DGGE
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Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur Übungsablauf • MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung • DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-Fällung • MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse • DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital) Inhalt • Culture dependent vs. Culture independent Methods • PCR • RT-PCR • DGGE, TGGE • SSCP, MSSCP • RFLP, TRFLP • RISA, ARISA • Cloning, Sequencing 2 ways for identification: +/- cultivation Sample Culture DNA/RNA Culture- independent Methods Culture- dependent Methods Identification of Microorganisms Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation Habitat Cultivability (%) Freshwater 0,25 Brackish water 0,1-3 Sedimente 0,25 Soil 0,3 Food general 0,5-10 Culturable • Wachstumsbedingungen bekannt – Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob • Keim lebend • Verschiebung der Flora • 99% aller Bakterien unbekannt Culture independent Culture independent Spezies Sequenz S. aureus S. epidermidis S. capitis S. warneri S. haemolyticus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC Polymerase Chain Reaction Realtime-PCR RT-PCR 103 cop 100.000 106 cop Fluorescence (F1) 104 cop 105 cop 10.000 1.000 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Cycle Number 38 39 40 41 42 43 44 45 RT-PCR Denaturant Gradient Gel Electrophoresis Denaturant Gradient Gel Electrophoresis Temperature Gradient Gel Electrophoresis • Prinzip wie DGGE • Keine DNA- denaturierende Substanzen • Temperatur Gradient Singlestrand Conformatiom Polymorphism • DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt ssDNA • Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel SSCP Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism • ssDNA • Denaturants added to PCR- product • Different bands because of different conformation of ssDNA • Temperature is changing during the electrophoresis • Using high voltage MSSCP Temperatur changing during run Temp. 34°C 5´ 22°C 2´ 10°C Zeit MSSCP SSCP bei untersch. Temp. SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP MSSCP (Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism Cutting enzymes • HIND III • BAM HI • Eco RI A/AGCTT TGG/CCA GT/AATTC • 1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC • 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT • 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC 1) 2) 3) 1) + 2) + 3) (Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis • dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer) • Fluorescently primers • Different bands because of different length of PCR- product Sensitivity • • • • • DGGE: 95 - 100% SSCP: 80 - 85 % MSSCP: 85 - 95% [T]RFLP: 90 – 100% [A]RISA: 95 - 100% 100-700 bp 100-500 bp 100-500 bp 100-10000 bp 200-1200 bp Membran Hybridisierungsverfahren Target DNA Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen Y Western Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen Methode Food samples DNA extraction PCR Monitoring Community fingerprints DGGE Comparison of bandpatterns Screenig for different clones and sequencing Clone libraries Identification of microorganisms PCR Amplifikation der 16S rDNA 600 –1300 bp 1. Runde PCR (lange Fragmente) Klonierung Nested PCR DGGE 200 – 500 bp Einer der Primer trägt am 5‘-Ende eine GC-clamp. Agarosegel DGGE Cloning Extrahierte DNA ~ 700 bp PCR Amplifikation der langen Fragmente Ligation BHI-Agar + Tet + Amp + IPTG + X-Gal Cloning Lac Z klonierte DNA Lactose --> Galactose + Glc ß-Galactosidase X-Gal --> blau (Kolonien blau) Lactose X-Gal (Kolonien weiß) Blue/white screening Clone screening Sequenzierung Sequenzierung FASTA run • • • Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% EM_PRO:AB012212 Enterococcus faecalis gene 1517 99.719 100.000 356 8e-57 10 EM_PRO:AB036835 Enterococcus faecalis gene 1518 100.000 100.000 356 1.2e-57 45 EM_PRO:AB092693 Enterococcus faecalis gene 1455 100.000 100.000 329 9.6e-53 18 EM_PRO:AB098122 Enterococcus faecalis gene 1466 99.719 100.000 356 2e-57 30 EM_PRO:AB100597 Enterococcus faecalis gene 394 100.000 100.000 356 2.9e-57 ....... EM_PRO:AB101658 Streptococcus epidermidis g 197 69.854 70.1000 245 2e-48 31 98% Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html Tendogramm Clone http://rdp8.cme.msu.edu/html/index.html Fragestellung Verursachen alle (kultivierbare/nichtkultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme? Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten? Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten? Was kann man dagegen tun? KLINISCHE BEDEUTUNG Wozu molekulare Analyse ? Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese Staphylococcus specific Primers Enterobacteriaceae/Pseudomonadaceae specific Primers Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut DGGE Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation unspiked Shigella- Sonde spiked m. E.coli u. S.flexneri E.coli- Sonde Spezielle DNA- Extraktionsmethode Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM Spezielle DNA- Extraktionsmethode Gelelektrophorese Spezielle DNA- Extraktionsmethode Spezielle DNA- Extraktionsmethode DGGE Abwesenheit v. Blut-DNA Sensitivität
