Kalziumsignale in intestinalen Lymphozyten

Kalziumsignale in intestinalen
Lymphozyten
Dissertation
Zur Erlangung des Grades
des Doktors der Naturwissenschaften
der Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät III
Chemie, Pharmazie, Bio- und Werkstoffwissenschaften
der Universität des Saarlandes
Von
Birgit Gisela Löffler, geb. Heß
Saarbrücken 2007
Tag des Kolloquiums:
Dekan:
Vorsitzender:
1. Prüfer:
2.Prüfer:
Akad. Mitarbeiter:
19.05.2008
Professor Dr. Uli Müller
Professor Dr. M.J. Schmitt
Professor Dr. M. Hoth
Professor Dr. I. Bernhardt
Dr. E. Krause
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
3
Abkürzungsverzeichnis
5
Zusammenfassung
7
Summary
8
1. Einleitung
9
1.1. Kalziumsignale und Aktivierung von B- und T-Zellen
9
1.2. Das Immunsystem des Darms
16
1.3. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)
18
1.4. Zielsetzung der Arbeit
21
2. Material und Methoden
2.1.Material
22
22
2.1.1. Chemikalien
22
2.1.2. Antikörper
23
2.1.3. Lösungen für die Präparation muriner Zellen
24
2.1.4. Lösung zum Beschichten der Deckgläser
24
2.1.5. Lösungen für Kalzium-Imaging Experimente
25
2.1.6. Lösungen mit Antikörpern zur Identifikation und zur Stimulation der
Zellen
25
2.1.7. Versuchstiere
25
2.1.8. Geräte
25
2.1.9. Auswertungsprogramme
26
2.2. Methoden
26
2.2.1. Isolierung von mononuklearen murinen Zellen aus dem Blut
26
2.2.2. Isolierung von mononuklearen murinen Zellen aus dem Darm
27
2.2.3. Induzierung der Kolitis bei Mäusen
29
2.2.4. Kalzium Imaging- Experimente
30
2.2.4.1. Beschichtung der Deckgläser
32
2.2.4.2. Der Messplatz
32
2.2.4.3. Kontrollversuch ohne Applikation von Substanzen
33
2.2.4.4. Experimente mit Thapsigarginlösungen
33
2.2.4.5. Experimente mit Antikörperstimulation
3. Ergebnisse
34
36
3.1.Optimierung der Zellpräparation
36
3.2. Kontrollversuche, um den Einfluss äußerer Faktoren auf die [Ca2+]i
der Lymphozyten zu testen
40
3.3. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von Balb/cAnCrlMäusen nach Zugabe von unterschiedlichen Ca2+-Lösungen mit
Thapsigargin
42
3.5. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von Balb/cAnCrlMäusen nach Antikörperstimulation
45
2+
3.6. Vergleich von [Ca ]i in Blut- und Darmlymphozyten von verschiedenen
TRPC-Knock-out- Mäusen nach Antikörperstimulation
50
3.6. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von ver-schiedenen
TRPC-Knock-out Mäusen nach Zugabe von unter-schiedlichen Ca2+Lösungen mit Thapsigargin
3.7. Einfluss einer induzierten Darm-Kolitis auf die Kalziumsignale
4. Diskussion
53
56
61
4.1.Lymphozyten aus dem Darm
61
4.2.Isolation der Lymphozyten aus dem Darm
62
4.3. Vergleich von murinen und humanen [Ca2+]i-Signale aus Lymphozyten
63
4.4. Physiologische Stimulation der Lymphozyten
65
2+
4.5. [Ca ]i-Signale bei Lymphozten aus verschiedenen TRPC-Knock-out
Mäusen
67
4.6. [Ca2+]i-Signale von Lymphozyten bei CED
68
4.7. Schlußbetrachtung und Ausblicke
70
5. Literatur
71
Lebenslauf
78
Abkürzungsverzeichnis
AM
Azetoxymethylester
AP-1
activator protein 1
APC
antigen presenting cell
ATP
Adenosintriphosphat
BCR
B-cell receptor
[Ca2+]I
intrazelluläre Kalziumkonzentration
CD
cluster of differentiation
CED
chronisch entzündliche Darmerkrankungen
CRAC
calcium release acrivated channel
DAG
Diacylglycerol
DSS
Dextran Sulfate Sodium
DTT
DL-Dithiothreitol
ER
endoplasmatisches Retikulum
EDTA
Ethylendiaminetetra-Acetic Acid
EGTA
Ethylene Glycol-bis(β-Amino-Ethylen Ether)-N,N,N′,N′-Tetraacetic
Acid
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein-5-Isothiocyanat
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
INF-γ
Interferon γ
IP3
Inositol-1,4,4-trisphosphat
ITAM
immunoreceptor tyrosine-based activation motif
LPL
Lamina propria Lymphozyt
MHC
major histocompatibility complex
NFAT
nuclear factor of activated T-cells
NFκB
nuclear factor-κB
PBL
peripherer Blutlymphozyt
PIP2
Phosphatidylinositoldiphosphat
PKC
Proteinkinase C
PLCγ
Phospholipase C-γ
PMCA
Plasma Membran Calcium ATPase
SCID
Severe combined immunodeficiency
SERCA
Sarco-endoplasmatic reticulum Calcium ATPase
SOC
store-operated channel
TCR
T-cell receptor
TG
Thapsigargin
TNF-α
Tumornekreosefaktor-α
TPP-Protein Transient Rezeptor Potential-Protein
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Blutlymphozyten (PBL) und Lamina Propria Lymphozyten (LPL) sind Zellen des
spezifischen Abwehrsystems im Organismus. Die LPL zeigen physiologischer Weise
eine Hyporeaktivität gegenüber physiologischen Stimuli im Vergleich zu PBL. Kommt
es zu einer Immunreaktion gegenüber nicht pathogenen Antigenen, kann dies zu
einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung führen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Methode etabliert werden, um Lymphozyten aus
dem Darm der Maus in ausreichenden Mengen zu isolieren. Bei den isolierten und
nicht voraktivierten Zellen von verschiedenen Mausstämmen sollten mit Hilfe der
Fluoreszenzmikroskopie und geeigneten Farbstoffen [Ca2+]i nach Stimulation
gemessen, miteinander und mit Daten von Lymphozyten aus Mäusen mit
experimentell induzierter Kolitis verglichen werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass sich die Zellen aus den
verschiedenen Mausstämmen durch die gewählten Stimuli, Thapsigargin und
Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, stimulieren lassen. Die Daten bestätigen
eine niedrigere [Ca2+]i der LPL gegenüber den PBL gesunder Mäuse, was bereits für
humane Zellen gezeigt wurde.
Erste Daten von Mäusen mit induzierter Kolitis konnten aufgrund der Schwierigkeit
der Präparation nur für wenige CD19+-Lymphozyten gewonnen werden. Bei diesen
zeigte sich ein im Vergleich zu Kontrolltieren höherer [Ca2+]i.
Die Ergebnisse dieser Arbeite legen nahe, dass Lymphozyten aus dem Mausdarm
sowohl für die als Model für die Rolle von [Ca2+]i Signalen bei CED, die Reproduktion
der Daten mit Lymphozyten von Mäusen mit induzierter Kolitis vorrausgesetzt, als
auch für die Analyse der Ca2+-abhängigen Hyporeaktivität von LPLs genutzt werden
können.
7
Summary
Summary
Peripheral blood lymphocytes (PBL) and lamina propria lymphocytes (LPL) are part
of the specific immune system. LPLs are considered hypo-reactive, a phenomenon
called oral tolerance. If this tolerance mechanism does not work properly, lamina
propria T-cells may react to non-pathogenic antigens with an uncontrolled activation
which can finally lead to chronic intestinal inflammation (inflammatory bowel disease,
IBD).
The aim of this thesis included the evaluation of an method to isolate lymphocytes
from mice intestine. [Ca2+]i from isolated resting single cells from different mice
strains were measured using sutable fluoroscopic Ca2+ sensitive dye. Finally [Ca2+]i
measurements in LPLs from healthy mice should be compared to [Ca2+]i
measurements from mice with an experimentally induced colitis.
The results of the present thesis show that thapsigargin as well as antibodies raised
against T cell receptors (anti-CD3/anti-CD28) increase [Ca2+]i in LPL from different
mouse strains. Similar to previous findings for human cells show mice LPLs a much
lower [Ca2+]i signals as compared to PBLs from the same mice.
The isolation of LPLs from mice with experimentally induced colitis was unfortunately
very difficult. Only from very few of the experiments it was possible to analyze CD19+
(B-lymphocytes). However, the B-cell data show that in mice with colitis, [Ca2+]i
increases were on average higher than in cells from control mice.
From the results it can postulated, that LPL from mice can be used for both a model
to investigate Ca2+-dependent patho-physiological hyper-reactivity of lymphocytes
during intestinal inflammation, assuming reproduction in mice with induced colitis, as
well as for understanding the Ca2+-dependent hypo-reactivity of LPLs.
8
Einleitung
1. Einleitung
1.1. Kalziumsignale und Aktivierung von B- und T-Zellen
Das Immunsystem stellt für jeden Organismus einen Schutzmechanismus dar, mit
dessen Hilfe er seine biologische Identität verteidigen kann. Dieses Immunsystem
ermöglicht es dem Organismus zwischen eigenen und fremden Strukturen zu
unterscheiden und fremde Pathogene zu erkennen und zu zerstören. Besonders der
Darm stellt eine große Eintrittspforte für Krankheitserreger dar und in dieser Arbeit
sollten die Lymphozyten dieses Abwehrsystems hinsichtlich ihrer intrazellulären
freien Kalziumkonzentration [Ca2+]i näher untersucht werden.
Heute unterscheidet man zwischen dem unspezifischen Abwehrsystem, dem z.B.
Granulozyten und Makrophagen angehören und dem spezifischen Abwehrsystem,
das
von
den
Lymphozyten
repräsentiert
wird.
Die
beiden
verschiedenen
Abwehrsysteme reagieren unterschiedlich. Das unspezifische Abwehrsystem macht
die Fremdkörper durch Phagozytose und intrazellulären Abbau unschädlich, während
das spezifische Immunsystem Antikörper und Effektorzellen bildet, die die Zielzelle
für den Abbau markieren und zerstören. Um den Organismus wirkungsvoll zu
schützen, arbeiten beide Systeme eng zusammen.
Ein erwachsener Mensch verfügt über etwa 1012 Lymphozyten, wobei täglich etwa
109 absterben. Der Nachschub an Lymphozyten kommt aus Stammzellen, die im
Knochenmark lokalisiert sind und die die lymphoiden Vorläuferzellen herstellen.
Diese lymphoiden Vorläuferzellen erhalten eine weitere Prägung, entweder in den
lymphytischen Anteilen im Knochenmark (= Bone, B-Lymphozyten) oder im Thymus
(T-Lymphozyten) [Klinke, et al., 2005].
Die Lymphozyten unterscheidet man heute aufgrund ihrer Oberflächenproteine (=
Cluster of Differentiation, CD). Über 90% der B-Lymphozyten exprimieren das
Oberflächenantigen CD19 auf der Zelloberfläche und sind CD3 negativ, deshalb
werden das Vorkommen oder Fehlen der CD kurz als CD19+CD3- bezeichnet. Die
zwei Hauptgruppen der T-Zellen sind CD3 positiv, lassen sich aber über die CD4 und
CD8 Oberflächenantigene unterscheiden.
Die T-Zellen erkennen ein Antigen nur dann, wenn es zusammen mit den MHCKlasse-I bzw. II Antigenen (major histocompatibility complex, MHC) auf einer
Antigen-präsentierenden Zelle (APC) präsentiert wird, während die B-Zellen mit ihren
9
Einleitung
BCR (B cell receptor) sowohl lösliche als auch zellgebundene Antigene erkennen
können. Diese MHC-Antigene sind Zelloberflächenmoleküle (Rezeptoren), wobei
MHC-I-Proteine auf fast allen Körperzellen vorkommen, MHC-II-Proteine kommen
hauptsächlich auf antigenreräsentieren Zellen, B-Zellen und Makrophagen vor.
Es kommt zu einer Stimulation von CD8+CD4--T-Zellen (zytotoxischer T-Lymphozyt),
wenn diese T-Lymphozyten ein körperfremdes Antigen mit den MHC-Klasse-IMolekülen als ihr Epitop auf einer Zelle erkennen. Viren benutzen den
Syntheseapparat der Wirtszelle, um eigene Proteine herzustellen und sich zu
vermehren. Es entstehen dabei endogen Antigene, die von der betroffenen Zelle zu
Peptiden verdaut werden. Entstandene Antigenpeptide werden eingebettet in die
MHC-Tasche auf der Zelloberfläche präsentiert. Bei Erstkontakt der T-Lymphozyten
mit dem Antigen führt dies zu einer Kostimulation der T-Zellen, die die
Differenzierung der T-Zellen zu reifen zytotoxischen T-Zellen und Gedächtniszellen
ermöglicht. Die zytotoxischen CD8+CD4--T-Zellen lagern sich an befallenen Zellen
mit dem als fremd erkannten Antigen an und leiten die Apoptose ein.
Die CD4+CD8--T-Zellen (T-Helferzellen) übernehmen immunregulatorische Aufgaben
und reagieren mit MHC-Klasse-II-Molekülen. Sie aktivieren Makrophagen und liefern
kostimulatorische Signale für die Proliferation und Ausdifferenzierung von B-Zellen
zu antikörperproduzierenden Plasmazellen [Sprent, J., 1994].
Kommt es zu einer Bindung zwischen der APC und einer T-Helferzelle, die den dazu
gehörenden antigenspezifischen Rezeptor (T cell receptor, TCR) besitzt, wird die
Zelle aktiviert. Die T-Helferzelle proliferiert und bildet Interleukin 2 (IL 2), die
zytotoxische T-Zelle proliferiert durch das IL 2 und wird zur Effektorzelle, die
Zielzellen abtöten kann [Klinke, R., et al., 2005].
Ein Schlüsselsignal für die Aktivierung von T- bzw. B-Zellen nach der Stimulation des
T- bzw. B-Zell-Rezeptors (TCR, BCR) durch Antigene oder andere Substanzen, die
an die Rezeptoren binden können, ist die Erhöhung der [Ca2+]i [Lewis, R.S. 2001].
Um die Veränderung der [Ca2+]i-Signale erfassen zu können, sollte zunächst in
dieser Dissertation die Präparation der Lymphozyten aus dem Darm von Mäusen
etabliert werden.
Der Aufbau der Rezeptoren von B- und T-Lymphozyten ist aufgeklärt. Sie werden in
Rezeptorkomplexe eingeteilt, die aus variablen und konstanten Proteinbereichen
bestehen. Die variablen Proteinbereiche sind zur Antigenerkennung nötig, die
konstanten Proteinbereiche sind zur Signaltransduktion ins Zellinnere verantwortlich.
10
Einleitung
Wird der T- bzw. B-Zell-Rezeptor stimuliert, kommt es zur Aktivierung von Kinasen
der Src-Familie, welche Tyrosinreste der ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based
activation motifs) phosphorylieren. ITAMs sind in den zytoplasmatischen Regionen
der Rezeptoren lokalisiert.
Über verschiedene Proteine wird schließlich die Phospholipase C (PLCγ) aktiviert,
die
das
membranständige
Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat
(PIP2)
in
Diacylglycerol (DAG) und 1,4,5-Inositoltriphosphat (IP3) spaltet.
Abb.1.1. Modell der Kalziumsignalwege in T-Zellen; Die Stimulation über den TCR/CD3/CD28
Komplex durch eine antigenpräsentierende Zelle führt über mehrere Zwischenschritte zur Aktivierung
von PLCγ. PLCγ spaltet PIP2 in DAG und IP3, DAG aktiviert PKC und IP3 bindet an Rezeptoren an der
ER-Membran, wodurch Ca
2+
aus dem ER freigesetzt wird. Durch die Vermittlung von STIM-Proteinen
2+
kommt es zur Öffnung der CRAC-Kanäle in der Zellmembran und zum Einstrom von Ca . Durch die
2+
Erhöhung des intrazellulären Ca
wird das Signalmolekül Calcineurin aktiviert, das den
Transkriptionfaktor NFAT dephosphoryliert. Der dephopsphorylierte NFAT-Faktor kann in den Kern
eingeschleust werden und dort zusammen mir anderen Transkriptionsfaktoren (z.b. AP-1 und NFκB)
zur Zytokinexpression beitragen [nach AG Hoth].
DAG aktiviert die Proteinkinase C (PKC) und IP3 bindet an die IP3-Rezeptoren in der
Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER), das löst wiederum die Öffnung
11
Einleitung
von Kalziumkanälen aus und es kommt zu einer Kalziumfreisetzung aus dem ER ins
Zytosol [Lewis, R:S:, 2001, Feldhahn, N. et al., 2002, Berridge, M.J. et al., 2003].
Der Kalziumfreisetzung aus dem ER folgt ein Kalziumeinstrom über die
Plasmamembran.
Hierbei
kommt
es
durch
die
Entleerung
intrazellulärer
Kalziumspeicher zu einer Öffnung speichergesteuerter Kalziumkanäle (store
operated channels, SOCs). Die SOCs werden in verschiedenen Zellen exprimiert,
wobei die SOCs in Lymphozyten sich durch eine hohe Kalziumselektivität
auszeichnen. Die SOCs in den Lymphozyten werden auch als Calcium ReleaseActivated Calcium (CRAC) Kanäle bezeichnet. Durch Öffnung der CRAC-Kanäle
kann Kalzium aus dem extrazellulären Bereich in die Zelle einströmen [Lewis.R.S.,
2001, Penner, R. et Fleig, A., 2004]. Diese Öffnung wird durch das Protein STIM
vermittelt, das seine Position vom ER zum CRAC-Kanal in der Plasmamembran
verändert. STIM ist ein Transmembranprotein, das in zwei homologen Formen bei
menschlichen Zellen, STIM1 und STIM2, existiert [Roos, J. et al., 2005, Zhang, S.L.
et al., 2005].
Die Aktivierung der CRAC-Kanäle ist nicht nur über eine Rezeptorstimulation und
eine IP3-Bildung möglich, sondern auch durch eine rezeptorunabhängige Entleerung
der Kalziumspeicher des ERs, z B. mit der Blockierung der Sarco-endoplasmatic
reticulum Calcium ATPase (SERCA) durch Thapsigargin [Ebert, E.C., 2003,
Penner,R. et Fleig, A., 2004]. Die SERCA in menschlichen Zellen pumpt Kalzium aus
dem Zytosol ins ER im Ruhezustand der Zelle [Lewis, R., 2001] und erhält ein
Kalziumkonzentrationsgefälle über die Membranen des ERs aufrecht.
Für die physiologische Funktion der T-Zellen ist es wichtig, den Ca2+ -Einstrom über
die CRAC-Kanäle zu kontrollieren. Der Einstrom, die Höhe und die Kinetik der Ca2+
Signale ist von entscheidender Bedeutung bei der Genexpression, der Aktivierung
und Proliferation der Zelle während der Immunantwort [Zweifach, A. et Lewis, R.S.,
1993, Quintana, A. et al., 2005].
Durch die Erhöhung des [Ca2+]i wird die Phosphatase Calcineurin aktiviert.
Calcineurin dephosphoryliert den Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated Tcells (NFAT), der dadurch seine Konformation ändert und in den Kern importiert wird.
NFAT kontrolliert die Expression von TNF-α und als Komplex mit AP-1 die Bildung
von verschiedenen Interleukinen, GM-CSF und IFN-γ.
12
Einleitung
Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-κB (NFκB) koordiniert die Aktivierung von
zahlreichen Genen und vor allem von proinflammatorische Zytokine wie z.B TNF-α.
Zytokine sind Proteine, die von Immunzellen gebildet und freigesetzt werden. Sie
steuern als Botenstoffe die Immunreaktion, wirken als Wachstumsfaktoren, aktivieren
und deaktivieren Zellen und dienen als Schutz vor Gewebsschädigungen [Klinke, R.
et al., 2005]. Da aber immer noch neue Interleukine entdeckt werden, ist die Liste der
Funktionen sicher noch nicht volllständig. Zytokine haben keine einheitliche
Namensgebung, viele werden als Interleukine (IL-) bezeichnet. Andere Zytokine sind
nach ihrer Funktion benannt, z.B. Tumornekreosefaktor-α (TNF-α).
Kalziumsignale sind für viele Funktionen der T-Zellen notwendig [Lewis, R.S. et al.,
2001], so ist zum Beispiel die Genexpression kalziumabhängig. Bei den
Untersuchungen der [Ca2+]i-Signale in dieser Dissertation und in anderen Arbeiten
[Lewis, R.S., 1989, Dolmetsch,R.E. et Lewis,R.S., 1997, Griesemer, D. et al., 2004]
konnte festgestellt werden, dass es verschiedene Arten von Signalen, wie zum
Beispiel einzelne Peaks, oszillatorische Peaks oder langanhaltende [Ca2+]i-Signale,
die ein Plateau bilden, gibt. Diese Vielfalt der [Ca2+]i ermöglicht eine differenzierte
Genexpression, die durch die unterschiedliche Affinität der Transkriptionsfaktoren
NFAT und NFκB zu Kalzium gesteuert werden kann [Dolmetsch,R.E. et Lewis,R.S.,
1994, Rao, A. et al.,1997] und die für die Aktivierung und Proliferation der T-Zellen
wichtig ist [Schottelius, A.J. et al., 1999, Schwarz, E.C. et al., 2007]. Eine Störung
des [Ca2+]i und eine anhaltende TCR-Stimulation führen die Zelle in die Apoptose
[Sprent, J., 1994, Rizzuto, R. et Pozzan, T., 2003].
Eine wichtige Rolle bei der Generierung von Kalziumsignalen in Zellen spielen auch
die kalziumspeichernden Organellen, z.B. das ER und die Mitochondrien.
Mitochondrien sind Kalziumspeicher, die bei steigendem [Ca2+]i Kalzium aus dem
Zytosol aufnehmen und bei sinkendem [Ca2+]i Kalzium ins Zytosol wieder freisetzen
können. Die Mitochondrien können die CRAC-Kanal-Aktivität steuern, wenn sie nahe
der Membran liegen und durch Kalziumspeicherung die kalziumabhängige
Inaktivierung des CRAC-Kanals verhindern [Hoth, M. et al., 2000, 1997, Quintana, A.
et al., 2005]. Somit wäre auch die Verteilung und Anzahl der Mitochrondrien ein
wesentlicher
Aspekt
für
die
Bildung
verschiedenen Zellen.
13
unterschiedlicher
Kalziumsignale
in
Einleitung
Der aktuellem Stand der Forschung geht davon aus, dass der Kalziumeinstrom in die
Zelle fast ausschließlich über die CRAC-Kanäle erfolgt. Dies konnte eindrucksvoll
gezeigt werden durch den spezifische CRAC-Kanalblocker BTP2, der die TCRinduzierten Kalziumsignale und die T-Zellproliferation blockiert [Zitt,C., et al. 2004,
Quintana, A. et al., 2005]. Weiter untermauert konnte diese These durch die
Erforschung der humanen Erkrankung SCID (severe combined immunodeficiency),
einem schweren kombinierten Immundefekt, bei dem den Lymphozyten fast
vollständig eine CRAC-Kanal-Aktivität fehlt [Feske, S. et al., 2005]. Die T-Zellen der
SCID Patenten zeigen keinen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration nach
einer Stimulierung über den TCR, sowie keine Steigerung der Transkription, was
auch das Ausbleiben der Immunantwort erklärt. Bei SCID Patienten ist mit der fast
fehlenden CRAC-Aktivität auch eine Verminderung der Kv1.3-Kanal-Aktivität
korreliert, was auf eine funktionale Verbindung der Kanäle hinweist [Feske, S. et al.,
2005]. Die meisten Kinder mit SCID sterben innerhalb des ersten Lebensjahres, da
sich die Krankheit in häufig schweren, systemisch verlaufenden Infektionen äußert.
Die genetische Grundlage dieser Krankheit ist eine Punktmutation im Orai1-protein.
Dieser Zusammenhang wurde von Freske gezeigt, der dieses Protein identifizierte
und der Orai 1 als eine Untereinheit oder als Schlüsselregulator des CRAC-Kanals
vorschlägt [Freske, S. et al., 2006].
Der molekulare Aufbau der CRAC-Kanäle ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Man
geht heute davon aus, dass Transient Rezeptor Potential-Proteine(TRP-Proteine)
und ORAI Proteine [Feske,S. et al.,2006] beteiligt sind. In welcher Weise die
verschiedenen TRP-Proteine in den verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, ist
noch nicht geklärt [Nilius, B. et al., 2004, Ramsey, I.S. et al. 2006]. TRP-Proteine
werden in verschiedene Subfamilien eingeteilt [Freichel, M. et al., 2005]. Es wurden
zum Beispiel TRPC-Proteine (canonical TRP), TRPV-Proteine (vanilloid TRP) und
TRPM-Proteine (melastatin TRP) charakterisiert, wobei diese Proteine Gegenstand
vieler Forschungsprojekte sind und immer neue in der Literatur beschrieben werden
[Kwan, H.-Y. et al., 2004, Freichel, M. et al., 2005, Erler, I. et al., 2006]. Das TRPC3Protein des CRAC-Kanals zum Beispiel wurde zuerst von Zhu [Zhu et al. 1996]
beschrieben. Kwan zeigte, indem er das TRPC3 Gen in HEK293- Zellen exprimierte,
dass der Ca2+-Influx in diesen Zellen größer war als in den Wildtypzellen [Kwan, H-Y.
et al., 2004].
14
Einleitung
Da bestimmte defiziente Mausstämme in den Abteilungen von Professor Flockerzi /
Professor Freichel vorhanden waren, konnten in dieser Arbeit aus TRPC-Knock-out
Mäusen Lymphozyten isoliert und [Ca2+]i in den Zellen gemessen werden. Dadurch
konnte in dieser Arbeit der Frage nachgegangen werden, ob das Ausschalten von
TRPC-Proteinen in TRPC-Knock-out Mäusen einen messbaren Einfluss auf das
[Ca2+]i in Lymphozyten von verschiedenen TRPC-Knock-out Mäusen im Vergleich zu
dem entsprechenden Wildtyp hat.
Für die Zelle ist auch die Funktion der Kalziumclearance von Bedeutung, die
hauptsächlich durch die Plasmamembran Ca2+ATPase (PMCA) gesteuert wird
[Bautista, D.M. et Lewis, R.S., 2004]. Dadurch ist die Zelle in der Lage, große
Kalziumeinströme während der CRAC-Kanal-Aktivität zu kompensieren.
Zusätzlich zu den genannten Mechanismen, die den Ca2+-Einstrom kontrollieren, wie
z.B. die CRAC-Kanäle, Kalziumpumpen, Ca2+-Aufnahme und Freisetzung aus den
vorhandenen Speichern, bauen die Kalium-Kanäle das elektrische Membranpotential
für den Ca2+-Eintritt in die Zelle auf. Da aber ein Ca2+-Einstrom auf Dauer die
Depolarisation der Plasmamembran verursachen würde, ist ein ausgleichender
Kationausstrom aus der Zelle notwendig [Fanger, C.M. et al, 2001], damit das
Membranpotential über der Plasmamembran aufrecht erhalten wird.
Durch die Arbeit von Tutsch [Tutsch, E. et al., 2004] wurde auf die erniedrigten
[Ca2+]i-Signale der Darmlymphozyten gegenüber den PBLs hingewiesen. Ebenso
wurde in der Arbeit von Tutsch der Vergleich von dissozierten und im
Gewebeverband gemessenen Lymphozyten durchgeführt, der dieses Ergebnis
bestätigte. Ein verringerter Nettoeinstrom ist wahrscheinlich die Ursache, womit die
niedrigeren [Ca2+]i der LPLs teilweise erklärt werden kann. Diese Verringerung des
Nettokalziumstromes kann durch verschiedene Mechanismen zustandekommen,
prinzipiell bestehen folgende Möglichkeiten, die reduzierten [Ca2+]i in den LPLs zu
erklären.
Eine Blockade vorhandener Kanäle oder die Hemmung des Signalflusses zwischen
Speicherentleerung und Kanalöffnung können die CRAC-Kanäle und somit die [Ca2+]i
beeeinflussen. Das Protein STIM 1 ist in die Signalkaskade eingebunden und eine
Hemmung dieses Proteins würde den Kalziumstrom reduzieren. So sind von z.B.
einer verminderten Expression bis hin zur Mutation des STIM-Proteins [Liou, J. et al.,
2005, Marchant, J.S., 2005, Zhang, S.L. et al., 2005] viele Möglichkeiten denkbar, die
direkt den Kalziumstrom beeinflussen können.
15
Einleitung
Eine weitere Ursache für den erniedrigten Strom könnte darin liegen, dass z.B. in
LPLs eine geringere Anzahl von CRAC-Kanälen in der Plasmamembran exprimiert
ist, oder es wird ein anderer Kanaltyp in den LPLs als in den PBLs exprimiert.
Aber auch die Aktivität der Kaliumkänale, die das Membranpotential bestimmen,
könnte eine Ursache eines verminderten Kalziumeinstromes darstellen. So könnten
auch hier unterschiedliche Expressionen verschiedener spannungsabhängiger
Kanäle, z.B. des Kv1.3 Kanals oder des kalziumaktivierten IKCa1 Kanals, und die
unterschiedliche Anzahl in der Membran eine entscheidende Rolle spielen [Chandy,
K.G. et al., 1993, Panyi, G. et al., 2003, Feske, S., et al. 2005]. Eine Blockade des
Kv1.3 Kanals depolariseirt zum Beispiel die T-Lymphozyten [Panyi, G., 2003]. Eine
Herunterregulierung der Kaliumkanäle könnte der Teil eines Regelkreises sein, der
durch die verminderte Aktivität eine Depolarisierung des Membranpotentials auslöst
[Kerschbaum, H.H. et al., 1997]. Das hätte zur Folge, dass eine Verminderung des
Kalziumeinstromes eintreten würde.
Schließlich ist auch ein erhöhter Kalziumexport eine der Möglichkeiten, die das
[Ca2+]i-Signal beeinflussen können. Um diese Regulation der Zellen zu untersuchen,
wurden in der vorliegenden Arbeit bei allen Thapsigarginexperimenten nach 1200
Sekunden
nach
dem
Start
ein
Lösungswechsel
zu
kalziumfreier
Lösung
durchgeführt. Dadurch kann die Änderung der [Ca2+]i-Signalen von den untersuchten
Zellen, die durch Kalziumpumpen hervorgerufen werden, abgeschätzt werden.
Um die Basis für die geplanten Experimente zu schaffen, sollte der Frage
nachgegangen werden, ob sich die [Ca2+]i-Signale der isolierten murinen Blut- und
Darmlymphozyten ohne Stimulation durch applizierte Substanzen über den Zeitraum
von 2000 Sekunden verändern. Sollten von den Zellen über diesen Zeitraum
konstante [Ca2+]i-Signale aufgezeichnet werden, schafft dieses die Grundlage, auf
der weitere [Ca2+]i-Messungen durchgeführt werden können.
1.2. Das Immunsystem des Darms
Das Leben von Vertebraten hängt unter anderem davon ab, dass die Homöostase
des Körpers aufrechterhalten wird [Pschyrembel, 1994]. Ein Faktor ist dabei das Blut,
das im Organismus zirkuliert und mit sämtlichen Organen und der Luft in Verbindung
steht. Die Organe entnehmen dem Blut Substanzen, die sie für ihre Funktion
benötigen und geben ihre Stoffwechselprodukte ab. Darüber hinaus wird mit dem
Blut auch Wärme transportiert und es übernimmt eine Abwehrfunktion gegen
16
Einleitung
Fremdkörper und veränderte Körperzellen durch die Leukozyten. Durchschnittlich
besitzt ein Mensch 5000 – 10000 Leukozyten/µl Blut, davon sind 20 – 40 %
Lymphozyten (B- und T-Lymphozyten) [Klinke, R. et al., 2005].
Einen weiteren wichtigen Teil des Immunsystems stellt das intestinale Immunsystem
dar, das gut-associated lymphoid tissue (GALT), dessen Oberfläche über 300 m2
groß ist. Eine der großen Leistungen dieses Systems liegt darin, zwischen schädlichen Organismen und harmlosen Antigenen, die mit dem Nahrungsbrei durch das
röhrenförmige Darmsystem geschleust werden bzw. den Bakterien der Darmflora, zu
unterscheiden [Duchmann, R. et al., 1999]. Das Unterscheiden von harmlosen
Antigenen, wie z.b. Proteinen der Nahrung oder Bakterien der Darmflora, und
pathogenen Keimen wird täglich tausendfach gefordert [Mayer, L., 1996]. Während
gegen pathogene Keime eine Immunantwort notwendig ist, kann eine Immunreaktion
gegen
nicht
pathogene
Antigene
die
Ursache
für
chronisch
entzündliche
Darmerkrankungen (CED) sein.
Der Darm wird gegenüber dem Darmlumen von einer Epithelschicht (Lamina
epithelialis mucosae) begrenzt, die durch apikale Mikrovilli, Zotten, Krypten und
makroskopische Falten stark vergrößert ist. Die Aufgaben dieser Schicht sind
insbesondere die Absorption von Nährstoffen, Elektrolyten und Wasser. Diese
Schicht der Epithelzellen wird durch eine Schleimschicht (Muzin) geschützt, wobei
der Schleim von Becherzellen sezerniert wird [Specian, R.D. et Neutra, M.R., 1982].
Unter der Epithelschicht befindet sich ein lockeres Bindegewebe (Lamina propria
mucosae), das Kapillaren, Neurone, Immunzellen und eine dünne Muskelschicht
(Lamina
muscularis
Muskelschichten
mucosae)
(Ring-
und
enthält.
Es
folgt
Längsmuskelschicht)
die
Submucosa,
und
die
zwei
äußere
Bindegewebsschicht (Serosa), die den Darm nach außen hin begrenzt.
Die Abwehrfunktion des Darmes beruht auf dem Zusammenspiel von verschiedenen
Systemen.
Zuerst
werden
von
den
Mundspeicheldrüsen
Enzyme
in
den
Nahrungsbrei abgegeben, die Krankheitserreger abtöten sollen. Hierzu gehören
Lysozym, das die Zellwände gram-positiver Bakterien hydrolysiert und die
Komplementaktivität gegen gram-negative Bakterien stimuliert und Antikörper vom
Typ Ig A. Die Ig A markieren die Zelle, dadurch wird die Immunantwort und letztlich
der Abbau eingeleitet. Sollten die Keime nicht schon vorher durch den sauren pHWert des Magensaftes abgetötet worden sein, verhindern der Schleim und die
Epithelzellen des Darms ein Eindringen in den Organismus und die Keime werden
17
Einleitung
mit dem Stuhl ausgeschieden. Die Darmflora verhindert zudem, dass sich
pathologische Keime einnisten.
Das Immunsystem des Darmes besteht aus organisiertem Lymphgewebe (z.B. Peyer
Plaques) und verteilten Immunzellen, den Lymphozyten und den Mastzellen in der
Lamina propria [Duchmann, R. et al., 1999]. Die Funktion der T-Lymphozyten in dem
mukosalen Immunsystem aufzuklären ist das Ziel vieler Arbeitsgruppen. Schon 1991
zeigten Qiao [Qiao,L. et al 1991], dass die Lamina propria T-Lymphozyten nach
Stimulation über den T-Zell-Rezeptor eine deutlich geringere Aktivierungs- und
Proliferationrate als die T-Zellen des pheripheren Blutes aufwiesen und eine
Stimulation über den CD2 Rezeptor möglich ist. Nach CD2-Stimulation produzieren
Lamina propria T-Lymphozyten mehr IL-10 (Interleukin-10) als die Blut-Lymphozyten.
[Braunstein,J. et al., 1997]. Ist die Aktivierungs- und Proliferationrate der intestinalen
T-Lymphozyten gestört, führt dies zu Darmerkrankungen.
1.3. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)
Das Immunsystem des Darmes ist vor allem durch die Krankheiten Colitis ulcerosa
und Morbus Crohn in den Mittelpunkt der Forschung gestellt worden. Unter dem
Begriff CED sind diese beiden Krankheiten zusammengefasst. Die Ursachen der
zwei verschiedenen Krankheiten sind zur Zeit noch nicht geklärt. Auf der einen Seite
gibt es deutliche Überschneidungskriterien, wie z.B. Manifestationsalter und
Symptomatik. Andererseits bestehen deutliche Unterschiede wie z.B. die Verteilung
der veränderten Darmabschnitte und das histologische Erscheinungsbild. Einige
klinische Beobachtungen und Tierversuche weisen auf den Einfluss von Bakterien
hin [Swidsinski,A. et al., 2002], aber auch genetische Faktoren und Umwelteinflüsse
scheinen die Krankheit zu beeinflussen [Targan,S.R. et al., 2005, Podolsky,M.J. et
al., 2006].
Bakterien, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und womöglich noch nicht
entdeckte Einflüsse scheinen im Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf der CED
in ein gemeinsames pathogenes Erscheinungsbild zu münden, indem sie zu einer
anhaltenden Aktivierung des Darmimmunsystems führen. Bei dieser Aktivierung
spielen die T-Zellen der Lamina propria eine entscheidende Rolle. Wie es zu dieser
anhaltenden Aktivierung kommt, gilt es jedoch noch aufzuklären. Gesteigerte
Proliferation, gestörte Apoptosis und eine fehlerhafte Regulation von Zytokinen der
18
Einleitung
T-Lymphozyten sind wichtige Faktoren der Colitis ulcerosa [Pawlowski, N.N., et al.,
2005] und der Morbus Crohn [Hara, J. et al. 1997].
Der Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran ist, wie schon vorher beschrieben,
wichtig für die T-Zell vermittelte Immunantwort. Die Messungen mit dissoziierten
Lymphozyten konnten die große Vielfalt der [Ca2+]i-Signale in den Zellen zeigen
[Lewis, R.S., 1989, Dolmetsch,R.E. et Lewis,R.S., 1994, Griesemer, D. et al., 2004].
Die Veränderung des [Ca2+]i hat einen Einfluss auf die Transkriptionsfaktoren NFAT
und NFκB, die eine unterschiedliche Affinität zu Ca2+ haben. Der NFκB-Faktor spielt
z. B. eine Schlüsselrolle bei der CED, da seine Aktivierung die Expression von proinflammatorischen Zytokinen induziert. Ein Zusammmenhang zwischen CEDPatienten und hohen NFκB-Aktivitäten konnte dadurch hergestellt werden, dass in
Entzündungsherden
hohe
Erkrankungen,
sich
die
NFκB-Aktivitäten
durch
festgestellt
Entzündungen
von
werden
konnten.
bestimmten
Geweben
gekennzeichnet sind, konnten auch durch spezifische Blockerung von NFκB
behandelt werden [Schottelius, A.J. et al., 1999]. So könnten erhöhte [Ca2+]i-Signale
in Lymphozyten aus chronisch entzündeten Darmabschnitten die vermehrte
Produktion von NFκB fördern und damit wiederum eine Verstärkung der Erkrankung
bewirken.
Ebenso konnte auch festgestellt werden, dass bei CED-Patienten durch T-ZellRezeptor-Stimulation eine überschießende Proliferationsantwort zu beobachten ist.
Die gemessenen [Ca2+]i-Signale der LPLs von CED-Patienten erreichen oft die Höhe
von [Ca2+]i-Signalen der PBLs, bei gesunden Spendern sind die gemessenen [Ca2+]iSignale der LPLs niedriger als die der PBLs. Die erhöhte T-Zell-Aktivität im Darm bei
CED ist möglicherweise eine Ursache für die Entzündung des Darms [Schwarz,A. et
al., 2004, Tutsch et al., 2004]. Dazu sollte im Rahmen dieser Arbeit eine Methode
entwickelt werden, gezielt murine Blut- und Darmlymphozyten zu isolieren, um die
[Ca2+]i zu vergleichen. Dabei sollte analysiert werden, ob sich die [Ca2+]i von
gesunden und kranken Tieren unterscheiden.
Die Faktoren, die die chronische Entzündung des Darms iniziieren, sind noch nicht
völlig identifiziert. Daher ist es wichtig für die Erforschung der Erkrankung geeignete
Tiermodelle einzusetzen, um die einzelnen Prozesse, die dann als Erkrankung des
Darms gipfeln, besser frühzeitig erkennen und bekämpfen zu können. Es wurden
viele unterschiedliche Tiermodelle in den letzten Jahren entwickelt, die aber nicht in
19
Einleitung
allen Aspekten dem Verlauf der Erkrankung der CED beim Menschen entsprechen
[Jurjus, A.R., et al., 2003]. Einige Tiermodelle, die in verschiedenen Labors etabliert
wurden, sollen bei der Aufklärung der Rolle von T-Zellen bei CED helfen [Melgar S.
et al, 2004]. Ein Modell für CED in Tieren ist das DSS (Dextran-sodium-sulfad)induzierte Kolitismodell bei der Maus. In diesem Modell wird die Kolitis bei den Tieren
über DSS-versetztes Trinkwasser induziert, das über einen bestimmten Zeitraum
verabreicht wird. Mit dieser Methode entsteht bei den Tieren eine akute Erkrankung
mit Eiterung des Darms, Gewichtsverlust und blutigem Durchfall, die den Symptomen
der CED in der akuten Phase entspricht, allerdings existiert noch kein Modell für jede
Form der chronischen Darmerkrankungen [Melgar, S. et al., 2004].
20
Einleitung
1.4. Zielsetzung der Arbeit
Die Erhöhung des [Ca2+]i ist ein zentrales Schlüsselsignal für die Aktivierung von
Lymphozyten. Mit der Methode der Fluoreszenzmessung von [Ca2+]i ist es möglich,
den Verlauf der [Ca2+]i in einer intakten Zelle über einen bestimmten Zeitraum zu
verfolgen. Durch die Möglichkeit der Identifikation der eingesetzten Zellen, können
Vergleiche zwischen den B- und T-Lymphozyten und gleichzeitig der Einfluss von
verschiedenen Substanzen auf die [Ca2+]i in den verschiedenen Zelltypen untersucht
werden.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Isolation der Lymphozyten aus dem Darm der
Maus etabliert werden. Darüber hinaus sollten verschiedene Antikörperstimulationen
und Thapsigarginexperimente bei den isolierten Lymphozyten aus verschieden
Mäusen miteinander verglichen werden. Zur Antikörperstimulation der Lymphozyten
wurden OKT3 oder eine Kombination von Anti-maus CD3e+- und Anti-maus CD28+Antikörper verwendet. Diese Antikörper stimulieren den T-Zellrezeptor und im Fall
der Anti-maus CD28+ auch den CD28 Ko-Rezeptor. Dadurch wird, wie in diesem
Kapitel beschrieben, die Kaskade in den Zellen gestartet, die zur Aktivierung des
Calcium Release-Activated Calcium-Kanals (CRAC-Kanals) und zu einer Erhöhung
des [Ca2+]i führen.
Da bei chronischen Darmerkrankungen erhöhte [Ca2+]i der humanen T-Lymphozyten
aus dem Darm gemessen wurden, ist die Frage interessant, ob die [Ca2+]i der
murinen Lymphozyten aus erkranktem Darm im Vergleich zu Lymphozyten aus
gesundem Darm auch verändert sind. Zu diesem Zweck sollten Zellen aus dem
entzündeten Darm der Maus isoliert werden, die [Ca2+]i der Lymphozyten aus dem
Darm gemessen und mit [Ca2+]i der Lymphozyten aus dem Darm von gesunden Kontrolltieren verglichen werden.
21
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1.Material
2.1.1. Chemikalien
Chemikalien
Firma / Artikelnummer
Amphotericin B 500x
(Boehringer, 14977600)
C5H12O (Amylalkohol tertiärer)
(Merck, 999.1000)
CaCl2 2H2O (Calciumchlorid-2-hydrat)
(J.T.Baker, 0504)
Cell tak Cell and Tissue Adhesive
(BD Pharmingen, 4240)
Collagenase III (CIII-22)
(Biochrom AG, M2E5586)
DMSO (Dimethylsulfoxid)
(Sigma, A-0808)
DNase I
(Roche, 1284932)
DSS (Dextran Sulfate Sodium)
(MP Biomedicales, 0216011080)
DTT (DL-Dithiothreitol)
(Sigma, D-9779)
EDTA (Ethylendiaminetetra-Acetic Acid)
(Sigma, E-9884)
EGTA (Ethylene Glycol-bis(β-AminoEthylen Ether)-N,N,N′,N′-Tetraacetic
Acid
(Sigma, E-4378)
FCS (Fetales Kälberserum)
(Gibco, 10270-106)
Ficoll-Paque Plus
(Amersham Biosciences, 17-1440-03)
Fura-2/AM (Azetoxymethylester-Derivat)
(Molecular Probes, F1221)
Gentamycin
(Biochrom, A2410)
D-(+)-Glucose-Monohydrat
(Merck, 1.08342)
Dulbecco′s PBS (1x)
(PAA Laboratories GmbH, H15-002)
Hank′s Balanced Salt Solution
(PAA Laboratories GmbH, H15-009)
Haemoccult
(Beckman Coulter GmbH, 9490)
Heparin
(Sigma, H-7523)
HEPES (4 (2-hydroxyethyl) - Säure
1-piperazineethanesulfonic)
(Sigma, H7523)
KCl (Kaliumchlorid)
(Merck, 104933)
KHCO3 (Kaliumhydrogencarbonat)
(Aldrich, 23,720-5)
β-Mercaptoethanol
(Acros, 125472500)
22
Material und Methoden
MgCl2 (Magnesiumchlorid-Hexahydrat)
(Merck, 105833)
NaCl (Natriumchlorid)
(Sigma, S9889)
NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat)
(Merck, 1.063290500)
NaOH (Natriumhydroxid)
(J.T.Baker, 0402)
NH4Cl (Amoniumchlorid)
(Sigma, A-0171)
Penicillin – Streptomycin(Pen/Strep)
(Gibco, 15140-122)
Percoll
(Amersham Biosciences, 17-0891-01)
Poly-L-Lysin Hydrobromid
(Sigma, P-6282)
Poly-L-Ornithin
(Sigma, P3655)
RPMI-1640 + L-Glutamin Medium
(Invitrogen, 21875-034)
Silikon-Fett
(Merck, 107746)
Thapsigargin
(Molecular Probes, T7459)
2,2,2 – Tribromomethanol
(Fluka, 90710)
Trypanblau
(Sigma, T8154)
2.1.2. Antikörper
FITC konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553785)
+
Anti-maus CD 19 (1D3) Antikörper
FITC konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553650)
Anti-maus CD 4+ (L3T4)(H129.19)
Antikörper
PE konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553032)
Anti-maus CD8a+ (Ly2)(53-6.7)
Antikörper
PE konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553786)
Anti-maus CD19+ (1D3) Antikörper
PE-Cy5 konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553065)
Anti-maus CD3e+ (CD3 εchain)
(145-2c11)Antikörper
PE-Cy5 konjugierter Monoclonal Hamster
(BD Pharmingen, 553654)
Anti-maus CD4+ (L3T4)(H129.19)
Antikörper
Gereinigter Anti-maus CD3e (CD3ε chain)
(145-2C11) Antikörper 0,1mg/ml
23
(BD Pharmingen, 553057)
Material und Methoden
Gereinigter Anti-maus CD28 (37,51)
(BD Pharmingen, 553294)
OKT3 (Muromonab-CD3) Antikörper
(Universitätsklinik
Homburg,
Innere
Medizin II, AG A. Stallmach)
2.1.3. Lösungen für die Präparation muriner Zellen
Avertin Stocklösung: 1,59 g Tribromomethanol / ml C5H12O
Avertin Gebrauchslösung: 600µl Stocklösung + 50 ml NaCl 0,9%
Ery-Lyse-Puffer: 0,156 mM NH4CL + 99,8 mM KHCO3 + 0,9 mM EDTA, pH 7,3
DNase-Medium: 98 ml RPMI-Medium mit Zusätzen + 2 mM HEPES-Puffer + 0,1
mg/ml DNase
DSS im Trinkwasser: Das Trinkwasser zur Induzierung der Kolitis beinhaltete 45 g/l
DSS für BALB/c Mäuse und 25 g/l DSS für C57/BL6 Mäuse
HBSS (1) – Lösung: 500 ml HBSS + 100µg/ml Pen/Strep + 25 mM HEPES
HBSS - DTT- Lösung: 500 ml HBSS + 100 µg/ml Pen/ Strep + 25 mM HEPES-Puffer
+ 2,5 ml Gentamycin +1 ml Amphotericin B 500x + 0,05 mM Mercaptoethanol + 1
mM DTT
HBSS - EDTA- Lösung: 500 ml HBSS + 100 µg/ ml Pen/Strep + 25 mM HEPESPuffer + 0,05 mg/ml Gentamycin + 0,0025mg/ml Amphotericin B 500x + 0,5 ml
Mercaptoethanol (0,05 M Stammlösung) + 12,5 ml EDTA (500 mM, pH 8)
HBSS-EDTA-DTT-Lösung: 1 Teil HBSS-EDTA-Lösung + 3 Teile HBSS-DTT-Lösung
Kollagenasemedium: 30 ml DNase-Medium + 0,167 mg/ml Collagenase III
Percoll 90%: 90 ml Percoll (Stammlösung) + 10 ml HBSS
Percoll 36%: 40 ml Percoll 90% + 60 ml HBSS
RPMI –Medium: 500 ml RPMI-Medium + 100 µg/ml Pen/Strep + 11% FCS
gepuffertes RPMI –Medium: 24 ml RPMI-Medium + 41,7 mM HEPES-Puffer (pH 7,4)
2.1.4. Lösung zum Beschichten der Deckgläser
Cell-tak-Puffer-Lösung: 20 µl Cell tak (Stammlösung) + 0,275 mM NaHCO3-Puffer
(pH 8) + 5 µM NaOH
Poly-L-Ornitin-Lösungen: 1mg/ml Poly-L-Ornitin, 0,5µg/ml Poly-L-Ornitin, 0,1mg/ml
Poly-L-Ornitin
Poly-L-Lysin Hydrobromid: 0,5 mg/ml Poly-L-Lysin Hydrobromid, 0,1 mg/ml Poly-LLysin Hydrobromid
Mikroskopische Deckgläser ∅ 12mm und ∅ 25mm, Fa.Kindler
24
Material und Methoden
2.1.5. Lösungen für Kalzium-Imaging Experimente
0 mM Ca-Lösung, pH 7,4 mit Tg: 155 mM NaCl +4,5 mM KCl +10 mM Glucose + 5
mM HEPES + 3 mM MgCl2 + 1 mM EGTA + 1µM Thapsigargin (pH 7,4 mit NaOH).
EGTA ist dieser Lösung zugesetzt, um kontaminierendes Ca abzufangen, HEPES
wurde den Lösungen zugesetzt, um den pH-Wert konstant zu halten.
0,5 mM Ca-Lösung, pH 7,4: 155 mM NaCl + 4,5 mM KCl +10 mM Glucose + 5 mM
HEPES + 2,5 MgCl2 + 0,5 mM CaCl2 (pH 7,4 mit NaOH)
1 mM Ca-Lösung, pH 7,4 mit Tg: 155 mM NaCl +4,5 mM KCl +10 mM Glucose + 5
mM HEPES +2 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 + 1µM Thapsigargin (pH 7,4 mit NaOH)
2.1.6. Lösungen mit Antikörpern zur Identifikation und zur Stimulation
der Zellen
Antikörper-Lösung zur Identifikation der Zelltypen: 28 µl RPMI-Medium + 26 µg/ml
FITC konjugierter Monoclonaler Hamster Anti-maus CD 19+ (1D3) Antikörper + 26
µg/ml PE-CY5 konjugierter Monoclonaler Hamster Anti-maus CD 4+ (L3T4)(H129.19)
Antikörper + 26 µg/ml PE konjugierter Monoclonaler Hamster Anti-maus CD8a+
(Ly2)(53-6.7) Antikörper
Antikörper-Lösung zur Stimulation der Zellen: 1 ml Ca2+–Lösung (1 mM) + 5 µg/ml
gereinigter Anti-maus CD3e+ (CD3ε chain)(145-2C11) Antikörper + 5µg/ml
gereinigter Anti-maus CD28+ (37,51) Antikörper
2.1.7. Versuchstiere
Die Balb/cAnCrl-Mäuse (17,6-23,6 g, 8-12 Wochen alt) und die C57/BL6-Mäuse
(20,0-30,6 g, 12-14 Wochen alt) wurden von der Fa. Charles River bezogen.
Die 129 B6F1-Mäuse, die 1295VJ-Mäuse, die TRPC1C4C6 (-/-)3- TRPC4C6(-/-)2und die TRPC6(-/-)-Mäuse wurden von dem Institut der Universitätsklinik Homburg,
Pharmakologie und Toxikologie, AG Freichel zur Verfügung gestellt.
2.1.8. Geräte
Heidolph Duomax 1030, Plattformschüttler
Heidolph Inkubator unimax 1010
Captair flow by erlab
Sartorius analytic Feinwaage
25
Material und Methoden
Mikroskope
Olympus CK30 (Durchlicht)
Olympus IX70 (Fluoreszenz), Objektiv 40x
Till Photonics Polychrome V
Zentrifugen, Schüttler
Eppendorf Zentrifuge 5415 C
Hettich Universal 30F, Zentrifuge
Hettich Universal 32, Zentrifuge
Vibrofix VF1 Electronic, Schüttler
2.1.9. Auswertungsprogramme
Mikrosoft Exel (Version 6.0),Statistikprogramm
Till Photonics Vision (Version 4.0), Programm zur Erfassung der Experimentdaten
Wavemetrics Igor Pro (Version 4.01, Analyse und Präsentation der Daten)
2.2. Methoden
2.2.1. Isolierung von mononuklearen murinen Zellen aus dem Blut
Die Blutentnahme bei der Maus erfolgte aus dem retrobulbären Venenplexus. Die
Versuchstiere wurden leicht mit Kohlendioxid betäubt. Anschließend wurde eine
Avertinlösung (25 µl/g Körpergewicht) durch peritoneale Injektion verabreicht, um die
Tiere zu narkotisieren. Zur Blutentnahme wurde eine heparinisierte Glaskapillare am
nasalen Augenwinkel in Richtung auf das gegenüberliegende Kiefergelenk bis zur
knöchernen Orbita eingeführt. Die Kapillare wurde geringfügig bewegt und das
austretende Blut in einem Eppendorfgefäß mit Heparin (50 µl) aufgefangen. Die
Blutmenge variierte pro Versuchstier zwischen ca. 500-800 µl. Danach wurden die
narkotisierten Versuchstiere durch Genickbruch getötet.
Das mit Heparin gemischte Blut wurde in ein 5 ml Tube überführt, 1:1 mit PBS
verdünnt und mit 1,5 ml Ficoll-Plaque unterschichtet. Bei 740 x g, mit den
Einstellungen Beschleunigung/Bremse 2 und 20 min, erfolgte bei Raumtemperatur
die Dichtegradientenzentrifugation (Hettich Universal 32R). Der Interphasenring mit
den Lymphozyten wurde abgenommen und einmal mit 5 ml HBSS gewaschen. Zur
Erythrozyten-Lyse wurde das Pellet mit 500 µl Ery-Lyse-Puffer resuspendiert. Nach 3
Minuten wurde der Vorgang durch Verdünnen der Suspension mit 2,5 ml HBSS und
26
Material und Methoden
anschließender Zentrifugation gestoppt. Das Pellet wurde in 500 µl Medium
aufgenommen und die Zellen in der Neubauerkammer gezählt. Dazu wurden die
Zellen mit Trypanblau gefärbt, um ihre Vitalität zu überprüfen. Bis zur KalziumImaging-Messung wurden die Zellen im Kühlschrank bei 10°C ca. 2 Stunden
aufbewahrt. Die Blutlymphozyten werden im Folgenden auch mit periphere Blut
Lymphozyten = PBL bezeichnet Die Blutentnahmen wurden von Anja Ludes und
Daniela Franze durchgeführt.
2.2.2. Isolierung von mononuklearen murinen Zellen aus dem Darm
Nach der Blutentnahme erfolgte die Isolierung der mononuklearen Zellen aus den
verschiedenen Darmabschnitten. Nach dem Eröffnen des Abdomens erfolgte die
Entnahme des Dünndarms, wobei der orale Schnitt unterhalb des Pylorus und der
aborale Schnitt oberhalb des Caecums erfolgte und die Resektion des Kolons, wobei
der orale Schnitt unterhalb des Caecums und der aborale Schnitt oberhalb des
Analkanals gesetzt wurde.
Abb.: 2.1. Isolierter Darm einer Balb/cAnCrl-Maus: vom Caecum (links im Bild) bis zum Kolon ohne
After.
Bis zur Reinigung der einzelnen Darmabschnitte wurden diese in HBSS getrennt
aufbewahrt. Die verschiedenen Darmresektate wurden von Bindegewebe und
27
Material und Methoden
Fettanteilen gereinigt, das Darmrohr wurde aufgeschnitten und der Darminhalt mit
einer Spritze abgespült. Das HBSS wurde erneuert und der Darm wurde in ca. 2–3
mm2 große Stücke geschnitten. Diese Darmstücke wurden dann 1 Stunde in HBSS
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Darmstücke in EDTA-DTTLösung 15 min bei 37°C mit 200 U/min (Vibrofix VF1 Electronic) geschüttelt. DTT löst
Disulfidbrücken und wurde in dieser Präparation eingesetzt, um den Schleim, der von
den Becherzellen sezerniert wird, aufzulösen. Die Kolonstücke wurden ein Mal in
HBSS gewaschen, um das DTT zu entfernen und dann in Kollagenasemedium 90
min bei 37°C bei 200 U/min geschüttelt. Das Kollagenasemedium wurde eingesetzt,
um das Gewebe des Darmes aufzulösen.
Die Dünndarmstücke wurden ein zweites Mal in der EDTA-DTT-Lösung 15 min bei
37°C mit 200 U/min geschüttelt, da sich während der Präparation herausstellte, dass
in diesem Abschnitt mehr Schleim von der Darmschicht zu entfernen war. Die
Dünndarmstücke wurden solange mit HBSS gewaschen bis der Überstand klar blieb.
Im Anschluss daran erfolgte die Inkubation in Kollagenasemedium (60 min, 37°C und
200 U/min). Nach der Inkubation in Kollagenasemedium wurden die DarmKollagenase-Suspensionen in eine Perfusorspritze hineingesaugt und wieder
herausgedrückt. Durch die Scherkräfte wurden der restliche Schleim und die
Epithelzellen von der Mucosa abgelöst. Dieser Prozess wird im Folgenden mit
gepurged bezeichnet („to purge“ bedeutet reinigen). Nachdem sich die Darmstücke
wieder abgesetzt hatten, wurde der Überstand bei 240 x g für 7 min bei
Raumtemperatur zentrifugiert (Hettich, Universal 30F). Das Pellet wurde in 11 ml
DNase-Medium resuspendiert und für 7 min bei Raumtemperatur bei 240 x g
zentrifugiert (Hettich Universal 30F). Dieses Pellet wurde wieder in 11 ml DNaseMedium resuspendiert und zweimal gefiltert (100 µm und 70 µm Filter). Gleichzeitig
wurde auf die Darmstücke 11 ml DNase-Medium gegeben und 30 min bei 37°C und
200 U/min inkubiert (Vibrofix VF1 Electronic). Die Suspension wurde gepurged und
der Überstand bei Raumtemperatur bei 240 x g zentrifugiert (Hettich Universal 30F).
Das Pellet wurde in 11 ml DNase-Medium resuspendiert und zweimal gefiltert (100
µm und 70 µm Filter). Anschließend wurden die Suspensionen der identischen
Darmstücke zusammen geführt und für 7 min bei Raumtemperatur bei 240 x g
pelletiert (Hettich Universal 30F). Das Pellet wurde in 5 ml 36% Percoll resuspendiert
und mit 5 ml 90 % Percoll unterschichtet. Die Dichtegradientenzentrifugation erfolgte
28
Material und Methoden
bei 580 x g bei Raumtemperatur ohne Bremsvorgang (Hettich Universal 32 R). Der
Ring zwischen den Phasen 36% und 90% Percoll wurde abgenommen, in ein neues
Falcon überführt und mit gepuffertem RPMI-Medium auf 4 ml aufgefüllt und
anschließend für 7 min bei Raumtemperatur bei 240 x g zentrifugiert (Hettich
Universal 30F). Das Pellet wurde in gepuffertem RPMI-Medium ein Mal gewaschen.
Die Zellen wurden in RPMI-Medium über Nacht bei 10° C aufbewahrt. Die
Zellzählung erfolgte in einer Neubauerkammer mit Trypanblaufärbung. Die
Lymphozyten, die aus diesem Gewebe isoliert wurden, werden als LPL (Lamina
Propria Lymphozyten) bezeichnet.
2.2.3. Induzierung der Kolitis bei Mäusen
Bei Balb/cAnCrl-Mäusen und C57/BL6-Mäusen kann eine Entzündung des Darmes
induziert werden, wenn über 7 bis 9 Tagen DSS (Dextran Sulfate Sodium) im
Trinkwasser verabreicht wird. Diese Methode ist ein im Labor etabliertes Modell.
Abb.2.2 Isolierter Darm einer an Kolitis erkrankten Maus. Der isolierte Darm, vom Caecum bis
zum Kolon ist bei den durchgeführten Experimenten kürzer als der einer gesunden Maus (vergleiche
Abb.2.1)
29
Material und Methoden
Die Tiere wurden über 7 bzw. 9 Tage mit DSS versetztem Trinkwasser behandelt,
das Gewicht der Tiere täglich notiert und ab dem 5.Tag wurde ein Haemocculttest
durchgeführt, der Blut im Darm durch eine Blaufärbung des Kots aufzeigt. Die Kolitis
bei C57/BL6 Mäusen war am 7. Tag voll ausgeprägt, bei Balb/cAnCrl-Mäusen erst
nach 9 Tagen. Nachdem der Haemocculttest positiv getestet war, wurden bei den
erkrankten Tieren, wie zuvor beschrieben, das Blut und der Darm entnommen und
die Lymphozyten daraus isoliert.
2.2.4. Kalzium Imaging- Experimente
Die Messung der freien zytosolischen Kalziumkonzentration [Ca2+]i in lebenden
Zellen
ist
möglich
durch
die
Verwendung
von
Indikatorfarbstoffen.
Diese
Kalziumindikatoren, z.B. Fura-2/AM, wurden in den 80iger Jahren von Tsien und
Mitarbeitern entwickelt [Grynkiewicz, G. et al., 1985]. Diese Farbstoffe besitzen
negative Ladungen, an die das Kalzium binden kann. Die Bindung eines Liganden an
diese Moleküle verändert die optische Eigenschaft der Farbstoffe. Bindet Kalzium an
Fura-2, so ändert sich vor allem das Anregungsspektrum. Gemessen wurde bei 340
nm und 380 nm, da sich die Exitationseigenschaften bei den beiden Wellenlänge 340
nm und 380nm bei Kalziumbindung unterschiedlich ändern.
Die optischen Eigenschaften dieser Farbstoffe ermöglichen es, eine Ratio-Messung
von Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen durchzuführen. Verwendet man
Fura-2/AM, werden die Emissionsintensitäten bei einer Emissionswellenlänge nach
Anregung des Fura-2-Moleküls mit zwei unterschiedlichen Anregungswellenlängen
gemessen und zueinander ins Verhältnis (Ratio) gesetzt. Bei Fura-2 werden am
besten Wellenlängen gewählt, bei denen sich die Emissionsintensitäten abhängig
von der Kalziumkonzentration gegensätzlich verhalten. In den Experimenten für
diese Arbeit wurden als Anregungswellenlängen die Anregungsmaxima 340 nm und
380 nm gewählt. Das Ratio 340 nm/380 nm ist in diesem Fall ein gutes Maß für
[Ca2+]i und wurde durchgängig verwendet. Für Ratios zwischen 0.3 und 1.5 haben
wir in der Vergangenheit eine nahezu lineare Korrelation mit [Ca2+]i gefunden. In der
vorliegenden Arbeit wurden alle Ratios mit 1000 multipliziert.
Die Berechnung der Kalziumkonzentration kann mit der Gleichung [Grynkiewicz, G.
et al., 1985] aus den Ratiowerten erfolgen:
[Ca2+] = Kd Q (R-Rmin) / (Rmax-R)
30
Material und Methoden
Erläuterung der Abkürzungen:
R entspricht dem Fluoreszenzintensitätsratio (Fλ1/ Fλ2), mit λ1 = 340 nm und λ2 = 380
nm, gemessen zum jeweiligen Zeitpunkt des Experimentes, Rmin entspricht dem
Ratio des vollständig kalziumfreien Indikators, Rmax dem Ratio der kalziumgesättigten
Form des Farbstoffes. Kd ist die effektive Dissoziationskonstante des Indikators. Q
ergibt sich aus dem Ratio Fmin/Fmax gemessen bei λ2, wobei Fmin, die
Fluoreszenzintensität
unter
kalziumfreien
Bedingungen
und
Fmax,
die
Fluoreszenzintensität unter kalziumgesättigten Bedingungen ist.
Verwendet wurden in den Experimenten Fura-2/AM. Dieser Farbstoff ist ein
Azetoxymethylester-Derivat, d.h. durch eine Modifikation der Carbonsäuregruppe
des Farbstoffes mit den Azetoxymethylester-Gruppen entstehen ungeladene,
lipophile Moleküle, die über die Plasmamembran der Zelle gelangen können. Im
Zytosol werden die Azetoxymethylester durch unspezifische Esterasen vom
Farbstoffmolekül abgespalten. Dadurch werden die Carboxylatgruppen wieder frei,
so dass Kalzium an den Farbstoff binden kann. Aufgrund Polarität des Moleküls kann
der Farbstoff auch nicht so schnell aus der Zelle heraus diffundieren.
2+
Abb.2.3. Fluoreszenzspektren der Exzitation und der Emission von Ca -gesättigtem (A) und
2+
Ca -freiem (B) Fura-2 (pH7.2)
Für die Bestimmung der einzelnen Werte sind Kalibrationsexperimente mit dem
Farbstoff und geeigneten Zellen durchzuführen. Der Vorteil der ratiometrischen
31
Material und Methoden
Messung von [Ca2+]i liegt darin, dass Faktoren wie z.b. die Verteilung des Farbstoffes
in den Zellen oder das Photobleaching als Einfluss auf die Messergebnisse minimiert
werden, da diese Faktoren Zähler und Nenner des Ratios in gleicher Weise
beeinflussen.
2.2.4.1. Beschichtung der Deckgläser
Die Deckgläser wurden mit Ethanol (70%) gereinigt, danach wurden 12 µl Cell-takPuffer-Lösung auf die Deckgläser aufgetragen. Nach 30 min Inkubationszeit wurde
die Cell-tak-Puffer-Lösung abgesaugt und die Deckgläser mit H2Odest abgespült. Die
beschichteten Deckgläser wurden im Kühlschrank bis zur Messung der Zellen
aufbewahrt.
Ebenso wurden die gereinigten Deckgläser mit zwei weiteren Lösungen beschichtet.
Dazu wurden 18 µl Poly-L-Ornithin der verschiedenen Konzentrationen 1 µg/ml, 0,5
µg/ml, 0,1 µg/ml und 18 µl Poly-L-Lysin Hydrobromid der Konzentrationen 0,5 µg/ml
und 0,1 µg/ml gewählt.
2.2.4.2. Der Messplatz
Der Messplatz, mit dem die Kalzium-imaging Experimente durchgeführt wurden, ist
ausgestattet mit einem Till Photonics Polychrome V, einem Olympus IX70
(Fluoreszenz)- Mikroskop, in das die Sandwichkammer eingebaut werden kann.
Die, wie zuvor beschrieben, isolierten Zellen wurden bei Raumtemperatur 30 min in
RPMI-Medium mit 2 µg Fura-2/AM (gelöst in DMSO, 1 mM) lichtgeschützt inkubiert.
Danach wurden die Zellen in gepuffertem RPMI-Medium gewaschen und in 12 µl
gepuffertem RPMI-Medium resuspendiert. In dieser Form wurden die Zellen auf ein
Cell-tak beschichtetes Deckglas aufgetragen. Nach einer Ruhezeit von 25 min wurde
die Sandwichkammer zusammengebaut. Dazu wurde eine Plexiglasvorrichtung, die
über einen Zulauf und einen Ablauf verfügt, mit Silikon auf das Deckglas geklebt.
Anschließend wurde ein kleineres Deckglas auf die Decke der Plexiglaskammer
geklebt, so dass ein geschlossener Raum entstand. Die Kammer ist so konstruiert,
dass ein Austausch der Flüssigkeit in der Kammer möglich ist, ohne dass die
Flüssigkeit über den Zellen abgesaugt wird. In den Versuchen wurden die neuen
Lösungen mit einer Spritze in die Kammer gespült, so dass die Flüssigkeit in der
Kammer verdrängt und durch eine Pumpe abgesaugt werden konnte.
32
Material und Methoden
Die Zellen wurden während des Versuches abwechselnd mit 340nm und 380nm
angeregt. Die Emissionsfluoreszenz > 440nm wurde über eine CCD Kamera (Till
imago) über die gesamte Versuchslänge alle 5 Sekunden mit der Till Vision Software
aufgezeichnet und nach dem Versuch mit der Wavematrics Igor Pro Software
analysiert.
2.2.4.3. Kontrollversuch ohne Applikation von Substanzen
Um sicher zu stellen, dass die Zellen nicht auf die Scherkräfte der Lösungswechsel
oder auf die Versuchsbedingungen wie etwa die Bestrahlung mit Licht reagieren,
wurden Kontrollversuche durchgeführt. Dazu wurden die Zellen in die Kammer
eingebracht, wie zuvor beschrieben. Anschließend wurde mit 1 mM Ca2+-Lösung die
nicht adherenten Zellen aus dem gewählten Messbereich gespült. Der so
vorbereitete Versuch wurde gestartet und nach 100 Sekunden wurde mit 1 mM Ca2+Lösung durch die Kammer gespült. Die Emissionsfluoreszenz wurde über 2000
Sekunden aufgezeichnet.
Um eine Beeinflussung der Kalziumsignale während der Experimente zu vermeiden,
wurde erst im Anschluss an die Kalziummessung eine Identifikation der Zellen
durchgeführt. Dazu wurden Antikörper, die einen fluoreszierenden Farbstoff tragen
und gegen Oberflächenmarker der verschiedenen Zelltypen gerichtet sind, benutzt.
40µl RPMI-Medium mit 3 verschiedenen Antikörpern (je 5 µg/µl) wurde in die
Kammer gespült und nach 15 Minuten Inkubationszeit mit 0,5 mM Ca2+-Lösung
wieder ausgewaschen. Danach wurden mit HQ-Standartfiltersets (AHF) bei 460 nm,
540 nm und 640 nm die Zellen identifiziert, indem an der exakt gleichen Stelle des
Messbereiches Bilder der Zellen bei verschiedenen Wellenlängen aufgezeichnet
wurden.
2.2.4.4. Experimente mit Thapsigarginlösungen
Um eine passive Entleerung der Kalziumspeicher zu induzieren, wurden Versuche
mit Thapsigargin durchgeführt. Thapsigargin hemmt die SERCA-Pumpen (Sarcoendoplasmic reticulum Calcium ATPases) des endoplasmatischen Retikulums. Aus
dem endoplasmatischen Reticulum entweicht permanent Kalzium in das Zytosol,
welches entweder über SERCA ins ER zurückgepumpt wird oder über PMCA in den
Extrazellulärraum gepumpt wird (T-Zellen verfügen über keinen funktionellen Na+-
33
Material und Methoden
Ca2+-Antiporter). Wird nun die SERCA-Pumpe durch Thapsigargin gehemmt, führt
diese Blockade zu einer passiven Entleerung der Kalziumspeicher.
In unserem Versuchsaufbau wurde die Kammer mit 0,5 mM Ca2+-Lösung gespült, so
dass nicht haftende Zellen weggewaschen wurden und die verbleibenden Zellen auf
ihre Haftung überprüft werden konnten. Danach wurde der Versuch gestartet. In den
ersten 99 Sekunden wurden die [Ca2+]i- Signale aufgezeichnet, die das Ruhekalzium
in den Zellen vor der Stimulation angeben. 100 Sekunden nach Versuchsbeginn
wurde 0 mM Ca2+- Lösung mit EGTA/1µM Thapsigargin durch die Kammer gespült.
Durch die Zugabe dieser Lösung zu den Lymphozyten kommt es zu einer transienten
Erhöhung von [Ca2+]i und zur Entleerung der ER-Kalziumspeicher. [Ca2+]i sinkt nach
wenigen Minuten auf ein Minimum ab. 700 Sekunden nach dem Start des
Experiments wurde 1 mM Ca2+-Lösung/1µM Thapsigargin zu den Zellen gegeben. Es
folgte ein steiler Anstieg von [Ca2+]i in der Zelle, der sich schließlich einem
Plateauwert annäherte. Nach 1200 Sekunden wurde wieder 0 mM Ca2+-Lösung mit
EGTA/1µM Thapsigargin in die Kammer gespült, was wiederum zu einem starken
Abfall von [Ca2+]i führte. Nach Abschluss der Messung wurde wie zuvor beschrieben,
eine Identifikation der Zellen durchgeführt.
2.2.4.5. Experimente mit Antikörperstimulation
In diesen Experimenten wurden die Zellen wie zuvor beschrieben mit Fura2/AM
beladen und in die Kammer eingebracht. Danach wurde die Haftung der Zellen auf
dem Deckglas mit 1 mM Ca2+-Lösung überprüft. Um eine physiologischere
Stimulation der Zellen zu erreichen, wurden in diesen Experimenten 100 Sekunden
nach Versuchstart 1 mM Ca2+-Lösung mit je 5 µl Anti-maus CD3e+ Antikörper und
Anti-maus CD28+ Antikörper in die Kammer gespült und [Ca2+]i gemessen. Die
beiden Antikörper stimulieren sowohl den T-Zellrezeptor als auch den CD28 KoRezeptor, was eine optimale T-Zellstimulation ermöglicht. Nach Ende des Versuches
wurden die Zellen wie zuvor beschrieben identifiziert.
Ebenso wurden einige Versuche mit Muromonab-CD3 (OKT3) durchgeführt, einem
klassischen Antikörper gegen den humanen T-Zellrezeptor (der erste zugelassene
monoklonale Antikörper war OKT3). OKT3 bindet spezifisch an die ε-Kette des CD3Moleküls, das auf allen reifen T-Zellen exprimiert wird und für die Signaltransduktion
des T-Zell-Rezeptors verantwortlich ist. OKT3 ist ein monoklonaler, gentechnisch
34
Material und Methoden
hergestellter Maus-Antikörper, der im Gegensatz zu den polyklonalen Antikörpern,
nur von einem Zellklon produziert wird (NOVARTIS Pharma. de, 2006).
Bei diesen Versuchen wurden die Zellen wie zuvor beschrieben in die Kammer
eingebaut. Um den Messbereich für die Messung vorzubereiten, wurde mit 1 mM
Ca2+-Lösung durch die Kammer gespült und auf diese Art die nicht haftenden Zellen
weggespült. 250 Sekunden nach dem Start wurde 750 µl 1 mM Ca2+-Lösung mit 1 µg
OKT3 zu den Zellen gegeben. Nach 2000 Sekunden, am Ende des Experimentes,
wurden die Zellen wie zuvor beschrieben identifiziert.
35
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1.Optimierung der Zellpräparation
Ein Ziel dieser Arbeit war die Messung der freien zytosolischen Kalziumkonzentration
[Ca2+]i von Lymphozyten aus dem Blut und dem Darm der Maus. Zunächst musste
die Präparationsmethode an die Zielsetzung der Arbeit angepasst und optimiert
werden. Es wurden die im vorherigen Kapitel beschriebenen Methoden verwendet,
um Lymphozyten aus dem Blut mit Hilfe der Gradientenzentrifugation zu isolieren.
Andererseits mussten, um die Lymphozyten des Darmes zu isolieren, Gewebe
aufgelöst und die gewünschten Zellen aus den Präparationslösungen herausgefiltert
werden. Diese Arbeitsschritte bedeuten für die Zellen, dass sie aus ihrer natürlichen
Umgebung herausgelöst werden müssen, um zur Messung von [Ca2+]i in die
Experimentkammer eingebracht werden zu können.
Die Optimierung der Methode gliederte sich in zwei Schritte, die einerseits eine
höhere Ausbeute an nicht voraktivierten Zellen umfasst und andererseits eine
verbesserte Haftung der Lymphozyten auf den Deckgläsern beinhaltete. Hinsichtlich
der Verwendung der Zellen für [Ca2+]i Experimente sind 2 Faktoren entscheident:
Adherenz und nicht voraktivierte Zellen
In den ersten Versuchen zur Optimierung der Zellpräparation sollte getestet werden,
wie hoch der Ruhekalziumwert der Zellen nach der Präparation war. Dazu wurden
Zellen aus Balb/cAnCrl-Mäusen isoliert, mit Fura2/AM beladen und in die
Messkammer eingebracht. Es zeigte sich, dass sich bei älteren Tiere mehr Fett um
den Darm bildet, was die Präparation der Lymphozyten erschwert. Außerdem trat bei
Tieren, die älter als 13 Wochen waren, mehr Schleim bei der Präparation auf, was
dazu führte, dass die Zellen schlecht mit Fura2/AM zu beladen waren und nicht mehr
auf den Deckgläsern hafteten. Tiere von 8 bis 12 Wochen waren zur Isolation der
Zellen optimal, da um den Darm herum fast kein Fett ausgebildet war. Bei diesen
Tieren konnte auch der Schleim, der von den Becherzellen in das Darmlumen
abgegeben wird, durch mehrmaliges Waschen der isolierten Darmstückchen mit
HBSS entfernt werden, so dass die Zellen gut mit Fura2/AM beladen werden
konnten.
Die Blutzellen konnten schon 2 Stunden nach der Isolation zu Versuchen verwendet
werden, da bei Experimentstart kein erhöhtes [Ca2+]i gemessen wurde, im Vergleich
36
Ergebnisse
zu späteren Messungen, so dass die Zellen durch die Präparation nicht voraktiviert
waren. Im Gegensatz dazu zeigten die Zellen aus dem Darm nach 2 Stunden
Ruhezeit im Kühlschrank ein sehr hohes [Ca2+]i von 700 bis 1100 a.u. (arbitrary
units). Die hohe [Ca2+]i unter Ruhebedingungen ist wahrscheinlich auf den Stress der
Zellen während der Präparation zurückzuführen. Bei den menschlichen LPL wurden
von der Arbeitsgruppe in vorher durchgeführten Experimenten keine so hohen
Ruhekalziumkonzentrationen, auch direkt nach der Präparation, gefunden [Schwarz
et al., 2004, Tutsch et al. 2004] Um dieses hohe zytosolische [Ca2+]i zu senken,
wurden die Zellen in verschiedenen Experimenten im Brutschrank von 2 bis zu 14
Stunden aufbewahrt (Daten nicht gezeigt). Diese verschiedenen Ruhezeiten führten
allerdings nicht zu einer Senkung des hohen Kalziumniveaus, erst eine Ruhezeit
über Nacht im Kühlschrank lies die intrazelluläre Kalziumkonzentration auf einen
Ratiowert (340 nm/380 nm) zwischen 300-400 a.u. absinken, was etwa einem [Ca2+]i
von 50-100 nm an diesem Messplatz entspricht. In allen folgenden Versuchen
wurden die Ratiowerte 340 nm/380 nm als Maß für [Ca2+]i benutzt, da diese
proportional zu [Ca2+]i sind. Wenn im folgenden von [Ca2+]I gesprochen wird, ist
strenggenommen der Ratiowert 340 nm/380 nm gemeint.
Bei
den
Balb/cAnCrl-Mäusen
von
8-12
Wochen
wurden
Versuchsreihen
durchgeführt, um herauszufinden, auf welchen Deckgläsern, die unterschiedlich
beschichtet wurden, die meisten Zellen haften. Dazu wurden parallel Zellen aus einer
Präparation auf Deckgläser, die entweder mit Poly-L-ornitin, Poly-L-Lysin oder Cell
tak beschichtet waren, gemessen. Zunächst wurden die Messungen auf Deckgläsern
durchgeführt, die mit Polyornithin (0,5 mg/ml) beschichtet waren. Die Abb. 3.1. zeigt
das Ergebnis der ersten 40 Versuche der Darmlymphozyten (schwarze Kurve) und
zum Vergleich eine Zelle aus einem späteren Experiment (rote Kurve). Die Zellen
hafteten sehr schlecht auf dem Polyornithin, so dass aus 40 Versuchen nur 66 CD3+Lymphozyten gemessen werden konnten (schwarze Kurve). Die Zellen aus diesen
ersten Experimenten zeigen ebenfalls ein immer noch relativ hohes Ruhekalzium im
Vergleich zu den Ergebnissen der späteren Experimente, bei denen verschiedene
Schritte
der
Präparation
nach
und
nach
Beschichtungen, siehe unten).
37
optimiert
wurden
(u.a.
andere
Ergebnisse
3000
2+
0,5nm Ca
2+
Tg in 1 nm Ca
2+
Tg in 0 nm Ca
2+
+
2500
Ratio 340/380
Tg in 0 nm Ca
LPL_CD3
Ø von 66 Zellen
1Zelle
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
+
Abb. 3.1. Experimente mit Thapsigargin. Schwarze Kurve: Durchschnitt (∅) von 66 CD3 positiven
Lymphozyten mit Standartabweichung aus dem Kolon der Balb/cAnCrl-Maus. Thapsigargin in 0 mM
2+
2+
Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung, 40 Versuche, Deckgläser mit Polyornitin
+
beschichtet. Dazu im Vergleich eine CD8 -Zelle aus einer späteren Messung (rote Kurve).
Um mehr Zellen auf dem Deckglas zu fixieren, wurden andere Beschichtungen
gewählt. Der Versuch mit Poly-L-Lysin (0,5 mg/ml) brachte keinen Erfolg, da noch
weniger Zellen nach dem Spülen auf dem Deckglas hafteten als mit Polyornithin. Die
Beschichtung mit Cell-tak (0,061 mg/ml) zeigte, dass die beste Haftung der Zellen
aus Balb/cAnCrl-Mäusen auf Cell tak zu erreichen war, deshalb wurden für die
weiteren Versuche die Beschichtung der Deckgläser mit Cell tak gewählt.
Im Anschluss an die [Ca2+]i-Messung wurden die T- und B-Lymphozyten identifiziert.
Dazu wurden CD19+-, CD4+- und CD8+-Antikörper verwendet, um B-Lymphozyten
und verschiedene T-Lymphozyten zu identifizieren. An der oben gezeigten CD8+Zelle (Abb.3.1, rote Kurve) wird im folgenden das Thapsigarginexperiment erklärt.
Die Lymphozyten wurden mit Fura2/AM beladen und auf einem Deckglas in die
Versuchskammer eingebracht. Vor Beginn des Experimentes wurden die nicht
haftenden Zellen mit 0,5 mM Ca2+-Lösung weggespült und in dieser Lösung wurde
über die ersten 99 Sekunden die Ruhekalziumkonzentration der Zellen bestimmt. Die
Stimulation der Zellen erfolgte 100 Sekunden nach dem Start durch die Zugabe von
0 mM Ca2+-Lösung mit EGTA + 1µM Thapsigargin. Thapsigargin blockiert die
SERCA-Pumpen, die Ca2+ aus dem Zytosol in das Endoplasmatische Retikulum
pumpen, wodurch es zu einer passiven Entleerung der Ca2+-Speicher kommt. Durch
38
Ergebnisse
diese Entleerung werden die CRAC-Kanäle aktiviert. Der Ca2+-Ausstrom aus dem
Endoplasmatischen Retikulum (ER) zeigt sich in einer kleinen Erhöhung der
Emissionskurve (nach 100 Sekunden). Dieses Ca2+ wird von Pumpen aus der Zelle
gepumpt, was sich dadurch zeigt, dass die Kurve danach wieder langsam zum
Ruhekalziumwert absinkt. 700 Sekunden nach Versuchsbeginn erfolgt die Erhöhung
des extrazellulären Kalziums auf 1 mM durch Zugabe 1 mM Ca2+-Lösung + 1 µM
Thapsigargin. Es kommt zu einem steilen Anstieg der Kurve durch den Ca2+ Einstrom
durch die CRAC Kanäle. Nach Erreichen eines Peaks erfolgt die langsame Abnahme
von [Ca2+]i bis zu einem Plateau, was das Ergebnis eines Fließgleichgewichts
zwischen Ca2+ Ein- und Ausstrom darstellt. Nach 1200 Sekunden, ausgehend von
Start des Experimentes, wurde wieder die 0 mM Ca2+-Lösung mit EGTA + 1 µM
Thapsigargin in die Kammer gespült, was eine Senkung der Kalziumkonzentration im
Zytosol nach sich zog.
A
B
C
D
Abb. 3.2. Bilder zur Identifikation der Zellen, A: 360 nm alle Zellen des Versuches, die mit
+
+
Fura2/AM beladen sind, B: 460 nm alle CD19 -Zellen, C: 640 nm alle CD4 -Zellen, D: 540 nm alle
+
CD8 -Zellen.
Der Zeitraum zwischen Erhöhung des [Ca2+]a und dem Wechsel zu kalziumfreier
extrazellulärer Lösung reicht aus, damit sich [Ca2+]i auf ein fast gleichbleibendes
39
Ergebnisse
Plateau einstellt, dessen Endwert statistisch analysiert wurde. Mit diesem Protokoll
wurden
alle
Thapsigarginexperimente
mit
den
verschiedenen
Lymphozyten
durchgeführt.
Um die Messergebnisse nicht zu beeinflussen wurden die Zellen erst nach Ende der
Datenaufzeichnung mit Antikörpern, die gegen spezifische Oberflächenantigene
gerichtet sind, identifiziert. Dazu wurden 40 µl Medium mit verschiedenen
Antikörperlösungen, wie im Kap. Material und Methoden beschrieben, in die
Messkammer gespült. Nach einer Inkubationszeit von 15 min wurden die nicht
gebundenen Antikörper aus der Kammer mit 0,5 mM Ca2+-Lösung ausgewaschen
und die Zellen mit Hilfe von HQ-Standartfiltersets (AHF) bei 470, 540 und 640 nm
identifiziert (siehe Abb. 3.2).
3.2. Kontrollversuche, um den Einfluss äußerer Faktoren auf die
[Ca2+]i der Lymphozyten zu testen
Um den Einfluss der Faktoren, wie z.B. Belichtung mit UV-Licht oder Scherkräfte
beim Lösungswechsel, auf die Zellen zu testen, wurden bei den Blut- und Darmzellen
Kontrollversuche gemacht. Dazu wurden die Zellen wie vorher beschrieben mit
Fura2/AM beladen und in die Experimentkammer eingebracht. Danach wurden die
nicht haftenden Zellen mit 1 mM Ca2+-Lösung weggespült. 100 Sekunden nach
Versuchsstart wurde 1 mM Ca2+-Lösung ohne weitere Substanzen durch die
Kammer durchgespült und die Emissionsintensitäten über 2000 Sekunden
aufgezeichnet (Abb. 3.3., 3.4.). Nach Versuchsende wurden die Zellen, wie zuvor
beschrieben, identifiziert.
Die Abbildung 3.3. zeigt den Kontrollversuch mit Darmlymphozyten, indem nur mit
1 mM Ca2+-Lösung die Kammer durchgespült wurde. Die Abbildung zeigt deutlich,
dass die Zellen nicht mechanisch durch die Perfussion der Lösung durch die
Messkammer und auch nicht unspezifisch durch z.B. Licht über einen Zeitraum von
2000 Sekunden aktiviert wurden.
Die nachfolgende Abbildung 3.4. mit den isolierten Blutzellen zeigt den gleichen
Kontrollversuch wie Abbildung 3.3. mit isolierten Darmzellen. Die CD19+Blutlymphozyten reagieren zu 54% und die CD3+-Blutlymphozyten zu 0,1% mit einer
leichten Oszillation des [Ca2+]i, die deutlich schwächer ist als die [Ca2+]i-Signale in
den später durchgeführten Thapsigarginexperimenten.
40
Ergebnisse
Ratio 340/380
2000
LPL
CD3+, Ø von 15 Zellen
CD19+, Ø von 52 Zellen
1500
1000
1mM Ca2+ .500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
2+
Abb.3.3. Kontrollversuch mit 1 mM Ca -Lösung. Mononukleare Darmzellen der Balb/cAnCrl-Maus
2+
Experiment in 1mM Ca -Lösung mit Zellen von der Balb/cAnCrl-Maus, LPL = Lymphozyten aus der
Lamina Propria, ∅ = Durchschnitt der [Ca ]I der Zellen, die beiden Kurven zeigen keine Reaktion auf
2+
den Lösungswechsel in der Kammer nach 100 sec, Ratio 340/380 = Ratio 340 nm/380nm,
2000
PBL
+
CD3 _R,Ø 7Zellen
+
CD19 _R, Ø 95 Zellen
+
CD19 _k R,Ø 77 Zellen
+
CD3 _k R,Ø 66 Zellen
Ratio 340/380
1500
1000
1mM Ca2+ .500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
2+
Abb.3.4. Kontrollversuch mit 1 mM Ca -Lösung. Mononuklearen Blutzellen der Balb/cAnCrl-Maus,
Experiment in 1mM Ca -Lösung, PBL = periphere Blutlymphozyten, ∅= Durchschnitt der [Ca ]I der
2+
2+
Zellen, kR = keine Reaktion, R = Reaktion auf den Lösungswechsel in der Kammer nach 100 sec,
Ratio 340/380 = Ratio 340 nm/380nm
41
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Optimierung sowie die Kontrollversuche ohne Stimulation durch
zugegebene Substanzen (Abb.3.3, 3.4.) schafften die Grundlage, [Ca2+]i in LPLs und
PBLs miteinander zu vergleichen. Es zeigt sich, dass die Zellen nicht (bzw. wenn,
dann nur sehr schwach, wie teilweise die PBL) durch den Lösungsmittelwechsel, der
bei den Versuchen notwendig ist, aktiviert werden. Fast alle Zellen bleiben auch über
den Zeitraum von 2000 Sekunden ruhig, so dass sichergestellt wurde, dass die
Versuche innerhalb dieser Zeit durchgeführt werden konnten.
Die isolierten Lymphozyten aus dem Kolon hafteten besser auf den Deckgläsern als
die Lymphozyten aus dem Dünndarm, deshalb wurden für die folgenden Versuche
nur noch die Lymphozyten aus dem Kolon verwendet.
Auf dieser Grundlage sind die Vergleiche zwischen Zellen aus verschiedenen
Mausstämmen in den Experimenten mit Thapsigargin und mit physiologischen
Stimulationen in den folgenden Abbildungen dargestellt. Dazu wurden Zellen aus
verschiedenen Mausstämmen isoliert und mit Thapsigargin oder mit Antikörpern
stimuliert.
3.3. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von
Balb/cAnCrl- Mäusen nach Zugabe von unterschiedlichen Ca2+Lösungen mit Thapsigargin
Die folgenden Abbildungen zeigen die Experimente mit Balb/cAnCrl- Mauszellen aus
Blut und Darm, die mit unterschiedlichen Ca2+-Lösungen, die Thapsigargin enthalten,
durchgeführt wurden. In den ersten Abbildungen sind die Ergebnisse von
Thapsigarginexperimenten dargestellt, die an den beiden uns zur Verfügung
stehenden Messplätzen aufgezeichnet wurden. Die Zellen wurden wie zuvor im
Kapitel Material und Methoden beschreiben, isoliert. Anschließend wurden die Zellen
mit Fura2/AM beladen und in die Messkammer eingebracht.
Die gemessenen Zellen zeigten an den beiden verschiedenen Messplätzen ein
gleiches Verhalten, die CD3+-Zellen aus Blut und Darm liegen im Plateauwert über
den Daten der CD19+-Zellen. Die Signale im Plateaubereich am Messplatz 2 sind
etwas höher im Vergleich zum Messplatz 1, was durch die unterschiedliche
technische Ausstattung des Messplatzes zu erklären ist.
42
Ergebnisse
3000
0,5 Ca
Tg in 0 nm Ca
2+
2+
Tg in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
2+
+
2500
Ratio 340/380
2+
PBL_CD3 ,Ø 582 Zellen
+
LPL_CD3 , Ø 158 Zellen
+
PBL_CD19 , Ø 959 Zellen
+
LPL_CD19 , Ø 220 Zellen
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
+
+
Abb. 3.5. Vergleich von CD3 - und CD19 -Zellen aus Blut und Darm von Balb/cAnCrl-Mäusen,
2+
aufgenommen am Messplatz 1 mit Thapsigargin in kalziumfreier Lösung und in 1 mM Ca -Lösung,
PBL-Daten aus 5 Versuchen, LPL-Daten aus 2 Versuchen, Ratio 340/380 = Ratio 340 nm/380nm, Ø =
Durchschnitt von den in der Kurve zusammengefaßten Zellen.
Netto Ratio 340/380 Messplatz 1
2000
PBL_CD3
LPL_CD3
PBL_CD19
LPL_CD19
Ratio 340/380
1500
1000
500
0
Zelltypen
**
*
2+
Abb. 3.6. Statistische Auswertung Messplatz 1, Vergleich der netto [Ca ]i-Erhöhung (Plateau+
+
Ruhezustand) mit Standartabweichung für CD3 und CD19 -Zellen.
43
Ergebnisse
3000
2+
2500
2+
2+
T g in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
+
PBL_CD3 ,Ø 326 Zellen
+
LPL_CD3 ,Ø 31 Zellen
+
PBL_CD19 ,Ø 326 Zellen
+
LPL_CD19 , Ø 120 Zellen
2000
Ratio 340/380
2+
TG in 0 nm Ca
0,5nm Ca
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
+
+
Abb. 3.7. Vergleich von CD3 - und CD19 -Zellen aus Blut und Darm von Balb/cAnCrl - Mäusen,
2+
gemessen an Messplatz 2, Thapsigargin in kalziumfreier Lösung und in 1 mM Ca -Lösung, PBLDaten und LPL-Daten jeweils aus 3 Versuchen.
Netto Ratio 340/380 Messplatz 2
2500
PBL_CD3
LPL_CD3
PBL_CD19
LPL_CD19
Ratio 340/380
2000
1500
1000
500
0
Zelltypen
ns
**
2+
Abb. 3.8. Statistische Auswertung Messplatz 2, Vergleich der netto [Ca ]i-Erhöhung (Plateau+
+
Ruhezustand) mit Standartabweichung für CD3 und CD19 -Zellen.
Die statistische Analyse der Daten ergab für den Messplatz 1 einen hoch
signifikanten Unterschied zwischen den CD3+-Zellen für Blut und Darm von p < 0,004
44
Ergebnisse
und einen signifikanten Unterschied für die CD19+-Zellen von p < 0,05. Für den
Messplatz 2 konnte nur ein hoch signifikanter Unterschied für die CD3+-Zellen von p
< 2,3x10-5 festgestellt werden, für die CD19+-Zellen ergab der t-test ein p < 0,09.
Diese Ergebnisse bei den Balb/cAnCrl-Mäusen zeigen, dass das [Ca2+]i-Plateau der
PBL-Zellen über dem [Ca2+]i-Plateau der LPL-Zellen liegt. Dieses Ergebnis ist
konsistent mit Ergebnissen aus unserer Arbeitsgruppe bezüglich humaner TLymphozyten aus Blut und Darm [Schwarz,A. et al, 2004, Tutsch et al., 2004] und es
ist ein Hinweis, dass die Maus als Modellorganismus für die Untersuchungen der
erniedrigten [Ca2+]i-Signale in T-Lymphozyten aus dem Darm und die damit
wahrscheinlich verbundene T-Zell-Hyporeaktivität benutzt werden kann.
3.5. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von
Balb/cAnCrl- Mäusen nach Antikörperstimulation
Die Stimulation der Blut- und Darmlymphozyten kann physiologisch über Antikörper
erfolgen. In diesem Zusammenhang war die Frage interessant, ob diese Stimulation
in diesem Versuchsaufbau anhand der [Ca2+]i-Signale zu erkennen ist. Dazu wurden
die Antikörper Anti-CD3+, Anti-CD28+ und OKT3 eingesetzt. Die Anti-CD3+/AntiD28+- Antikörper stimulieren sowohl den T-Zellrezeptor als auch den CD28+-KoRezeptor, während OKT3 einen der klassischen Antikörper gegen den T-Zellrezeptor
darstellt.
In dieser Versuchsreihe wurden die Lymphozyten wie zuvor in Kapitel Material und
Methoden beschrieben, isoliert und mit Fura2/AM beladen. Danach konnten die
Zellen in die Messkammer eingebracht werden. Die nachfolgenden Experimente
wurden an Messplatz 1 durchgeführt. In den Versuchen mit Antikörperstimulation
wurden die nicht haftenden Zellen mit 1 mM Ca2+-Lösung vor Versuchsstart
weggespült. Die physiologische Stimulation erfolgte in 1 mM Ca2+-Lösung mit den
ausgewählten Antikörpern. Dazu wurde eine Kombination von 2 Antikörpern, AntiCD3+ und Anti-CD28+, oder eine Stimulation mit OKT3 verwendet.
Bindet ein Antikörper an den korrespondierenden Rezeptor an der Plasmamembran,
löst diese Bindung eine Kaskade aus, wodurch es im weiteren Verlauf zu der
Öffnung der CRAC-Kanäle und damit zu einem Einstrom von Ca2+ in das Zytosol
kommt. Durch die Öffnung der Kanäle und den gleichzeitigen Export von Ca2+ über
45
Ergebnisse
die Plasmamembran kommt es zu einem Fließgleichgewicht des Ca2+, was am Ende
jeder Antikörperstimulation zu beobachten ist (siehe auch Abb.3.9 und 3.10.).
+
Ratio 340/380
2000
LPL CD3
R,Ø 31 Zellen
kR, Ø 47 Zellen
1500
1000
Anti CD3+ und CD28+
500
0
0
500
1000
1500
Time (sec)
+
2+
Abb. 3.9. Antikörperstimulation der CD3 -LPLs von Balb/cAnCrl-Mäusen in 1 mM Ca -Lösung,
2+
+
Stimulation 100 sec nach Versuchsstart mit 1mM Ca -Lösung mit je 5µg/ml Anti-CD3 und Anti+,
CD28 kR = keine Reaktion, R = Reaktion
Die Abbildungen 3.9. und 3.10. zeigen die Ergebnisse der Antikörperstimulation mit
Anti-CD3+ und Anti-CD28+ von den Darm- und den Blutlymphozyten. Die roten
Kurven zeigen die durchschnittlichen [Ca2+]i-Signale der Zellen, die durch einen
Anstieg des [Ca2+]i eine Reaktion auf die Stimulation zeigen, während die schwarzen
Kurven die durchschnittlichen [Ca2+]i-Signale der Zellen zusammenfassen, die keine
Erhöhung des [Ca2+]i aufweisen. Die Zellen reagieren auf die Stimulation mit
Antikörpern verschieden, dies zeigt sich in einem unterschiedlichen Kurvenverlauf,
was am Beispiel von 5 verschiedenen Blutlymphozyten in Abbildung 3.11. gezeigt
wird.
46
Ergebnisse
+
2000
PBL CD3
R,Ø 128 Zellen
kR, Ø 46 Zellen
Ratio 340/380
1500
1000
Anti CD3+ und CD28+
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
+
Abb. 3.10. Antikörperstimulation der CD3 -Zellen aus dem Blut der Balb/cAnCrl Maus in 1 mM
2+
2+
+
Ca -Lösung nach 100 sec. Stimulation mit 1 mM Ca -Lösung mit je 5 µg/ml Anti-CD3 und Anti+
CD28 , kR = keine Reaktion, R = Reaktion
2500
PBL CD3
Ratio 340/380
2000
+
Anti CD3+ und CD28+
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
+
Abb. 3.11. Beispiel für 5 verschieden reagierende CD3 -Zellen aus dem Blut einer Balb/cAnCrl
Maus, die in Abb. 3.9 in der roten Kurve gewertet wurden
Der Vergleich zwischen der Stimulation der Zellen mit den Antikörpern Anti-CD3+ und
Anti-CD28+ und mit den Kontrollversuchen (Abb. 3.3., 3.4.), indem nur 1 mM Ca2+47
Ergebnisse
Lösung durch die Kammer gespült wurde, zeigt deutlich, dass die CD3+-Zellen aus
dem Blut und dem Darm der Maus durch die Antikörper stimuliert wurden (siehe
Abb.3.9., 3.10., 3.11.). Bei den Kontrollversuchen reagierten 10% der Blut-TLymphozyten
und
12%
Antikörperstimulation
74%
der
der
Darm-T-Lymphozyten
Blut-T-Lymphozyten
während
und
40%
bei
der
der
Darm-T-
Lymphozyten reagierten.
Reaktion
keine Reaktion
100
Zellen %
75
50
25
0
PBL_CD3
Kontrolle
LPL_CD3
Kontrolle
PBL_CD3
Antikörper
LPL_CD3
Antikörper
+
Abb.3.12. Vergleich der CD3 -Zellen von Blut (PBL) und Darm (LPL) von Balb/cAnCrl Mäusen aus
+
+
den Kontrollversuchen und den Versuchen mit Antikörperstimulation (anti-CD3 und anti-CD28 ), R =
Reaktion, kR = keine Reaktion
Der Vergleich zwischen den Blut- und Darmlymphozyten der folgenden Abbildung
zeigt, dass die Blutzellen eine kleinere Latenz aufweisen, d.h. die Zeit zwischen der
Stimulation der Zellen und dem messbaren Signal ist kürzer und es konnten höhere
[Ca2+]i
Signale
gemessen
werden.
Außerdem
erreichen
die
Blutzellen
durchschnittlich die maximale [Ca2+]i Werte in 600 sec, während es bei den
Darmzellen 1120 sec dauert. Im Plateau = stady state erreichen PBL und LPL fast
das gleichen Niveau. Aus den Ergebnissen läßt sich feststellen, dass insgesamt
mehr PBLs auf die Stimulation mit Antikörpern reagieren als LPLs, sie reagieren
auch etwas schneller (siehe Abb. 3.13.). Dieser Befund weist auf eine Hyporeaktivität
der LPLs gegenüber den PBLs hin. Die LPL Zellen, die auf die Antikörper reagieren,
48
Ergebnisse
erreichen jedoch ähnlich [Ca2+]i Werte wie die PBLs. Diese Daten legen insgesamt
den Schluss nahe, dass es sich um ein Schwellenphänomen handelt, das heißt, im
Mittel überschreiten weniger LPLs als PBLs die Aktivierungsschwelle.
1200
PBL
LPL
1000
800
600
400
200
0
Latenz
(sec)
max. [Ca2+]i
Signal(a.u.)
Zeitp.des
max.[Ca2+]i
Signals(sec)
Plateau (=
stady state
Wert)(a.u.)
Abb.3.13. Vergleich der Blut- und Darmzellen der Balb/cAnCrl-Maus, Latenz= Zeit zwischen der
2+
2+
Stimulation mit Antikörpern CD3+/CD28+ und Beginn der Erhöhung von [Ca ]i max[Ca ]i Signal =
2+
2+
Mittelwert der höchsten [Ca ]i, Zeitp. des max[Ca ]i Signals = Mittelwert des Zeitpunktes des
2+
2+
höchsten [Ca ]i nach Stimulation, Plateau (steady state Wert)= [Ca ]i 1000 sec nach Stimulation,
Als weitere physiologische Stimulation der Darmlymphozyten wurde eine Stimulation
mit OKT3 durchgeführt. Die folgende Abbildung 3.14. zeigt die Ergebnisse dieser
Stimulation mit Darmzellen der Balb/cAnCrl-Maus. Bei diesen Versuchen reagierten
25 % der Darm-T-Lymphozyten, während 75 % der Zellen nicht reagierten. Bei der
OKT3-Stimulation reagierten also weniger Zellen als bei der Antikörperstimulation
Anti-CD3+/Anti-CD28+, aber deutlich mehr als in den Kontrollversuchen, in denen
lediglich 12 % der ausgewerteten Zellen reagierten.
49
Ergebnisse
+
Ratio 340/380
2000
LPL CD3
R,Ø 16 Zellen
kR,Ø 47 Zellen
1500
OKT3
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
+
2+
Abb. 3.14. OKT3–Stimulation der CD3 -LPLs von der Balb/cAnCrl-Maus in 1 mM Ca -Lösung,
2+
nach 250 sec Stimulation mit 1 mM Ca -Lösung mit 4 µg/ml OKT3.
Insgesamt zeigen die Versuche mit Antikörperstimulation, dass weniger LPLs als
PBLs durch die Antikörperstimulation Anti-CD3+/Anti-CD28+ reagieren (Abb. 3.12.),
was auch konsistent mit Schwarz ist [Schwarz et al., 2004]. Auch in diesem Fall ist
die Maus ein mögliches Modell, um die unterschiedlichen [Ca2+]i-Signale zwischen
LPL und PBL zu untersuchen.
3.6. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von
verschiedenen
TRPC-Knock-out-
Mäusen
nach
Antikörperstimulation
Die
CRAC-Kanäle
spielen
bei
der
Generierung
der
Kalziumsignale
eine
entscheidende Rolle, allerdings ist der exakte molekulare Aufbau der Kanäle noch
nicht vollständig aufgeklärt. Man geht zur Zeit davon aus, dass TRP-Proteine am
Aufbau der CRAC-Kanäle beteiligt sind. Als Kandidatengene kommen unter anderem
die Proteine der TRPC-Familie in Frage [Freichel, M. et al., 2005]. Durch die
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe M. Freichel, war die Möglichkeit gegeben,
aus TRPC-Knock-out Mäusen Lymphozyten zu isolieren. Dadurch konnten
Experimente durchgeführt werden, die der Frage nachgehen, ob das Ausschalten
von verschiedenen TRPC-Proteinen Unterschiede in den gemessenen [Ca2+]i von
50
Ergebnisse
Lymphozyten gegenüber dem entsprechenen Wildtyp in diesem Versuchsaufbau
erkennen läßt. Dazu wurden die Lymphozyten der verschiedenen Knock-out Mäuse
und dem entsprechenden Wildtyp in Thapsigarginexperimenten untersucht. Auch die
Möglichkeit, die Zellen mit Antikörpern physiologisch zu stimulieren, wurde in dieser
Arbeit genutzt, um eine OKT3-Stimulationen der Lymphozyten bei verschiedenen
Mausstämmen zu testen.
In den folgenden Abbildungen sind der Vergleich von LPLs aus TRPC6(-/-)-Knockout Mäusen mit dem Wildtyp (WT) 1295 VJ und ein Beispiel für 3 verschiedene
CD3+-LPLs, die auf die OKT3- Stimulation reagieren, dargestellt.
Die Stimulation der Zellen durch OKT3 bei den Zellen der TRPC6(-/-)-Knock-out
Maus, ebenso bei dem entsprechenden Wildtyp 1295VJ lässt sich durch einen
Anstieg des [Ca2+]i, der in der grünen und roten Kurve der Abb. 3.15. dargestellt ist,
ablesen.
+
LPL_ CD3
WT, R Ø 137 Zellen
KO, R Ø 16 Zellen
KO, kR Ø 8 Zellen
WT kR Ø 125 Zellen
Ratio 340/380
2000
1500
1000
OKT3
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
Abb. 3.15. Vergleich der LPLs von TRPC6(-/-)-Knock-out Mäusen mit dem Wildtyp (WT) 1295 VJ
2+
2+
in 1 mM Ca -Lösung, Stimulation nach 250 sec mit 1 mM Ca -Lösung mit 4 µg/ml OKT3.
Die Darmlymphozyten reagieren auf die Stimulation durch OKT3 unterschiedlich,
was schon in der Abb.3.11. für die Antikörperstimulation durch Anti-CD3+/Anti-CD28+
gezeigt werden konnte. Die Abb. 3.16 zeigt 3 Beispiele für die unterschiedlichen
[Ca2+]i–Signale nach OKT3 Stimualtion.
51
Ergebnisse
Ratio 340/380
2000
LPL
CD3+
1500
1000
OKT3
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
+
Abb. 3.16. Beispiel für 3 unterschiedlich reagierende CD3 - LPL aus TRPC6(-/-)-Knock-out
Mäusen, die in Abb.3.15 n der grünen Kurve gewertet wurden
80%
Reaktion
keine Reaktion
Zellen
60%
40%
20%
0%
WT
TRPC6(-/-)
Mausstamm
+
Abb. 3.17. Vergleich der Reaktionen nach OKT3-Stimulation der CD3 positiven Zellen aus dem
Darm von WT= Wildtyp1295VJ und TRPC6(-/-)-Knock-out Mäusen, R = Reaktion, kR = keine
Reaktion
52
Ergebnisse
Es reagierten bei den TRPC6(-/-)-Knock-out Mäusen (67%) und dem Wildtyp 1295VJ
(52%) prozentual mehr Zellen auf die OKT3-Stimulation als bei den Balb/cAnCrlMäusen (25%) (siehe Abb.3.14). Bei den Knock-out-Mäusen reagierten die CD3+LPL auf die Stimulation durch OKT3 prozentual besser, aber es konnten nur wenige
Zellen von den TRPC6(-/-)-Knock out Mäusen ausgewertet werden. Die Isolation der
Darmzellen von den TRPC6(-/-)-Knock-out Mäusen ist noch nicht so weit optimiert,
dass viele Zellen isoliert und gemessen werden können. Deshalb musste auf eine
statistische Auswertung verzichtet werden und aus diesem Ergebnis ist kein direkter
Einfluss auf das [Ca2+]i der Lymphozyten erkennbar, der durch das Ausschalten des
TRPC6-Protein entstehen könnte.
Für die weiteren Versuche mit Lymphozyten aus dem Darm und dem Blut wurden
Zellen von den TRPC4C6(-/-)2- Knock-out Mäusen und den TRPC1C4C6(-/-)3–
Knock-out Mäusen isoliert.
3.6. Vergleich von [Ca2+]i in Blut- und Darmlymphozyten von verschiedenen TRPC-Knock-out Mäusen nach Zugabe von unterschiedlichen Ca2+-Lösungen mit Thapsigargin
Die folgenden Abbildungen zeigen die Ergebnisse der Thapsigarginexperimente der
Zellen von der TRPC4C6 (-/-)2-Knock-out Maus und dem Wildtyp 129 B6F1. Es
gestaltete sich sehr schwierig, aus TRPC-Knock-out Mäusen die Lymphozyten aus
dem Darm zu isolieren und auf dem Deckglas zu fixieren. Deshalb konnten bei den
Experimenten von den Lymphozyten aus dem Darm nur wenige CD4+- und CD8+Lymphozyten fixiert und [Ca2+]i-Daten aufgezeichnet werden. In den Abbildungen
3.18. und 3.20. der LPLs wurden die [Ca2+]i -Daten aus den CD4+- und CD8+Lymphozyten als [Ca2+]i-Daten aus CD3+-Lymphozyten zusammengefasst.
Ebenso wie bei der Balb/cAnCrl-Maus, liegen die [Ca2+]i-Signale der CD3+Lymphozyten aus dem Darm der TRPC4C6(-/-)2- Knock-out Maus und des Wildtyps
129 B6F1 über den [Ca2+]i Daten der CD19+-Lymphozyten (siehe Abb. 3.18.).
Der Abstand der Kurven im Plateaubereich von den CD19+-PBLs zu den CD4+- und
CD8+-PBLs ist größer als der Abstand der Kurven der LPLs in diesem Bereich
(Vergleiche Abb.3.18. und 3.19.). Allerdings konnte kein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den [Ca2+]i -Signalen der Knock-out Mäusen und dem Wildtyp
festgestellt werden.
53
Ergebnisse
3000
2+
2+
2+
Tg in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
LPL
2500
Ratio 340/380
2+
Tg in 0 nm Ca
0,5nm Ca
+
KO CD3 , Ø 3 Zellen
+
WT CD3 , Ø 11 Zellen
+
KO CD19 , Ø 27 Zellen
+
WT CD19 , Ø 34 Zellen
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
2
Abb.3.18. Vergleich der LPLs der TRPC4C6 (-/-) - Knock-out Maus (KO) mit dem Wildtyp 129 B6F1
2+
2+
(WT) mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung
3500
3000
2+
0,5 Ca
Tg in 0 nm Ca
2+
Tg in 1 nm Ca
2+
Tg in 0 nm Ca
2+
PBL
+
KO CD8 ,Ø 72 Zellen
+
KO CD4 , Ø 486 Zellen
+
WT CD4 , Ø 197 Zellen
+
WT CD8 , Ø 31 Zellen
+
KO CD19 , Ø 573 Zellen
+
WT CD19 , Ø 506 Zellen
Ratio 340/380
2500
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
2
Abb.3.19. Vergleich der PBLs der TRPC4C6 (-/-) - Knock-out Maus (KO) mit dem Wildtyp 129 B6 F1
2+
2+
(WT) mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung
Betrachtet
man
die
folgende
Abbildung,
die
die
Ergebnisse
von
je
3
3
Thapsigarginexperimenten mit TRPC1C4C6(-/-) -Kock-out Mäusen und dem Wildtyp
1295 VJ zeigt, sind die [Ca2+]I -Werte der CD3+-Zellen im Plateaubereich nicht mehr
von den CD19+-Zellen zu unterscheiden. Die Ursache könnte darin liegen, dass bei
der TRPC1C4C6(-/-)3-Knock-out Maus trotz identischer Versuchsdurchführung bei
54
Ergebnisse
der Isolation der Darmzellen wesentlich geringere Zellmengen isoliert wurden. In
Folge dessen war die eingesetzte Zellmenge geringer und es konnten nur wenige
Zellen ausgewertet werden.
2500
2+
Tg in 0 nm Ca
2+
Tg in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
LPL
2000
Ratio 340/380
2+
2+
0,5nm Ca
+
KO CD3 , Ø 7Zellen
+
WT CD3 ,Ø 3 Zellen
+
KO CD19 , Ø 45 Zellen
+
WT CD19 , Ø 7 Zellen
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
3
Abb.3.20. Vergleich der LPLs der TRPC1C4C6 (-/-) - Knock-out Maus (KO) mit dem Wildtyp 1295VJ
2+
2+
(WT) mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung.
2+
3000
2+
Tg in 0 nm Ca
2+
Tg in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
PBL
2500
Ratio 340/380
2+
0,5nm Ca
+
KO CD8 , Ø 166 Zellen
+
KO CD4 .Ø 517 Zellen
2000
+
WT CD4 , Ø 65 Zellen
+
WT CD8 , Ø 18 Zellen
+
WT CD19 , Ø 280 Zellen
1500
+
KO CD19 , Ø 641 Zellen
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
3
Abb.3.21. Vergleich der PBLs von der TRPC1C4C6 (-/-) - Knock-out Maus (KO) mit dem Wildtyp
2+
2+
1295 VJ (WT) mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung
Der Vergleich von Blut- und Darmzellen der TRPC4C6(-/-)2- Knock-out Maus und der
TRPC1C4C6(-/-)3- Knock-out Maus zeigt, dass sich die CD3+-Zellen im Vergleich zu
den CD19+-Zellen so verhalten, wie die Lymphozyten der Balb/cAnCr-Mäuse.
55
Ergebnisse
Lediglich der Abstand des Plateaus des [Ca2+]i zwischen den CD3+- und CD19+Zellen nimmt ab.
Die Unterschiede zwischen den Wildtyp-Mäusen und den TRPC-Knock-out Mäusen
sind nicht signifikant. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass das
Ausschalten von verschiedenen TRPC-Proteine keinen Einfluss auf die Höhe der
[Ca2+]i in den Lymphozyten bei diesem Versuchsaufbau hat. Es konnte aber gezeigt
werden, dass Lymphozyten aus dem Darm der verschiedenen TRPC-Knock-out
Mäusen isoliert werden können. Die zur Verfügung standenden Tiere waren über das
geeignete Alter von 8 bis 12 Wochen hinaus, was schon bei der Balb/cAnCr-Maus
die Ausbeute an Lymphozyten senkte. Mit TRPC-Knock-out Mäusen von 8 bis 12
Wochen könnte ebenso wie bei der Balb/cAnCrl-Maus eine höhere Ausbeute an
Lymphozyten erreicht werden werden.
3.7. Einfluss einer induzierten Darm-Kolitis auf die Kalziumsignale
Neben den Untersuchungen der Zellen aus verschiedenen TRPC-Knock out-Mäusen
und dem entsprechenden Wildtyp sollten auch Tiere mit induzierter Kolitis untersucht
werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Modell der experimentell induzierten
Kolitis benutzt, um ein Modell zur Untersuchung der potentiellen Funktion von [Ca2+]i
der T-Zellen bei CED zu etablieren. Dazu wurde ein Protokoll verwendet, das den
Tieren über 7-9 Tagen gleichmäßig Dextran sulfate sodium (DSS) zuführt. Durch
Haemoculttests wurde sichergestellt, dass die Tiere zum Zeitpunkt der Experimente
erkrankt waren. Danach wurde den Tieren das Blut und der Darm, wie in Kapitel
Material und Methoden beschrieben, entnommen und die Lymphozyten isoliert.
Die ersten Ergebnisse der Blutlymphozyten bei Mäusen mit induzierter Kolitis zeigen,
dass [Ca2+]i in den Lymphozyten der Kolitistiere nach Stimulation höher ist als in den
Zellen aus Kontrolltieren. Die Experimente mit Darmzellen haben sich als sehr
schwierig herausgestellt, da die Zellpräparation aufgrund der Kolitis erschwert war
und viele der isolierten Zellen nicht gut hafteten. Aus diesem Grund konnten nur
Ergebnisse von PBLs von bislang zwei Balb/cAnCrl-Mäusen gewonnen werden.
Diese Experimente müssen reproduziert werden. Insbesondere ist der initiale Anstieg
von [Ca2+]i der CD3+-Zellen aus dem Blut der Tiere mit Kolitis ungewöhnlich langsam
(Abb. 3.22.)
56
Ergebnisse
3000
2+
2+
2+
Tg in 0 nm Ca
0,5nm Ca
Tg in 1 nm Ca
2+
Tg in 0 nm Ca
2500
PBL
+
CO CD19 , Ø 252 Zellen
Ratio 340/380
2000
+
CO CD3 , Ø 156 Zellen
+
Kon CD3 , Ø 582 Zellen
1500
+
Kon CD19 , Ø 959 Zellen
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
Abb. 3.22. Vergleich der PBLs von Balb/cAnCrl-Mäusen, Kontrolltiere (Kon) und Tiere mit
2+
2+
induzierter Kolitis (CO), mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM Ca -Lösung.
Für die nächsten Versuche wurden die C57BL6-Mäuse eingesetzt, da bei diesem
Tierstamm die Tiere schneller die Symptome der Kolitis ausbilden. Die folgenden
Abbildungen zeigen die Ergebnisse der Thapsigarginexperimente mit Lymphozyten
der C57BL6-Mäuse aus dem Blut und dem Darm. Bei diesen Experimenten wurden
Tiere mit induzierter Kolitis und Tiere ohne Kolitis, hier als Kontrolltiere bezeichnet,
verglichen. Die Präparation der LPLs gestaltete sich selbst bei den Kontrolltieren
besonders schwer. So gelang es bisher nicht, mehr als 120 000 LPLs von einer
C57BL6-Maus zu isolieren, wohingegen bei der Balb/cAnCrl-Maus in einem
Experiment bis zu 450 000 LPLs isoliert werden konnten.
Aus dem Kolon der an Kolitis erkrankter Tiere gelang es bisher noch nicht, CD3+Zellen zu isolieren und zu messen. Durch die Entzündung des Darms ist das
Gewebe
verändert
und
für
die
weiteren
Isolationsversuche
sind
weitere
Optimierungen nötig, z.B. eine Verlängerung der Kollagenase-Inkubationszeit, um
das Gewebe stärker aufzulösen und mehr CD3+-Zellen zu isolieren.
Die folgende Abbildung zeigt den Vergleich der Blut-T-Lymphozyten von an Kolitis
erkrankten und gesunden C57BL6-Mäusen.
57
Ergebnisse
2+
3000
2+
Tg in 0 nm Ca
2+
Tg in 1 nm Ca
Tg in 0 nm Ca
PBL
2500
Ratio 340/380
2+
0,5nm Ca
+
CO CD4 , Ø 16 Zellen
+
CO CD8 , Ø 16 Zellen
+
Kon CD4 , Ø 65 Zellen
+
Kon CD8 ,Ø 18 Zellen
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
Abb.3.23. Vergleich der PBLs von C57BL6-Mäusen, Kontrolltiere (Kon) und Tiere mit induzierter
2+
2+
Kolitis (CO), mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung und in 1 mM Ca -Lösung
Es gelang allerdings CD19+-Lymphozyten aus entzündetem Darm zu isolieren. Die
Abb. 3.24. zeigt die ersten Ergebnisse mit diesen CD19+-LPLs aus dem Darm und
CD19+-Blutlymphozyten.
Der Vergleich der Ergebnisse (Abb. 3.24.) von den Blut und Darmzellen der C57BL6Mäuse
liefert
folgendes
Ergebnis.
Während
die
verschiedenen
[Ca2+]i im
Plateaubereich von den CD3+-PBLs der Mäuse mit Kolitis über den der Kontrolltieren
liegen,
zeigt
der Vergleich
der CD19+-Zellen
2+
ein anderes Ergebnis.
Die
+
durchschnittlichen [Ca ]i -Signale aus den CD19 -LPLs der an Kolitis erkrankten
Tieren liegen 800 Sekunden nach Experimentstart über den [Ca2+]i-Signalen der
Kontrolltiere. Aber bei den CD19+-PBLs der Kontrolltiere wurden höhere [Ca2+]iWerte im Plateau gemessen als bei den CD19+-PBLs der erkrankten Tiere.
Aus dem Dünndarm einer an induzierter Kolitis erkrankten Maus konnte bislang ein
Versuch mit CD3+-Zellen durchgeführt werden, die mit der Antikörperstimulation AntiCD28+/Anti-CD3+ stimuliert wurden. Die Zellen aus dem Dünndarm hafteten leider
sehr schlecht auf den beschichteten Deckgläsern und deshalb konnten nur wenige
Zellen gemessen werden (Abb. 3.25.).
58
Ergebnisse
2000
2+
2+
2+
Tg in 0 nm Ca
0,5nm Ca
Tg in 1 nm Ca
2+
Tg in 0 nm Ca
+
Ratio 340/380
1500
CD19
Kon PBL, Ø 118 Zellen
CO LPL, Ø 12 Zellen
Kon LPL, Ø 4 Zellen
CO PBL, Ø 298 Zellen
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Time (sec)
+
Abb. 3.24. Vergleich der CD19 -Zellen von PBL und LPL aus C57BL6-Mäusen, Kontrolltiere (Kon)
2+
und Tiere mit induzierter Kolitis (CO) mit Thapsigargin in 0 mM Ca -Lösung mit EGTA und in 1 mM
2+
Ca -Lösung.
+
2500
LPL CD3
R Ø 7 Zellen
kR Ø 2 Zellen
Ratio 340/380
2000
Anti CD3+ und CD28+
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
Time (sec)
Abb. 3.25. Beispiel für ein Experiment von LPL-CD3+-Zellen aus dem Dünndarm der
2+
Balb/cAnCrl- Maus mit induzierter Kolitis in 1 mM Ca -Lösung und nach 100 sec. Stimulation mit 1
2+
+
mM Ca -Lösung mit je 5 µg/ml Anti-CD3 und Anti-CD28.
Sollten sich die Ergebnisse mit den CD3+-Zellen der an Kolitis erkrankten Maus
reproduzieren lassen, würden sie die Ergebnisse von humanen Zellen bestätigen
59
Ergebnisse
und zeigen, dass auch bei der Maus [Ca2+]i in den Lymphozyten des Darms eines
erkrankten Tieres erhöht sind und es reagieren prozentual mehr Zellen auf den
gewählten Stimulus (Abb. 3.9., 3.25). Bereits in den Arbeiten von Tutsch und
Schwarz [Schwarz, A. et al. 2004, Tutsch, E. et al., 2004] wurde auf ein erhöhtes
[Ca2+]i in den Lymphozyten der Darmzellen bei Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmkrankheiten hingewiesen. Das würde bedeuten, das dieses Kolitismodell der
Maus ein gutes Modell für die Untersuchung der Rolle von [Ca2+]i bei der
pathologischen
Aktivierung
der
Lymphozyten
Darmerkrankungen ist.
60
bei
chronisch
entzündlichen
Diskussion
4. Diskussion
4.1.Lymphozyten aus dem Darm
Ausgehend von der Arbeit von Schwarz [Schwarz et. al., 2004], der die intrazelluläre
Kalziumkonzentration [Ca2+]i für isolierte humane Lymphozyten untersuchte, wurde in
dieser Dissertation der Frage nachgegangen, ob die isolierten murinen Lymphozyten
als Modell für die Erforschung von [Ca2+]i und der Hyporeaktivität verwendet werden
können.
Das Darmsystem bildet ein Mikroenviroment, in das die T- und B- Zellen des
Immunsystems eingebettet sind. Die Isolation der Zellen bedeutet einerseits
gleichzeitig eine Zerstörung der natürlichen Umgebung dieser Zellen. Andererseits
kann man Untersuchungen an einzelnen Zellen nur durchführen, wie zum Beispiel
die Analyse der Veränderungen des [Ca2+]i einer bestimmten Zelle, wenn die Signale
aus einzelnen Zellen und nicht aus Zellen, die im Gewebe liegen, gewonnen werden
können. Von Tutsch wurden Lymphozyten im intakten Gewebe mit Hilfe der 2
Photonenmikroskopie hinsichtlich des [Ca2+]i untersucht. Da die Daten von Tutsch
[Tutsch.E. et al. 2004], die von humanen Lymphozyten im Gewebeverband
gewonnen wurden, gut mit den Daten von Schwarz [Schwarz, A. et al, 2004] aus
isolierten humanen Lymphozyten korrelieren, scheint die Zerstörung des gewohnten
Umfeldes der Zellen keinen unmittelbaren Einfluss auf die [Ca2+]i-Signale zu haben.
Dass ein langanhaltender Einfluss des Mikroenviromentes auf die Zellen durchaus
vorstellbar ist, wurde von Mowat [Mowat, A.M. et al. 2003] verdeutlicht.
Ausgehend von den Ergebnissen für humane Zellen von Schwarz und Tutsch
[Schwarz et. al., 2004,Tutsch.E. et al., 2004], wurde in dieser Dissertation der Frage
nachgegangen, ob sich die Ergebnisse, die sich aus isolierten Lymphozyten aus der
Balb/cAnCrl-Maus erfassen lassen, sich von den humanen Daten unterscheiden.
Interessant ist die Frage, warum die LPL eine niedrigere [Ca2+]i nach Zugabe von
Thapsigargin aufweisen als PBL. Sehr deutlich sind die Ergebnisse für die
unterschiedliche Höhe des Kalziumsignals für PBL- und LPL-Zellen bei Balb/cAnCrlMäusen, die im Kapitel Ergebnisse dieser Dissertation dargestellt sind. Dies
entspricht den Ergebnissen von Schwarz [Schwarz, A. et al, 2004], der bei humanen
LPLs aus gesunden Spendern eine niedrigere [Ca2+]i nach Zugabe von Thapsigargin
festgestellt hat als bei humanen PBL.
61
Diskussion
4.2.Isolation der Lymphozyten aus dem Darm
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode in der Arbeitsgruppe etabliert, die es
ermöglicht, aus dem Darm der Maus die Lymphozyten zu isolieren. Die Probleme
dieser Isolation sind vielfältig. Die Lamina Propria Lymphozyten befinden sich im
Organismus in einer intakten Gewebsschicht, die bei der Isolation so entfernt werden
muss, dass die Zellen nicht zerstört werden. Bei Tieren, die älter als 16 Wochen
waren, zeigte sich ein Fettpolster, das um den Darm herum ausgebildet war und erst
entfernt werden musste. Bei diesen Tieren stellte zusätzlich der Schleim, der als
Schutzschicht im Lumen des Darmes gebildet wird, auch während der ganzen
Präparation ein weiteres Problem dar. Die Lymphozyten verteilten sich während der
Präparation im Schleim, waren somit gegen die eingesetzten Lösungen isoliert,
nahmen fast kein Fura2/AM auf und hafteten nicht mehr auf dem Deckglas. Auch der
Versuch, den Schleim gegen Ende der Präparation mit DTT zu lösen und die Zellen
zu
messen,
schlug
fehl,
da
die
Zellen
keine
Reaktion
auf
eingesetzte
Thapsigaginlösungen zeigten. Es zeigte sich während des Optimierens des
Versuchsaufbaus, dass Tiere zwischen 8 und 12 Wochen das ideale Alter hatten, da
bei diesen Tieren die Fettpolster um den Darm herum noch nicht ausgebildet waren,
so dass während der Präparation das Entfernen dieser Fettanteile entfiel.
Durch eine zusätzliche Inkubationszeit der Darmstücke in HBSS für 1 Stunde und die
Optimierung der Inkubationszeiten der eingesetzten Lösungen wurden aus den
Balb/cAnCrl-Mäusen mehr Zellen (> 450 000 Zellen) als zu Beginn (30 000 Zellen)
isoliert, und bei den Messungen zeigten diese Zellen ein niedrigeres Ruhekalzium als
die Zellen aus den ersten Versuchen.
Da bei der Isolation B- und T-Lymphozyten aus dem Blut und Darm isoliert wurden,
konnte als weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit die Messung von [Ca2+]i-Signalen
aus verschiedenen Lymphozyten aus dem Darm und dem Blut der Maus verfolgt
werden. Die im Kapitel Ergebnisse dargestellten Daten zeigen nach der Optimierung
der Präparation aus den Balb/cAnCrl-Mäusen kein unterschiedliches Ruhekalzium
von Blut- und Darmlymphozyten zu Beginn des Experimentes. Das entspricht den
Ergebnissen die in der Arbeitsgruppe Hoth schon für humane Lymphozyten gemacht
wurden [Tutsch,E. et al., 2004, Schwarz, A. et al, 2004]. Dies bezüglich konnten die
Ergebnisse, dass die intrazellulären Ruhekalziumkonzentration [Ca2+]i inT-LPL höher
als die in T-PBL, die von de Maria mittels FACS- Analyse gemacht wurden, auch für
62
Diskussion
die Maus nicht bestätigt werden [De Maria, R. et al.1993]. Bei der FACS- Analyse
müssen die Antikörper schon vor Experimentstart zugegeben werden, was unter
Umständen zu einer Aktivierung führen könnte. Ein entscheidender Vorteil bei den in
dieser Arbeit erhobenen Daten ist die Möglichkeit, die Zellen erst im Anschluss an
die Versuche mit Hilfe von Antikörpern zu identifizieren.
Ein erhöhter Kalziumexport ist eine der Möglichkeiten, die das [Ca2+]i-Signal
beeinflussen
können.
In
Thapsigarginexperimenten
Lösungswechsel
zu
der
nach
vorliegenden
1200
kalziumfreier
Arbeit
Sekunden
Lösung
wurden
nach
dem
durchgeführt,
bei
allen
Start
um
ein
diesen
Regulationsmechanismus der Zellen zu untersuchen. Dabei konnten in unseren
Versuchen keine wesentlichen Unterschiede zwischen dem Verhalten der PBLs und
der LPLs festgestellt werden, da die [Ca2+]i-Signale in unseren Experimenten etwa
gleich schnell abfallen. Aus diesem Ergebniss kann man feststellen, dass der
Kalziumexport in beiden Zelltypen etwa gleich hoch ist.
Eine
weitere
Beobachtung
konnte
bei
der
vorliegenden
Arbeit
in
den
Thapsigarginexperimenten gemacht werden. Bei den B-Zellen konnte ein verzögerter
Anstieg der [Ca2+]i-Signale zu dem Plateau in der 1 mM Ca2+-Lösung festgestellt
werden. Die [Ca2+]i-Signale der B-Zellen erreichten auch nicht die gleiche Höhe im
Plateaubereich wie T-Zellen. Dies entspricht den Beobachtungen von Feldhahn
[Feldhahn, N. et al., 2002], der bei der Stimulation von B-Zellen über den BCR, einen
verzögerten Anstieg der [Ca2+]i-Signale bei B-Gedächtniszellen festgestellt hat.
Da in dieser Dissertation der Frage nachgegagen werden sollte, ob murine
Lymphozyten als Modellorganismus zur Untersuchung für [Ca2+]i-Signale verwendet
werden können, und gezeigt werden konnte, dass die PBL und LPL kein
unterschiedliches Ruhekalzium bei Experimentstart aufweisen, wurde nun der Frage
nachgegangen, ob experimentebedingte exogen Faktoren den Ruhekalziumwert
über den Zeitraum von 2000 Sekunden beeinflussen.
4.3. Vergleich von murinen und humanen [Ca2+]i-Signale aus
Lymphozyten
Um die [Ca2+]i-Signale von Zellen aufzeichnen zu können, wurden die isolierten
Zellen auf einem Deckglas fixiert und in den Strahlengang eines Mikroskopes
eingebracht. Nun sollte in Kontrollversuchen der Einfluß der verwendeten zwei
63
Diskussion
unterschiedlichen Anregungswellenlängen und der Einfluß des Lösungswechsels auf
die [Ca2+]i-Signale getestet werden und der Frage nachgegangen werden, ob die
[Ca2+]i-Signale auf der Höhe des Ruhekalziumwertes konstant bleiben, wenn die
Zellen nicht zusätzlich durch weitere Substanzen stimuliert werden.
In den im Kapitel Ergebnisse abgebildeten Kontrollversuchen, in denen nur 1 mM
Kalziumlösungen zu den Zellen gegeben wurde, konnte gezeigt werden, dass die
Zellen nach einer, in einer Reihe von Experimenten ermittelten Ruhezeit von 2 bzw.
12 Stunden, keinen Anstieg des [Ca2+]i während der gewählten Experimentlänge von
2000 sec aufzeigten. Somit ist die Grundlage geschaffen, an den, wie im Kapitel
Material
und
durchzuführen,
Methoden
um diese
beschrieben,
Ergebnisse
isolierten
mit
Lymphozyten
Experimente
den Ergebnissen von
humanen
Lymphozyten, die in der Arbeit von Schwarz [Schwarz, A. et al.,2004] aufgezeichnet
wurden, zu vergleichen.
In der Arbeit von Schwarz [Schwarz, A. et al.,2004] wurden [Ca2+]i von isolierten TLymphozyten aus der Mukosa des Menschen aufgezeichnet. Bei den Experimenten
mit Thapsigargin konnte von Schwarz [Schwarz, A. et al.,2004] ein typischer
Kurvenverlauf festgestellt werden. Die aufgezeichnete Kurve beginnt damit, dass die
Zellen in 1 mM Ca2+-Lösung eingebettet sind, wodurch die Höhe des Ruhekalziums
der Zellen bestimmt werden kann. Nach Zugabe von 0 mM Ca2+-Lösung mit EGTA +
Thapsigargin kommt es zu einer passiven Speicherentleerung, da Thapsigargin die
SERCA Pumpen blockiert. Dies wird sichtbar in einer kleinen Erhöhung der
aufgezeichneten Experimentkurve, die nach kurzer Zeit wieder auf die Höhe des
Ausgangswertes der Kurve zurückgeht. Werden zu den Zellen 1 mM Ca2+-Lösung
gegeben, folgt ein steiler Anstieg der Kurve, die sich nach einem Peak auf einem
etwas niedrigerem Plateau einpendelt. Bei der anschließenden Zugabe von 0 mM
Ca2+-Lösung mit EGTA und Thapsigagin geht die aufgezeichnete Kurve schnell auf
Plateauwerte, die nur ein wenig höher sind als zu Beginn des Experimentes, zurück.
Um die Daten der humanen Zellen mit den murinen Daten vergleichen zu können,
sollten Experimente mit den gleichen Lösungen und mit murinen Lymphozyten
durchgeführt werden. Die aufgezeichneten Kurven der Experimente mit murinen
Lymphozyten sollten dann mit den Kurven der humanen Zellen verglichen werden.
Bei den Experimenten dieser Dissertation konnte folgendes festgestellt werden.
Ebenso wie bei den von Schwarz und Tutsch eingesetzten Zellen des Menschen
liegen die [Ca2+]i der murien PBL über den der murinen LPL in Bereich des Plateaus,
64
Diskussion
während sich die Zellen in der 1 mM Ca2+-Lösung befinden [Schwarz et. al., 2004,
Tutsch et al., 2004]. So konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die
T-Zellen des Darmes von Balb/cAnCrl-Mäusen nach Stimulierung über den TZellrezeptors eine geringere Aktivierungsrate haben als die Blutzellen, was auch für
humane Zellen gezeigt wurde [Qiao, L. et al.,1991, Schwarz, A. et al., 2004]. Da
auch bei der Balb/cAnCrl-Maus die [Ca2+]i in LPLs in 1 mM Ca2+-Lösung niedriger
sind als in den PBLs, gemessen in der gleichen Lösung, könnte das auf eine
Hyporeaktivität der murinen LPL-Zellen gegenüber den murinen PBLs hindeuten.
Durch den Vergleich der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i der isolierten
humanen Lymphozyten, die in der Arbeit von Schwarz dargestellt sind und den
intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i der murinen Lymphozyten, die der
vorliegenden Arbeit vorgestelllt wurden, bestätigt den gleichen Kurvenverlauf der
intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i der humanen und murinen Lymphozyten
in den eingesetzten Thapsigarginlösungen. Dieses Ergebnis spricht für die
Verwendung der Mauslymphozyten als Modellzellen für Untersuchungen der [Ca2+]iSignale in Lymphozyten. Eine weitere Frage in diesem Zusammenhang ist, wie
reagieren die Balb/cAnCrl-Lymphozyten auf physiologischere Stimuli.
4.4. Physiologische Stimulation der Lymphozyten
Für LPLs und PBLs wurde ein Zusammenhang zwischen Proliferation und
Kalziumeinstrom gezeigt [Schwarz, A. et al.,2004]. Durch die Costimulation mit AntiCD3+ und Anti-CD28+ Antikörpern, kommt es zu einer Steigerung der Proliferation
und IL-2 Produktion, was schon von Ebert [Ebert, E.C. et Roberts, A.I., 1996] gezeigt
werden konnte.
Von Targan [Targan,S.R., et al., 1995] konnte gezeigt werden, dass nach einer AntiCD2+/Anti-CD28+-Antikörper Stimulation mehr Zytokine bei den LPLs gebildet
werden, als durch eine Anti-CD3+-Antikörper Stimulation alleine. Zytokine docken an
ihren Rezeptor auf der Zielzelle an und durch diese Bindung werden in der Zielzelle
Reaktionen ausgelöst. Von Targan [Targan, S. et al., 1995] wurden die
Zytokinproduktion der LPLs und PBLs nach Antikörperstimulation verglichen. Dabei
konnte festgestellt werden, dass bei den LPLs die Stimulierbarkeit über dem Weg
Anti-CD2+/Anti-CD28+ gegenüber den PBLs gesteigert ist, es werden sogar mehr
Zytokine als bei einer Anti-CD3+ Stimulation gebildet.
65
Diskussion
Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit für
die ersten Experimente die Anti-CD3+-Stimulation gewählt, dabei konnten aber kein
Anstieg der der [Ca2+]i-Signale festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Erst die
Anti-CD3+/Anti-CD28+-Antikörper Stimulation zeigte eine Stimulation der murinen
Lymphozyten in einer 1 mM Ca2+-Lösung, die durch den Anstieg der [Ca2+]i-Signale
in den Lymphozyten festgehalten werden konnte. Dies zeigt, dass bei gleichem
Versuchsaufbau, nur bei Kostimulation ein Anstieg der [Ca2+]i-Signale erkennen lies
und die Stimulation mit Anti-CD3+-Antikörper Stimulation keinen messbaren Effekt
lieferte. In den Experimenten dieser Dissertation konnte festgestellt werden, dass
von den eingesetzten murinen Blut-T-Lymphozyten (74%) deutlich mehr als bei den
Darm-T-lymphozyten (40%) reagieren. Dies zeigt auch bei physiologischer
Stimulation die bessere Stimulierbarkeit der Blutlymphozyten gegenüber den
Darmlymphozyten.
Im
Rahmen
dieser
Dissertation
wurde
als
weitere
physiologische
Stimulationsmöglichkeit der Antikörper OKT3 eingesetzt. Das OKT3, das in den
Experimenten eingesetzt wurde, ist gegen Oberflächenantigene auf menschlichen TZellen gerichtet und bindet an die ε-Kette des CD3-Moleküls. Vergleicht man die
[Ca2+]i-Signale der Darmlymphozyten nach der Stimulation mit OKT3, die in den
Abbildungen 3.14 und 3.17 dargestellt sind, wird deutlich, dass bei verschiedenen
Mausstämmen eine unterschiedlich gute Stimulierbarkeit der LPLs festgestellt
werden konnte. Es reagierten bei den TRPC6(-/-)-Mäusen 67%, dem Wildtyp 1295VJ
52% und bei den Balb/cAnCrl-Mäusen 25% der erfassten Lymphozyten. Die Maus-TLymphozyten lassen sich im Vergleich zu den Ergebnissen für humane T-Zellen
besser stimulieren, wie sie in der Arbeit von Schwarz für humane LPLs (16%)
dargestellt sind [Schwarz, A. et al.,2004]. In dieser Dissertation konnte gezeigt
werden, dass im Vergleich zu den Kontrollversuchen ohne Stimulus, die murinen
Lymphozyten durch OKT3 stimuliert werden können, obwohl das verwendetet OKT3
gegen humane T-Zellantigene gerichtet ist.
Wie schon in den Thapsigarginexperimenten gezeigt werden konnte, reagieren mehr
PBL als LPL auf die gewählten Antikörper Anti-CD3+/Anti-CD28+-Stimulation. Auch in
diesem Fall zeigt sich eine Hyporeaktivität der Balb/cAnCrl-Maus Darmlymphozyten
gegenüber den Blutlymphozyten. Da bei den TRPC-Knock-out Tiere eine bessere
Stimulierbarkeit durch OKT3 festgestellt werden konnte und eine Stimulation bei der
Balb/cAnCrl-Mauslymphozyten erfolgreich durchgeführt wurde, war die Frage
66
Diskussion
interessant, wie Experimente mit Lösungen, die Thapsigargin enthalten, und
Lymphozyten aus anderen Mausstämmen verlaufen würden.
4.5. [Ca2+]i-Signale bei Lymphozten aus verschiedenen TRPCKnock-out Mäusen
Die Funktion der CRAC-Kanäle ist gut charakterisiert [Lewis, R.S. et al., 2001], aber
hinsichtlich des molekularen Aufbaus besteht noch kein exaktes Modell des Kanals.
Es wird angenommen, dass unter anderem TRP-Proteine am Aufbau beteiligt sind.
TRPC-Knock out Tiere sind für unsere Experimente interessant, da in diesen Tieren
gezielt verschiedene Proteine der TRPC-Familie ausgeschaltet werden können
[Freichel, M. et al., 2005]. Eine interessante Fragestellung dieser Arbeit war, ob das
Ausschalten von verschiedenen TRPC-Proteine eine Änderung des Kalziumsignals
in den Lymphozyten in dem in dieser Arbeit gewählten Versuchsaufbau erkennen
lässt. Dazu wurden T- und B-Lymphozyten aus verschiedenen TRPC-Knock outTieren, wie im Kapitel Material und Methoden beschrieben, isoliert.
Der Vergleich der Thapsigargin induzierten [Ca2+]i-Signale bei verschiedenen Knock
out Mäusen zeigte, dass das Ausschalten der TRPC6 (-/-)-, TRPC4C6 (-/-)2- und
TRPC1C4C6 (-/-)3Proteine keinen in unserem Versuchsaufbau messbaren Einfluss
auf den Kalziumeinstrom in die Zelle hat. Aus diesen Ergebnissen kann nur
geschlossen werden, dass die TRPC-Proteine bei der Regulation der [Ca2+]i keine
Rolle spielen.
Obwohl die Präparation von Lymphozyten aus dem Darm der Balb/cAnCrl-Maus gut
optimiert werden konnte, erwies sich die Präparation der drei verschiedenen Knock
out Mäuse, TRPC6 (-/-), TRPC4C6 (-/-)2 und TRPC1C4C6 (-/-)3, als sehr schwierig
und ließ keine statistische signifikante Auswertung zu.
Die in dieser Arbeit eingesetzten Tiere waren über das optimale Alter von 8 bis 12
Wochen hinaus, was auch schon die Präparation bei der Balb/cAnCrl-Maus erheblich
erschwerte. Dadurch wurden durchschnittlich 45 % weniger Zellen als bei der
Balb/cAnCrl-Maus pro Tier isoliert. Zusätzlich hafteten die isolierten Zellen auch sehr
schlecht auf den Deckgläsern, obwohl in verschiedenen Versuchsreihen Poly-LLysin, Poly-L-Ornithin und Cell-tak in verschiedenen Konzentrationen ausprobiert
wurden. Trotz der Optimierung der Präparation der Lymphozyten bei der
Balb/cAnCrl-Maus, konnten in den Experimenten mit TRPC-Knock out Tieren wenig
67
Diskussion
Zellen isoliert und eingesetzt werden und daher mussten viele Experimente
durchgeführt werden.
Hätten die TRPC6(-/-)-, TRPC4C6(-/-)2- und TRPC1C4C6(-/-)3Proteine einen
deutlichen Einfluss auf den Ca2+ Einstrom wie zu Beginn der Arbeit angenommen, so
müsste ihr Einfluss trotz der methodischen Schächen nachweisbar sein. Dies war
nicht der Fall und deckt sich mit der Interpretation mit der aktuellen Bewertung der
TRPC6(-/-)-,
TRPC4C6(-/-)2-
und
TRPC1C4C6(-/-)3Proteine
hinsichtlich
ihrer
Beteiligung am CRAC. Wie in der Einleitung ausgeführt wird mittlerweile die zentrale
Bedeutung der ORAI1 und STIM1-Proteine am CRAC beschrieben [Zhang, S.L. et
al., 2005, Liou, J. et al., 2005, Marchant, J.S., 2005, Freske, S. et al., 2006].
4.6. [Ca2+]i-Signale von Lymphozyten bei CED
In der Fachliteratur wurden von Qiao beschrieben, dass bei LPLs von CED-Patienten
die natürliche Hemmung der Proliferation aufgehoben ist [Qiao, L. et al., 1994].
Zudem wurden in den Arbeiten von Tutsch und Schwarz bei Kalzium-Imaging–
Experimenten erhöhte [Ca2+]i-Signale bei LPLs betroffener Patienten festgestellt
[Schwarz, A. et al, 2004, Tutsch,E. et al., 2004]. Da beim Menschen erhöhte [Ca2+]iSignale der T-Zellen des Darmes in erkrankten Gewebe gemessen wurden, war ein
weiteres Ziel dieser Dissertation, [Ca2+]i-Signale von murinen Lymphozyten aus
erkranktem Gewebe zu untersuchen. Danach sollten die Ergebnisse von murinen
Lymphozyten mit den Ergebnissen, die für humane Lymphozyten von Schwarz
gezeigt wurden [Schwarz, A. et al.,2004] verglichen werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach Optimierung der
Präparation von LPLs aus der gesunden Balb/cAnCrl-Maus, die Experimentdaten gut
mit den Ergebnissen aus humanen Zellen korrelieren. Dies ist die Grundlage für die
Möglichkeit, die Zellen aus der Maus als Modell für die Messung der [Ca2+]i-Signale
zu verwenden. Gleichzeitig war auch die Möglichkeit gegeben, ein bereits
existierendes Kolitismodell der Maus als Modell für die Messung der [Ca2+]i-Signale
in LPLs zu verwenden. Die entwickelten murinen Modelle haben verschiedene
Ansätze, aber sie bilden letztlich alle eine Entzündungsreaktion der Schleimhaut des
Darmes aus, die auch durch T-Zellen induziert wird. Wie schon im Kapitel
Ergebnisse erwähnt, konnten nur CD19+-Zellen aus Mäusen mit induzierter Kolitis in
unseren Experimenten gemessen werden. Es zeigen sich folgende Tendenzen: Die
PBL [Ca2+]i-Signale aus der an Kolitis erkrankten Mäuse liegen im Plateaubereich
68
Diskussion
unter denen der gesunden Kontrolltiere. Die LPL-[Ca2+]i-Signale aus der an Kolitis
erkrankten Tiere liegen im Plateau über dem der Kontrolltiere. Obwohl die LPL[Ca2+]i-Signale erhöht sind, erreichen die Daten aber nicht die Höhe der PBL-[Ca2+]iSignale der Kontrolltiere, wie das für humane Zellen von Schwarz gezeigt wurde
[Schwarz, A. 2004]. Es scheint, dass auch bei der Maus die LPL-[Ca2+]i-Signale aus
erkrankten Tieren erhöht sind, so dass die Hyporeaktivität der Zellen aus an Kolitis
erkranktem Darm gegenüber den isolierten Zellen aus gesunden Tieren aufgehoben
sein kann.
Bei der Präparation stellte sich heraus, dass auch die Zellen aus der C57BL6-Maus
schwieriger zu isolieren waren als die aus den Balb/cAnCrl-Mäusen. Trotz einiger
Versuchsreihen mit Veränderung der Inkubationszeiten konnte die Antwort auf die
Frage, warum wesentlich weniger Zellen aus dem Darm dieses Mäusestammes
isoliert wurden, nicht gefunden werden.
Ein weiteres Problem stellte die Isolierung der Zellen aus entzündetem Gewebe dar,
so dass bei diesen Experimenten nur zwischen 15 000 und 150 000 Zellen isoliert
werden konnten. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist das Gewebe
histologisch verändert. Je nach Erkrankungsintensität und Grad der Entzündungsprozesse kommt es zu Darmvernarbungen. Da es während der Experimente
nicht gelang, intakte CD3+-Zellen aus diesen Darmsegmenten zu isolieren, stellt sich
die Frage, ob das vernarbte Gewebe mit unserer Methode ausreichend aufgelöst
wurde. Es könnte sein, dass eine Verlängerung der Kollagenase-Inkubationszeit oder
eine stärkere mechanische Zerstörung des Gewebes mehr Zellen freisetzten würde.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass mehr T-Zellen im Bereich von
erkrankten Darmabschnitten nur in äußeren Bereichen sitzen und bei der Isolation
zusammen mit dem Schleim weggespült werden. In dem Schleim waren unter dem
Mikroskop Zellen erkennbar, da aber die von uns verwendeten Antikörper zur
Identifikation der Zellen, nicht an die durch den Schleim abgeschirmten Zellen heran
kamen, kann über die Zellart keine Aussage gemacht werden.
In
unseren
Zellpellets
aus
dem
entzündeten
Darm
wurden
durch
die
Antikörperfärbung Zellfragmente von CD3+-Lymphozyten gefunden. Das bedeutet,
dass
während
der
Isolation
Lymphozyten
platzen,
was
trotz
identischer
Versuchsdurchführung bei der Isolation der LPLs aus der Balb/cAnCrl-Maus nicht
festgestellt werden konnte. Zusätzlich werden bei unserem Versuchsaufbau sehr
viele Zellen aus der Experimentkammer weggespült. Bei der in dieser Arbeit
69
Diskussion
verwendeten
Methode
der
Identifikation
der
Zellen
ist
es
nötig,
die
Experimentkammer nach Zugabe der Antikörper durchzuspülen, um nicht haftende
Antikörper zu entfernen. Dadurch kann über die weggespülten Zellen keine Aussage
gemacht werden, da sie zur Identifikation nicht zur Verfügung standen. Voraktivierte
Zellen haften schlechter auf dem Deckglas als nicht aktivierte Zellen, was sich im
Laufe unserer Optimierungsversuche herausgestellt hat. Da von Schwarz und Tutsch
[Schwarz, A. et al, 2004, Tutsch,E. et al., 2004] gezeigt wurde, dass LPLs aus
erkranktem Gewebe höhere [Ca2+]i-Signale generieren, ist es möglich, dass bei
Zellen aus entzündetem Gewebe die Haftung so schlecht ist, dass sie bevorzugt aus
der Experimentkammer gespült werden oder platzen.
4.7. Schlußbetrachtung und Ausblicke
Von Schwarz und Tutsch [Schwarz, A. et al, 2004, Tutsch,E. et al., 2004] wurde für
humane Zellen gezeigt, dass die [Ca2+]i-Signale sowohl für dissoziierte Zellen als
auch für Zellen im Gewebeverband, niedrigere [Ca2+]i der LPL gegenüber den PBLs
bestätigen. Zusammen mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, konnte gezeigt
werden, dass die Balb/cAnCrl-Maus als Modellorganismus für die Untersuchungen
der erniedrigten [Ca2+]i-Signale in T-Lymphozyten aus dem Darm und die
wahrscheinlich damit verbundene T-Zell-Hyporeaktivität benutzt werden kann.
Außerdem besteht die Möglichkeit, nach Optimierung der Zellpräparation, auch das
eingesetzte Kolitismodell für weitere Untersuchungen von [Ca2+]i-Signalen in TLymphozyten zu verwenden. Das bessere Verständnis der [Ca2+]i-Signale könnte
dazu führen, Krankheiten wie CED genauer zu untersuchen und bessere Therapien
zu finden. Denn die Kalziumabhängigkeit vieler zellulärer Prozesse, wie von z.B. dem
Transkriptionsfaktor NFAT, der auch bei CED eine wichtige Rolle spielt, zeigt den
Zusammenhang zwischen Kalziumsignalen und Steuerung der Zellen [Schottelius,
A.J.et al., 1999].
Da die Daten von Tutsch gut mit den Daten von Schwarz und den Daten dieser
Arbeit korrelieren, liegt der Rückschluss nahe, dass die Maus als Modell zur
Untersuchung der [Ca2+]i-Signale geeignet ist. So konnte in der vorliegenden
Dissertation gezeigt werden, dass sowohl pathophysiologische Experimente
durchgeführt als auch grundlegende, physiologische Fragestellungen untersucht
werden können.
70
Literatur
5. Literatur
Bautista, D.M., Lewis, R.S., 2004. Modulation of plasma membrane calcium-ATPase
activity by local calcium microdomains near CRAC channels in human T cells. J
Physiol 556.3: 805-817
Berridge, M.J., Bootman, M.D., Roderick, H.L.,2003. Calcium Signalling: Dynamics,
Homeostasis And Remodelling. Molecular Cell Biology 4:517-529.
Braunstein, J., Qiao, L., Autschbach, F., Schürmann, G., Meuer, S., 1997. T cells of
the human intestinal propria are high producers of interleukin-10. Gut 41:215-220.
Chandy, K.G., Gutman, G.A., Grissmer, S., 1993. Physiological role, molecular
structure and evolutionary relationships of voltage-gated potassium channels in T
lymphocytes. The Neurosciences, 5:pp125-134.
Dolmetsch, R.E., Lewis, R.S., 1994. Signaling between intracellular Ca2+ stores and
depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J
Gen Physiol 103:365-388.
Dolmetsch, R.E., Xu, K., Lewis, R.S., 1998. Calcium oscillations increase the
efficiency and specificity of gene expression. Nature 392:933-936.
Duchmann, R., Hoffmann, J., Marth, T., Schneider, T., Stallmach, A., Zeitz, M., 1999.
Mukosales Immunsystem im Darm. Magazin Forschung 1:47-62.
Ebert, E.C., Roberts, A.I., 1996. Costimulation of the CD3 pathway by CD28 ligation
in human intestinal lymphocytes. Cellular Immunology 171:211-216.
Ebert, E.C., 2003. Activation of human intraepithel lymphocytes reduces CD3
expression. Clin Exp Immunol 132:424-429.
71
Literatur
Erler, I., Al-Ansary, D.M.M., Wissenbach, U., Wagner, T.F.J., Flockerzi, V. Niemeyer,
B.A., 2006. Trafficking and assembly of the cold-sensitive TRPM8 channel. J Biol
Chem 281:38396-38404.
Fanger, C.M., Rauer, H., Neben, A.L., Miller, M.J., Rauer, H., Wulff, H., Rosa, C.J.,
Ganellin, C.R., Chandy, K.G., Cahalan, M.D., 2001. Calcium-activated potassium
channels sustain calcium signaling in T lymphocytes. Selctive blockers and
manipulated channel expression levels. J Biol Chem 275:12249-12256.
Feldhahn, N., Schwering, I., Lee, S., Wartenberg, M., Klein, F., Wang, H., Zhou, G.,
Wang, S.M., Rowley, J.D., Hescheler, J., Krönke, M., Rajewsky, K., Küppers, R.,
Müschen, M., 2002. Silencing of B cell rezeptor signals in human naïve B cells. J Exp
Med 196:1291-1305.
Feske, S., Gwack, Y., Prakriya, M., Srikanth, S., Puppel, S.H., Tanasa, B., Hogan,
P.G., Lewis, R.S., Daly, M., Rao, A., 2006. A mutation in Orai1 causes immune
deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature 441:179-185.
Feske, S., Prakriya, M., Rao, A., Lewis, R.S., 2005. A severe defect in CRAC Ca2+
channel activation and altered K+ channel gating in T cells from immunodeficient
patients. J Exp Med 202:651-662.
Freichel, M. Vennekens, R., Olausson, J., Stolz, S., Philipp, S.E., Weissgerber, P.,
Flockerzi, V., 2005. Functional role of TRPC proteins in native systems: implications
from knockout and knock-down studies. J Physiol 567: 59-66.
Griesemer, D., Quintana, A., Mery, L. Schwarz, E., Hoth, M., 2004. Calcium
Transport in Lymphocytes. Nova Acta Leopoldina NF 89, 336:75-80.
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R.Y., 1985. A new generation of Ca2+ indicators
with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260:3440-3450.
Hara, J., Ohtani, H., Matsumoto, T., Nakamura, S., Kitano, A., Arakawa, T., Nagura,
H., Kobayashi, K., 1997. Expression of costimulatory molecules B7-1 and B7-2 in
72
Literatur
macrophages and granulomas of Crohn΄s disease: demonstration of cell-to-cell
contact with T lymphocytes. Lab Invest 77:175-184.
Hoth, M., Fanger, C.M., Lewis, R.S., 1997. Mitochondrial regulation of store-operated
calcium signaling in T lymphocytes. J Cell Biol 137:633-648.
Hoth, M., Button, D.C., Lewis, R.S., 2000. Mitochondrial control of calcium-channel
gating: a mechanism for sustained signaling and transcriptional activation in T
lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA 97:10607-10612.
Jurjus, A.R., Khoury, N.N., Reimund, J.M., 2004. Animal models of inflammatory
bowel disease. J Pharmacol Toxicol Methods 50:81-92.
Kerschbaum, H.H., Negulescu, P.A., Cahalan, M.D., 1997. Ion channels, Ca2+
signaling, and reporter gene expression in antigen-specific mouse T cells. J Immunol
159:1628-1638.
Klinke,R., Pape, H.-C., Silbernagel,S., 2005. Physiologie. 5. Auflage, Thieme
Kwan, H.Y., Huang, Y., Yao, X., 2004. Regulation of canonical transient receptor
potential isoform 3 (TRPC3) channel by protein kinase G. Proc Natl Acad Sci USA
101:2625-2630.
Lewis, R.S., Cahalan, M.D., 1989. Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and
transmembrane Ca2+ current in human leukemic T-cells. Cell Regul 1:99-112.
Lewis, R.S., 2001. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu Rev
Immunol 19:497-521.
Liou, J., Kim, M.L., Heo, W.D., Jones, J.T., Myers, J.W., Ferrell, J.E. Jr., Meyer, T.,
2005. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx.
Curr Biol 15:1235-1241.
73
Literatur
De Maria, R., Fais, S., Silvestri, M., Frati,L., Pallone, F., Santoni, A., Testi, R., 1993.
Continuous in vivo activation and transient hyporesponsiveness to TcR/CD3
triggering of human gut lamina propria lymphocytes. Eur. J. Immunol. 23:3104-3108.
Mayer, L., 1996. Yin and Yang of mucosal immunology. Transplant Proc 28:24352437.
Marchant, J.S., 2005. Cellular Signalling : STIMulating Calcium Entry. Curr Biol
13:R493-R496.
Melgar, S., Karlsson, A., Michaëlsson, E., 2005. Acute colitis induced by dextran
sulfate sodium progresses to chronicity in C57BL/6 but not in BALB/c mice:
correlation between symptoms and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 288: G1328-1338.
Mowat, A.M., 2003. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal
antigens. Nat Rev Immunol 3:331-341.
Nilius, B., Prenen, J., Tang, J., Wang,C., Owsianik, G., Janssens, A., Voets, T., Zhu,
M.X., 2005. Regulation of the Ca2+ sensitivity of the nonselective cation channel
TRPM4. J Biol.Chem. 280:6423-6433.
Novatis Pharm de. 2006
Panyi, G., Bagdány, M., Bodnár, A., Vámosi, G., Szentesi, G., Jenei, A., Mátyus, L.,
Varga, S., Waldmann, T.A., Gáspar, R. Damjanovich, S., 2003. Colocalization and
non-random distribution of Kv1.3 potassium channels and CD3 molecules in the
plasma membrane of human T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA 100:2592-2597
Pawlowski,
N.N,
Kakirman,
H.,
Kühl,
A.A.,
Liesenfeld,
O.,
Grollich,
K.,
Loddenkemper, C., Zeitz, M. Hoffmann, J.C., 2005. Alpha-CD2 mAb treatment safely
attenuates adoptive transfer colitis. Lab Invest 85:1013-1023.
74
Literatur
Penner, R., Fleig, A., 2004. Store-operated calcium entry: a tough nut to CRAC.
Sci.STKE 2004: pe38
Podolsky, M.J., Lasker, A., Flaminio, M.J. Gowda, L.D., Ezekowitz, R.A., Takahashi,
K., 2006. Characterization of an equine mannose-binding lectin and its roles in
disease. Biochem Biophys Res Commun 343:928-936.
Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, 257. Auflage, 1994. Walter de Gruyter.
Qiao, L., Schürmann, G., Betzler, M., Meuer, S.C., 1991. Activation and signaling
status of human lamina propria T lymphocytes. Gastroenterology 101:1529-1536.
Qiao, L., Golling, M., Autschbach, F., Schürmann, G., Meuer, S.C., 1994. T cell
receptor repertoire and mitotic responces of lamina propria T lymphocates in
inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol 97:303-308.
Quintana, A., Hoth, M., 2004. Apparent cytosolic calcium gradients in T-lymphocytes
due to fura-2 accumulation in mitochondria. Cell Calcium 36:99-109.
Quintana, A., Griesemer, D., Schwarz, E.C. and Hoth, M., 2005. Calcium-dependent
activation of T-lymphocytes. Pflugers Arch 450:1-12.
Ramsey, I.S., Delling, M., Clapham,D.E., 2006. An introduction to TRP channels.
Annu Rev Physiol 68:619-647.
Rao, A., Luo, C., Hogan, P.G., 1997. Transcription factors of the NFAT family:
regulation and function. Annu Rev Immunol, 15:707-747
Rizzuto, R. et Pozzan, T., 2003. When calcium goes wrong : genetic alterations of a
ubiquitous signaling route. Nature Genetics 2:135-141.
Roos, J., DiGregorio, P.J., Yeromin, A.V., Ohlsen, K., Lioudyno, M., Zhang, S.,
Safrina, O., Kozak, J.A., Wagner, S.L., Cahalan, M.D., Veliςebi, G., Stauderman,
K.A., 2005. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+
channel function. J Cell Biol 189:435-445.
75
Literatur
Schottelius, A.J., Mayo, M.W., Sartor, R.B. Baldwin, A.S. jr., 1999. Interleukin-10
signaling blocks inhibitor of κB kinase activity and nuclear factor kappa B DNA
binding. J Biol Chem 274:31868-31874.
Schwarz, A., Tutsch,E., Ludwig,B., Schwarz,E.C., Stallmach,A., Hoth, M., 2004. Ca2+
signaling in identified T-lymphocytes from human intestinal mucosa. J Biol Chem
7:5641-5647.
Schwarz,
E.C.,
Kummerow,
C.,
Wenning,
A.S.,
Wagner,K.,
Sappok,
A.,
Waggershausen, K., Griesemer, D., Strauß, B., Wolfs, M.J., Quintana, A., Hoth, M.,
2007. Calcium dependence of T cell proliferation following focal stimulation. Eur J
Immunol, 37:2723-2733.
Specian, R.D., Neutra, M.R., 1982. Regulation of intestinal goblet cell secretion. I.
Role of parasympathetic stimulation. Am J Physiol 242: G370-G379.
Sprent, J., 1994. T and B memory cells. Cell 76:315-322.
Swidsinski, A., Ladhoff, A., Pernthaler,A., Swidsinski, S., Loening-Baucke, V., Ortner,
M., Weber, J., Hoffmann, U., Schreiber, S., Dietel, M., Lochs, H., 2002. Mucosal flora
in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 122:44-54.
Targan, S.R., Deem, R.L., Liu, M., Wang,S., Nel, A., 1995. Definition of a lamina
propria T cell responsive state. J Immunol 154:664-675.
Targan, S.R., Karp, L.C., 2005. Defects in mucosal immunity leading to ulcerative
colitis. Immunol Rev 206:296-305.
Tutsch,E., Griesemer, D., Schwarz, A., Stallmach, A., Hoth, M., 2004. Two-photon
analysis of calcium signals in T lymphocytes of intact lamina propria from human
intestine. Eur J Immunol 34:3477-3484.
76
Literatur
Zhang, S.L., Yu, Y., Roos, J., Kozak, J.A., Deerinck, T.J., Ellisman, M.H.,
Stauderman, K.A. Cahalan, M.D., 2005. Stim1 is a Ca2+ sensor that activates CRAC
channels and migrates from the Ca2+ store to the plasma membran. Nature 437:902905.
Zhu, X., Jiang, M., Peyton, M., Boulay, G., Hurst, R., Stefani, E., Birnbaumer, L.,
1996. Trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated
capacitative Ca2+ entry. Cell 85:661-671.
Zitt, C., Strauss, B., Schwarz, E.C.,Spaeth, N.,Rast, G.,Hatzelmann, A., Hoth,M.,
2004. Potent inhibition of Ca2+ release-activated Ca2+ channels and T-lymphocyte
activation by the pyryzole derivative BTP2. J Biol Chem 279:12427-12437.
Zweifach, A., Lewis, R.S., 1993. Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is
activates by depletion of intracellulat Ca2+ stores. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:62956299.
77
Anhang
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Birgit Gisela Löffler, geb. Heß
Geburtsdatum/-ort
24.09.1964 in Quierschied
Familienstand
verheiratet
Berufserfahrung und Hochschulstudium
3/2007 – 8/2007
mibeg-Institut Medizin Köln,
Weiterbildung Klinische Forschung,CRA
Praktikum beim BfArM, Bonn
7/2003 – 2/2007
Universitätsklinik Homburg, Physiologisches Institut
Wissenschaftliche Mitarbeiterin
Promotion (zur Begutachtung eingereicht),auf dem Gebiet
der fluoreszenzmikroskopischen Messung der freien
zytosolischen Kalziumkonzentration in Lymphozyten
10/1990 – 6/2003
Firma FESTO AG & Co, Rohrbach,
Mitarbeiterin (30 Stunden/Woche) in der Abteilung
Fertigung von Ventilgruppen,
10/1988 – 9/2002
•
Urlaubsvertreterin der Teamleitung der Inselgruppen
•
Bearbeitung der Sonderaufträge
•
Beteiligung am KVP
•
Einarbeitung von neuen Mitarbeitern
Universität des Saarlandes, Studium der Biologie
Studienschwerpunkte:
Genetik,
Botanik,
Biochemie,
Biophysik, Abschluss: Diplom Biologin
Diplomarbeit auf dem Gebiet von atomabsorbtionsspektroskopischen Untersuchungen von Ionenkanälen in
der Erythrozytenmembran
6/1985 – 6/1991
Bäckerei
Heß;
Krankheitsbedingte
Vertretung
Geschäftsleitung im elterlichen Betrieb
•
Betreuung der Auszubildenden
•
Herstellung, Kalkulation und Verkauf der Waren
78
der
Anhang
Schul- und Berufsausbildung
10/1985 – 4/1988
Technikum Landau
Abschluss: Biologisch- Technische -Assistentin,
8/1981 – 7/1985
Wirtschaftsgymnasium Saarbrücken
Abschluss: Abitur
8/1979 – 7/1981
Wirtschaftsschule Saarbrücken
Abschluss: Mittlere Reife
8/1971 – 7/1979
Grundschule Fischbach, Hauptschule Quierschied
Sprachkenntnisse
Englisch
in Wort und Schrift
Französisch
Grundkenntnisse
Weitere Kenntnisse
Qualitätsmanagement
Teilnahme an einem KVP – Team Schulungszyklus im
Lernzentrum FESTO
Buchführung
fundierte Kenntnisse durch elterlichen Betrieb
Hobbys
Aquarell- und Seidenmalerei
Veröffentlichung
Griesemer D., Löffler B., Kummerow C., Quintana A., Schwarz E.C., Hoth M., 2006.
CRAC calium channels as signal transducers in T-cells, Signal Transduction 6, 233239.
Saarbrücken 2007
79
Anhang
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde an der Universitätsklinik Homburg, Physiologisches
Institut, in der Arbeitsgruppe von Herrn Professor Dr. Markus Hoth erstellt.
Meinem Betreuer, Herrn Professor Dr. Markus Hoth, möchte ich für die Vergabe des
Themas, sowie für die gute Betreuung danken. Bedanken möchte ich mich auch bei
dem gesamten Team der Arbeitsgruppe Hoth, insbesondere bei Frau Anja Ludes,
Frau Bettina Strauss und Herr Dr. Ariel Quintana, für die gute Zusammenarbeit.
Ebenso möchte ich mich bei Herrn Dr. Lutz Sternfeld für die interessanten
Diskussionen bedanken.
80