Diss. ETHNr. 10654
Untersuchungen
zur
Struktur der
Oxalacetat-Decarboxylase
ABHANDLUNG
zur
Erlangung des
Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
Günther Woehlke
Dipl. Biologe Philipps-Umversität Marburg/Lahn
geboren am 6. Februar 1964
Bundesrepublik Deutschland
Angenommen auf Antrag
von
Prof. Dr. P. Dimroth, Referent
Prof. Dr. G. Braus, Korreferent
Zürich 1994
Zusammenfassung
1.
Das
5
Zusammenfassung
Enterobakterium
Salmonella
biotinhaltige Oxalacetat-Decarboxylase.
die
a-Untereinheit
entsprechenden
Ä,-Phagen
im
Gene
Na+-translozierende,
eine
typhimurium besitzt
Auf der
Grundlage
EMBL3
wurde
einer
Expressionsbank
für
die
DNA-Sequenz
der
Es fanden sich drei offene Leseraster, die
aufgeklärt.
(in
der
ß (oadB)
codieren. Vor
diesen drei Genen findet sich ein weiteres offenes Leseraster, dessen
sequenzierter
Reihenfolge)
(padG),
für die Untereinheiten y
Teil auf Aminosäureebene 66 % Identität
Dehydratase ß-Untereinheit
sich keine
abgeleiteten
Untereinheiten
aus
vor
und
dem C-terminalen Bereich der L-Tartrat-
zu
jedem
für einen Promotor.
Mögliche
Ribosomen-
offenen Leseraster.
für
Aminosäuresequenzen
S.
(padA)
Escherichia coli besitzt. Vor den oad-Genen findet
typische Konsensussequenz
Bindungsstellen liegen
Die
aus
a
typhimurium
sind stark
Oxalacetat-Decarboxylase
die
homolog
zum
entsprechenden
Klebsiella
pneumoniae Enzym (71% Identität für die y- Untereinheiten, 92% für die
ß-Untereinheiten).
Untereinheiten und 93 % für die
Ähnlichkeit auf die N-terminalen
sich die
konnte
jedoch gezeigt werden,
pneumoniae-Gene entstanden
Zur
Kontrolle
der
dass
Klonierung
chromosomale
Kartierung
sequenzierten
Bereichs
der
und nicht auf dem
Die
zu
Artefakt bei
Klonierung
irrtümlichen
S.
gefunden,
stammeigenen
Plasmid
Oxalacetat-Decarboxylase-Gene
zeigt, dass
mit
aus
K.
typhimurium gebracht
proteinchemisch
vorhergesagte
chromosomalen
ergaben
zusammen
mit dem
gewonnenen
und in
Einklang
mit der
abgeleiteten Aminosäuresequenz
Peptidsequenzen
wieder.
ß-Untereinheit
wurde
ein
das 9 Transmembranhelices voraussagt. Es wurde
'p/ioA-Genfusionen experimentell überprüft.
Bereiche
Karte
weiterer Genlocus für die
korrigiert
werden. In der
membranständige Oxalacetat-Decarboxylase
Topologiemodell vorgeschlagen,
von
eine
wurde
dem Chromosom kloniert. Die DNA-
des oadfi-Gens konnte durch diesen Klon
mit Hilfe
K.
die Restriktionskarte des
pneumoniae wurden
aus
aus
die
der
pSLT.
Sequenz
Für
oad-Gene
der
dass ein
Sequenz
finden sich sämtliche
beschränken. Es
vorhanden ist. Die Gencluster sind chromosomal codiert
Gen für den anaeroben Citratcarrier (citS)
S.
der
a-
schien
Ergebnissen führte.
typhimurium
typhimurium
S.
ß-Untereinheiten
314 Aminosäuren
vorgenommen. Sie
in
übereinstimmt. Ausserdem wurde
Oxalacetat-Decarboxylase
ein
war, was zu
Bei den
die erwarteten
Vier
zytoplasmatisch
Phosphatase-negativen Fusionen,
für
6
Zusammenfassung
den fünften wurde keine Fusion erhalten
4 und 6 wurden
erhalten
in
Übereinstimmung
Die vermeintlich
Fusion mit alkalischer
Aus dem
der
Sequenzvergleich
sequenziert
Fragment
werden,
Aminosauresequenz
Um
aus
das
weist
Na+-translozierenden
aus
Teil
zu
Untersuchungen
durchgeführt
an
in
Lactococcus
Rohextrakt
Es
von
werden
Oxalacetat
ergab
Loops 2,
Fusionen
wider Erwarten keine
zu
im
Polymerase Kettenreaktion
Diplomarbeit
einer
modestum
ein
750
bp
amplifiziert,
klomert und
Die
abgeleitete
mmdB-Gens
ist
den drei sequenzierten
ß-Untereinheiten
auf
Bakterien
ssp
Abbauwege
ausserhalb
einer
lactis
Organismen fand
umgehen
parvula wurden konservierte
eine
Rahmen
Rahmen
lactis
Oxalacetat-Decarboxylasen und
Veillonella
eines
Decarboxylasen
In keinem der beiden
Decarboxylierung
im
65 % Identität
finden, wurden
der
Pnmer für
Propionigenium
Oxalacetat-Decarboxylasen
Enterobaktenen
im
spezifische
Mit diesem Ansatz konnte
grosses DNA
erwarteten
Phosphatase-positive
Schleife 8
ß-Untereinheiten
der
penplasmatisch
Modell
Aktivität
Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase
konstruiert
von
penplasmatische
Phosphatase
Bereiche identifiziert und
In den
zum
für
und
sich
solche
der
physiologische
Clostridium
eine
Citrat
Klasse
der
Semesterarbeit
sphenoides
Enzymaktivitat
beschritten,
die
die
Zusammenfassung
1.
7
Summary
The Enterobacterium Salmonella
biotin-containing
corresponing
EMBL3 screened
reading
were
frames
immunologically
were
this order.
Upstream
with 66 %
identity
amino acid level in its
on
sequence
(oadG),
typhimurium
reading
identity
71 %
identity
to
ß-subunits.
exist
only
The
control for the
cloning
of the S.
chromosomal map. Furthermore,
decarboxylase
in S.
pneumoniae oad-genes
oadB gene
was
phoA
identity
model
typhimurium
binding
sites
subunits from
pneumoniae enzyme
with
between the a-subunits, and 93 %
the
corresponding ß-subunits
was
pneumoniae-genes
was
additional gene locus
identified. The
were
the
shown that
that led to
oad-genes
were
mapped
in accordance with the
coding
two
for
an
oxaloacetate
oarf-gene-clusters
are
strain-specific plasmid pSLT.
cloned
together
with the gene
encoding
the
(citS) from the chromosome. The nucleotide sequence of the
now
with all available
for
the
integral
in accordance with the
peptide
technique.
give phosphatase-negative
Four
membrane-bound
accordance with the model, in
was
loops predicted
fusions. The fifth
loops 2,
corresponding
S.
sequences.
9 transmembrane helices. The model
gene fusion
genes, the
sequenced part
was
not on
corrected and is
typhimurium-gene and
topology
an
typhimurium
the chromosome and
anaerobic citrate carrier
predicting
ribosome
of the oad-
results.
the chromosome. The map of the
A
Upsteam
decarboxylase
the Klebsiella
of the K.
during cloning
a
The K.
in
detected
was
with the C-terminal part
putative
similarity between
As
on
to
92 %
on
located
ß (oadB)
and
frame
reading
for the 314 N-terminal amino acid residues. It
artifact had occured
erroneous
y-subunits,
between the
between the
appeared
an
highly homologous
are
A.-phage
frame.
The deduced amino acid sequences for the oxaloacetate
S.
(oadA)
a
sequenced part
found but
in the
of the oc-subunit. Three open
from Escherichia coli.
was
the
of
sequences
genomic libary
a
additional open
an
Na+-translocating,
a
nucleotide
expression
the subunits y
of these genes,
typical promotor
no
for the
encoding
identified before each open
were
the basis of
on
dehydratase ß-subunit
of the L-tartrate
genes
established
found
The
decarboxylase.
oxaloacetate
genes
LT2 possesses
typhimurium
to
subunit
tested
be
cytoplasmic
4 and 6 the fusions
ß
was
proposed,
experimentally
cytoplasmic
fusion
were
were
was not
with the
found to
obtained. In
phosphatase-positive.
8
Zusammenfassung
Unexpectedly,
the putative
periplasmic loop
8 does
not
confer activity
to
Phosphatase
fusions
alignments
From
of the
ß-subumts
methylmalonyl-CoA decarboxylase
identified and
course
of
specific
diploma
a
and to sequence
part of
three
a
a
pnmers for
bp
DNA
sequenced ß-subunits
identify
from Na+
oxaloacetate
physiological investigations
Clostridium
sphenoides
m
showed enzymatic activity
amino
it was
and
conserved regions
were
possible
Propionigenium
to
constructed
amplify,
to
the
were
in
the
clone
modestum which
acid sequence shows 65 %
identity
is
with the
translocatmg decarboxylases
performed
the frame of
in
from
decarboxylases
were
decarboxylases
parvula
chain-reaction
approach,
fragment
mmdB gene The deduced
In order to
Polymerase
thesis With this
750
of the oxaloacetate
from Veillonella
a
in
in
bactena other than
Lactococcus
laboratory
course
Enterobactena,
lactis ssp lactis and
None of these organisms
the crude extract In the anaerobic metabohsm of these
bactena, the decarboxylation of oxaloacetate
is
circumvented
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Untersuchungen zur Struktur der Oxalacetat - ETH E