
- Toxikologischen Markern
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Zwillingsstudien
1
3
2
4
1 … Einfluss der Umweltbedingungen
2 … Einfluss zufälliger Größen
3 … Einfluss von Umwelt und Genen
4 … Einfluss der Veranlagung
Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern
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unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen.
Genomweite Kopplungskartierung
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Mechanistische Untersuchungen
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Kandidatengen-Assoziationsstudien
Komplexe Phänotypen
Morphologie
Umwelt
Proteom
Expression: Gene, ncRNA
Epigenetik
Genetische Variation
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Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung?
Variable Elemente des Genoms
• Chromosomenaberrationen
• Mutationen
• Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
• Insertionen und Deletionen
• Copy Number Variation
• Repeats (meist nicht kodierend)
- Megasatelliten
(mehrere kbp, Blocks bis 100e kbp)
- Satelliten
(5-171 bp,
- Minisatelliten (6-64 bp,
- Microsatelliten
(1-4 bp,
Blocks 100 kbp bis Mbp)
Blocks 0,1 – 20 kbp)
Blocks bis 150bp)
• Repetitive kodierende DNA
• “Variable Number Tandem Repeats” (VNTRs)
• “Transposable Elements”
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SNPs und Humane Genetische Variabilität
~ 3 Mrd. Basenpaare
~ 99.9 % Identität zwischen
Individuen
~ 3 Millionen Basenunterschiede zwischen Individuen
SNP... Single Nucleotide Polymorphism
ACGTCTATGCATAGCTAG
TGCAGATACGTATCGATC
ACGTCTATTCATAGCTAG
TGCAGATAAGTATCGATC
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Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Analysis & Gene Selection
Clinical-Biological
System
Candidate Genes
SNP Retrieval
Clinical Problem
Clinical Study
Candidate SNPs
SNP Evaluation
and Selection
SNP Short List
Assay Design & Genotyping
Clinical Data
Genotype Data
Statistics / Data Mining
Pattern Recognition
Diagnostics
Associations
Verification
Studies
Verification
Studies
Research
into Causations
Drug Targets
Personalized
Medicine
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Identifizierung von Kandidatengenen
Genetische Kartierung
“Krankheits Loci”
Funktionelle Biologie/Biochemie
Proteomik
Genfunktion
Kandidatengene
Genexpression
Studien in Tiermodellen
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Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften
SERPINA1
SERPINA3
C9
CTSD
MCP
IGF2
CST3
PTGS1
PTGS2 PLA2G1B
IGFBP3
GAD1
PROC
SERPINC1
Umfassende (automatisierte)
Literatur
Analyse
HTATIP
IDDM2
CD59
C5
CTSL
CD38
CTSB
C2
IGF1
ICA1
CD22
DAF
HFE
IGFBP2INS
LEP
BCGF1
C3
A2M
CR1
NOVA2
IL10RA
PEPD
DPP4
ITGA6
SPN
POLA2
UBTF
ITGA4
POLG
PTGDR
CP
C6
SLC3A2 SLC25A4
TIMP1
MMP2
RCD-8
B2M
SSB
ITGB1
CD68
ITGB2
CALR
MMP13
ITGAX
MMP9
HNRPC
ATM
IL2RB
PECAM1
PTPRC
GYPB
FLG
ICAM2
MMP16
ITGAM
MMP14
CD44
HSMCR30
IL1B
MMP1
TIMP2
CD8A
SELP
CAST
MTX1
TNFRSF5CD4 SELL
LIF
TNFSF5
SSA1
CD80
GUSB
ICAM1
KITLG
IL2RA
ITGAL
TIMP3
PLG
CSF3
VEGF
IL1RN IL10 IL2
CRP
MMP3
SERPINE1
ALPP
SELE
ICAM3
SIASDIL6 IL1A IL4 VCAM1
SERPINB2
OSM
TFRC
CD2
LTA
EGF
CD14 CD86
CRAT
CDR3
CDR1
MPO
SF
CD28ITGA1
IL8 TNF CD69
KPNB2
EPO ESR1
CSF2IFNG
CD57
TRH
LYZ
IL11
TNFRSF1A
IL7 CTLA4
IL13
CD58
PRL
IL15
CAT
IL5
TNFSF6
TNFRSF1B
CSF1 IL3
FCER2 ITGA5
IL17
POMC
CTSG CRH
CD19 CR2
SCYA5
PRTN3
IL6R
IL18
TRB@
NCAM1
IL5RA
FPR1
SULT2A1
IL1R1
MME
MIF
TNFRSF6
CD33
MAPK14
SCYA2
IL18BP
FN1
MAPK8
SCYB10
MAPK1
ANPEP
VTN
CXCL10 IL4R
SCYB5
SR-BP1
SAA4 SAA1
LOC64167
CCR4
ACP5
TNFRSF11B
HLA-B
CCR3
CXCL9
SAA2
CALCR
HLA-A
TNFSF11
LAP3
CCR6
CXCL12
CXCR3
TNFRSF11A
HLA-DPB1
HLA-DPA1
CXCR4
HLA-DQA1
CCR5
CCL5
HLA-DRB1
ALB
MMP8
FUT2
NXF1
TAP1
CCR2
SDF1
TAP2
HLA-DQB1
CCR7
CCL2
CCR1
TNFRSF12
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Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Analysis & Gene Selection
Clinical-Biological
System
Candidate Genes
SNP Retrieval
Clinical Problem
Clinical Study
Candidate SNPs
SNP Evaluation
and Selection
SNP Short List
Assay Design & Genotyping
Clinical Data
Genotype Data
Statistics / Data Mining
Pattern Recognition
Associations
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Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs
Ausgewählte SNPs sollten:
- Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren
- Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des
Genproduktes haben
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SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten
Die Haplotyp-Struktur des Genoms:
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Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2004 Aug 5
Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Analysis & Gene Selection
Clinical-Biological
System
Candidate Genes
SNP Retrieval
Clinical Problem
Clinical Study
Candidate SNPs
SNP Evaluation
and Selection
SNP Short List
Assay Design & Genotyping
Clinical Data
Genotype Data
Statistics / Data Mining
Pattern Recognition
Associations
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Genotypisierungsmethoden
• Sequenzierung
• Minisequenzierung
• Pyrosequenzierung
Allelspezifische
Primerextension
• Single Base Extension (SBE)
• TaqMan
• Invader
Allelspezifische
Enzymreaktion
• MLPA
• Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA
Hybridiserungsarrays
Allelspezifische
Hybridisierung
Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf:
- Fluoreszenz
- Massenspektrometrie
- Chemolumineszenz
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- Fluoreszenzpolarisation
Genotypisierung - Single Base Extension
C
G
Biotin
Single base Extension
A
ddNTPs
SBE primer
PCR product
Product Purification
SBE primer
Streptavidin
Photocleavage
T
G
UV
SBE primer
+G
MALDI-TOF MS
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Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Analysis & Gene Selection
Clinical-Biological
System
Candidate Genes
SNP Retrieval
Clinical Problem
Clinical Study
Candidate SNPs
SNP Evaluation
and Selection
SNP Short List
Assay Design & Genotyping
Clinical Data
Genotype Data
Statistics / Data Mining
Pattern Recognition
Associations
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Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus?
Side-effect 1
Side-effect 2
Side-Effect 3
Clinical
Background 1
Clinical
Background 2
Patient
SNP 1
SNP 3
SNP 4
SNP 5
SNP 6
1
2
3
4
5
6
7
4
10
3
2
4
10
1
6
5
3
8
2
7
3
5
3
7
5
8
2
9
1
3
2
8
8
8
3
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
0
0
1
1
1
2
3
4
5
6
7
A A A
A A B
A A AB
B AB A
A A B
B AB B
A A B
AB
B
B
B
AB
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
A
B
SNP 2
Drug Efficacy
Genetische Daten
Patient
Klinische Daten
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Analyse Einzelner Polymorphismen
• Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse
• Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat
• Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE)
• Vererbung berücksichtigende Tests
• Transmission Disequilibrium Tests (TDT)
• Affected Family Based Controls (AFBAC)
• Genetisches Relatives Risiko (GRR)
• ...
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Musteranalysen
“Clinical Bar Codes”
“Genetic Bar Codes”
Patient 1
Patient 2
Patient 3
• Schrittweise Progressive Regression
• Klassifikation (Support Vector Machines,
Neuronale Netze)
• Mustererkennung
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Herausforderungen bei der Analyse
der Genetik Polygener Phänotypen
• Phänotyp-Bestimmung
• Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten
(Common Disease – Common Variant
vs. Common Disease – Rare Variant )
• Geringe Penetranz von Haplotypen
• Genomweite Variantenmuster (GVPs)
• GVP-Subgruppen für einen Phänotyp
• Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz
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Genomweite Studien
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Bekannte Assoziationen
Gene
Disease/Field
Effect/Comment
Deep-vein
Coagulation factor 5 thrombosis,
etiology
Activated protein C (APC) limits clot formation by inactivating
factor V. The phenotype heterozygosity or homozygosity for a
single point mutation in the factor V gene (at nucleotide
position 1,691, G-->A substitution), synthesis of a factor V
molecule (FV Q506, or FV Leiden) that is not properly
inactivated by APC
Thiopurine Smethyltransferase
Leukemia,
drug response
Adverse drug reactions, metabolism, Three mutant alleles,
TPMT(*)2, TPMT(*)3A and TPMT(*)3C, more adverse effects in
TPMT-deficient heterozygous patients on thiopurine
medications (e.g. 6-mercaptopurine against childhood acute
lymphoblastic leukemia, lowering dose 15-fold works!)
Apolipoprotein E
Alzheimer's,
susceptibility,
drug response
Her2
Breast
cancer,
susceptibility,
drug response
Literature
Nature 1994
May;369(6475):647
Pharm Res 1999
Mar;16(3):342-9,
Pharmacology
2000
Sep;61(3):136-46
Susceptebility to disease, response to cholinesterase inhibitor, Proc Natl Acad Sci
The results strongly support that apoE4 plays a role in
U S A 1995
cholinergic dysfunction associated with AD, may be a
Dec;92(26):12260prognostic indicator of poor response to therapy with
4
acetylcholinesterase inhibitors (tacrine)
Growth factor receptor, multiple copies lead to overexpression
(~30% of breast cancer patients), higher risk for breast cancer
and harder to treat traditionally, Trastuzumab (Herceptin,
Genentech) is a specific Ab against her2 product
Semin Oncol. 2000
Dec;27(6 Suppl
11):46-52 (Review)
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Pharmakogenetischer Test
Warfarin
- “Blutverdünner” z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko
- Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten
- 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase
Komplex 1 Gen (VKORC1)
- 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9)
- Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr
- Individuelle Anpassung der Dosierung durch “Trial & Error”
- Alter
- Gewicht
- Ernährung
- Medikamente
- Genetik
- FDA: genetische Tests könnten
- Pro Jahr 85.000 Blutungsereignisse verhindern
- Pro Jahr 17.000 Schlaganfälle verhindern
- Am 17.09.2007 durch die FDA in den USA zugelassen
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Phänotyp - Genotyp Analyse
der Rheumatoiden Arthritis
• Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung
• Etwa 1% der Bevölkerung betroffen
• Lebenserwartung um 5 - 10 Jahre reduziert
• Ätiologie nicht genau bekannt
• Genetische Suszeptibilität 30-60%
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Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden?
Verständnis der biologischen
Prozesse in Ätiologie und
Pathogenese
 Neue Behandlungsstrategien
Frühdiagnose  Therapieentscheidungen
Differentialdiagnose
Voraussage der Progression
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Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis
genetic predisposition
other risk factors
unknown antigens
T-cells & Bcell activation
Synovial
membrane
Activation
Adhesion
Permeabilization
Migration of
inflammatory cells
Cytokines
Mediators
Pannus formation
Production of Collagenases (MMPs) by
TNF
IL-1
fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts
Lining cells
T-cells, M
Joint destruction
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Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory
Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack
Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA
IL5R
CCR5
Linkage
CD8A
Likely
IL18R1
IL6R
Il2
PRG4
Linkage
CTLA4
Possible
PRL
HLA
HSPA1L;
LTA; LTB,
MICA
No
IL6
linkage
CRH
CSF2;Il4; Il5;
Il13; IRF1
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Unsere Bisherigen Resultate
Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis:
• ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen
• Genotypisierung in 500 Proben  >90.000 Genotypen
• Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag
• >98% erfolgreiche Genotypisierung
• <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck)
•  mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs
•  einige Assoziationen konnten bestätigt werden
• Geninteraktionsanalyse läuft
40/37
Genotypisierung - TaqMan
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Genotypisierung - Weitere Techniken …
Invader Assay
www.twt.com
Pyrosequencing
www.pyrosequencing.com
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