FORSCHUNG MIT DER TAUFLIEGE DROSOPHILA

Serena Caldari, Larissa Schuh
FORSCHUNG MIT DER
TAUFLIEGE DROSOPHILA
RNA-Interferenz/Larvale Gewebe
Serena Caldari, Liceo Artistico
Larissa Schuh, Kantonsschule Uster
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Serena Caldari, Larissa Schuh
Tutor:
Katja Köhler
ETH Zürich
Einleitung
In der Molekularen Systembiologie ist Drosophila ein
beliebtes Versuchstier, da sie günstig ist, wenig Platz
braucht und zudem gleichen ihre Gene zu 80% dem
Menschen.
Die Drosophila dient als Versuchstier für die Tumor
Forschung.
Es gibt verschiedene Gene, die für das Wachstum
der Zellen eine Rolle spielen. Tumorsupressorgene
sind Gene, die das Wachstum hemmen im Gegenteil
zu den Onkogene, die das Wachstum fördern. Bei
Tumoren wurden Tumorsuppressorgene oder
Onkogene mutiert, sodass die betroffenen Zellen
unkontrolliert wachsen.
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PTEN ist ein Tumorsupressorgen, das oft in
menschlichen Tumoren mutiert wurde.
Wenn das PTEN Gen mutiert ist oder die Funktion
des PTEN Proteins verändert ist, dann wachsen die
Zellen schnell, unkontrolliert und profitieren auch von
schlechten Bedingungen (z.B. weniger Futter).
Ein Signalweg ist ein Prozess, in dem mehrere
Proteine zusammen eine bestimmte Reaktion in der
Zelle auslösen.
Beim Insulin-Signalweg dient Insulin dazu, Zucker zu
verarbeiten und die Zelle zum Wachsen anzuregen.
Wenn das Wachstum stoppen soll, wird PTEN
aktiviert, und blockiert somit den Insulin Signalweg.
1. Drosophila RNAi (RNAInterferenz)
Einfluss des Proteins Maltase auf den PTEN
Phänotyp
Eine Mutation der DNA bei der ganzen Fliege wurde
oft letale (tödliche) Auswirkungen haben. Deshalb
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werden nur die Augen der Fliege mutiert (PTENReduktion), der Rest des Fliegenkörpers bleibt
normal. Die Augen sind gross und gut zu
vermessen. Die Fliege erleidet bei der Mutation von
den Augen sonst keine Schäden.
In diesem Experiment wird der Einfluss des Proteins
Maltase auf den PTEN Phänotyp untersucht, dazu
wird die Menge des Proteins Maltase in der Fliege
über einen genetischen Trick reduziert. Dazu werden
vier verschieden gekreuzte Arten der Drosophila
Fliegen miteinander verglichen:
1. P x C (PTEN-Reduktion x Kontrolle)
2. P x 107 (PTEN-Reduktion x Maltase-Reduktion)
3. C x C (Kontrolle x Kontrolle)
4. C x 107 ( Kontrolle x Maltase-Reduktion)
Maltase ist ein Enzym, das die Abspaltung von
Glucose von Glucoseketten bewirkt. Damit ist es für
Wirbeltiere unentbehrlich bei der Verdauung von
Kohlenhydraten.
Die verschiedenen Fliegen wurden jeweils auf
normale (N) und nährstoffarmen (S) Futter gehalten.
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Die Körpergrösse der Fliegen ist beim S-Futter
kleiner. Die PTEN- reduzierten Fliegen profitieren
aber vom S- Futter und die Augen werden sogar
noch grösser.
 Petrischale
mit
Agar
Versuchstier:
Material:
 Taufliege
Drosophila
 Lichtmikroskop
 Pincetten
Methode:
Unter Einfluss von Kohlendioxid wurden die
Taufliegen betäubt und dann jeweils 20 Weibchen
aussortiert und in
Eppendorf Gefässe
eingefroren.
Nach zwei Tagen
wurden jeweils 12
Weibchen auf eine
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Petrischale mir Agar in einer vertikalen Linie
aufgelegt
(siehe Abb.1).
Danach wurden Fotos von den Augen der Fliegen
Abb.1: vertikale Aufreihung der Fliegen
auf Petrischale mit Agar
unter 400-facher
Vergrösserung mit einem Lichtmikroskop
aufgenommen.
Der Augenumfang wurde dann mit dem Programm
Photo Shop vermessen (siehe Abb. 2).
Abb. 2: vergrössertes Auge von PTEN x
Maltase gekreuzter Fliege
Tab.1: Augengrösse, Durchschnitte, Standardabweichung, Normalisierte
Durchschnitt und normalisierte Standardabweichungder verschiedenen
Genotypen.
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normalisierte Augengrösse
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1
2
3
4
5
Genotypen
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Diagramm 1: normalisierte Augengrösse zu den verschiedenen Genotypen.
= Signifikanter Unterschied
Resultate:
In diesem Experiment zeigte Reduktion von Maltase
keinen Einfluss auf die Augengrösse, da der
Unterschied nicht signifikant ist.
Diskussion:
Man müsste die Experimente wiederholen, um auch
wirklich sicher zu sein.
2. Larvale Gewebe
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Unser zweites Experiment besteht darin, die larvalen
Gewebe zu fixieren, färben und unter dem
Fluoreszenzmikroskop zu
vergleichen.
Material:
 Lichtmikroskop
Versuchstier:
 Larven der
 Pincetten
Taufliege
 Gilson Pipetten
Drosophila (so
 Konfokales
verändert, dass sie
Fluoreszenzmikrosk
grün fluoreszieren)
op
Methode:
Unter einem Lichtmikroskop wurden Drosophila
Larven seziert und deren Organe entnommen und
direkt in PBS auf Eis gestellt. Dann wurden die
Organe in 4% Paraformaldehyd gegeben. Danach
wurden sie mit Salzlösung (PBS) gewaschen. Die
Membran der Organe wurde mit einem
Detergenzmittel (PBT) durchlässig gemacht. So
konnten sie schliesslich mit DAPI gefärbt werden.
DAPI färbt die DNA in den Zellkernen an. Die
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Organe wurden schlussendlich nochmals in PBS
gewaschen. Danach wurden sie auf einen
Objektträger gegeben und mit einem Deckglas
verschlossen. Unter einem konfokalem
Fluoreszenzmikroskop wurden Augenscheiben, Darm,
Fettkörper, Malpigische Tubuli (Niere), Speicheldrüse
unter 10 und 20-facher Vergrösserung fotografiert.
Abb.3: Darm unter Einfärbung von
DAPI 10x vergrössert
Abb. 4: Augenscheiben unter
Einfärbung von DAPI 10x
vergrössert
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Abb. 5: Fettkörper 20x vergrössert
Abb. 6: Speicheldrüse 20x
vergrössert
Resultate:
Man erkennt, dass die Zellen der verschiedenen Organe
unterschiedlich gross sind. Die Speicheldrüse besitzt die grössten
Zellen.
Diskussion:
Die Fliegen wurden so verändert, dass sie grün leuchten.
In grüner Farbe sind die Zellen zu sehen und in blauer
Farbe sieht man besonders gut den Zellkern.
Danksagung:
Ein ganz grosses Dankeschön geht an unsere Betreuerin
Katja Köhler.
Ihre theoretischen sowie auch Ihre
praktischen Erklärungen waren sehr verständlich.
Wir danken auch Susanna, die uns beim Larven sezieren
half
und immer bereit war auf Fragen zu antworten.
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Zudem danken wir Federico, der uns seinen Computer
zur Verfügung stellte.
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