Doktorarbeit komplett
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Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover __________________________________________________________ Differentielle Genexpression im Rückenmark von Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) knock-out Mäusen INAUGURAL–DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Katrin Schlarmann aus Steinfeld (i. Oldb.) Hannover 2006 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. Univ.-Prof. Dr. Claudia Grothe/ PD Dr. Peter Claus 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna Tag der mündlichen Prüfung: 14. November 2006 Meiner Familie gewidmet 1. Einleitung............................................................................................................. 1 2. Literaturübersicht................................................................................................ 3 2.1 Das Fibroblastenwachtumsfaktor (FGF) – System ............................................... 3 2.2 Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) .............................................................. 4 2.3 FGF-2 knock-out Mäuse ....................................................................................... 6 2.3.1 Herstellung transgener FGF-2 knock-out Mäuse ........................................... 6 2.3.2 Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse .......................................................... 8 2.4 FGF-2 und prä-messenger RNA Spleissen ........................................................ 11 2.5 Konzeptioneller Hintergrund und Ziel der vorliegenden Arbeit............................ 13 3. Material und Methoden ..................................................................................... 14 3.1 Chemikalien ........................................................................................................ 14 3.2 Geräte................................................................................................................. 15 3.3 Sonstiges............................................................................................................ 16 3.4 Gewebe .............................................................................................................. 17 3.4.1 Rückenmark................................................................................................. 17 3.4.2 Striatum ....................................................................................................... 17 3.4.3 Cerebraler Cortex ........................................................................................ 18 3.4.4 Rückenmark für die in-situ-Hybridisierung ................................................... 18 3.5 Oligonukleotide (Primer) ..................................................................................... 18 3.6 DNA-Längenmarker............................................................................................ 21 3.7 Enzyme............................................................................................................... 21 3.8 Puffer und Lösungen .......................................................................................... 22 3.8.1 RT-PCR ....................................................................................................... 22 3.8.2 DNA-Agarosegelelektrophorese .................................................................. 22 3.8.3 RNA-Agarosegelelektrophorese .................................................................. 22 3.8.4 Restriktionsverdau ....................................................................................... 23 3.8.5 Markierung von Sonden............................................................................... 23 3.8.6 In-situ-Hybridisierung ................................................................................... 24 3.8.7 Reagenziensets ........................................................................................... 25 3.8.8 Nährmedien ................................................................................................. 25 3.9 Versuchstiere...................................................................................................... 26 3.9.1 Tierhaltung und Zucht .................................................................................. 26 3.9.2 Gewebe-Präparation.................................................................................... 27 3.10 Allgemeine Maßnahmen beim Umgang mit RNA ............................................. 29 3.11 Isolierung von Gesamt-RNA ............................................................................. 29 3.12 DNase-Verdau .................................................................................................. 31 3.13 RNA-Reinigung................................................................................................. 31 3.14 Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese ........................................................ 31 3.15 RNA-Quantifizierung......................................................................................... 33 3.16 Einzelstrang-cDNA-Synthese durch reverse Transkription............................... 33 3.17 Semiquantitative RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PolymeraseKettenreaktion)………….. ................................................................................... 35 3.18 Agarosegel-Elektrophorese .............................................................................. 39 3.19 Statistische Auswertung ................................................................................... 40 3.20 Klonieren von PCR-Produkten.......................................................................... 40 3.20.1 Ligation der Banden-cDNA in einen geeigneten Vektor ............................ 42 3.20.2 Transformation kompetenter Bakterien mit dem Vektor pGEM®-T ............ 42 3.21 Plasmid-Präparation (Minipräparation) ............................................................. 44 3.22 Restriktionsanalyse der Plasmid-Klone ............................................................ 45 3.23 Sequenzierung.................................................................................................. 45 3.24 In-situ-Hybridisierung (ISH)............................................................................... 47 3.24.1 Perfusion und Präparation von Rückenmarksgewebe............................... 47 3.24.2 Paraffineinbettung ..................................................................................... 48 3.24.3 Paraffin-Schnitte ........................................................................................ 49 3.24.4 Linearisierung der Plasmid-DNA ............................................................... 50 3.24.5 Nicht-radioaktive Markierung von RNA mit Digoxygenin ........................... 51 3.24.6 ISH an Paraffinschnitten ............................................................................ 52 4. Ergebnisse......................................................................................................... 55 4.1 "Screening" nach alternativ gespleissten mRNA-Transkripten im Rückenmark.. 55 4.2 Signifikante Hochregulation der Expression des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ............................... 59 4.3 Ionotrope Glutamatrezeptor-Expression im Rückenmark und im cerebralen Cortex von FGF-2 knock-out Mäusen................................................................. 60 4.3.1 Signifikante Hinunterregulation der Expression der AMPA-TypGlutamatrezeptoren 3 und 4 im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ........................................................................................................ 61 4.3.2 Keine Expressionsunterschiede der AMPA-Typ Glutamatrezeptoren im cerebralen Cortex von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen ................... 64 4.4 Dopaminrezeptor-Expression im Rückenmark und im Striatum von FGF-2 knock-out Mäusen .............................................................................................. 65 4.4.1 Signifikante Hochregulation der Dopamin1-Rezeptor Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ................................................ 68 4.5 Histologischer Nachweis von Dopamin1-Rezeptor mRNA im zervikalen Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen .................................. 69 5. Diskussion ......................................................................................................... 72 5.1 Methodische Aspekte ......................................................................................... 72 5.1.1 Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RTPCR) ............................................................................................................ 72 5.1.2 In-situ- Hybridisierung (ISH)......................................................................... 73 5.2 Zusammenfassung der Ergebnisse .................................................................... 75 5.3 Alternatives Spleissen und differentielle Expression im Rückenmark................. 78 5.4 Differentielle Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ........... 80 5.4.1 Der metabotrope Glutamatrezeptor 1 .......................................................... 80 5.4.2 Die ionotropen Glutamatrezeptoruntereinheiten 3 und 4 vom AMPA-Typ .......................................................................................................................81 5.4.3 Der Dopamin1-Rezeptor............................................................................... 83 5.5 Verteilung von Dopamin- und Glutamatrezeptoren im Rattenrückenmark.......... 86 5.5.1 Überblick über die Verteilung der Dopaminrezeptoren im Rückenmark der Ratte ............................................................................................................ 86 5.5.2 Überblick über die Verteilung der ionotropen Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ im Rückenmark der Ratte .......................................................... 89 5.5.3 Überblick über die Verteilung der Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren im Rückenmark der Ratte............................................ 91 5.6 FGF-2 und differentielle Expression. Welche Rolle spielt dies für den Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse? Zeigen FGF-2 knock-out Mäuse Parallelen zu neurodegenerativen Erkrankungen?................................................................... 93 6. Zusammenfassung.......................................................................................... 100 7. Summary.......................................................................................................... 102 8. Literaturverzeichnis ........................................................................................ 104 Abkürzungsverzeichnis A Absorption Abb. Abbildung ALS Amyotrophe Lateralsklerose Amp Ampicillin AMPA α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat AP Alkalische Phosphatase BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat BLAST basic local alignement search tools bp Basenpaare cDNA komplementäre DNA CO2 Kohlendioxid DEPC Diethylpyrocarbonat DIG Digoxigenin (Farbstoff aus Digitalis purpurea) DNA Desoxyribonucleinsäure DNase Desoxyribonuclease D1R Dopamin1-Rezeptor dNTP Desoxynuleotidtriphosphat dsDNA doppelsträngige DNA DTT Dithiothreitol E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ES-Zellen embryonale Stammzellen EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol FGF-2 Fibroblastenwachstumsfaktor-2 FGFR Tyrosinkinase-Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptoren g Gramm bzw. Erdbeschleunigung GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase gDNA genomische DNA HMW höhermolekulare (21 und 23 kDa) Isoformen von FGF-2 hnRNA Kern-RNA hsDNA Heringssperma-DNA HSPG Heparansulfat-Proteoglykane ionoGluR ionotroper Glutamatrezeptor vom AMPA-Typ ISH in-situ-Hybridisierung kb Kilobase; = 1000 Basenpaare kDa Kilodalton ko FGF-2 knock-out Mäuse LB Luria Bertani (Bakterienmedium) M Molar mA Milliampere µg Mikrogramm mg Milligramm mGluR1 metabotrober Glutamatrezeptor 1 MHH Medizinische Hochschule Hannover min Minute µl Mikroliter ml Milliliter µm Mikrometer mM Millimolar mmHg Millimeter Quecksilbersäule; 1 mmHg = 133,322 Pascal MMLV Moloney murine leukemia virus MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure mRNA messenger RNA NBT Nitroblautetrazolium NCBI National Center for Biotechnology Information (USA) NLS nuclear localization sequence NMDA N-Methyl-D-aspartat N-terminal Amino-terminales Ende von Proteinen OD260 optische Dichte bei 260 nm Wellenlänge PBS Phosphat gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion PFA Paraformaldehyd pGEM®-T Plasmid der Firma Promega (Madison, USA) PNS peripheres Nervensystem Poly-A+ Polyadenyl RM Rückenmark RNA Ribonucleinsäure RNase Ribonuclease rpm Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA RT Reverse Transkriptase RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SDS Natriumdodecylsulfat SF3a66 Spleissfaktoruntereinheit SF3a66 SMA Spinale Muskelatrophie SMN survival of motoneuron protein snRNA small nuclear RNA snRNPs prä-mRNA Komplexe snoRNPs ribosomale Komplexe s.o. siehe oben SSC (Sodium-) Natriumcitrat/ (Sodium-) Natriumchlorid ssDNA einzelsträngige DNA s. u. siehe unten Tab. Tabelle Taq-Polymerase Thermus aquaticus DNA-Polymerase TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer Tm Schmelztemperatur Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan tRNA Transfer-RNA U Unit UV Ultraviolett V Volt vgl. vergleiche wt Wildtyp-Mäuse X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid ZNS zentrales Nervensystem ZTL Zentrales Tierlabor Statistische Größen χ Mittelwert n Anzahl der Versuche p Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau) SEM Standardfehler des Mittelwertes (Standard Error ot the Mean) 1. Einleitung 1 1. Einleitung Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) sind während der embryonalen Entwicklung und im adulten Organismus an einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie Mitogenese, Angiogenese, Chemotaxis, Mesoderminduktion und Differenzierung von Zellen mesodermaler und neuroektodermaler Herkunft, beteiligt (SLACK et al., 1978; BÖHLEN, 1989; BIKFALVI et al., 1997). Die FGF-Familie umfasst derzeit 23 verschiedene Polypeptide. Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) ist eines davon (ORNITZ und ITOH, 2001). FGF-2 ist ein neurotropher Faktor, der die Proliferation und Differenzierung von neuronalen Präkursoren und von Gliazellen stimuliert (RAY et al., 1997). Nach Verletzungen vermittelt FGF-2 neurotrophe und neuriteninduzierende Effekte im zentralen und peripheren Nervensystem (KLIMASCHEWSKI et al., 1999; GROTHE und NIKKHAH, 2001). Hinsichtlich der Effekte von FGF-2 auf Motoneuronen gibt es eine Vielzahl von Befunden (GROTHE und WEWETZER, 1996). Exogen applizierter FGF-2 stimuliert das Überleben und die Cholinacetyltransferase-Aktivität kultivierter embryonaler bzw. postnataler Motoneurone (ARAKAWA et al., 1990; GROTHE et al., 1991; GROTHE und UNSICKER, 1992; HUGHES et al., 1993). In vivo Administration des Faktors verhindert das läsionsinduzierte Absterben postnataler Motoneurone und erhöht die Cholinacetyltransferase-Aktivität embryonaler Motoneurone (GROTHE et al., 1991; GROTHE und UNSICKER, 1992). FGF-2 kommt in mehreren Isoformen vor, deren Bildung von einer gemeinsamen messenger RNA (mRNA) an alternativen StartCodons translational reguliert wird. So wird die 18 kDa-Isoform am AUG Start-Codon translatiert, während die Herstellung höhermolekularer Isoformen (21 kDa, 23 kDa) an CUG Start-Codons initiiert wird (FLORKIEWICZ und SOMMER, 1989; PRATS et al., 1989; FLORKIEWICZ et al., 1991). Der unterschiedliche N-terminale Bereich der drei Isoformen führt zu verschiedenen intrazellulären Lokalisationen (BIKFALVI et al., 1995; CLAUS et al., 2003). Erst kürzlich konnte in der Abteilung Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) erstmals die spezifische Interaktion von 1. Einleitung 2 FGF-2 mit Proteinen der Spleissing-Maschinerie, wie dem survival of motoneuron (SMN)-Protein und der Spleissfaktoruntereinheit SF3a66, nachgewiesen werden (CLAUS et al., 2003, 2004; GRINGEL et al., 2004). SMN ist ein SpleissingAssemblierungsfaktor und FGF-2 möglicherweise an der Regulation des Spleissens beteiligt. Diese Interaktionen lassen vermuten, dass FGF-2 einen Effekt auf alternatives Spleissen und/oder differentielle Genexpression besitzten könnte. Das Ziel dieser Arbeit ist es, im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen die spezifischen Effekte der FGF-2-Abwesenheit auf alternatives Spleissen und differentielle Genexpression zu analysieren. Hierzu wird ein "Screening"-Experiment mit Kandidatengenen, die alternativ-gespleisste Transkripte im Rückenmark aufweisen (JENSEN et al., 2000), durchgeführt. 2. Literaturübersicht 3 2. Literaturübersicht 2.1 Das Fibroblastenwachtumsfaktor (FGF) – System Während der embryonalen Entwicklung spielen Fibroblastenwachstumsfaktoren (Fibroblast Growth Factors, FGFs) eine Rolle bei der Proliferation, Migration und Differenzierung von Zellen. Im adulten Organismus sind sie an der Aufrechterhaltung und Regeneration von Gewebe beteiligt (GROTHE und NIKKHAH, 2001; ORNITZ und ITOH, 2001; MALECKI et al; 2004). Die FGF-Familie umfasst derzeit 23 verschiedenen Polypeptide (ORNITZ und ITOH, 2001). Fibroblastenwachstumsfaktoren bestehen aus 155 bis 268 Aminosäureresten (ORNITZ und ITOH, 2001). Alle FGFs besitzen eine sogenannte "zentrale Domäne", die aus etwa 120 Aminosäureresten besteht und in der die Sequenzübereinstimmung 30-60% beträgt. Die zentrale Domäne enthält konservierte Aminosäurereste und strukturelle Motive, die den FGFs eine gemeinsame Tertiärstruktur und die Fähigkeit, an Heparin zu binden, verleiht (ZHU et al., 1991; FAHAM et al., 1996). Der größte Teil der im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisierten FGFProteine wird vom Golgi-Apparat in den Extrazellularraum sezerniert (MIYAMOTO et al., 1993; MIYAKE et al.,1998; MIYAKAWA et al., 1999; XU et al., 1999; OHMACHI et al., 2000; REVEST et al., 2000). FGF-1 und FGF-2 werden nicht sezerniert, da sie trotzdem in den Extrazellularraum gelangen, vermutet man, dass sie von beschädigten Zellen oder durch einen vom endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Weg unabhängigen exozytotischen Mechanismus freigesetzt werden (MIGNATTI et al., 1992). Die dritte Gruppe (FGF-11 bis FGF-14) ist intrazellulär lokalisiert (SMALLWOOD et al., 1996; YAMAMOTO et al., 1998; MUNOZ-SANJUAN et al., 2000; WANG et al., 2000). FGF-Proteine binden an hoch-affine transmembranäre Tyrosinkinase-Rezeptoren (FGFR). Diese bestehen aus einer extrazellulären, einer transmembranen Domäne sowie einer cytoplasmatischen Tyrosinkinase-Domäne (LEE et al., 1989; DIONNE et 2. Literaturübersicht 4 al., 1990; JOHNSON und WILLIAMS, 1993). Die extrazelluläre Domäne besteht aus drei Immunglobulin-ähnlichen Schleifen (LEE et al., 1989). Die Schleifen II und III treten in Kontakt mit dem FGF-Liganden, dabei ist der COOH-terminale Anteil von Schleife III ausschlaggebend für die Bindungsspezifität (CHEON et al., 1994; ORNITZ et al., 1996). Es sind vier FGFR bekannt, wobei durch alternatives Spleissen des COOH-Anteils der Schleife III verschiedene Spleiss-Varianten mit spezifischen Ligandenbindungs-Eigenschaften entstehen (JOHNSON et al., 1991; VAINIKKA et al., 1992; ORNITZ et al., 1996). Die Bindung des FGF-Liganden führt zur Dimerisierung des Tyrosinkinase-Rezeptors und zur Aktivierung der Tyrosinkinase im cytosolischen Anteil. Dadurch kommt es zur Autophosphorylierung des Rezeptors. Über sogenannte SH2-Domänen können eine Reihe von Proteinen, wie z.B. Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) oder Phospholipase Cγ, an die Phosphotyrosylreste des Rezeptors andocken. Im Falle von Grb2 erfolgt die Signaltransduktion in den Zellkern über eine Kaskade von Proteinkinasen. Bei Phospholipase Cγ-Aktivierung kommt es über die Inositoltrisphosphat (IP3)-Kaskade zur Signaltransduktion in den Kern. Beides führt zu einer Änderung der Genexpression (GOLDFARB et al., 2001). FGF-Signale werden aber auch über niedrig-affine Rezeptoren, die aus Heparansulfat-Proteoglykanen (HSPG) bestehen, vermittelt (ORNITZ et al., 1992; SPIVAK-KROIZMAN et al., 1994; LIN et al., 1999). Extrazellulärer FGF bindet fest an HSPG, dadurch wird die FGF-Diffusion eingeschränkt und die Interaktion mit Rezeptoren auf den Nachbarzellen gefördert (BAEG et al., 2001; MOSCATELLI et al., 1987). Zusätzlich unterstützen und stabilisieren HSPGs die Zusammenlagerung von FGF-Liganden und FGFR (SCHLESSINGER et al., 2000). 2.2 Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) gehört der FGF-Familie an, die derzeit 23 verschiedene Polypeptide umfasst (ORNITZ und ITOH, 2001). Die zentrale 2. Literaturübersicht 5 Domäne von FGF-2 enthält zwölf antiparallele ß-Faltblattstrukturen (ERIKSSON et al., 1991; ZHU et al., 1991). Die konservierten Aminosäure-Reste in diesen ßFaltblattstrukturen führen zur Ausbildung der typischen dreidimensionalen Struktur, einer Kleeblattstruktur bestehend aus vier ß-Faltblatt-Blättern, die dreieckig angeordnet sind ( FAHAM et al., 1998). Konservierte basische Aminosäurereste im zehnten und elften ß-Faltblatt bilden die Heparin-bindende Region von FGF-2 (ERIKSSON et al., 1991; ZHU et al., 1991; FAHAM et al., 1998; PLOTNIKOV et al., 1999). Das FGF-2 Gen liegt beim Menschen auf Chromosom 4, bei der Maus auf Chromosom 3 (LAFAGE-POCHITALOFF et al., 1990; MATTEI et al., 1992). Es enthält drei kodierende Exons, die durch zwei Introns getrennt sind. In Ratten kodiert Exon 1 für drei FGF-2 Isoformen (18 kDa, 21 kDa und 23 kDa), die durch alternative Initiation von einer gemeinsamen messengerRNA (mRNA) translatiert werden (FLORKIEWICZ et al., 1991). Die niedermolekulare 18 kDa-Isoform wird am AUG Start-Codon der FGF-2 mRNA translatiert, die höhermolekulare 21 kDa- und 23 kDaIsoform dagegen am CUG Start-Codon (FLORKIEWICZ u. SOMMER, 1989; PRATS et al., 1989; ARNAUD et al., 1999). Der unterschiedliche N-terminale Bereich der drei Isoformen führt zu unterschiedlichen intrazellulären Lokalisationen. Die CUGinitiierten höhermolekularen Isoformen enthalten eine Kernlokalisationsequenz (nuclear localization sequence, NLS) im N-terminalen Bereich und eine weitere in der zentralen Domäne und sind im Zellkern lokalisiert (BIKFALVI et al., 1995; CLAUS et al., 2003). Dort ist die 23 kDa-Isoform in der Peripherie der Nukleoli, im Nukleoplasma und in Assoziation mit Chromatin aufzufinden (CLAUS et al., 2003). Die AUG-initiierte 18 kDa FGF-2-Isoform enthält nur eine NLS in der zentralen Domäne und ist im Zytoplasma, aber auch im Zellkern lokalisiert. Im Zellkern ist die 18 kDa-Isoform mit den Nukleoli, dem Nukleoplasma und den Cajal-bodies assoziiert (CLAUS et al., 2003). Bei der Suche nach dem für die Wahl der alternativen Initiations-Codons verantwortlichen Mechanismus wurde eine Internal Ribosome Entry Site (IRES) in der mRNA von FGF-2 entdeckt (VAGNER et al., 1995). Diese IRES ist in den ersten 2. Literaturübersicht 6 176 Nukleotiden (5’ untranslatierte Region) der FGF-2 mRNA lokalisiert und steuert die Translation von den Initiations-Codons CUG 1, -2, -3 und AUG (ARNAUD et al., 1999; BONNAL et al., 2003). Kürzlich konnte festgestellt werden, dass die IRES der FGF-2 mRNA durch pathophysiologische Reize, wie z.B. Hodenreifung, Gehirnfunktionen und diabetische Hyperglykämie, aktiviert wird. Dabei konnten zwei regulatorische Elemente (IRES trans-acting factors, ITAFs) charakterisiert werden: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AI (hnRNP AI), welches IRES aktiviert und die Translation einleitet, und p53, welches IRES inhibiert und somit die Translation verhindert (GONZALEZ-HERRERA et al., 2006). Das FGF-2 Signal wird über hoch-affine Tyrosinkinaserezeptoren (FGFR) und niedrig-affine Heparansulfat-Proteoglykan-Rezeptoren vermittelt (BAIRD et al., 1988; MCKEEHAN et al., 1998). Dabei bindet FGF-2 an alle vier FGFRs, weist jedoch die höchsten Affinitäten für die Spleiss-Varianten 1c, 3c und 4c auf (ORNITZ et al., 1996). 2.3 2.3.1 FGF-2 knock-out Mäuse Herstellung transgener FGF-2 knock-out Mäuse Die für die Generierung von FGF-2 knock-out Mäusen notwendige gezielte Mutation im FGF-2-Gen wurde von Dr. Thomas Doetschman (Departments of Molecular Genetics, Biochemistry and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 231 Bethesda Avenue, Cincinnati, Ohio 45267, USA) entwickelt (ZHOU et al., 1998): Dabei wurde ein Austauschkonstrukt (replacement construct) hergestellt, welches zwei flankierende homologe Sequenzen enthält, zwischen denen die Mutation sitzt. Durch ein doppeltes Cross-over in den beiden homologen Regionen wird die Originalsequenz durch die mutierte Sequenz ersetzt. 2. Literaturübersicht 7 Doetschman isolierte zunächst aus der permanenten embryonalen Stammzelllinie 129P2/OlaHsd die Plasmid-DNA, welche 6,7 Kilobasen (kb) lang war. Von dieser Plasmid-DNA klonierte er ein 4 kb langes XbaI/BamHI-Fragment in das Bluescript KS II Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA). Ein 3,2 kb Hypoxanthin PhosphoribosylTransferase (Hprt) Minigen wurde benutzt, um ein 0,5 kb NarI/XbaI-Fragment aus der genomischen FGF-2-DNA auszutauschen. Als Negativ-Marker wurde ein Thymidin-Kinase-Gen am 3’-Ende der genomischen DNA inseriert. Das Austauschkonstrukt wurde mittels Elektroporation in die embryonale Stammzelllinie E14TG2a transfiziert. 24 Stunden nach Elektroporation wurde mit einem Antibiotikum-haltigen Medium auf stabil transfizierte Zellen selektiert. Anschließend, 48 Stunden nach Elektroporation, wurde Gancyclovir für 3-5 Tage hinzugegeben, welches vom Negativ-Marker (Thymidin-Kinase) in ein toxisches Produkt umgesetzt wurde. So wurden alle Zellen getötet, die den Negativ-Marker exprimieren, d.h., bei denen es zu keiner homologen Rekombination kam. Resistente Kolonien wurden durch PCR mit einem Primerpaar für das DNA-Konstrukt getestet. Diese korrekt transfizierten ES-Zellen (E14TG2a), bei denen ein 0,5 kb Abschnitt, der 121 Basenpaare (bp) der proximalen Promotorregion und das komplette erste kodierende Exon enthielt, durch das Hprt-Minigen ersetzt wurde, wurden in Blastocysten (C57BL/6) injiziert. Die Blastocysten wiederum wurden in pseudogravide Ammenmäuse implantiert, welche die Blastozysten austrugen. Die entstandenen Tiere waren Chimären, denn sie enthielten ihr ursprüngliches Erbgut (129P2/OlaHsd) und das Erbgut aus den embryonalen Stammzellen (E14TG2a). Um herauszufinden, ob eine Transmission des DNA-Konstrukts in die Keimbahnzellen stattgefunden hat, wurden die Chimären (F0-Generation) mit dem Maus-Stamm Black Swiss (Taconic Farms, Großbritannien) verpaart. Gemäß der Mendelschen Regeln trugen etwa die Hälfte der daraus entstandenen F1-Generation das DNAKonstrukt. Homozygote transgene Tiere erhielt man erst in der F2-Generation, die aus der Verpaarung der F1-Tiere hervorgeht. Die Genotypisierung wurde mittels der Schwanzspitzen-PCR mit einem Primerpaar für das FGF-2-Gen und einem weiteren Primerpaar für ein Fragment des Hprt-Minigens durchgeführt. Da die Black Swiss 2. Literaturübersicht 8 Mäuselinie keinen genetisch identischen Hintergrund besitzt, musste dieser durch konsequente Bruder-Schwester-Verpaarung über mindestens 20 Generationen geschaffen werden. 2.3.2 Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse FGF-2 knock-out Mäuse sind lebensfähig, entwickeln sich völlig unauffällig und erreichen die Geschlechtsreife mit 6-8 Wochen (ORTEGA et al., 1998). Beide Geschlechter sind fertil und produzieren normale Wurfgrößen, die wiederum gesund und unauffällig sind (DONO et al., 1998; ORTEGA et al., 1998; ZHOU et al., 1998). Die FGF-2 defizienten Mäuse besitzen eine normale Lebenspanne und zeigen weder im Verhalten noch ihrer Morphologie Unterschiede zu Wildtyp-Mäusen (ZHOU et al., 1998). Die Sektion und Untersuchungen von Organen und Geweben ergaben, in Übereinstimmung mit der normalen, gesunden Erscheinung der FGF-2 knock-out Mäuse, keine auffallenden Veränderungen. Obwohl das Gehirn der FGF-2 knock-out Mäuse makroskopisch keinen Unterschied zu Wildtyp-Mäusen zeigt (ORTEGA et al., 1998), weisen die knock-out Mäuse mikroskopisch sowohl während der embryonalen Entwicklung als auch im Erwachsenenalter Defekte in der Organisation und Differenzierung des cerebralen Cortex auf. So zeigen FGF-2 knock-out Mäuse im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine um 10% reduzierte Dicke des cerebralen Cortex (DONO et al., 1998). VACCARINO et al. (1999) konnten nachweisen, dass diese Reduktion durch eine Abnahme der Gesamtzellzahl, die sowohl Neurone als auch Astroglia betrifft, zustande kommt. Schon in FGF-2 defizienten Mäuseembryonen kann am Tag 10,5 eine etwa 60%ige Reduktion von proliferierenden Zellen im pseudostratifizierten ventrikularen Epithelium (PVE) nachgewiesen werden (RABALLO et al., 2000). Man fand heraus, dass FGF-2 für die Entwicklung von cortikalen Progenitoren im dorsalen PVE notwendig ist. Das PVE ist an der Ausbildung des cerebralen Cortex beteiligt, indem es in cortikale Projektionsneurone differenziert und soll demnach hauptsächlich dazu 2. Literaturübersicht 9 beitragen, dass glutamaterge pyramidale Zellen aus dem dorsalen Neuroepithelium radiär in die cortikale Platte einwandern (TAN et al., 1998). Das Fehlen von FGF-2 in diesem Entwicklungsstadium führt dazu, dass weniger glutamaterge pyramidale Zellen in die cortikale Platte einwandern. Dieses Ergebnis deckt sich mit Untersuchungen von KORADA et al. (2002). Sie fanden heraus, dass adulte FGF-2 knock-out Mäuse eine 40%ige Abnahme der glutamatergen pyramidalen Neurone im frontalen und parietalen Cortex, nicht aber im occipitalen Cortex aufweisen. Andere Zellen, wie z.B. cortikale GABA-Interneurone, sind nicht verändert. Auch sind die pyramidalen Zellen in FGF-2 defizienten Mäusen deutlich kleiner als in WildtypMäusen. Im frontalen Cortex von Wildtyp-Mäusen variiert die Zellgröße zwischen 151-200 µm². Dabei sind etwa 65% der pyramidalen Neurone größer als 151 µm². In FGF-2 knock-out Mäusen sind nur 38% der pyramidalen Neurone größer als 151 µm². FGF-2 ist also notwendig für die Regulation der Anzahl und Größe der glutamatergen pyramidalen Neurone im frontalen und parietalen Cortex. Aufgrund dieser Ergebnisse vermutete die Arbeitsgruppe, dass FGF-2 knock-out Mäuse im cerebralen Cortex eine Imbalance zwischen exzitatorischen (glutamatergen) und inhibitorischen Neuronen (GABA) besitzen und zeigten, dass die knock-out Mäuse bei Applikation von Pentobarbital (einem GABA-Rezeptor-Agonisten) einen verlängerten Nachschlaf haben. Die Defekte der FGF-2 knock-out Mäuse sind jedoch nicht nur auf den cerebralen Cortex beschränkt. FGF-2-defiziente Mäuse weisen im Durchschnitt einen um 10 mmHg niedrigeren Blutdruck als Wildtyp-Tiere auf (DONO et al., 1998; ZHOU et al., 1998). Dieser hypotensive Phänotyp ist überraschend, da vorherige Studien gezeigt haben, dass exogen appliziertes FGF-2 eine Hypotension in normotensiven und hypertensiven Tieren hervorrief (CUEVAS et al., 1991; LAZAROUS et al., 1995). Mehrere Untersuchungen sprechen dafür, dass es sich bei dem reduzierten Blutdruck von FGF-2 knock-out Mäusen um die Konsequenz einer autonomen Dysfunktion, die mit Hypotension assoziiert ist, handelt (BANNISTER, 1988). Nach chronischer Angiotensin II-Infusion zeigen FGF-2 defiziente Mäuse einen übertriebenen Anstieg des Blutdruckes, weshalb die Ursache für den niedrigen Blutdruck keine chronische 2. Literaturübersicht 10 glatte Muskel- und/oder Myocardinsuffizienz sein kann (DONO et al., 1998). Bei akuter Isoproterenol-Infusion kommt es in FGF-2 knock-out Mäusen zu einem drastischen Abfall des Blutdruckes, während Wildtyp-Mäuse keine Veränderung zeigen (DONO et al., 1998). In Zusammenhang mit einem beeinträchtigten Anstieg der Herzfrequenz sagt dieses Ergebnis aus, dass die Vasodilatation nicht durch einen Anstieg der sympathischen Nervenaktivität kompensiert wird. Dies ist ein Phänomen, das bei den meisten menschlichen Patienten mit autonomer Dysfunktion auftritt (MATHIAS, 1998). Interessanterweise wird FGF-2 und sein TyrosinkinaseRezeptor Typ 1 (FGFR1) in autonomen Wurzelzellen des Nucleus intermediolateralis im thorakalen Rückenmark von Ratten exprimiert (GROTHE und UNSICKER, 1990; STACHOWIAK et al., 1994; MEISINGER et al., 1996; BLOTTNER et al., 1997) und das Überleben dieser Neurone durch exogen applizierten FGF-2 reguliert (BLOTTNER et al., 1989a; BLOTTNER und BAUMGARTEN, 1992). Eine weitere Auffälligkeit, die man bei FGF-2 knock-out Mäusen feststellte, ist eine um etwa drei Tage verzögerte Wundheilung. So gibt es zwischen Tag 1 und 7 keinen signifikanten Unterschied in der Wundheilung von knock-out- und Wildtyp- Mäusen. Die Verzögerung tritt erst in der zweiten Woche der Wundheilung (also ab Tag 14) auf. Bei den Wildtyp-Tieren ist nach 14 Tagen die zugefügten Hautläsionen (eine einzelne kreisrunde Hautstanze, die das gesamte Epithel erfasste; Lokalisation: mittlerer Rücken) zu 50% verheilt. Knock-out-Tiere zeigen eine 50%ige Heilung der zugefügten Hautläsionen erst nach Tag 17 (ORTEGA et al., 1998). Als neurotropher Faktor ist FGF-2 auch an der Entwicklung und Regeneration des Nervengewebes beteiligt (GROTHE und NIKKHAH, 2001; DONO, 2003). So zeigen FGF-2 knock-out Mäuse im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine Woche nach Quetschung des Nervus ischiadicus nahe der Verletzung fünfmal mehr regenerierte, myelinisierte Axone mit erhöhtem Myelin- und Axondurchmesser. Aufgrund der quantitativen Verteilung von Makrophagen und kollabierten Myelinscheiden wird vermutet, dass die Wallersche Degeneration bei FGF-2 knock-out Mäusen schneller als bei Wildtyp-Mäusen abläuft (JUNGNICKEL et al., 2004). Die Abwesenheit von FGF-2 scheint das Überleben und die Regeneration von Nervengewebe zu 2. Literaturübersicht 11 beeinflussen. So kommt es nach Axotomie des Nervus ischiadicus bei WildtypMäusen zu einem normalen Verlust von sensorischen Neuronen (ca. 35%) und zu einer signifikanten Verminderung der Anzahl von calcitonin gene-related peptide (CGRP)-positiven Neuronen ( ca. 69%) in ipsilateralen lumbaren Spinalganglien. Bei FGF-2- und FGFR3 knock-out Mäusen dagegen gibt es keinen offensichtlichen Verlust von Neuronen, und die Anzahl der CGRP-positiven Neurone wird nicht signifikant verringert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass FGF-2 über den FGFR 3 entscheidend an der Regulation des Überlebens von lumbaren sensorischen Neuronen nach Nervenläsionen beteiligt ist (JUNGNICKEL et al., 2005; JUNGNICKEL et al., 2006; GROTHE et al., 2006). 2.4 FGF-2 und prä-messenger RNA Spleissen Unter prä-mRNA Spleissen versteht man das Entfernen der Introns aus der prämRNA und die Verknüpfung der Exons durch eine zweifache Umesterung. Die prämRNA, auch heterogene Kern-RNA (hnRNA) genannt, entsteht durch Transkription der DNA und ist eine 1:1-Kopie dieser mit einem Poly-A+-Schwanz. Das prä-mRNA Spleissen findet im Zellkern statt und wird in eukaryoten Zellen von einem Komplex aus mehr als 100 verschiedenen Ribonucleoproteinen und fünf kleinen RNAMolekülen (small nuclear RNAs, snRNAs), dem sogenannten Spleissosom, durchgeführt (BURGE et al., 1999; JURICA und MOORE, 2003; NILSEN, 2003). Durch prä-mRNA Spleissen entsteht die mRNA, welche als Informationsträger für die Proteinbiosynthese dient. Das prä-mRNA Spleissen ist eine von mehreren Möglichkeiten, die Genexpression in eukaryoten Organismen zu regulieren, weil es nicht nur zum Entfernen der Introns dient, sondern auch unterschiedliche mRNA-Transkripte aus einer einzigen prämRNA entstehen lässt, was die Proteinvielfalt wesentlich erhöht. Diesen Vorgang bezeichnet man als alternatives Spleissen. Über dessen Regulation weiß man bisher recht wenig. Es ist jedoch bekannt, dass die Regulation des alternativen Spleissens 2. Literaturübersicht 12 z. B. über Spleissfaktoren (Proteine, die Signale auf der prä-mRNA erkennen und die Auswahl der Spleiss-Stellen beeinflussen) erfolgt. Der Spleissfaktor SF3a120 ist ein solches Protein. SF3a120 bildet einen Komplex mit SF3a66 und SF3a60 (BROSI et al., 1993). Sowohl die 18 kDa- als auch die 23 kDa-Isoform von FGF-2 bindet direkt an die C-terminale Region von SF3a66 (GRINGEL et al., 2004). So könnte FGF-2 durch Bindung an SF3a66 den Spleissfaktor SF3a120 hinsichtlich der Auswahl von Spleiss-Stellen auf der prä-mRNA regulatorisch beeinflussen. Des weiteren konnte in unserer Arbeitsgruppe erstmals eine direkte Bindung von FGF-2 an den N-terminalen Bereich des survival of motoneuron (SMN)-Proteins nachgewiesen werden (CLAUS et al., 2003; CLAUS et al., 2004). Das SMN-Protein ist ein Assemblierungsfaktor für ribosomale Komplexe (snoRNPs) und prä-mRNA Komplexe (snRNPs). Möglicherweise besitzt es auch Funktionen bei der Transkription (TERNS und TERNS, 2001). Im Cytoplasma ist SMN Teil eines Komplexes mit spleisseosomalen Sm-Proteinen und Gemin-2, -3 und -4 (FRIESEN u. DREYFUSS, 2000). Im Zellkern kommt SMN in den nuclear gems (Gemini der Cajal bodies) vor. Es konnte gezeigt werden, dass SMN und die 23 kDa FGF-2 Isoform in Zellkernen von Schwannzellen (Gliazellen des peripheren Nervensystems) in nuclear gems co-lokalisieren (CLAUS et al., 2003). Im Zytoplasma assembliert SMN-Protein zunächst Sm-Proteine ringförmig auf einer U2 snRNA (small nuclear RNA), wodurch der inaktive 12S U2 snRNP (small ribonucleoprotein particle)Komplex entsteht, der einen der vier Hauptkomponenten des späteren Spleissosoms darstellt. Unsere Arbeitsgruppe konnte zudem zeigen, dass der U2 snRNP-Komplex mit FGF-2 co-immunpräzipitiert (CLAUS et al., 2004). 2. Literaturübersicht 2.5 13 Konzeptioneller Hintergrund und Ziel der vorliegenden Arbeit Deletionen bzw. Mutationen des SMN1-Gens des Menschen führen zu einer neurodegenerativen Erkrankung, der Spinalen Muskelatrophie (SMA). Obwohl SMN ubiquitär exprimiert wird, kommt es bei den betroffenen Patienten spezifisch zur Degeneration von spinalen Motoneuronen innerhalb der ersten beiden Lebensjahre. In ihrer schwersten Ausprägung führt die Erkrankung in diesem Zeitraum zum Tod des Patienten. Die Befunde unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass der intrazelluläre Wachstumsfaktor FGF-2 mit Komponenten der Spleissing-Maschinerie (SMN und SF3a66) direkt interagiert. Es stellt sich daher die Frage, ob die Bindung von FGF-2 an die Komplexe einen regulativen Effekt auf das Spleissen ausübt. Die Abwesenheit von FGF-2 kann möglicherweise zu Veränderungen der Regulation des Spleissens führen. Über die molekulare Pathologie der SMA ist bisher nur wenig bekannt. Möglicherweise kommt es bei Deletion des SMN1-Gens zu Störungen der Spleissing-Regulation. Vor diesem Hintergrund sollte daher untersucht werden, ob Veränderungen des SMN-Interaktionsproteins FGF-2 zu differentiell gespleissten Transkripten führen. Ein Nachweis von alternativ gespleissten mRNA-Transkripten in FGF-2 knock-out Mäusen kann ein Hinweis auf eine mögliche regulierende Funktion dieses Faktors sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in Screening-Experimenten alternativ gespleisste Transkripte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen zu charakterisieren. Dieses Gewebe wurde zur Analyse gewählt, da einerseits verschiedene gespleisste Kandidaten-Transkripte bekannt waren und andererseits spinale Motoneurone bei der SMA degenerieren. Die durchgeführten Screening-Experimente haben keinen Nachweis alternativ-gespleisster mRNAs erbracht, jedoch konnten interessanterweise differentiell regulierte Transkripte nachgewiesen werden. Durch diesen Befund konnte ein neuer molekularer Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse beschrieben werden. 3. Material und Methoden 14 3. Material und Methoden 3.1 Chemikalien Acrylamid BioRad, München Agar Sigma-Aldrich, Taufkirchen Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ampicillin Roth, Karlsruhe Borsäure Fluka, Buchs, Schweiz Bromphenolblau Na-Salz Roth, Karlsruhe Chloroform Fluka, Buchs, Schweiz DEPC Sigma-Aldrich, Taufkirchen dNTP (10 mM) Gibco, Invitrogen, Karlsruhe DTT (0,1 M) Invitrogen, Karlsruhe Ethanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande Ethidiumbromid (1%) Roth, Karlsruhe EDTA Sigma-Aldrich, Taufkirchen Formaldehyd (37%) Merck, Darmstadt Formamid Merck, Darmstadt Glycerol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Heringssperma-DNA Sigma-Aldrich, Taufkirchen Isopropanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande Kaisers-Glyceringelatine Merck, Darmstadt Lithiumchlorid (4 M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Maleinsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen ß-Mercaptoethanol Fluka, Buchs, Schweiz MgCl2 J.T. Baker, Deventer, Niederlande MOPS Sigma-Aldrich, Taufkirchen 3. Material und Methoden 15 Natriumacetat Fluka, Buchs, Schweiz Natriumchlorid Roth, Karlsruhe Paraformaldehyd Merck, Darmstadt PBS Fluka, Buchs, Schweiz Random Primer (3 µg/µl) Invitrogen, Karlsruhe Saccharose Roth, Karlsruhe Tris Roth, Karlsruhe TritonX-100 Roche, Mannheim tRNA (100 mg/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen X-Gal Sigma-Aldrich, Taufkirchen Xylol J.T. Baker, Deventer, Niederlande 3.2 Geräte Autoklav LVSA 40/60 Zirbus, Bad Grund DNA-Agarosegelelektrophoresekammer Renner, Darmstadt Kamm: 14 Zähne, 1 mm Fluoreszenzmikroskop IX-70 Olympus, Hamburg Geldokumentation BioDocIITM Biometra, Göttingen Haake Thermostat C10 Roth, Karlsruhe Hybridisieungsofen Heraeus, Hanau Inkubator "Mini-38" Sauer, Reutlingen Lichtmikroskop CK30-F200 Olympus, Hamburg Magnetrührer MR 2002 Heidolph, Schwabach Makro-Pipettierhelfer Brand, Wertheim/Main Mikrowellengerät Sharp, Hamburg pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin Pipetten: Pipetman® Gilson Abimed, Langenfeld 20 µl, 100 µl, 200 µl und 1000 µl 3. Material und Methoden Reagenzglasschüttler REAX top 16 Heidolph, Schwabach RNA-Agarosegelelektrophoresekammer: Horizon® 58 Gibco, Invitrogen, Karlsruhe Rotationsmikrotom RM 2155 Leica, Nussloch Schüttelinkubator 3032/3033 GFL®, Burgwedel Sony Digital Camera Res. 756x581 Biometra, Göttingen Sony Digital Graphic Printer Biometra, Göttingen Spannungsgerät: Modell 250EX Gibco, Invitrogen, Karlsruhe Sterilbank HERAsafe Heraeus, Hanau Thermocycler Primus 25/96 MWG-Biotech, Martinsried Trockenschrank Memmert Omnilab, Hannover UV/Vis-Spektralphotometer DU® 520 Beckmann, München Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen Wasserbad GFL®, Burgwedel Mikro-Zentrifuge neoLab, Heidelberg Tisch-Zentrifuge 5415 D Eppendorf, Wessling-Berzdorf Kühlzentrifuge Z 233 MK-2 Hermle, Wehigen Kühlzentrifuge Z 323 K Hermle, Wehigen 3.3 Sonstiges Deckgläser (24x60 mm) Menzel-Gläser®, Braunschweig Glaswaren Schott, Mainz Kimwipes® Lite 200 Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Kryoröhrchen (2 ml) Nunc, Roskilde, Dänemark Latexhandschuhe SAFESKIN (puderfrei) Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Nitrilhandschuhe SAFESKIN (puderfrei) Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Objektträger (silanisiert) Sigma-Aldrich, Taufkirchen PCR-Tubes (0,2 ml) Merck, Darmstadt 3. Material und Methoden 17 Petrischalen (Ø 10 cm) Becton Dickinson, Heidelberg Pipettenspitzen: gelb (0,2 ml), blau (1 ml) Sarstedt, Nümbrecht Proben- und Zentrifugenröhrchen: Falcon® 15 ml, 50 ml Becton Dickinson, Heidelberg Reaktionsgefäße: Eppendorf® 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml Sarstedt, Nümbrecht Rundbodenröhrchen (10 ml) Sarstedt, Nümbrecht 3.4 3.4.1 Gewebe Rückenmark Rückenmarkgewebe von insgesamt 50 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black SwissMäusen (ZHOU et al., 1998) wurden für die RT-PCRs eingesetzt. Genauer gesagt, waren es 21 Wildtyp- und 29 FGF-2 knock-out Mäuse. Die PCRs wurden aus statistischen Gründen mehrmals mit unabhängigen Proben wiederholt, d. h. pro Experiment (RT-PCR) wurde neues Rückenmarkgewebe von je 3 bis 4 Wildtyp- und ebensovielen FGF-2 knock-out Mäusen eingesetzt. Das Rückenmark der im Durchschnitt 3 bis 4 Wildtyp- und 3 bis 4 FGF-2 knock-out Mäuse wurde zu jeweils einer Wildtyp- und einer FGF-2 knock-out-Probe zusammengefasst. Einigen dieser 50 Tiere wurden ebenfalls Striatum und cerebraler Cortex entnommen (siehe unten). Die Gewebe-Präparation ist in Kapitel 3.9.2 beschrieben. 3.4.2 Striatum Striatum von 15 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black Swiss-Mäusen (8 Wildtyp- und 7 FGF-2 knock-out Mäusen) wurde für die RT-PCR eingesetzt. 3. Material und Methoden 3.4.3 18 Cerebraler Cortex Cerebraler Cortex von 6 weiblichen 129P2/OlaHsd x Black Swiss- Mäusen (3 Wildtyp- und 3 FGF-2 knock-out Mäuse) wurde für die RT-PCR eingesetzt. 3.4.4 Rückenmark für die in-situ-Hybridisierung Zusätzlich zu den 50 oben genannten Mäusen wurden 10 weitere weibliche 129P2/OlaHsd x Black Swiss- Mäuse ( 5 Wildtyp- und 5 FGF-2 knock-out Mäuse) mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) perfundiert, das Rückenmark entnommen, in Paraffin eingebettet und der in-situ-Hybridisierung unterzogen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 60 Mäuse verwendet. 3.5 Oligonukleotide (Primer) Um alternatives Spleissen in FGF-2 knock-out Mäusen zu untersuchen, wurden Primerpaarsequenzen der folgenden Gene Agrin, gam2GABA, ICH-1, mGluR1 und n-src (Erläuterungen siehe unten), anhand einer wissenschaftlichen Veröffentlichung, in der man diese Primer zur Erforschung alternativen Spleissens eingesetzt hatte (JENSEN et al., 2000), entworfen. Die übrigen spezifischen Primer wurden von unserer Arbeitsgruppe ausgewählt und von der Firma MWG-Biotech AG, Martinsried, BRD, hergestellt. Amplifizierung des Agrin-Gens (NM 021604): Agrin_for (5’-Primer): 5’ – GGG ATA GTT GAG AAG TCA GTG GGG G – 3’ Agrin_rev (3’-Primer): 5’ – CGA AGC CAG CGG TTG GTG TTG – 3’ 3. Material und Methoden 19 Amplifizierung des Dopaminrezeptor 1-Gens (D1R) (NM 010076): D1R_for (5’-Primer): 5’ – GGT CCA AGG TGA CCA ACT TC – 3’ D1R_rev (3’-Primer): 5’ – TGC CTT GTG CCA GCT TAG CTG – 3’ Amplifizierung des Dopaminrezeptor 2-Gens (D2R) (NM 010077): D2R_for (5’-Primer): 5’ – GTC CTG TCC TTC ACC ATC TC – 3’ D2R_rev (3’-Primer): 5’ – GGG CAT GGT CTG GAT CTC AA – 3’ Amplifizierung des Dopaminrezeptor 3-Gens (D3R) (NM 007877): D3R_for (5’-Primer): 5’ – GCC ATC AGC ATA GAC AGG TA – 3’ D3R_rev (3’-Primer): 5’ – AGC CAG CAG ACA ATG AAG GC – 3’ Amplifizierung des Fibroblastenwachstumsfaktor-2-Gens (FGF-2) (NM 008006): FGF-2_for (5’-Primer): 5’ – CGT CAA ACT ACA GCT CCA AGC AGA – 3’ FGF-2_rev (3’-Primer): 5’ – GGA TCC GAG TTT ATA CTG CCC AGT – 3’ Amplifizierung der gamma2-Untereinheit des GABAA-Rezeptors (gam2GABA) (NM 177408): gam2GABA_for (5’-Primer): 5’ – GTA TGG CAC CCT GCA TTA TTT TGT – 3’ gam2GABA_rev (3’-Primer): 5’ – TTG ATT GGT TGC TGA TCT GGG ACG – 3’ Amplifizierung des Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Gens (GAPDH) (BC 064681): GAPDH_for (5’-Primer): 5’ – CAG AAC ATC ATC CCT GCA TCC ACT – 3’ GAPDH_rev (3’-Primer): 5’ – GTT GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC – 3’ Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 1-Gens (ionoGluR1) (NM 008165): ionoGluR1_for (5’-Primer): 5’ – CAG TAG AGG AGG ACT TGT TAG GTT – 3’ ionoGluR1_rev (3’-Primer): 5’ – CTA GGA CAG GAA ACA GCA CAG AAG – 3’ 3. Material und Methoden 20 Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 2-Gens (ionoGluR2) (NM 013540): ionoGluR2_for (5’-Primer): 5’ – CAA CAG ATG GCA CGC ATC CAT TTG – 3’ ionoGluR2_rev (3’-Primer): 5’ – CTT AAT TGT CGC TGT GTG TGC TCC – 3’ Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 3-Gens (ionoGluR3) (NM 016886): ionoGluR3_for (5’-Primer): 5’ – CCT GCT GGA GTC AAC CAT GAA TGA – 3’ ionoGluR3_rev (3’-Primer): 5’ – GAG TTT CAT GCG TTT GGA CTC TGC – 3’ Amplifizierung des AMPA-typ Glutamatrezeptor 4-Gens (ionoGluR4) (NM 019691): ionoGluR4_for (5’-Primer): 5’ – CAC TGC TAA TCT GGC TGC ATT CCT – 3’ ionoGluR4_rev (3’-Primer): 5’ – CTG CCC TGG ACT TGT AAC AGA ACT – 3’ Amplifizierung des metabotropen Glutamatrezeptor 1-Gens (mGluR1) (BC 079566): mGluR1_for (5’-Primer): 5’ – CCT GGG GTG CAT GTT TAC TCC – 3’ mGluR1_rev (3’-Primer): 5’ – AGG CCG TCT CGT TGG TCT TCA – 3’ Amplifizierung des Caspase 2-Gens (ICH-1) (BC 034262): ICH-1_for (5’-Primer): 5’ – GTC TCA TCT TCA TCA ACT CC – 3’ ICH-1_rev (3’-Primer): 5’ – ATG CTA ACT GTC CAA GTC TA – 3’ Amplifizierung des Peripherin 56/58-Gens (Peph 56/58) (X 59840): Peph 56/58_for (5’-Primer): 5’ – TGC CTG AGA TGG AGC CTC TCC AGG A – 3’ Peph 56/58_rev (3’-Primer): 5’ – GCA TGC AGA GCA GGA CTG GAT ACA G – 3’ Amplifizierung des Peripherin 61/58-Gens (Peph 61/58) (X 15475): Peph 61/58_for (5’-Primer): 5’ – TCC CGC CTA GAA CTG GAG CGC AAG – 3’ Peph 61/58_rev (3’-Primer): 5’ – TGG CGG CGT CCG ACA GGT CAG CAT – 3’ 3. Material und Methoden 21 Amplifizierung des src-Tyrosinkinase Gens (src) (M 17031): src_for (5’-Primer): 5’ – CCA AGC TCT TCG GAG GCT TCA ACT – 3’ src_rev (3’-Primer): 5’ – CAC ATA GTT GCT GGG GAT GTA ACC – 3’ 3.6 DNA-Längenmarker λ DNA/ Pst I-Marker (47507 bp) 3.7 MBI Fermentas, St. Leon-Rot Enzyme Apa I (10 U/µl) MBI Fermantas, St. Leon-Rot DNase I (30 U/µl) Stratagene, Heidelberg Hind III (10 U/µl) MBI Fermentas, St. Leon-Rot MMLV-Reverse Transkriptase (200 U/µl) Invitrogen, Karlsruhe Proteinase K (2 µg/ml) Merck, Darmstadt Pst I (10 U/µl) MBI Fermentas, St. Leon-Rot Sac II (10 U/µl) Promega, Mannheim Sp6-Polymerase (15 U/µl) Promega, Mannheim Taq DNA Polymerase (5 U/µl) Eppendorf, Wessling-Berzdorf T3-Polymerase (50 U/µl) Stratagene, Heidelberg T4 DNA Ligase (3 WeissU/µl) Promega, Mannheim T7-Polymerase (50 U/µl) Stratagene, Heidelberg 3. Material und Methoden 3.8 3.8.1 22 Puffer und Lösungen RT-PCR First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe Taq-Eppendorf-Puffer (10x) Eppendorf, Wessling-Berzdorf 500 mM KCl 100 mM Tris-HCl ; pH 8 1,5 M MgCl2 3.8.2 DNA-Agarosegelelektrophorese DNA–Ladepuffer (6x) 2 g Saccharose 1 ml EDTA 0,5 M; pH 8 auf 5 ml dH2O Bromphenolblau (wenig) TBE-Puffer (1x) 54 g Tris-HCl; pH 8 27,5 g Borsäure 4,6 g EDTA Salz auf 5 l dH2O 3.8.3 RNA-Agarosegelelektrophorese MOPS-Puffer (10x); pH 7 0,4 M MOPS 0,1 M NaAc 0,01 M EDTA 3. Material und Methoden 23 MOPS-Puffer (1x); 150 ml 15 ml 10xMOPS-Puffer 3 ml Formaldehyd (37%) 132 ml DEPC-H2O RNA-Ladepuffer (5x) 400 µl 10xMOPS-Puffer 308 µl Formamid 200 µl Glycerin 100% 72 µl Formaldehyd 8 µl 500 mM EDTA; pH 8 12 µl DEPC-H2O Bromphenolblau (wenig) 3.8.4 Restriktionsverdau Puffer B+ (10x) für Enzym Apa I MBI Fermentas, St. Leon-Rot Puffer C (10x) für Enzym Sac II Promega, Mannheim Puffer O+ (10x) für Enzym Pst I MBI Fermentas, St. Leon-Rot Puffer R (10x) für Enzym Hind III MBI Fermentas, St. Leon-Rot REact 4-Puffer (10x) MBI Fermentas, St. Leon-Rot 3.8.5 Markierung von Sonden Transkriptionspuffer (5x) für T7-Polymerase Stratagene, Heidelberg Transkriptionspuffer (5x) für T3-Polymerase Stratagene, Heidelberg Transkriptionspuffer (5x) für Sp6-Polymerase, DTT (100 mM) Promega, Mannheim RNase –Inhibitor (40 U/µl) Stratagene, Heidelberg 3. Material und Methoden 3.8.6 24 In-situ-Hybridisierung Dehnhardt’s Solution Sigma-Aldrich, Taufkirchen Maleinsäurepuffer (pH 7,5) 100 ml 1 M Maleinsäure 150 ml 1 M NaCl auf 1000 ml DEPC-H2O PBS-Puffer (pH 7,4) 0,2 g KCl 0,2 g KH2PO4 1,15 g Na2HPO4 8 g NaCl auf 1000 ml DEPC-H2O TE-Puffer (pH 7,4) 50 ml 1 M Tris-HCl; pH 7,4 1 ml 0,5 M EDTA ; pH 8 auf 500 ml DEPC-H2O Trisalinepuffer (pH 9,5) 100 ml 1 M Tris-HCl; pH 8 100 ml 1 M NaCl 50 ml 1 M MgCl2 auf 1000 ml DEPC-H2O 20x SSC-Puffer (pH 7) 87,65 g NaCl 44,1 g Natrium-Citrat auf 500 ml DEPC-H2O 3. Material und Methoden 3.8.7 25 Reagenziensets DIG RNA Labeling Mix (10x konz., 40 µl) Roche, Mannheim DIG Nucleic Acid Detection Kit Roche, Mannheim • Markierte Kontroll-DNA • DNA-Verdünnungspuffer • Anti-DIG-AP-Konjugat (750 U/ml) • NBT/BCIP-Stammlösung • Blocking-Reagenz (1%) LigaFastTM Rapid DNA Ligation System 3.8.8 • T4 DNA Ligase (3 WeissU/µl) • 10x Rapid Ligation Buffer Promega, Madison, USA pGEM®-T Vector (50 ng/µl) Promega, Madison, USA QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden QIAquick® Spin Kit Qiagen, Hilden RNeasy® Mini Kit Qiagen, Hilden TRIzol® Reagenz Invitrogen, Karlsruhe Nährmedien LB-Medium (pH 7,5) 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl mit dH2O auf 1000 ml autoklavieren 3. Material und Methoden LB-Agar 26 LB-Medium 1,5% Agar autoklavieren, unter 50°C abkühlen lassen, dann Antibiotikum zugeben 3.9 3.9.1 Versuchstiere Tierhaltung und Zucht Homozygote FGF-2 knock-out- und die dazugehörigen heterozygoten Wildtyp-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) bezogen. Sie wurden ursprünglich durch gezielte homologe Rekombination generiert und hatten einen gemischten 129P2/OlaHsd x Black Swiss Hintergrund (ZHOU et al., 1998). Durch Bruder-Schwester-Verpaarung wurde die Zucht fortgeführt, um genetisch identische Tiere, die sich nur im FGF-2-Gen unterscheiden, zu erhalten. Jedes dieser Tiere wurde mittels Schwanzspitzen-PCR genotypisiert (ZHOU et al., 1998). Die heterozygoten FGF-2 Wildtyp-Mäuse wurden mit einem Primerpaar für das FGF-2Gen (oIMR840, oIMR841) identifiziert. Um homozygote FGF-2 knock-out Mäuse zu identifizieren, wurde zusätzlich ein weiteres Primerpaar (oIMR775, oIMR876) eingesetzt, welches ein Fragment des in den FGF-2 Locus inserierten Hprt (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) -Minigens amplifizierte. Im Rahmen der Arbeit wurden 60 weibliche 129P2/OlaHsd x Black Swiss Mäuse aus eigener Zucht verwendet. Für die Gewebe-Präparation und in-situ-Hybridisierung wurden nur adulte ca. 8 Wochen alte, weibliche Tiere mit einem durchschnittlichen Gewicht von 23 ± 5 g eingesetzt. Die Mäuse wurden im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) in Gruppen von 4-5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 22 ± 2°C, einer Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5% und einem künstlichen Tag/Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden in Makrolon-Käfigen 3. Material und Methoden 27 (TypIII) auf Standardeinstreu für Labortiere (Altromin, Altrogge, Lage, BRD) gehalten. Die Tiere erhielten Altromin-Haltungsfutter (Altrogge, Lage, BRD) und Wasser ad libitum. 3.9.2 Gewebe-Präparation 3.9.2.1 Gewinnung von Rückenmarkgewebe Für die Tötung von Wirbeltieren zu wissenschaftlichen Zwecken galt § 4 Abs. 3 des Tierschutzgesetzes in der Fassung vom 25.5.1998. Die Tötung der Mäuse im Rahmen dieser Arbeit wurde dem Tierschutzbeauftragten der MHH (Herrn Prof. Dr. Hedrich, Institutsleiter des ZTL) angezeigt. Es wurden nicht mehr Tiere getötet, als für den verfolgten Zeck erforderlich waren. Die Mäuse wurden einzeln durch 5-minütige Kohlendioxid (CO2)-Einleitung in den Tierkäfig getötet. Anschließend wurde das Tier in Bauchlage fixiert. Das Fell wurde mit 70%igem Ethanol befeuchtet, um bei der Präparation Verunreinigungen durch Haare zu vermeiden. Das Operationsbesteck wurde zur Keimabtötung ebenfalls in 70%igem Alkohol aufbewahrt. Mit einer chirurgischen Pinzette (No. 08-231-130, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD) wurde die Rückenhaut 1 cm kranial der Schwanzwurzel angehoben und mit einer Metzenbaumschere (Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) eine horizontale Inzision gesetzt. Diese wurde zu beiden Seiten in einem Bogen nach kranial fortgeführt und die Haut anschließend von kaudal nach kranial stumpf von der Unterlage gelöst und nach kranial umgeschlagen. Es folgte die Freipräparation der Wirbelsäule. Diese wurde mit einer chirurgischen Pinzette fixiert, leicht angehoben, anschließend wurden mit einer geraden, spitzen Schere (No. 04-124-145, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD) an beiden Seiten parallel zur Wirbelsäule die Bauch- und Brusthöhle eröffnet. Die Wirbelsäule wurde unter Schonung der Körperhöhlenorgane nach dorsal freipräpariert und ein 3. Material und Methoden 28 Tupfer untergelagert. Mit einem Einmalskalpell (No. 10, Medizin AG, Köln, BRD) wurde die Wirbelsäule kranial der Schwanzwurzel quer eingeschnitten. Die weitere Präparation wurde unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskopes (OPMI 9, Carl Zeiss AG, Oberkochen, BRD) durchgeführt. In den Wirbelkanal (Canalis vertebralis) wurde eine feine, spitze Schere (No. 15003-08, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) eingeführt und damit der Wirbelbogen (Arcus vertebrae) unterhalb der Gelenkfortsätze (Processus articulares) an beiden Seiten unter Schonung des Rückenmarks eingeschnitten. Der dorsale Teil der Wirbelsäule wurde so von kaudal nach kranial abgetrennt und das Rückenmark freigelegt. Mit einem Einmalskalpell (No. 15, Medizin AG, Köln, BRD) wurde ein Querschnitt durch das Rückenmark kranial der Intumescentia cervicalis und auf Höhe des Conus medullaris vorgenommen. Unter Zuhilfenahme einer Uhrmacherpinzette (Dumont No. 5, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD) und des Skalpells (No. 15) wurde das Rückenmark vorsichtig nach Durchtrennung der Spinalnerven herausgelöst und sofort in beschriftete 1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wessling-Berzdorf, BRD) überführt. Diese wurden in flüssigem Stickstoff gelagert. 3.9.2.2 Gewinnung von bestimmten Großhirnabschnitten Die Anleitung zur Präparation von Striatum und cerebralem Cortex wurde vorgenommen nach "A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System" (SHAHAR, VELLIS, VERNADAKIS und HABER, 1989). Zur genaueren Orientierung wurde "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates" (PAXINOS und FRANKLIN, 2001) hinzugezogen. Mit einer Vannas-Mikroschere (No. 15003-08, Fine Science Tools, Heidelberg, BRD) wurde die Schädeldecke vorsichtig abpräpariert und so das Gehirn freigelegt. Nach Durchtrennung der ventral verlaufenden Gehirnnerven mit einem Sterilskalpell (No. 15) wurde das Gehirn mit einer Uhrmacher Pinzette (No. 5) aus dem Schädel entnommen und mit der dorsalen 3. Material und Methoden 29 Fläche auf eine Glasplatte gelegt, so dass die ventrale Fläche sichtbar war. Um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, wurde das Gehirn mit isotonischer Kochsalz-Lösung (0,9%, Braun GmbH, Melsungen, BRD) befeuchtet. Es erfolgte ein transverser Schnitt durch das Gehirn vor dem Chiasma opticum und ein zweiter transverser Schnitt auf Höhe des Chiasma opticums. Die Gewebescheibe wurde auf die vordere Schnittfläche gelegt. Nun erfolgten zwei horizontale Schnitte, um das Striatum vom cerebralen Cortex darüber und dem basalen Vorderhirn darunter zu trennen. Dann wurden zwei vertikale Schnitte vorgenommen, um das Striatum vom medialen Septum und dem lateralen Cortex abzugrenzen. Striatum und cerebraler Cortex wurden getrennt in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und in flüssigem Stickstoff gelagert. 3.10 Allgemeine Maßnahmen beim Umgang mit RNA RNA ist sehr anfällig gegenüber äußeren Einflüssen (alkalische Hydrolyse, hohe Temperaturen) und wird leicht degradiert. Insbesondere Ribonukleinsäure abbauende Enzyme (RNasen) stellen eine große Gefahr dar, da diese sehr stabil sind, ubiquitär vorkommen und in der Regel keine Kofaktoren (SELA et al., 1957; BLACKBURN und MOORE et al., 1982) benötigen. Um Kontaminationen der Proben mit RNasen und damit ihre Zerstörung zu verhindern, wurden Gefäße und Gebrauchsgegenstände vor Benutzung bei 121°C autoklaviert oder mit DEPC-Wasser behandelt. Außerdem wurden sterile Einmalhandschuhe getragen und die Proben während des Pipettierens auf Eis gelagert. 3.11 Isolierung von Gesamt-RNA Die Isolierung der Gesamt-RNA erfolgte unter Verwendung von TRIzol® (Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, BRD) gemäß der dazugehörigen Anleitung. TRIzol® ist 3. Material und Methoden 30 eine gebrauchsfertige Lösung aus Phenol und Guanidiniumisothiocyanat, die zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen und Geweben eingesetzt wird. Die Verwendung von TRIzol® stellt eine Verbesserung der RNA-Isolierungsmethode nach CHOMCZYNSKI und SACCHI (1987) dar. Die mit flüssigem Stickstoff tiefgefrorenen Gewebeproben wurden abgewogen und mit 0,75 ml TRIzol® pro 100 mg Gewebe in einen 1 ml Potter (Wheaton, USA) überführt. Dieser wurde zuvor einige Minuten mit DEPC-Wasser behandelt, um RNasen zu reduzieren. Das Gewebe wurde sofort homogenisiert, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 2 ml-Reaktionsgefäße überführt. Anschließend erfolgte eine Zugabe von 0,2 ml Chloroform pro 0,75 ml TRIzol®. Die Reaktionsgefäße wurden verschlossen und 15 Sekunden kräftig von Hand geschüttelt. Nach dreiminütiger Inkubation wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12000 x g bei 4°C in einer Kühlzentrifuge (Z 233 MK-2, Hermle, Wehigen, BRD) zentrifugiert. Im Anschluss an die Zentrifugation erhält man drei Phasen: eine untere organische Phase (Phenol-Chloroform-Phase), eine mittlere feste und eine obere wässrige Phase. Diese enthält die Gesamt-RNA und wurde deshalb in neues 1,5 mlReaktionsgefäß überführt. Dabei wurde eine Verunreinigung durch die Interphase, welche die DNA der Zellen enthält, vermieden. Anschließend wurde 0,5 ml Isopropanol pro 0,75 ml TRIzol® zum Fällen der RNA zugegeben, gut gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten mit 12000 x g bei 4°C zentrifugiert. Danach wurde der Überstand entfernt und das Sediment mit 75%igem Ethanol gewaschen. Wiederum wurde 5 Minuten mit 7500 x g bei 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das RNA-Präzipitat 10 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Abschließend wurde das RNA-Pellet in 50 µl autoklaviertem DEPC-Wasser durch 10-minütiges Erhitzen auf 55°C im Wasserbad (GFL® , Burgwedel, BRD) gelöst. Die Gesamt-RNA wurde kurzzeitig bei –20°C gelagert. 3. Material und Methoden 31 3.12 DNase-Verdau Da das Vorhandensein von DNA-Kontaminationen in der gelösten RNA nicht auszuschließen war, wurde ein DNase-Verdau vorgenommen. Dazu wurden 50 µl RNA-Lösung, 20 µl 5x DNaseI-Reaktionspuffer (Stratagene, Heidelberg, BRD), 10 µl RNase-freie DNaseI (30 U/µl, Stratagene, Heidelberg, BRD) und 20 µl dH2O gemischt und 15 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Durch Zugabe von 4 µl EDTA 0,5 M (pH 8), 12,5 µl 4 M LiCl und 377 µl 100%igem Ethanol wurde die RNA gefällt und gleichzeitig das Enzym DNaseI inaktiviert. Sofort im Anschluss wurde die RNA 30 Minuten bei –20°C gelagert. Zur Weiterverwendung wurde die gefällte RNA zunächst durch 15-minütige Zentrifugation mit 12 000 x g bei 4°C pelletiert. Danach wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen (10 Minuten mit 12 000 x g bei 4°C). Der Überstand wurde verworfen, das Pellet erneut 5 Minuten mit 12 000 x g bei 4°C zentrifugiert. Der restliche Überstand wurde entfernt, das RNA-Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet und anschließend in 50 µl DEPC-Wasser aufgenommen. 3.13 RNA-Reinigung Die Gesamt-RNA, die für die Genexpressionsanalysen eingesetzt wurde, musste einen sehr hohen Reinheitsgrad aufweisen. Aus diesem Grund wurde die GesamtRNA nach dem DNase-Verdau zusätzlich aufgereinigt gemäß dem "RNeasy® Mini Protocol for RNA Clean-up" (Qiagen, Hilden, BRD). 3.14 Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese Nukleinsäuremoleküle sind bei pH 7 aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Rückgrates negativ geladen und wandern deshalb in einem elektrischen Feld in Richtung der 3. Material und Methoden 32 Anode. Dabei ist ihre Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von ihrer Größe und Konformation. Unterschiedlich lange Nukleinsäuremoleküle lassen sich also voneinander trennen, indem man sie im elektrischen Feld durch eine Agarosematrix wandern lässt. Da sich bei zunehmender Agarosekonzentration die Dichte des Agarosegels verändert, werden verschiedene Trennbereiche optimal erfasst. Die Nukleinsäuren wurden durch den interkalierenden und fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid (EtBr) unter UV-Bestrahlung als sogenannte Banden im Gel sichtbar gemacht. Die Kontrolle des DNase-Verdaus erfolgte anhand des Laufverhaltens der GesamtRNA in einem 1%igen Agarosegel, das mit MOPS-Puffer und Formaldehyd angesetzt wurde. Formaldehyd wurde zugesetzt, um die RNA zu denaturieren und ubiquitär vorkommende RNasen zu inaktivieren. Zur Herstellung eines 35 ml-Gels wurden 0,42 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben eingewogen, 30,5 ml autoklaviertes DEPC-Wasser und 3,5 ml 10x MOPS-Puffer zugegeben. Das ganze wurde in einem Mikrowellengerät erhitzt, bis die Agarose vollständig gelöst war. Nach Abkühlung auf 50°C wurden 1 ml Formaldehyd (37%) und 1 µl Ethidiumbromid (1%ige-Lösung) hinzupipettiert und durch vorsichtiges Schwenken gemischt. Dieser Schritt erfolgte, ebenso wie die nachfolgenden, im Abzug. Anschließend wurde die flüssige Gel-Masse blasenfrei in den integrierten Gelträger der Elektrophoresekammer des Horizon® 58-Gerätes (Gibco BRL, Invitrogen GmbH, Karlsuhe, BRD) gegossen und ein Kamm (8 Zähne) eingesetzt. Während des Abkühlens entstanden dadurch Geltaschen zum Einbringen der Probe. Nach Erstarrung des Gels und Entfernung des Kammes wurde die Elektrophoresekammer mit 1x MOPS-Puffer gefüllt. 10 µl Gesamt-RNA-Probe wurde mit 2 µl 5x RNA-Ladepuffer versetzt. Nach 5minütiger Denaturierung bei 65°C im Wasserbad wurden die Proben sofort auf Eis gekühlt und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Denaturierung bewirkte eine Auflösung der Sekundärstrukturen der RNA. Die Elektrophorese wurde mit 70 V für 60 Minuten durchgeführt. Unter UV-Licht wurden die Banden dargestellt und 3. Material und Methoden 33 fotodokumentiert. Als intakt wurde die RNA bewertet, wenn die 18S- und die 28Sribosomale RNA-Bande klar sichtbar waren und die 28S-RNA-Bande eine höhere Intensität aufwies. 3.15 RNA-Quantifizierung In einem UV/Vis-Spektrophotometer DU® 520 (Beckmann, München) wurde die Konzentration der gelösten RNA durch eine Absorptionsmessung (A) bei 260 und 280 nm Wellenlänge in einer Quarzküvette festgestellt. Hierzu wurde die RNA 1:20 in dH2O verdünnt. Als Leerwert diente die Absorption von reinem dH2O. Der RNA-Reinheitsgrad wurde über den Quotient A260/A280 bestimmt. Bei einer reinen RNA-Präparation liegt der Wert des Quotienten bei Messung in dH2O bei 1,9 bis 2,1. Die Absorption wird als optische Dichte (OD) angegeben und ist proportional zur Konzentration der absorbierbaren Teilchen (Nukleinsäuren). Die Gesamt-RNA-Konzentration (c) wurde wie folgt quantifiziert: 1 OD260 =ˆ 40 µg RNA/ml c [µg/ml] = A260 x Verdünnungsfaktor x 40 µg/ml 3.16 Einzelstrang-cDNA-Synthese durch reverse Transkription Einzelsträngige RNA-Moleküle werden aufgrund ihrer 2’-OH-Gruppe relativ leicht degradiert. Um die Sequenz einer RNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren, muss sie erst in einzelsträngige stabilere DNA umgeschrieben werden. Hierfür macht man sich die charakteristische Eigenschaft von Retroviren zunutze, mit Hilfe einer Reversen Transkriptase ihre genetische Information, die in Form von RNA vorliegt, nach Infektion von eukaryonten Zellen 3. Material und Methoden durch Synthese von 34 DNA-RNA-Hybriden in komplementäre DNA (cDNA) umzuschreiben. In vitro wird die Fähigkeit der Reversen Transkriptase ausgenutzt, um an die Einzelstrang-RNA zu binden und einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Dieser cDNA-Strang lässt sich dann als Vorlage (Template) in der Polymerase-Kettenreaktion einsetzen. Man spricht auch von einer RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, siehe 3.17), da der PCR eine reverse Transkription vorausgegangen ist. Zuerst werden RNA und Primer, hier Hexamerprimer, zusammen pipettiert und dann auf 70°C erhitzt, um die Sekundärstrukturen der RNA aufzulösen. Durch das langsame Abkühlen auf Raumtemperatur können die Hexamerprimer an die mRNA hybridisieren. Die sogenannten Hexamerprimer (random hexamers) hybridisieren irgendwo zufällig an die mRNA, wodurch später alle mRNA-Bereiche in der cDNA vertreten sind. Somit entstehen kurze Stücke doppelsträngige Nukleinsäure (priming), die als Ansatzpunkte für die Reverse Transkriptase dienen. Nun gibt man Puffer, Nukleotide, RNase-Inhibitor und Reverse Transkriptase hinzu und inkubiert 90 Minuten bei 42°C, dem Temperaturoptimum der Reversen Transkriptase. Für molekularbiologische Zwecke wird die klonierte Mäuse-Leukämie-Virus-ReverseTranskriptase (MMLV-RTase) eingesetzt, weil die intrinsische RNase H-Aktivität der MMLV-RTase ausreichend ist, um die nach der cDNA-Synthese verbleibenden intakten mRNA-Moleküle zu degradieren, die sonst mit der cDNA als Schablone konkurrierend die PCR stören. Um die Expression von mRNA-Transkripten in unterschiedlichen Geweben (hier: Rückenmark, Striatum und cerebraler Cortex) vergleichen zu können, mussten für die beiden Proben (Probe 1 = FGF-2 knock-out-Gewebe, Probe 2 = WildtypGewebe) jeweils gleiche RNA-Konzentrationen geschaffen werden. Durch die RNAQuantifizierung (3.15) wurde zunächst die Gesamt-RNA-Konzentration der beiden Proben in µg/µl bestimmt. Laut Protokoll konnten maximal 17 µl RNA-Lösung eingesetzt werden. Also wurde zuerst bestimmt, wieviel µg RNA sich in 17 µl der Probe mit der geringeren Gesamt-RNA-Konzentration befanden. Daraus ergab sich die Menge an RNA in µg, die in beiden Proben nachher vorhanden sein sollte. Diese 3. Material und Methoden 35 wurde dann durch die Probe mit der höheren Gesamt-RNA-Konzentration dividiert, wodurch sich ergab, wieviel µl RNA-Lösung von dieser Probe eingesetzt werden mussten, um auf die gewünschte RNA-Menge (µg) zu kommen. Um auf 17 µl RNALösung zu kommen, wurde mit RNase-freiem Wasser aufgefüllt. Beide Proben enthielten nun in jeweils 17 µl RNA-Lösung die gleiche Menge an RNA in µg. Zu der RNA-Lösung (17 µl) wurden 2 µl Random Primer (3 µg/µl) und 5 µl First Strand Buffer (5x) zugegeben und 2 Minuten bei 70°C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Abkühlung auf Eis wurden 5 µl ddH2O 4 µl DTT (0,1 M) 3 µl First Strand Buffer (5x) 2 µl dNTP (10 mM) 1 µl MMLV-Reverse Transkriptase (200 U/µl) 1 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl) hinzupipettiert. Nach vorsichtigem Mischen erfolgte eine 90-minütige Inkubation bei 42°C im Wasserbad. Zum Schluss wurde der Ansatz wieder auf Eis gekühlt. Das endgültige Volumen pro Probe betrug 40 µl. Die cDNA wurde bei –20°C gelagert. 3.17 Semiquantitative RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PolymeraseKettenreaktion) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist eine in vitroTechnik zur Vervielfältigung bzw. Amplifizierung eines spezifischen Genfragments 3. Material und Methoden 36 aus DNA (MULLIS u. FALOONA 1987; SAIKI et al., 1988). Erreicht wird dies durch die zyklische Wiederholung von drei Reaktionsschritten (Hitzedenaturierung des DNA-Doppelstranges, "Annealing" und Extension). Zuerst wird die DNA-Doppelhelix hitzedenaturiert, wodurch sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Strängen auftrennen und einzelsträngige DNA entsteht. An die einzelnen Stränge lagern sich beim sog. "Annealing" zwei synthetisch hergestellte "Primer". Primer sind Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 18-25 Nukleotiden, deren Anlagerungstemperatur abhängig von der Basenzusammensetzung und der Primer-Länge ist. Die Primer werden komplementär zu dem 5’- bzw. 3’-Ende der Zielstränge gewählt und begrenzen den zu vermehrenden DNA-Abschnitt. Nach dem Annealing folgt die Verlängerung der komplementären Stränge in 3’-Richtung. Dabei werden die zugegebenen Desoxynukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) an die Primer angeheftet (Extension). Durch erneutes Erhitzen des Reaktionsgemisches trennen sich die neu gebildeten Stränge wieder von ihren Matrizen und stehen nun selbst als Vorlage für eine neue Gegenstrangsynthese zur Verfügung. Dieser Zyklus von Hitzedenaturierung, Annealing und Extension wird bei einer Standard-PCR etwa 3040 mal wiederholt. Zu Reaktionsbeginn nimmt die Zahl der amplifizierten DNAFragmente exponentiell mit der Zykluszahl zu. Eine Abweichung von dem exponentiellen Wachstum tritt nach ca. 17 Zyklen auf und erreicht nach ca. 35 Zyklen ein Maximum. Ausschlaggebend hierfür ist unter anderem die begrenzte Verfügbarkeit der beteiligten Komponenten. Bei der Reversen-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR, reversetranscriptase-polymerase-chain-reaction) geht der eigentlichen PCR zunächst eine andere enzymatische Reaktion voraus, die reverse Transkription (siehe 3.16). Da mittels PCR-Reaktion keine RNA vervielfältigt werden kann, muss die RNA erst durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA (complementary DNA) 3. Material und Methoden 37 umgeschrieben werden. Daraufhin können die in cDNA umgeschriebenen RNAFragmente für die PCR-Reaktion eingesetzt werden. Um eine semiquantitative Aussage über die PCR zu ermöglichen, muss die in der PCR erzielte Produktmenge im exponentiellen Bereich liegen. Deshalb wurde die PCR mit maximal 27 Zyklen gefahren. Zur Kontrolle der cDNA-Expression wurde ein externer Standard (Glycerinaldehyd-3Phosphat-Dehydrogenase, GAPDH) hinzugezogen, von dem man annimmt, dass er in den untersuchten Ansätzen in einer konstanten Menge exprimiert wird (APOSTOLAKOS et al., 1993; ZHAO et al., 1995). Die Menge an spezifischem Produkt wurde anschließend auf die konstante Menge des Standards bezogen. Der PCR-Ansatz wurde wie folgt nach einer im Labor etablierten Standardvorschrift angesetzt: Für einen Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 µl wurden folgende Reagenzien in einem Reaktionsgefäß zusammenpipettiert: 2,5 µl Taq-Eppendorf-Puffer (10x) 20 µl dH2O 0,25 µl dNTP (10 mM) 0,25 µl Eppendorf Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl Primer F (forward,10 pmol/µl) 0,5 µl Primer R (reverse,10 pmol/µl) Um die Effizienz in einer PCR möglichst konstant zu halten, wurde ein "Master-Mix" angesetzt, der alle die für eine PCR nötigen Substanzen enthielt, und gleichmäßig auf die PCR-Ansätze verteilte. Pro Reaktion wurde 1 µl cDNA eingesetzt. Die PCR-Reaktion fand im Primus 25/96-Thermocycler (MWG-Biotech Gesellschaft für angewandte Biotechnologie mbH, Ebersberg, BRD) statt und wurde mit folgendem Temperaturprogramm (Tabelle) durchgeführt: 3. Material und Methoden Schritt 38 Temperatur Dauer Bemerkung verhindert die Heizdeckel Kondenswasserbildung am 110°C vorheizen Gefäßdeckel Initiale Denaturierung der DNA: Denaturierung 92°C 3 min. Denaturierung 94°C 30 sec. Annealing 55°C 60 sec. dsDNA ssDNA 27 Zyklen primerspezifisch Extension 72°C 60 sec. Extension 72°C 10 min. Kühlung 15°C unendlich Kühllagerung Tabelle: Thermocycler-Programm einer RT-PCR Zur Optimierung ausgetestet, der RT-PCR unterschiedliche wurden verschiedene Annealing-Temperaturen MgCl2-Konzentrationen und Zyklenzahlen ausprobiert. Nach Optimierung eines Parameters wurde der als ideal ermittelte Wert für die weiteren Versuche verwendet. So erhielt man beste Resultate bei einer Mg2+Konzentration von 1,5 mM. Die Annealing-Temperatur richtete sich nach den jeweiligen Primern und lag meist zwischen 55°C und 60°C. Um im exponentiellen Bereich zu bleiben, wurde die PCR mit maximal 27 Zyklen gefahren. 3. Material und Methoden 39 3.18 Agarosegel-Elektrophorese Durch Agarosegel-Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt und mittels des Fluoreszenzfarbstoffs Ethidiumbromid (EtBr) durch Einlagerung in doppelsträngige DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in einem 2%igen Agarosegel. Die hierfür benötigte Menge Agarose wurde in einen Erlenmeyerkolben eingewogen und mit der entsprechenden Menge 1x TBE-Puffer in einem Mikrowellengerät bis zur vollständigen Lösung der Agarose erhitzt. Nach Abkühlung auf 60°C wurden 1,25 µl Ethidiumbromid-Lösung (1%) pro 50 ml Gel-Lösung hinzugefügt. Das Gel wurde blasenfrei in einen horizontalen Flachbettgelträger (Renner GmbH, Darmstadt, BRD) gegossen, ein Probenkamm (14 Zähne) eingesetzt und nach Aushärtung in eine mit 1x TBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer verbracht. Der Probenkamm wurde vorsichtig entfernt, und anschließend erfolgte das Auftragen der Proben, die vorher mit 1/5 Volumen 6x DNA-Ladepuffer vermischt wurden. Der λ DNA/ Pst I-Längenmarker wurde in eine separate Geltasche pipettiert und diente der Längenbestimmung der DNA-Fragmente. Die Elektrophorese wurde über 45 Minuten bei 100 V Spannung durchgeführt. Zur Dokumentation wurde das Agarosegel unter UV-Licht-Bestrahlung (100%) mit einer Digitalkamera aufgenommen und mit dem Bildbearbeitungsprogramm BioDocII (Biometra GmbH, Göttingen, BRD) gespeichert. 3. Material und Methoden 40 3.19 Statistische Auswertung Von allen Ergebnissen wurden der Mittelwert ( χ ) und der Standardfehler des Mittelwertes (SEM, Standard Error of the Mean) mit Hilfe des Programms Excel 2002 unter dem Betriebssystem Windows XP Home Edition von Microsoft® bestimmt. Die Berechnung der Signifikanzen zwischen den beiden Gruppen (FGF-2 knock-out Mäuse und Wildtyp-Mäuse) wurde mit dem Statistikprogramm StatView für Windows, Version 5.0 (SAS Institute Inc., USA) durchgeführt. Hierfür wurde zunächst die Normalverteilung der Daten mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test getestet. Anschließend wurde zum Vergleich zweier unabhängiger Gruppen der ungepaarte tTest ("Student’s test") gewählt, bei dem eine Normalverteilung der Werte vorausgesetzt wird. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 bzw. p < 0,01 berücksichtigt. 3.20 Klonieren von PCR-Produkten Die Methoden molekularer Klonierung befassen sich mit der Konstruktion und Vervielfältigung neuer Plasmide. Bei ihrer Konstruktion geht man von zwei DNAFragmenten aus, die ligiert werden: Vektor und Insert. Während das Insert ein DNAStück ist, das man genauer untersuchen möchte, handelt es sich bei dem Vektor um ein vollständiges Plasmid, das als Vehikel benutzt wird. Nach der Konstruktion eines neuen Plasmides werden mit ihm Bakterien "transformiert", in denen es dann repliziert wird. Zur Klonierung von PCR-Produkten wurde das Plasmid pGEM®-T der Firma Promega (Madison, USA) verwendet. Es besteht aus ca. 3000 Basenpaaren und wurde durch Schneiden des pGEM®-5Zf(+)-Vektors (Promega, Madison, USA) mit EcoRV und Addition eines 3’-terminalen Thymidins an beide Enden hergestellt. Diese 3’-T-Überhänge verbessern die Effizienz bei der Ligation mit PCR-Produkten in das Plasmid. Die Ligation nutzt die Tatsache, dass z.B. die Taq-DNA-Polymerase, 3. Material und Methoden 41 Matrizen-unabhängig ein einzelnes Adenosin an das 3’-Ende von PCR-Produkten hängt. Zusätzlich enthält der Vektor einen sogenannte Polylinkerregion, die durch die Aneinanderreihung singulärer Restriktionschnittstellen der Einklonierung dient und innerhalb der α-Peptid-codierenden Region des Enzyms β-Galactosidase liegt. Durch die Insertion von PCR-Produkten in dieses α-Peptid wird dieses inaktiviert und erlaubt so die Identifikation rekombinanter Klone durch das Blau/Weiß-Screening. Der Polylinker wird von Primersequenzen (universeller und reverser Primer), die für die DNA-Sequenzierung notwendig sind und von Promotoren für die T7- und Sp6RNA-Polymerase flankiert. Zuerst wurde eine Standard-PCR (Protokoll siehe 3.17, Tabelle) mit einer beliebigen cDNA-Probe (hier: Striatum-cDNA von Wildtyp-Mäusen) und Primern für das Dopaminrezeptor-1-Gen durchgeführt. Es wurde die kommerzielle Taq DNA Polymerase (5 U/µl) von Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, BRD, verwendet. Die Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in einem 2%igen Agarosegel (siehe 3.21.). Das Gel wurde kurz unter UV-Licht (70%) betrachtet und die entsprechende Bande markiert. Anschließend wurde die Bande mit einem Einmalskalpell (No. 15) aus dem Gel ausgeschnitten. Es folgte eine Extraktion und Aufreinigung der DNA-Fragmente aus dem Gel mittels des QIAquick® Gel Extraktion Protokolls (Qiagen, Hilden, BRD). 3. Material und Methoden 42 3.20.1 Ligation der Banden-cDNA in einen geeigneten Vektor Für die Ligation wurde das LigaFastTM Rapid DNA Ligation System von Promega (Madison, USA) in Zusammenhang mit dem Vektor pGEM®-T (siehe oben) verwendet. Zur Ligation wurde das aufgereinigte PCR-Produkt aus der Amplifikation des Dopaminrezeptor-1-Gens eingesetzt (s.o.). Reaktionsgemisch: 1 µl pGEM®-T Vektor (50 ng/µl) 5 µl aufgereinigtes PCR-Produkt 2 µl dH2O 1 µl 10x Ligation Puffer 1 µl T4 DNA Ligase (3 WeissU/µl) 10 µl Die Bestandteile wurden gut gemischt und über Nacht bei 15°C im Wasserbad inkubiert. 3.20.2 Transformation kompetenter Bakterien mit dem Vektor pGEM®-T Als kompetente Bakterien dienten DH5α E.coli-Zellen von Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, BRD [Genotyp: T’/endA1 hsdR17(rK-mK+) glnV44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 ∆ 8lacIZYA-argF) 4169 deoR (Ф80dlac∆ (lacZ) M15]. 100 µl kompetente Zellen wurden 15 Minuten auf Eis aufgetaut. Dann wurde der gesamte Ligationsansatz (10 µl), der den Vektor mit dem eingesetzten PCR-Produkt enthielt, hinzugefügt und vorsichtig durch Fingerschnippen gemischt. Die Zellen wurden 20 Minuten auf Eis gekühlt, dann genau 90 Sekunden bei 42°C im Wasserbad inkubiert (Hitzeschock-Transformation) und nochmals 2 Minuten auf Eis 3. Material und Methoden 43 gestellt. Anschließend wurden sie in 1 ml LB-Medium suspendiert und 60 Minuten bei 37°C im Schütteler inkubiert. Abschließend wurde die Zell-Suspension 1 Minute abzentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 100-200 µl abgenommen, das Pellet vorsichtig resuspendiert und dann auf einer Agar-Platte (X-Gal/IPTG/Amp) ausplattiert. Die Platte wurde mit Parafilm abgedichtet und bei 37°C über Nacht inkubiert. Da der pGEM®-T-Vektor ein Resistenzgen für Ampicillin enthält, konnten nur transformierte Bakterien-Klone auf den LB-(Amp-)Platten wachsen. Am darauffolgenden Morgen wurde die Platte 12 Stunden bei 4°C im Kühlschrank gelagert und schließlich einer Blau-Weiß-Selektion unterworfen. Die Blau-Weiß-Selektion beruht auf einer Unterbrechung des lacZ’-Gens im pGEM®T-Vektor. Dieses Gen kodiert für das N-terminale α-Fragment der ß-Galaktosidase, das alleine keine ß-Galaktosidase-Aktivität besitzt. Bringt man das α-Fragment mit dem ebenfalls inaktiven C-terminalen ω-Fragment zusammen, wird diese Aktivität wieder hergestellt, ein Vorgang den man α-Komplementation nennt (ULLMANN und PERRIN, 1970). Bakterienkolonien, bei denen das lacZ’-Gen durch Einklonierung des Inserts (PCR-Fragment) unterbrochen wurde, bleiben nach Inkubation mit IPTG und X-Gal weiß. Denn hier kann das Substrat X-Gal nicht mehr in einen blauen Farbstoff umgesetzt werden, während Klone ohne Insertion das α-Fragment exprimieren und sich blau färben. Von der Agar-Platte wurden 6 weiße Kolonien gepickt und in jeweils ein beschriftetes Rundbodenröhrchen überführt. Die Rundbodenröhrchen enthielten jeweils 5 ml LB-Medium und 12,5 µl Ampicillin. Jeder dieser 6 Klone wurde über Nacht bei 37°C im Schüttler (250 Umdrehungen/min) inkubiert. 3. Material und Methoden 44 3.21 Plasmid-Präparation (Minipräparation) Für die Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab (Minipräparation) wurde die Methode nach BIRNBOIM und DOLY (1979), die auf einer alkalischen Lyse der Bakterien beruht, verwendet. Es wurden von jedem der 6 Klone jeweils 1,5 ml Übernachtkultur in LB-Medium (siehe 3.20.2) 1 Minute bei maximaler Erdbeschleunigung (g) zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Vorgang wurde ein zweites Mal mit weiteren 1,5 ml Übernachtkultur wiederholt. Das entstandene Bakterienpellet wurde noch einmal 1 Minute bei maximaler g zentrifugiert und der restliche Überstand verworfen. Dann wurde es in 0,3 ml P1 (10 mM TrisHCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 µg/ml gekochte RNase A in TE-Puffer) gründlich resuspendiert. Nach Zugabe von 0,3 ml P2 (0,2 M NaOH, 1% SDS) wurde vorsichtig durch Invertieren gemischt und für 4 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse der Bakterien war an der höheren Viskosität der Lösung sichtbar. Nun wurden 0,3 ml P3 (2,55 M KAc pH 4,88) zugegeben, gemischt (Vortex) und sofort 15 Minuten bei 14 000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde sauber abgenommen, mit Isopropanol auf 1,5 ml aufgefüllt und gemischt (Vortex). Nach 5bis 10-minütigem Inkubieren wurde nochmals 15 Minuten bei 14 000 g zentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen. Es wurde weitere 10 Sekunden bei 14 000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet dann zweimal mit 1 ml Ethanol (70%) gewaschen. Abschließend wurde das Pellet wiederum 120 Sekunden bei 14 000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und nach kurzer Trocknungszeit in 16 µl ddH2O aufgenommen. 3. Material und Methoden 45 3.22 Restriktionsanalyse der Plasmid-Klone Die durch die Minipräparation (siehe 3.21) gewonnene Plasmid-DNA aller 6 Klone wurde in einem Testverdau mit den Restriktionsendonukleasen PstI und ApaI auf korrekte Insertion des PCR-Produktes überprüft. Reaktionsgemisch: 2 µl 10x REact 4-Puffer 1 µl Pst I 1 µl Apa I 16 µl Plasmid-DNA 20 µl Die Bestandteile wurden gut gemischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Restriktionsverdau auf einem 1,5%igen Agarosegel kontrolliert. Von den Klonen, die erfolgreich im Testverdau waren, wurden Glycerolstocks angelegt. Hierfür wurden 2 ml-Kryoröhrchen entsprechend beschriftet und mit 1 ml Glycerol befüllt. Danach wurden 800 µl Bakterienkultur der entsprechenden Klone hinzugegeben und gemischt (Vortex). Die Klone wurden bei –80°C in der laboreigenen Klon-Datenbank konserviert. 3.23 Sequenzierung Um die Klone sequenzieren zu lassen, wurden von ihnen Übernachtkulturen angesetzt (siehe 3.20.2, letzter Abschnitt). Am darauffolgenden Morgen erfolgte anhand des QIAprep® Spin Miniprep Kit Protokolls (Qiagen, Hilden, BRD) die Extraktion der Plasmid-DNA. 3. Material und Methoden 46 Die Konzentration dieser wurde photometrisch, ähnlich wie bei der RNAQuantifizierung (siehe 3.15), bestimmt. Hierfür erfolgte eine 1:20 Verdünnung der Plasmid-DNA . Als Leerwert diente die Absorption von reinem dH2O. Die Gesamt-DNA-Konzentration (c) wurde wie folgt quantifiziert: 1 OD260 =ˆ 50 µg DNA/ml c [µg/ml] = A260 x Verdünnungsfaktor x 50 µg/ml Damit die Plasmid-DNA später in Sequenzierungspuffer gelösen werden konnte, wurde sie vorher gefällt. Für die Sequenzierung wurde mindestens 1 µg DNA benötigt, deshalb wurden 1,5 bis 1,8 µg Plasmid-DNA eingesetzt und mit dH2O auf ein Volumen von 20 µl aufgefüllt. Fällung der Plasmid-DNA: Die DNA-Suspension wurde mit 1/10 Volumen 3 M NaAc (pH 5,5) und 2 Volumen 100%igem Ethanol (EtOH) gut gemischt und dann 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Um das DNA-Pellet zu waschen, wurde es 10 Minuten mit 70%igem EtOH zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes ließ man das Pellet lufttrocknen. Die Didesoxy-Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) wurde von der Firma MWG-Biotech AG, Martinsried, BRD durchgeführt. Das Ergebnis der Sequenzierung wurde über die Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) unter Verwendung des Programmes BLAST Blastn. 2.0.2. mit schon bekannten Gensequenzen verglichen. 3. Material und Methoden 47 3.24 In-situ-Hybridisierung (ISH) Mit der ISH wird die mRNA eines bestimmten Gens (hier: Dopaminrezeptor-1-Gen) vor Ort (in situ) nachgewiesen, um auf diese Weise die gewebs- oder zellspezifische Expression des Proteins zu lokalisieren. 3.24.1 Perfusion und Präparation von Rückenmarksgewebe Für die Perfusion, durchgeführt von Frau Natascha Heidrich, wurden die Mäuse einzeln durch 1-minütige Einleitung von CO2 in den Tierkäfig in einen sehr tiefen Betäubungszustand versetzt und anschließend auf dem Operationsplatz in Rückenlage verbracht. Es erfolgte die zügige Eröffnung des Thorax mittels einer chirurgischen Schere (No. 04-124-145, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD). Anschließend wurde eine sterile Kanüle in das noch schlagende Herz (linke Herzkammer) eingeführt, durch die dann insgesamt 5 ml sterile, isotonische Kochsalz-Lösung (0,9%, Braun GmbH, Melsungen, BRD) langsam in den großen Blutkreislauf des Tieres infundiert wurden. Während der Infusion wurde mit der chirurgischen Schere der rechte Vorhof des Herzens eröffnet, damit die Lösungen dort wieder austreten konnten. Anschließend wurde die Perfusion mit frisch angesetztem, steril filtriertem Paraformaldehyd (4% PFA in PBS/DEPC-Wasser) durchgeführt. Insgesamt wurden 20 ml 4%iges PFA pro Tier infundiert. Nach der Perfusion erfolgte die Präparation des Rückenmarks (RM) wie in Kapitel 3.9.2 beschrieben. Es wurde zervikales Rückenmarksgewebe (Th1-Th13) entnommen und in ein mit 4%igem PFA gefülltes 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Über Nacht wurde das Gewebe in der Lösung bei 4°C im Kühlschrank gelagert. 3. Material und Methoden 48 3.24.2 Paraffineinbettung Am ersten Tag wurde dem Rückenmarksgewebe (RM-Gewebe) in alkoholischen Lösungen aufsteigender Konzentration, einer sogenannten "Alkoholische Reihe", langsam Wasser entzogen: 70% Ethanol (in DEPC-Wasser) 90 Minuten bei Raumtemperatur 80% Ethanol (in DEPC-Wasser) 90 Minuten bei Raumtemperatur 90% Ethanol (in DEPC-Wasser) 90 Minuten bei Raumtemperatur 100% Ethanol 90 Minuten bei Raumtemperatur Isopropanol 90 Minuten bei Raumtemperatur (davon die letzten 20 Minuten im Wärmeschrank bei 60°C) Das auf 60°C erwärmte, in Isopropanol befindliche RM-Gewebe wurde nun in ein 2 ml-Reaktionsgefäß, das eine Mischung aus Isopropanol/Paraffin im Verhältnis 1:1 enthielt, verbracht. In dieser Mischung wurde das Gewebe über Nacht im Wärmeschrank (60°C) inkubiert. Am zweiten Tag wurde das RM-Gewebe aus der Isopropanol/Paraffin-Mischung in ein Reaktionsgefäß, welches Paraffin enthielt, überführt und darin tagsüber im Wärmeschrank (60°C) inkubiert. Dabei blieb der Deckel des Reaktionsgefäßes offen, damit das restliche Isopropanol abdampfen konnte. Abends erfolgte die Umlagerung des Gewebes in ein neues, mit Paraffin gefülltes Reaktionsgefäß, worin es über Nacht im Wärmeschrank bei 60°C inkubiert wurde. Anschließend wurden die RMPräparate unter RNase-freien Bedingungen in Paraffin-Blöcke eingebettet. Diese wurden in einem RNase-freien Behältnis bis zur Durchführung der ISH gelagert. 3. Material und Methoden 49 3.24.3 Paraffin-Schnitte Einen Tag vor Durchführung der ISH wurden von Frau Hildegard Streich ParaffinSchnitte von den Rückenmarks-Präparaten unter RNase-freien Bedingungen hergestellt. Von den in Paraffin-Blöcken eingebetteten RM-Geweben wurden Querschnitte (8 µm) mit dem Rotationsmikrotom RM 2155 (Leica, Nussloch, BRD) geschnitten. Diese wurden mit DEPC-Wasser auf silanisierte Objektträger (SilanePrepTM Slides, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) aufgezogen und bei 40°C für 1 Minute erwärmt, damit sich die Schnitte ausbreiten konnten. Pro Ojektträger wurden 3 Schnitte aufgezogen. Die Schnitte wurden über Nacht im Trockenschrank (45°C) getrocknet und am nächsten Tag in der ISH eingesetzt. 3. Material und Methoden 50 3.24.4 Linearisierung der Plasmid-DNA Zuerst wurden Übernachtkulturen (20 ml LB-Medium, 20 µl Ampicillin (150 mg/ml in 50% EtOH)) von einem Dopaminrezeptor-1-Gen-Klon (siehe 3.20.1, ff.) und einem Tubulin-Klon (in pBluescript KS) angesetzt. Tubulin fungierte als Positiv-Kontrolle in der ISH. Die Plasmid-DNA gewann man mittels einer Minipräparation nach dem QIAprep® Spin Miniprep Kit (siehe 3.23). Es wurde eine DNA-Quantifizierung (siehe 3.23) vorgenommen und danach der Restriktionsverdau-Ansatz entsprechend berechnet. Reaktionsgemisch: Dopamin1-Rezeptor (D1R) Ansatz 1: 10 µl Enzym Apa I 15 µl 10x Buffer B Ansatz 2: Tubulin Ansatz 1: 10 µl Enzym Sac II + 15 µl 10x Buffer C 90 µl pDNA (10,25 µg) 90 µl pDNA (42 µg) 35 µl DEPC-H2O 35 µl DEPC-H2O 150 µl 150 µl 10 µl Enzym Pst I 15 µl 10x Buffer O Ansatz 2: 10 µl Enzym Hind III + 15 µl 10x Buffer R 90 µl pDNA (10,25 µg) 90 µl pDNA (42 µg) 35 µl DEPC-H2O 35 µl DEPC-H2O 150 µl 150 µl Die Ansätze wurden 2 Stunden bei 37°C im Inkubator inkubiert und abschließend auf einem 1%igen Agarosegel kontrolliert. Der Restriktionsverdau wurde bei –20°C gelagert. 3. Material und Methoden 51 3.24.5 Nicht-radioaktive Markierung von RNA mit Digoxygenin Bei dieser Methode wird die DNA durch Anwesenheit von RNA-Polymerase in vitro transkribiert und anwesende DIG-dUTPs zufällig in die gebildete RNA eingebaut (FEINBERG und VOGELSTEIN, 1983). Zur Markierung von RNA-Fragmenten wurde das DIG RNA Labeling Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, BRD) benutzt. Zur Herstellung von RNA-Sonden wurde das entsprechende DNA-Fragment in den Vektor pGEM®-T kloniert (siehe 3.20) und das entstandene Plasmid anschließend mit Restriktionsendonukleasen am 3’- bzw. 5’-Ende des Inserts linearisiert (siehe 3.24.4). Reaktionsgemisch: 2 µg linearisierte Plasmid-DNA 4 µl 10x Transkriptionspuffer (je nach RNA-Polymerase) 2 µl 10x DIG RNA Labeling Mix 1 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl) 0,7 µl DTT (wurde bei der Sp6-RNA-Polymerase von Promega mitgeliefert, 100 mM) 1,6 µl RNA-Polymerase (Sp6, T7, T3) Der Ansatz wurde mit DEPC-Wasser auf 20 µl aufgefüllt und 2 Stunden bei 30°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden 3 µl RNase-freie DNase I (30 U/µl) zugegeben und 15 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert, um die DNA zu hydrolysieren. Von dem Reaktionsgemisch wurden 2 µl für ein RNA-Kontrollgel (1%, siehe Kap. 3.14) abgenommen. Die Inhibition der DNase erfolgte mit 0,8 µl EDTA (0,5 M; pH 8). Durch Zugabe von 2,5 µl LiCl (4 M) und 75 µl Ethanol (100%) wurde die RNA in Fällung gebracht. Die präzipitierte RNA konnte so 1-3 Tage bei –20°C gelagert werden. 3. Material und Methoden 52 Zur Verwendung wurde die RNA-Sonde abzentrifugiert, mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach kurzem Trocknen in 100 µl DEPC-Wasser resuspendiert. Laut Protokoll befanden sich 200 µg Sonde in dem 20 µl Ansatz. Die hergestellten Sonden wurden unmittelbar zur ISH eingesetzt. 3.24.6 ISH an Paraffinschnitten Die Technik der ISH wurde Ende der sechziger Jahre von zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander entwickelt (PARDUE und GALL, 1969; JOHN et al., 1969). ISH ermöglicht, spezifische Nukleinsäuresequenzen in Metaphasenchromosomen, Interphasekernen und Zellen von Gewebeschnitten zu detektieren. Für die Lokalisation zellulärer RNA wurden Rückenmarks-Gewebeschnitte verwendet. Aus Paraffin-Blöcken wurden Frontalschnitte mit einer Schnittdicke von 8 µm hergestellt (siehe 3.24.3). Die Schnitte wurden in Xylol entparaffinisiert (2x 10 Minuten), in einer abnehmenden Ethanolreihe (100% 80% (in DEPC-H2O) 50% (in DEPC-H2O), jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur) rehydriert und dann in TEPuffer gelagert (10 Minuten). Es folgte ein Proteinase K-Verdau des Gewebes, um die Zugänglichkeit zur komplementären Sonde zu verbessern. Hierfür wurde Proteinase K (2 µg/ml) 1:1000 in TE-Puffer verdünnt und 30 Minuten bei 37°C auf den Schnitten inkubiert. Um den RNA-Gehalt im Gewebe zu bewahren, wurde die zelluläre Proteinmatrix mit 4%igem Paraformaldehyd (in PBS) fixiert. Nach 10 Minuten wurden die Schnitte dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen. 3. Material und Methoden 3.24.6.1 53 Prähybridisierung Um alle unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Objektträger mit je 1 ml Prähybridisierungslösung bedeckt und in einer feuchten Hybridisierungskammer 2 Stunden bei 55°C inkubiert. Die Prähybridisierungslösung enthielt: 50% entionisiertes Formamid 20x SSC 5x Dehnhardt’s Solution 250 µg/ml tRNA 500 µg/ml Heringssperma-DNA (denaturiert bei 95°C für 5 Minuten) 3.24.6.2 Hybridisierung Zur Herstellung der Hybridisierungslösung wurden jeweils 12,5 µl DIG-markierte RNA-Sonde (siehe 3.24.5) und 5 µl Heringssperma-DNA 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad denaturiert und anschließend mit 200 µl Prähybridisierungslösung pro Objektträger verdünnt. Der Objektträger wurde mit einem Stück Parafilm abgedeckt, um die Schnitte gleichmäßig mit Hybridisierungslösung zu benetzen und vor Austrocknung zu schützen. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht in einer feuchten Hybridisierungskammer bei 55°C. 3. Material und Methoden 3.24.6.3 54 Nachweis der digoxygeninmarkierten Sonde mit alkalischer Phosphatase (AP) Am nächsten Tag wurden die Objektträger zuerst in 5x SSC (5 Minuten bei 72°C) und dann in 0,2x SSC (1 Stunde bei 72°C) gewaschen, um überschüssige und unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Anschließend wurden sie 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,3% Triton-X 100 in Maleinsäurepuffer inkubiert. Es folgte eine Inkubation mit 1% Blockingreagenz in Maleinsäurepuffer (30 Minuten bei Raumtemperatur). Der Anti-DIG-AP-Antikörper wurde 1:2500 in 1% Blockingreagenz verdünnt und je 1 ml pro Objektträger aufgetragen. Die Objektträger wurden in einer feuchten Hybridisierungskammer über Nacht bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. An Tag 3 wurden die Objektträger zweimal mit Maleinsäurepuffer (jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur) und dann einmal mit Trisalinepuffer (2 Minuten bei Raumtemperatur) gewaschen. Abschließend wurde mit je 100 µl NBT/BCIP (in Trisalinepuffer) pro Objektträger bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach 5 Minuten wurde die Farbreaktion regelmäßig unter dem Lichtmikroskop (Olympus CK30-F200, Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg, BRD) begutachtet. Bei ausreichender Färbung wurde sie mit dH2O gestoppt. Die Objektträger wurden mit Kaisers Glyceringelatine (für Mikroskopie) und Deckgläsern (Menzel-Gläser®, 24x60mm, Braunschweig, BRD) eingedeckt. Die Betrachtung der Paraffinschnitte erfolgte lichtmikroskopisch unter Verwendung des Olympus IX-70 Fluoreszenzmikroskopes (Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg, BRD). Mittels DIG-markierter antisense-D1R-RNA-Sonden wurde die zelluläre Lokalisation der D1R-mRNA-Expression im zervikalen Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen dargestellt und verglichen. Die gefärbten Schnitte wurden mit der im Mikroskopie-System integrierten digitalen Kamera (Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg) dokumentiert. 4. Ergebnisse 55 4. Ergebnisse 4.1 "Screening" nach alternativ gespleissten mRNA-Transkripten im Rückenmark Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) interagiert mit Proteinen der SpleissingMaschinerie und könnte möglicherweise regulatorisch in den Prozess des Spleissens eingreifen. So fand unsere Arbeitsgruppe heraus, dass FGF-2 direkt an den Spleissing-Assemblierungsfaktor survival of motoneuron (SMN)-Protein bindet (CLAUS et al., 2003; CLAUS et al., 2004). Desweiteren konnte nachgewiesen werden, dass sowohl die 18 kDa-Isoform als auch die 23 kDa-Isoform von FGF-2 direkt an eine Untereinheit des Spleissfaktors SF3a120, nämlich SF3a66, bindet (GRINGEL et al., 2004). Diese Interaktionen mit eher generellen Komponenten des Spleissosom-Komplexes lassen vermuten, dass FGF-2 eine Rolle beim prä-mRNASpleissen spielen könnte. Der Nachweis von alternativem Spleissen bzw. differentieller Genexpression wäre ein Hinweis auf die funktionelle Rolle von FGF-2 im Zusammenspiel mit Komponenten der Spleissing-Maschinerie. Aus diesem Grund sollten die spezifischen Effekte der FGF-2-Expression auf alternatives Spleissen und differentielle Genexpression im Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen untersucht werden. Hierzu wurde eine "ScreeningPCR" durchgeführt. Das bedeutet, es wurde eine semiquantitative ReverseTranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit Primerpaaren für "Kandidatengene" vorgenommen, um deren Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen zu vergleichen. Die Kandidatengene (mGluR1, ICH-1, n-src, Agrin, GABAγ2) weisen alternativ gepleisste mRNA-Transkripte im Rückenmark auf (JENSEN et al., 2000). Die Primer dieser Kandidatengene sind so gewählt, dass sie sich über eine mRNA-Sequenz erstrecken, die für zwei verschiedene Spleiss-Varianten kodiert. Beide Spleiss-Varianten werden in einem bestimmten Verhältnis exprimiert. Als Nachweis für alternatives Spleissen in 4. Ergebnisse 56 Abwesenheit von FGF-2 ist eine Änderung im Expressionsverhältnis dieser SpleissVarianten zu erwarten. Die übrigen Primersequenzen wurden von unserer Arbeitsgruppe entworfen und sollten probeweise auf ihr Expressionsverhalten im Rückenmark von FGF-2 knock-out und Wildtyp-Mäusen getestet werden. Zum Nachweis alternativen Spleissens und differentieller Gen-Expression mittels semiquantitativer RT-PCR wurde die aus Rückenmarksgewebe von FGF-2 knockout- und Wildtyp-Mäusen isolierte RNA auf einem 1%igen Formaldehyd-Agarosegel hinsichtlich ihrer Qualität überprüft (Abb. 1) und mit Hexamerprimern (random hexamers) revers transkribiert. FGF-2 ko Abb. 1: Qualitätskontrolle der GesamtRNA-Präparation aus dem Rückenmark von FGF-2 knock-out- und WildtypMäusen wt 28S 18S Gezeigt ist ein 1%iges Ethidiumbromidgefärbtes Formaldehyd-Agarosegel unter UV-Licht. Zu sehen sind die beiden charakteristischen RNA-Banden, die die eukaryotische ribosomale 18S und 28S RNA repräsentieren. Die Intensitäten der 18S und der 28S RNA-Banden sollten dabei im Verhältnis von 1 : 1,5-2,5 vorliegen, was hier der Fall ist. Zusätzliche Banden, die bei kleineren Kilobase(kb)-Werten auftraten, waren auf ribosomale 5S RNA und tRNA zurückzuführen. In der nachfolgenden PCR wurde jeweils 1 µl cDNA im doppelten Ansatz eingesetzt. Die Expressions-Level der cDNAs wurden gegen die Expression der konstitutiv exprimierten Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) normalisiert, indem für jeden Wert die Intensitäten der Banden auf einem 2%igen Agarosegel densitometrisch ausgewertet und mit der Intensität der GAPDH-Bande für den gleichen Wert verglichen wurden. Mittels der Screening-RT-PCR konnten zwar keine alternativ gespleissten mRNATranskripte, wohl aber eine differentielle Expression des metabotropen Glutamatrezeptor 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen 4. Ergebnisse 57 nachgewiesen werden. Es stellte sich im Vergleich mit den Wildtyp-Mäusen heraus, dass die Expression des mGluR1 im Rückenmark von FGF-2 knock-out-Mäusen hochreguliert wurde (Abb. 2). wt FGF-2 ko mGluR1α mGluR1β wt FGF-2 ko GAPDH Abb. 2: Ausschnitte aus dem Screening-Experiment auf einem 2%igen mit Ethidiumbromidgefärbten Agarosegel Die cDNA wurde jeweils im doppelten Ansatz auf das Gel aufgetragen. GAPDH wurde als cDNAExpressionskontrolle verwendet. Amplifiziert wurde ein Abschnitt aus der cDNA für den metabotropen Glutamatrezeptor 1. Der metabotrope Glutamatrezeptor 1 (mGluR1) ist eines der Kandidatengene, von denen bekannt ist, dass sie im Rückenmark alternativ gespleisst werden (JENSEN et al., 2000). Um alternativ gespleisste Transkripte zu analysieren, wurden die Primer so gewählt, dass sie sich über eine mRNA-Sequenz erstrecken, welche für zwei verschiedene Spleiss-Varianten kodiert. Auf dem Gel sind die Banden der zwei Spleiss-Varianten von mGluR1 zu sehen, nämlich mGluR1α und mGluR1β. Dem Transkript mGluR1α fehlt ein Exon und Transkript mGluR1β enthält ein zusätzliches Exon in der mRNA des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (HOLLMANN und HEINEMANN, 1994). Beide Spleiss-Varianten des mGluR1 werden bei Wildtyp-Mäusen in einem bestimmten Verhältnis exprimiert und zwar: mGluR1α in geringerem Ausmaß als mGluR1β. Als Nachweis für alternatives Spleissen in Abwesenheit von FGF-2 wäre eine Änderung im Expressionsverhältnis dieser SpleissVarianten bei FGF-2 knock-out Mäusen zu erwarten gewesen. Ein verändertes Expressionsverhältnis hätte sich in den Intensitäten der entsprechenden Banden auf dem Gel wiedergespiegelt. So würde z.B. bei verstärkter Expression der mGluR1α-Spleissvariante die mGluR1α-Bande stärker und die mGluRβ-Bande möglicherweise schwächer exprimiert werden. Abbildung 2 zeigt jedoch, dass das Verhältnis der Spleiss-Varianten bei Wildtyp (wt)- und FGF-2 knock-out (FGF-2 ko)-Mäusen gleich bleibt. Somit konnte kein alternatives Spleissen für die beiden Spleiss-Varianten von mGluR1 bei FGF-2 knock-out Mäusen festgestellt werden. Da gleiche Mengen cDNA in der PCR eingesetzt und keine Unterschiede der GAPDH-Expression zwischen Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen festgestellt wurden, bedeutet dieses Ergebnis, dass die Expression beider mGluR1-Transkripte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen hochreguliert wird. 4. Ergebnisse 58 Alle übrigen mit der semiquantitativen RT-PCR auf alternatives Spleissen und differentielle Expression getesteten Gene zeigten hinsichtlich ihrer Expression keinen Unterschied zwischen FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen (Abb. 3). Verhältnis ko/wt 2 1,5 1 0,5 Pe ph 51 /5 8 sr c 2G AB A H ga m IC Ag rin 1 Pe ph 61 /5 8 G lu R m FG F2 G AP D H 0 Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2), metabotroper Glutamatrezeptor 1 (mGluR1), Peripherin 61/58 (Peph61/58), Agrin, Caspase 2 (ICH), gamma2-Untereinheit des GABAA-Rezeptors (gam2GABA), src-Tyrosinkinase (src), Peripherin 51/58 (Peph51/58) Abb. 3: Repräsentative densitometrische Auswertung einer Screening-RT-PCR Dargestellt ist ein typisches Ergebnis eines Screening-Experiments. Die Ethidiumbromid-gefärbten Banden auf dem 2%igen Agarosegel wurden densitometrisch mit der Software Scion Image quantifiziert. Die Werte wurde gegen die GAPDH-Expression (Säule 1), welche als cDNAExpressionskontrolle diente, normalisiert, indem das Verhältnis zwischen jedem Wert und dem dazugehörigen GAPDH-Wert berechnet wurde. Gezeigt werden relative mRNA-Expressions-Level im Rückenmark von FGF-2 knock-out- im Verhältnis zu entsprechenden Wildtyp-Mäusen. Die Expression von FGF-2 ist erniedrigt, da FGF-2 knock-out- im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen kein FGF-2 exprimieren (Säule 2). Der knock-out war jedoch nicht vollständig, da noch geringe Mengen FGF-2mRNA gemessen wurden. Dagegen ist die Expression von mGluR1 in FGF-2 knock-out Mäusen deutlich hochreguliert (Säule 3). Die übrigen getesteten Gene zeigten keine ExpressionsUnterschiede. 4. Ergebnisse 4.2 59 Signifikante Hochregulation der Expression des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen Um das Ergebnis der Screening-RT-PCR statistisch zu verifizieren, wurde die RTPCR viermal mit unterschiedlichen Rückenmark-Gewebeproben von FGF-2 knockout- und Wildtyp-Mäusen wiederholt (Abb. 4). Erwartungsgemäß gab es zwischen den beiden Gruppen einen hochsignifikanten Unterschied in der Expression des FGF-2-Gens, welches in FGF-2 knock-out Mäusen inaktiviert vorliegt und somit eigentlich keine FGF-2-mRNA exprimiert werden dürfte. Teilweise konnte jedoch noch FGF-2-mRNA in knock-out-Mäusen gemessen werden, was wahrscheinlich auf einen unvollständigen knock-out zurückzuführen ist. In vier unabhängigen semiquantitativen RT-PCRs bestätigte sich, dass die Expression des metabotropen Glutamatrezeptor 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren signifikant hochreguliert wird. Der metabotrope Glutamatrezeptor 1 ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor. Nach Andocken von Glutamat kommt es zu einer G-Protein-vermittelten Aktivierung der Phospholipase C (PLC). Daraufhin wird der sekundäre Botenstoff Inositol-1,4,5-tris-phosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) aus Phosphatidylinositol (PI) gebildet. IP3 führt zur signalartigen Freisetzung von Calcium-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum (KANDEL, SCHWARTZ und JESSEL, 2000). 4. Ergebnisse 60 2 * Verhältnis ko/wt 1,5 1 0,5 *** 0 FGF-2 mGluR1 GAPDH Abb. 4: Densitometrische Auswertungen der RT-PCRs Ethidiumbromid-gefärbte Banden auf 2%igen Agarosegelen wurden mit der Software Scion Image densitometrisch quantifiziert. Alle Werte wurden gegen die GAPDH-Expression normalisiert (Säule 3). Gezeigt werden relative mRNA-Expressions-Level von FGF-2 knock-out- im Verhältnis zu WildtypMäusen im Rückenmark. Erwartungsgemäß gibt es zwischen FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen einen hochsignifikanten Unterschied in der Expression von FGF-2 (Säule 1). Die mGluR1-Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ist im Gegensatz zu den Wildtyp-Tieren signifikant hochreguliert (Säule 2). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten (n=4); *p < 0,05, ***p < 0,001, Student’s t-Test für ungepaarte Proben. 4.3 Ionotrope Glutamatrezeptor-Expression im Rückenmark und im cerebralen Cortex von FGF-2 knock-out Mäusen Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Expression des metabotropen Glutamatrezeptor 1 (mGluR1) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen signifikant hochreguliert wird, sollte geklärt werden, ob auch die ionotropen Glutamatrezeptoren Unterschiede in der Expression aufweisen. Im Gegensatz zu den metabotropen Glutamatrezeptoren, welche G-Proteingekoppelte Rezeptoren sind, bilden ionotrope Glutamatrezeptoren Kationenkanäle, deren Öffnung zu unterschiedlich schnellen Ionenströmen und somit zur Depolarisierung der postsynaptischen Zelle führen. Ionotrope Glutamatrezeptoren 4. Ergebnisse 61 werden nach ihren pharmakologischen Agonisten benannt. So gibt es drei Familien von diesen Rezeptoren. Diese sind die AMPA-Rezeptoren (AMPA von α-Amino-3hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat), die Kainatrezeptoren und die NMDA- Rezeptoren (NMDA von N-Methyl-D-aspartat) (WATKINS et al., 1990; HOLLMANN und HEINEMANN, 1994). In der vorliegenden Arbeit wurde die Familie der AMPARezeptoren, welche glutamatinduzierten aus vier Antworten Untereinheiten vermittelt, als besteht und Vertretung die für schnellsten ionotrope Glutamatrezeptoren ausgewählt. Um den Einfluss von FGF-2 auf die Expression der ionotropen Glutamatrezeptoruntereinheiten vom AMPA-Typ zu untersuchen, wurde die GesamtRNA aus Rückenmark-Gewebe und cerebralem Cortex von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen isoliert und die mRNA in cDNA umgeschrieben. Zusätzlich zum Rückenmark-Gewebe wurde cerebraler Cortex untersucht, da bekannt ist, dass FGF2 knock-out Mäuse eine ca. 40%ige Abnahme der glutamatergen pyramidalen Neurone im frontalen und parietalen Cortex aufweisen (KORADA et al., 2002). 4.3.1 Signifikante Hinunterregulation der Expression der AMPA-TypGlutamatrezeptoren 3 und 4 im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen Abbildung 5 zeigt das Ergebnis einer repräsentativen RT-PCR. Es wurde jeweils 1 µl cDNA im doppelten Ansatz eingesetzt. Als externe Kontrolle wurde GAPDH hinzugezogen. Die semiquantitative RT-PCR ergab, dass die Expressionen der vier AMPARezeptoruntereinheiten im Rückenmark von FGF-2 knock-out (ko)- im Vergleich mit Wildtyp (wt)-Mäusen erniedrigt sind. Aus statistischen Gründen wurden jeweils drei bis vier unabhängige RT-PCRs ausgewertet (Abb. 6, 7 und 8). 4. Ergebnisse λ Pst I wt 62 ko λ Pst I ionoGluR1 (424bp) λ Pst I wt GAPDH wt ko ionoGluR2 (533bp) ko λ Pst I wt ko wt ko ionoGluR3 (376bp) wt ko wt ko ionoGluR4 (613bp) wt ko GAPDH Abb. 5: Repräsentative semiquantitative RT-PCR der ionotropen Glutamatrezeptoren 1 bis -4 vom AMPA-Typ im Rückenmark von FGF-2 knock-out (ko)- und Wildtyp-Mäusen (wt) Gezeigt werden 2%ige Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegele unter UV-Licht. Die Proben wurden jeweils im doppelten Ansatz aufgetragen. Amplifiziert wurden Fragmente aus dem ionotropen Glutamatrezeptor1, -2, -3, und -4 (ionoGluR1, -2, -3 und -4). λ Pst I wurde als DNA-Längenmarker benutzt. GAPDH wurde als cDNA-Expressionskontrolle herangezogen. Die Abbildungen 6 und 7 geben die densitometrischen Auswertungen aller semiquantitativen RT-PCRs als Mittelwerte ± SEM (Standard Error of the Mean, Standardfehler des Mittelwertes) wieder. In Abbildung 6 ist die Expression der AMPA-Glutamatrezeptoruntereinheiten im Rückenmark in direktem Vergleich von Wildtyp- mit FGF-2 knock-out Mäusen dargestellt. Die Auswertungen ergaben, dass die Expression aller AMPA-Glutamatrezeptoruntereinheiten im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen reduziert ist. Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen lag bei der Expression der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 3 und 4 vor (Abb. 6, weiße Säulen). In Abbildung 7 sind die gleichen Auswertungen als Verhältnis der Expression von FGF-2 knock-out- zu Wildtyp-Mäusen abgebildet. 4. Ergebnisse 63 2000 relative mRNA-Level 1500 * 1000 * wt ko 500 0 ionoGluR1 ionoGluR2 ionoGluR3 ionoGluR4 Abb. 6: Direkter Vergleich der relativen mRNA-Level der ionotropen AMPA-Rezeptoren im Rückenmark von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen Ethidiumbromid-gefärbte Banden auf 2%igen Agarosegelen wurden mit der Software Scion Image densitometrisch quantifiziert. Alle Werte wurden gegen die GAPDH-Expression normalisiert. Dargestellt werden relative mRNA-Level der ionotropen AMPA-Rezeptoren 1 bis 4 (ionoGluR1 bis 4) im Rückenmark in direktem Vergleich von Wildtyp- (wt, schwarze Säulen) und FGF-2 knock-outMäusen (ko, weiße Säulen). Im Rückenmark von FGF-2 knock-out-Mäusen wird im Vergleich zu Wildtyp-Tieren die Expression der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 1 bis 4 hinunterreguliert. Dabei zeigen FGF-2 knock-out Mäuse eine signifikante Reduktion der Expression der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 3 und 4. Die Werte für den AMPA-Typ-Glutamatrezeptor 1 sind Mittelwerte ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten (n=4); Die Werte für die AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 2 bis 4 sind Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten (n=3); *p < 0,05, Student’s t-Test für ungepaarte Stichproben. 4. Ergebnisse 64 1,5 Verhältnis ko/wt 1 * * 0,5 0 ionoGluR1 ionoGluR2 ionoGluR3 ionoGluR4 Abb. 7: Verhältnis der relativen mRNA-Level der ionotropen AMPA-Rezeptoren von FGF-2 knock-out- zu Wildtyp-Mäusen im Rückenmark In Abbildung 7 werden die relativen mRNA-Level aus Abbildung 6 als Verhältnisse von FGF-2 knockout- zu Wildtyp-Mäusen gezeigt. Die Werte für den AMPA-Typ-Glutamatrezeptor 1 (ionoGluR1) sind Mittelwerte ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten (n=4); Die Werte für die AMPA-TypGlutamatrezeptor 2 bis 4 (ionoGluR2, -3, -4) sind Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten (n=3); *p < 0,05, Student’s t-Test für ungepaarte Stichproben. 4.3.2 Keine Expressionsunterschiede der AMPA-Typ Glutamatrezeptoren im cerebralen Cortex von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen Da FGF-2 knock-out Mäuse Defekte in der Organisation und Differenzierung ihres cerebralen Cortex während der embryonalen ZNS-Entwicklung und im adulten Organismus (DONO et al., 1998) und eine Abnahme in der Anzahl der kortikalen, glutamatergen Pyramidenzellen aufweisen (KORADA et al., 2002), wurde in dieser Arbeit auch die Expression der AMPA-Glutamatrezeptoruntereinheiten im cerebralen Cortex untersucht. Es konnten jedoch keine Unterschiede bezüglich der Expression 4. Ergebnisse 65 der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoruntereinheiten zwischen Wildtyp- und FGF-2 knockout Mäusen im cerebralen Cortex festgestellt werden (siehe Abb. 8). Verhältnis ko/wt 1,5 n.s. 1 0,5 0 ionoGluR1 CC ionoGluR2 CC ionoGluR3 CC ionoGluR4 CC Abb. 8: Verhältnis der relativen mRNA-Level der ionotropen AMPA-Rezeptoren von FGF-2 knock-out- zu Wildtyp-Mäusen im cerebralen Cortex Ethidiumbromid-gefärbte Banden auf 2%igen Agarosegelen wurden mit der Software Scion Image densitometrisch quantifiziert. GAPDH wurde als cDNA-Expressionskontrolle eingesetzt. Abgebildet werden relative mRNA-Expressions-Level der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoruntereinheiten 1 bis 4 im cerebralen Cortex (CC) im Verhältnis von FGF-2 knock-out (ko)- zu Wildtyp (wt)-Mäusen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede (n.s.) zwischen FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen hinsichtlich der Expression der AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren im cerebralen Cortex ausgemacht werden. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten (n=3). 4.4 Dopaminrezeptor-Expression im Rückenmark und im Striatum von FGF-2 knock-out Mäusen Nach Entdeckung von Expressionsunterschieden der Glutamatrezeptoren im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen wurde die Screening-RT-PCR mit Primerpaaren für Dopaminrezeptoren erweitert. Die Dopaminrezeptor-Familie besteht aus zwei Untergruppen: Erstere sind die Dopamin1-artigen Dopaminrezeptoren, welche über G-Proteine die Adenylatcyclase aktivieren und dadurch den cAMP-Spiegel erhöhen (KEBABAIN und CALNE, 1979). 4. Ergebnisse Die zweite 66 Gruppe sind Dopamin2-artigen Dopaminrezeptoren, die die Adenylatcyclase hemmen, dafür aber die Leitfähigkeit von Kalium-Ionenkanälen steigern (VALLAR et al., 1988). In der vorliegenden Arbeit wurde der Dopamin1Rezeptor als Vertreter für die Dopamin1-artigen Rezeptoren ausgewählt. Vertreter für die Dopamin2-artigen Rezeptoren waren die Dopamin2- und 3-Rezeptoren. Da die Expressionsunterschiede der Glutamatrezeptoren in FGF-2 knock-out Mäusen auf das Rückenmark beschränkt waren, sollte dieses auch auf unterschiedliche Dopaminrezeptor-Expression getestet werden. Zusätzlich wurde das Striatum untersucht, da es von dopaminergen Fasern aus der Substantia nigra, den sogenannten nigrostriatalen Bahnen, innerviert wird. Für die Untersuchung der Expression der Dopamin1-, 2- und 3- Rezeptoruntereinheiten mittels semiquantitativer RT-PCR wurde aus RückenmarkGewebe und Striatum von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen die Gesamt-RNA isoliert und die mRNA in cDNA umgeschrieben. In der nachfolgenden PCR wurde jeweils 1 µl cDNA im doppelten Ansatz eingesetzt. Die Expressionen der cDNAs wurden gegen die Expression des konstitutiv exprimierten Glycerinaldehyd-3Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) normalisiert, indem für jeden Wert die Intensitäten der Banden auf den 2%igen Agarosegelen densitometrisch ausgewertet und mit der Intensität der GAPDH-Bande für den gleichen Wert verglichen wurden. Aus statistischen Gründen wurden drei bis sieben unabhängige RT-PCRs ausgewertet. In den Abbildungen 9 bis 11 ist die Expression der jeweiligen DopaminrezeptorUntereinheiten im Rückenmark und im Striatum von Wildtyp- und FGF-2 knock-outMäusen zu sehen. Im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen konnte eine deutlich verstärkte Expression des Dopamin1-Rezeptors festgestellt werden (Abb. 9, Pfeil). Im Striatum gab es zwischen Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen keinen Unterschied in der Expression der Dopamin1-Rezeptor (Abb. 9). Weder im Rückenmark noch im Striatum von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen ergaben sich Unterschiede bezüglich der Expression Rezeptoruntereinheiten (Abb. 10, Abb. 11). der Dopamin2- und 3- 4. Ergebnisse 67 Rückenmark λPstI wt ko Striatum wt D1R λPstI wt D1R ko wt GAPDH wt ko Striatum wt D2R ko GAPDH Rückenmark wt ko Striatum wt D3R λPstI wt GAPDH ko wt GAPDH λPstI ko wt D2R λPstI ko GAPDH Rückenmark λPstI ko wt GAPDH Gezeigt werden 2%ige Ethidiumbromid (EtBr)gefärbte Agarosegele unter UV-Licht. Die Proben wurden jeweils im doppelten Ansatz aufgetragen. Amplifiziert wurde ein Fragment (331 bp) aus dem D1R-Gen. Als Längenstandard wurde λ DNA/Pst IMarker eingesetzt. GAPDH diente als cDNAExpressionskontrolle. FGF-2 knock-out Mäuse zeigten im Vergleich mit ihren Wildtyp-Artgenossen einen Anstieg der D1RExpression im Rückenmark (Pfeil). Eine differentielle Expression im Striatum konnte nicht festgestellt werden. Abb. 10: Semiquantitative RT-PCR eines D2RFragments in Rückenmark und Striatum von FGF2 knock-out (ko)- und Wildtyp-Mäusen (wt) Abgebildet wird das Ergebnis eines repräsentativen Experiments. Amplifiziert wurde ein Fragment (560 bp, Pfeil) aus dem D2R-Gen. λ DNA/Pst I diente als DNA-Längenmarker. GAPDH wurde als Kontrolle eingesetzt. Sowohl im Rückenmark als auch im Striatum von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen konnte kein Unterschied in der Expression der D2R-mRNA-Level festgestellt werden. ko Abb. 11: Semiquantitative RT-PCR eines D3RFragments in Rückenmark und Striatum von FGF2 knock-out (ko)- und Wildtyp-Mäusen (wt) ko Abgebildet sind 2%ige EtBr-gefärbte Agarosegele unter UV-Licht. Amplifiziert wurde ein Fragment (658 bp) aus dem D3R-Gen. λ DNA/Pst I wurde als Längenstandard benutzt. Das Haushaltsgen GAPDH wurde als cDNA-Expressionskontrolle eingesetzt. Es konnte weder im Rückenmark noch im Striatum eine differentielle D3R-Expression nachgewiesen werden. D3R ko Abb. 9: Semiquantitative RT-PCR eines D1RFragments in Rückenmark und Striatum von FGF2 knock-out (ko)- und Wildtyp-Mäusen (wt) 4. Ergebnisse 4.4.1 68 Signifikante Hochregulation der Dopamin1-Rezeptor Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen In den Abbildungen 12 und 13 werden die densitometrischen Auswertungen aller durchgeführten RT-PCRs als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Die Auswertungen belegten einen signifikanten Anstieg der Expression der Dopamin1-RezeptorUntereinheit im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen (Abb. 12). Im Striatum von Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Expression der Dopaminrezeptor-Untereinheiten gefunden (Abb. 13). Abb. 12: Abb. 13: 2 * n.s. Verhältnis ko/wt Verhältnis ko/wt 2 1 1 0 0 D1R RM D2R RM D3R RM D1R Striat. D2R Striat. D3R Striat. Abb. 12 und Abb. 13: Densitometrische Auswertungen der semiquantitativen RT-PCRs Ethidiumbromid-gefärbte Banden auf 2%igen Agarosegelen wurden mit der Software Scion Image densitometrisch quantifiziert. Dabei wurden alle Werte gegen die GAPDH-Expression normalisiert. Dargestellt werden die relativen mRNA-Level im Rückenmark (RM, Abb. 12) und im Striatum (Striat., Abb. 13) im Verhältnis von FGF-2 knock-out (ko)- zu Wildtyp-Mäusen (wt). Im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen konnte festgestellt werden, dass die Expression des Dopamin1 –Rezeptor (D1R) im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen signifikant hochreguliert wurde (Abb. 12, Säule1). Für die Dopamin2 –Rezeptor (D2R)- und Dopamin3 –Rezeptor (D3R)-Expression konnten keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen gefunden werden. Die Werte für D1R sind Mittelwerte ± SEM aus sieben unabhängigen Experimenten (n=7); *p < 0,05, Student’s t-Test für ungepaarte Proben. Die Werte für D2R und D3R sind Mittelwerte ± SEM aus sechs unabhängigen Experimenten (n=6). Im Striatum konnten keine signifikanten Unterschiede (n.s.) in der Expression von Dopamin1 Rezeptor (D1R), Dopamin2 -Rezeptor (D2R) und Dopamin3 -Rezeptor (D3R) identifiziert werden. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM aus vier unabhängigen Experimenten (n=4). 4. Ergebnisse 4.5 69 Histologischer Nachweis von Dopamin1-Rezeptor mRNA im zervikalen Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen Die densitometrischen Auswertungen der semiquantitativen RT-PCRs ergaben, dass die Dopamin1-Rezeptor (D1R)-Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen signifikant hochreguliert wird. Mittels ISH sollte die zelluläre Lokalisation der D1R-mRNA-Expression im Rückenmark dargestellt und die räumliche Verteilung dieser zwischen FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen verglichen werden. Hierfür wurden tief anästhesierte Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäuse intrakardial mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) perfundiert. Anschließend wurde den Tieren zervikales Rückenmark-Gewebe entnommen und in Paraffin eingebettet. Zervikales Rückenmark-Gewebe wurde ausgewählt, da FGF-2 knock-out Mäuse in diesem Bereich des Rückenmarks weniger gut differenzierte, große Neurone als WildtypMäuse aufweisen (DONO et al., 1998). Für die ISH wurden RückenmarkQuerschnitte mit einer Schnittdicke von 8 µm verwendet. Die Hybridisierung wurde mit Digoxygenin-markierten D1R-RNA-Sonden durchgeführt. Die D1R-RNA-Sonden wurden durch Klonierung eines D1R-RNA-Fragments in den Vektor pGEM®-T (Promega, Madison, USA) hergestellt. Der Nachweis gebundener Digoxygenin (DIG)-markierter D1R-RNA-Sonden im Rückenmark erfolgte mit Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Antikörpern. Mit der ISH konnte durch DIG-markierte antisense-D1R-RNA-Sonden die Expression von D1R-mRNA in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz des zervikalen Rückenmarks nachgewiesen werden (Abb. 14, C und D). Besonders deutlich fiel der Nachweis von D1R-mRNA im Zytoplasma von multipolaren Wurzelzellen des Ventralhorns aus (Abb. 14, E und F). Die sternförmige Struktur (Perikaryon, Dendriten, Axon), die Größe, ein teilweise deutlich erkennbarer Axonhügel und die Lage im Ventralhorn lassen den Schluss zu, dass es sich hierbei um Motoneurone handelt. Bezüglich der zellulären Verteilung der D1R-mRNAExpression im zervikalen Rückenmark war kein Unterschied zwischen FGF-2 knockout- und Wildtyp-Mäusen sichtbar (Abb. 14, C und D). 4. Ergebnisse 70 Abb. 14: Lokalisation der Dopamin1-Rezeptor (D1R) mRNA-Expression mittels ISH im zervikalen Rückenmark (RM) einer FGF-2 knock-out (FGF-2 ko)- und einer Wildtyp-Maus (wt) Die Bilder A, C und E stammen von der FGF-2 knock-out Maus "2750", die Bilder B, D und F von der Wildtyp-Maus "2687". A und B: Übersichtsdarstellung des zervikalen RMs der FGF-2 knock-out- (Bild A) und der WildtypMaus (Bild B). Die Hybridisierung wurde mit sense-D1R-RNA-Sonden als Negativ-Kontrolle durchgeführt. Messbalken = ˆ 500 µm. C und D: Übersichtsdarstellung des zervikalen RMs der FGF-2 knock-out- (Bild C) und der WildtypMaus (Bild D). Die Expression von D1R-mRNA konnte mit DIG-markierten antisense-D1R-RNASonden in multipolaren Nervenzellen in der gesamten grauen Substanz des zervikalen RMs nachgewiesen werden. Hinsichtlich der zellulären Verteilung der D1R-mRNA-Expression war kein Unterschied zwischen FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen erkennbar. Messbalken = ˆ 500 µm. E und F: Vergrößerter Ausschnitt aus dem jeweiligen Ventralhorn der FGF-2 knock-out- (Bild C) und der Wildtyp-Maus (Bild D). Besonders deutlich fiel der Nachweis von D1R-mRNA mit DIG-markierten antisense-D1R-RNA-Sonden in multipolaren Wurzelzellen der grauen Substanz des Ventralhorns aus. Die Größe, Lage und Struktur (Perikaryon, Dendriten, Axon) dieser Zellen sind charakteristisch für Motoneurone. Messbalken = ˆ 100 µm. 4. Ergebnisse 71 Abb. 14: wt (2687) FGF-2 ko (2750) sense: A dorsal B ventral antisense: C dorsal D ventral E F 5. Diskussion 72 5. Diskussion 5.1 5.1.1 Methodische Aspekte Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RTPCR) Für die Messung der Genexpression wurde die molekularbiologische Methode der semiquantitativen RT-PCR verwendet, durch die sich die Menge an mRNA im Gewebe quantifizieren lässt. Sie ist eine etablierte Methode, um Gentranskripte zu analysieren, weil sie hoch sensitiv ist und schnell Ergebnisse liefert. Mit der RT-PCR werden die steady-state levels der mRNA als Netto-Ergebnis von Transkription und Degradierung der RNA gemessen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Effizienz der cDNA-Synthese zwischen 10-90% schwankt, daher liefert eine Quantifizierung nur eine Aussage über die Menge an cDNA im Probenansatz (RAPPOLEE, 1990). Also muss man davon ausgehen, dass die RT-PCR nur die minimale Anzahl an mRNA-Molekülen in der vorhandenen Probe anzeigt, nicht aber die ursprünglich im Gewebe vorhandene mRNA-Menge (SOUAZE et al., 1996). Nach PRICE et al. (1992) reicht eine semiquantitative RT-PCR jedoch aus, um relative Veränderungen der mRNA-Level zu bestimmen, wenn man einen externen Standard hinzuzieht. So kann man die relative Menge der Gewebe-mRNA zwischen den Proben schätzen, indem man das Verhältnis der Menge an amplifizierter Gewebe-mRNA (eigentlich cDNA) zur amplifizierten Standard-mRNA (cDNA) für jede einzelne Probe bildet. Ein Anstieg oder Abfall in diesem Verhältnis von Probe zu Probe reflektiert direkt die initiale relative Menge von Gewebe-mRNA in jeder Probe. Als externer Standard wurde in der vorliegenden Arbeit Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) benutzt. Man nimmt an, dass dieses Enzym in allen Zellen gleich stark exprimiert wird (APOSTOLAKOS et al., 1993; ZHAO et al., 1995). 5. Diskussion 73 Eine weitere Schwierigkeit dieser Methode ist, dass nur in der exponentiellen Phase der PCR ein nachvollziehbarer Zusammenhang zwischen amplifizierter Produktmenge und Templatemenge besteht (SOUAZE et al., 1996). Um zu gewährleisten, dass die PCR in der exponentiellen Phase blieb, wurde sie mit 25 bis maximal 27 Zyklen durchgeführt. Die Anzahl der Zyklen wurde dabei anhand der cDNA-Menge im Probenansatz bestimmt/abgeschätzt. Auch muss einschränkend auf die Anfälligkeit der RT-PCR durch Kontamination mit RNasen hingewiesen werden. Daher wurden ausschließlich RNase-freie Reagenzien und Materialien benutzt. Als Alternative zur semiquantitativen RT-PCR ist die Methode der Real Time PCR zu nennen. Diese Methode könnte bedingt durch ihre höhere Spezifität und exaktere Messgenauigkeit eine stärkere Ausbeute der mRNA Menge zulassen, wodurch Unterschiede in der Genexpression zwischen Wildtyp- und FGF-2 knock-out-Mäusen noch deutlicher herausgearbeitet werden könnten. 5.1.2 In-situ- Hybridisierung (ISH) Die ISH ist eine komplexe Methode zum Nachweis von mRNA vor Ort (in situ). In der zugrundeliegenden Arbeit wurde mit dieser Methode die zelltypspezifische Expression von D1R-mRNA in zervikalen Rückenmarksschnitten von Wildtyp- und FGF-2 knock-out-Mäusen untersucht. Hier soll ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass keine Aussagen über Expressionsunterschiede zwischen den beiden Mäusegruppen gemacht werden können, da die ISH keine quantitative Methode ist. Als Negativkontrolle wird die mRNA sense Sonde verwendet, deren Sequenz der zellulären mRNA entspricht. Die antisense Sonde dagegen ist komplementär zur zellulären mRNA und ermöglicht deren Nachweis im Gewebepräparat (LEITCH et al., 1994). Es ist jedoch bekannt, dass auch die sense Sonde zu einer spezifischen Färbung führen kann. Ursache dafür sind sogenannte antisense RNAs, die neben der eigentlichen, kodierenden sense RNA (mRNA) vom Gegenstrang der DNA abgelesen werden. Dieses Phänomen wurde bei der Maus bei speziellen Hitze- 5. Diskussion 74 Schock Genen nachgewiesen (MURASHOV und WOLGEMUTH, 1996). Im Rahmen dieser Arbeit konnte keine spezifische Färbung durch die sense Sonde bei dem untersuchten Gen festgestellt werden. Sofern in entsprechenden Experimenten positive Signale auftreten, sollte die sense Sonde als Negativkontrolle hinterfragt werden. Für eine erfolgreiche ISH sind drei Kriterien von besonderer Bedeutung. Erstens, die Integrität der Ziel-mRNA in den Gewebeschnitten, die entscheidend von der Gewebeaufbereitung abhängt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Paraffineinbettung gewählt, da die Morphologie des Gewebes erhalten bleibt, und somit eine hohe zelluläre Auflösung gewährleistet wird. Ein Verlust von bis zu 30% der mRNA wurde dabei in Kauf genommen (LEITCH et al., 1994; JIN und LLOYD, 1997). Als zweites Kriterium spielt die Fähigkeit der Sonde, das Gewebe zu penetrieren, eine wichtige Rolle. Hierzu muss das Gewebe entsprechend vorbereitet werden. Es wurde ein Proteinase K - Verdau durchgeführt, da Proteine besonders nach Gewebefixierungen mit Paraformaldehyd (PFA) die mRNA im Gewebeschnitt maskieren können. Dabei durfte die Intensität des Verdaus nicht zu stark sein, weil sonst die mRNA freigesetzt wird, somit aus dem Gewebe verloren geht und zusätzlich die Gewebemorphologie angegriffen wird (MILLAR et al., 1993). Anschließend wurde mit 4%igem PFA nachfixiert, um einem weiteren Verlust von Nukleinsäuren vorzubeugen (JIN und LLOYD, 1997). Eine Prähybridisierung in der späteren Hybridisierungslösung sollte das Gewebe auf die Bedingungen während der Hybridisierung vorbereiten. Um Hintergrundsignale zu reduzieren, enthielt die Hybridisierungs-Lösung nicht-spezifische DNA (Heringsperma-DNA), nicht- spezifische RNA (tRNA) und Denhardt’s-Lösung (SINGER et al., 1986). Durch den Zusatz von monovalenten Kationen (Na+ in SSC) wurde die Stabilität des Nukleinsäurehybrids durch elektrostatische Wechselwirkungen erhöht. Als Sonden wurden RNA-Sonden verwendet, da RNA-RNA-Hybride wesentlich stabiler als RNADNA-Hybride sind. Zudem sind sie sehr spezifisch und bis zu zehnmal sensitiver als DNA-Sonden (SCHENBORN und MIERENDORF, 1985). Nachteilig war die recht aufwendige Herstellung der RNA-Sonden durch in vitro-Transkription von einem 5. Diskussion 75 Transkriptionsvektor vorkommenden (Plasmid) RNasen, und weshalb die Empfindlichkeit Bedingungen für gegenüber ubiquitär RNase-freies Arbeiten geschaffen werden mussten. Das dritte Kriterium ist ein sensitives Nachweissystem, das schon geringe Mengen an Sonden-RNA-Hybriden sichtbar macht und eine möglichst geringe Hintergrundfärbung besitzt. Es wurde die indirekte nichtradioaktive Markierung mit Digoxigenin eingesetzt, da der hochspezifische AntiDigoxigenin-Antikörper nicht an tierisches biologisches Material bindet (HERRINGTON et al., 1989). 5.2 Zusammenfassung der Ergebnisse Nachdem Interaktionen des Fibroblastenwachstumsfaktors-2 (FGF-2) mit generellen Komponenten des Spleissosom-Komplexes, wie dem survival of motoneuron (SMN)Protein und der Spleissfaktoruntereinheit SF3a66 (CLAUS et al., 2003; CLAUS et al., 2004; GRINGEL et al., 2004), nachgewiesen werden konnten, lag die Vermutung nahe, dass FGF-2 eine Rolle beim prä-mRNA-Spleissen spielt. Der Nachweis von alternativem Spleissen bestimmter Transkripte bei Abwesenheit von FGF-2 in knockout Mäusen wäre ein Hinweis auf die mögliche regulatorische Funktion von FGF-2 während des Spleissing-Prozesses. Hierzu wurde zunächst ein "Screening"Experiment durchgeführt, bei dem bekannte, alternativ-gespleisste Transkripte im Rückenmark analysiert wurden. Diese Suche ergab in FGF-2 knock-out Mäusen keinen Hinweis auf alternativ-gespleisste mRNAs, erbrachte aber den Nachweis, dass mehrere Gene im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen differentiell exprimiert werden. So konnte mittels semiquantitativer Reverse-Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gezeigt werden, dass sowohl die Expression des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) als auch die des Dopamin1Rezeptors (D1R) im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen signifikant hochreguliert wird, Glutamatrezeptoren während 3 und die 4 im Expression der Rückenmark ionotropen dieser Mäuse AMPA-Typsignifikant 5. Diskussion 76 hinunterreguliert wird. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 15 zusammenfassend dargestellt. FGF-2 knock-out Mäuse weisen eine signifikante Abnahme der glutamatergen pyramidalen Neurone im cerebralen Cortex auf (KORADA et al., 2000). Bei der Untersuchung der Expression ionotroper Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ im cerebralen Cortex von FGF-2 knock-out Mäusen wurden im Vergleich mit WildtypMäusen keine Expressionsunterschiede festgestellt (Abb. 15). Da dopaminerge Fasern aus der Substantia nigra das Striatum innervieren und die Expression des D1R im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen hochreguliert wird, erfolgte eine Überprüfung der Expression im Striatum dieser Mäuse. Es waren im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen keine Unterschiede hinsichtlich der D1R-mRNA-Expression im Striatum sichtbar (Abb. 15). Mit der ISH konnte die zelluläre Lokalisation der D1RmRNA-Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen geklärt werden. Durch Verwendung von DIG-markierten antisense-D1R-RNA-Sonden lies sich die D1R-mRNA-Expression in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz des zervikalen Rückenmarks nachweisen. Besonders deutlich fiel der Nachweis in multipolaren Wurzelzellen des Ventralhorns aus. Die Größe, Lage und Struktur dieser Zellen (Perikaryon, Dendriten, Axon) lassen den Schluss zu, dass es sich dabei um Motoneurone handelt. Hinsichtlich der zellulären Verteilung der D1R-mRNA-Expression im zervikalen Rückenmark war kein Unterschied zwischen FGF-2 knock-out und Wildtyp-Mäusen erkennbar (Abb. 15). 5. Diskussion 77 mGluR1 Expression im RM: ionoGluR3 + 4 D1R Expression im RM: Expression im RM: Expression im cerebralen Cortex: Expression im Striatum: = hochreguliert = hinunterreguliert = unverändert Nachweis von D1RmRNA-Expression mittels ISH in Motoneuronen des zervikalen RMs Abb. 15: Schematische Übersicht der Ergebnisse Abbildung 15 zeigt schematisch die Expressionen des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1), der ionotropen AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 3 und 4 (ionoGluR3+4) und des Dopamin1-Rezeptors (D1R) im Rückenmark sowie im cerebralen Cortex und im Striatum von FGF-2 knock-out Mäusen. Mittels ISH konnte im zervikalen Rückenmark (RM) von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen eine D1R-mRNA-Expression in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz, besonders deutlich aber in Motoneuronen des Ventralhorns nachgewiesen werden. 5. Diskussion 5.3 78 Alternatives Spleissen und differentielle Expression im Rückenmark Differentielle prä-mRNA-Prozessierung ist einer der grundlegenden Mechanismen, um Unterschiede in Zellen zu bewirken. Alternatives Spleissen kann subzelluläre Lokalisationen, molekulare Interaktionen oder Proteinfunktionen bestimmen und ist in der Lage, unterschiedliche Proteine von einer einzelnen prä-mRNA zu generieren. Die Regulation dieses Mechanismus ist bisher noch weitgehend unbekannt. Biochemische in vitro-Studien haben jedoch gezeigt, dass Sequenz-spezifisch an RNA bindende Proteine an der Regulation von alternativem Spleissen beteiligt sind (TACKE und MANLEY, 1999). Diese Sequenz-spezifischen RNA-bindenden Proteine können regulatorisch in den Prozess des Spleissens eingreifen, indem sie z.B. ihre relativen Mengen variieren, ihre post-translationalen Modifikatoren regulieren oder an der Assemblierung des Spleissosom-Komplexes beteiligt sind. JENSEN et al. (2000) kombinierten genetische und biochemische Methoden, um zu untersuchen, ob das RNA-bindende Protein Nova-1 (paraneoplastic opsoclonusmyoclonus ataxia [POMA] antigen) alternatives Spleissen reguliert. Nova-1 ist ein RNA-bindendes Protein, das in Gehirnextrakten spezifisch an eine GlyRα2 IntronZielsequenz (UCAUY)3 bindet und dadurch das E3A Spleissen des Glycinrezeptors in Co-Transfektions Assays verstärkt (BUCKANOVICH und DARNELL, 1997). Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass Nova-1 knock-out Mäuse spezifische Defekte im Spleissen zweier inhibitorischer Rezeptoren prä-mRNAs, Glycin α2 Exon 3A und GABAA Exon γ2L, aufweisen. Die spezifischen Anomalien im alternativen Spleissen von GlyRα2- und GABAA γ2-Transkripten in Nova-1 knock-out Mäusen unterstützen die Hypothese, dass Nova-1 spezifisch an eine Zielsequenz in der prä-mRNA bindet und dadurch alternatives prä-mRNA-Spleissen reguliert. Die Veröffentlichung von JENSEN et al. (2000) wurde als eine wichtige Grundlage für das Screening-Experiment herangezogen. Nach dieser Publikation wurden die Primer für die "Kandidatengene", die alternativ gespleisste mRNA-Transkripte im Rückenmark aufweisen, gewählt. Mit diesen Primern wurde im Rückenmark von 5. Diskussion 79 Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) knock-out- und Wildtyp-Mäusen nach differentiell-gespleissten mRNA-Transkripten gesucht, um zu analysieren, ob FGF-2 eventuell in ähnlicher Weise wie das RNA-bindende Protein Nova-1 agiert. Zwar war anzunehmen, dass FGF-2 andere Transkripte als das Protein Nova-1 reguliert. Da FGF-2 jedoch mit Proteinen interagiert, die an allen Spleissvorgängen beteiligt sind, wäre durchaus zu erwarten gewesen, dass FGF-2 einen generellen Effekt auf das Spleissen und somit auf die untersuchten Transkripte ausübt. In dem ScreeningExperiment zeigten die Kandidatengene kein alternatives Spleissen. Da hier aber nur eine ausgesuchte Anzahl von Kandidatengenen getestet wurde, kann ein Einfluss von FGF-2 auf das prä-mRNA Spleissen anderer Proteine nicht vollständig ausgeschlossen werden. Der Nachweis direkter Interaktionen von FGF-2 mit Proteinen der Maschinerie des Spleissens unterstützt diese Vermutung (CLAUS et al., 2003, 2004; GRINGEL et al., 2004). Zur Klärung wäre eine Untersuchung weiterer Kandidatengene erforderlich. Mit dem Screening-Experiment konnte kein alternatives Spleissen, dafür aber differentielle Genexpression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen nachgewiesen werden. Wie in der schematischen Übersicht der Ergebnisse (Abb. 15) dargestellt ist, wurden im Rückenmark dieser Mäuse differentielle Expressionen des Dopamin1-Rezeptors (D1R), des metabotropen Glutamatrezeptors 1 (mGluR1) und der Untereinheiten 3 und 4 der ionotropen Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ (ionoGluR3+4) festgestellt. FGF-2 hat also einen regulierenden Effekt auf die Transkription bestimmter Gene. FGF-2 könnte eine Änderung der Transkription spezifischer Gene über verschiedene Mechanismen bewirken: Extrazelluläres FGF-2 bindet als Ligand an seine hoch-affinen Tyrosinkinase-Rezeptoren (FGFR). Dies führt zu ihrer Dimerisierung sowie zur Aktivierung der Tyrosinkinase und damit zur Autophosphorylierung dieser Rezeptoren. Über die Phosphotyrosinreste können dann weitere Proteine (z.B. Phospholipase C) an die Rezeptoren binden, was wiederum eine Signaltransduktion in den Zellkern auslöst. Dabei wird die Expression einer Vielzahl von Zielgenen verändert. 5. Diskussion 80 Intrazelluläres FGF-2 bindet an intrazelluläre FGF-Rezeptoren. So könnte FGF-2 einerseits direkt als Transkriptionsfaktor wirken, wofür es noch keine expliziten Hinweise gibt. Andererseits könnte FGF-2 an noch nicht identifizierte Kernproteine binden, die an der Transkription beteiligt sind. Beides würde zu Änderungen der Expression der entsprechend regulierten Gene führen. Es stellt sich die Frage, ob die veränderte Genexpression bei FGF-2 knock-out Mäusen Auswirkungen auf den Phänotyp hat. In Kapitel 5.4 soll daher zunächst geklärt werden, was die gerade genannten Proteine für Genprodukte sind und wo sie eine Rolle spielen, um daraus Rückschlüsse auf den Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse ziehen zu können. 5.4 5.4.1 Differentielle Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen Der metabotrope Glutamatrezeptor 1 Metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) bestehen aus Proteinuntereinheiten mit sieben Transmembrandomänen, die wahrscheinlich als Dimere vorliegen (LIU et al., 2000). Sie besitzen eine extrazelluläre Bindungsstelle für den Liganden, eine intrazelluläre Bindungsstelle für G-Proteine und werden in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe I mGluRs (mGluR1 und mGluR5) sind mit Gq-Proteinen assoziiert. Die Aktivierung dieser Rezeptoren Dihydroxyphenylglycin führt zu durch Glutamat oder den Agonisten 3,5- einer G-Protein-vermittelten Aktivierung der Phospholipase C (PLC). Daraufhin wird der sekundäre Botenstoff Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) aus Phosphatidylinositol (PI) gebildet. IP3 führt zur signalartigen Freisetzung von Calcium-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum (MOEPPS u. FAGNI, 2003). Gruppe II (mGluR2 und mGluR3) und Gruppe III mGluRs (mGluR4, -6, -7, -8) sind mit Gi/Go-Proteinen assoziiert. Ihre Aktivierung inhibiert die Adenylatcyclase-Aktivität, 5. Diskussion 81 erhöht dafür aber die Leitfähigkeit von Kalium-Ionenkanälen (HERMANS und CHALLISS, 2001; PIN und ACHER, 2002). CONN und PIN (1997) konnten alternatives Spleissen für die metabotropen Glutamatrezeptoren nachweisen. Durch diesen Vorgang entstehen die drei Hauptisoformen des mGluR1-Proteins, welche sich in ihrem C-Terminus unterscheiden und mGluR1α, mGluR1β und mGluR1c genannt werden. Alle drei Spleiss-Varianten aktivieren die Pospholipase C (FERRAGUTI et al., 1998). Im Rückenmark von adulten Ratten und Menschen werden die höchsten mGluR1αExpressions-Level in den dorsalen Laminae I-II und in Motoneuronen erreicht, und der physiologischen Aktivierung von Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren werden neuroprotektive Effekte zugeschrieben (VALERIO et al., 2002). In der vorliegenden Arbeit wurde im Rückenmark adulter FGF-2 knock-out Mäuse eine signifikante Hochregulierung des mGluR1 festgestellt. Eine solche Überexpression von Gruppe I mGluRs konnte ebenfalls im Rückenmark von an Amyotropher Lateralsklerose (ALS) erkrankten Menschen gezeigt werden (ARONICA et al., 2001; ANNESER et al., 2004). Auf die Frage, ob die Hochregulierung der mGluR1-Expression bei FGF-2-Abwesenheit neuroprotektive oder neurotoxische Effekte auf den Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse besitzt, soll in Kapitel 5.6 näher eingegangen werden 5.4.2 Die ionotropen Glutamatrezeptoruntereinheiten 3 und 4 vom AMPA-Typ Im Unterschied zu den metabotropen Glutamatrezeptoren stellen die ionotropen Glutamatrezeptoren überwiegend unspezifische Kationenkanäle dar, deren Öffnung zu unterschiedlich schnellen Ionenströmen und damit zur Depolarisation der postsynaptischen Zelle führen. Sie werden in drei Familien eingeteilt, deren Benennung nach ihren pharmakologischen Agonisten erfolgt: Diese sind die AMPARezeptoren (AMPA von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat), die Kainatrezeptoren und die NMDA-Rezeptoren (NMDA von N-Methyl-D-aspartat) 5. Diskussion 82 (WATKINS et al., 1990; HOLLMANN und HEINEMANN, 1994). Die Familie der AMPA-Rezeptoren besteht aus vier Subtypen (AMPA-GluR1-4). AMPA-Rezeptoren sind tetramere Moleküle. Jede der vier Untereinheiten weist drei Membrandurchgänge auf. Der extrazelluläre Anteil des AMPA-Rezeptors besteht aus zwei gegeneinander beweglichen Dömanen die, wie Schalen einer Muschel, den Liganden einschließen. Eine hydrophobe Region, die als TM2 bezeichnet wird, dringt von der cytosolischen Seite schleifenförmig in die Membran ein und führt ins Zellinnere zurück. Sie kleidet den Kationenkanal des AMPA-Rezeptors aus (WO und OSWALD, 1995). AMPA-Rezeptoren vermitteln die schnellsten glutamatinduzierten Antworten. Ihre Öffnung führt zu schnellen Strömen von Natrium-, Kalium- und Calcium-Ionen, was eine Depolarisation der postsynaptischen Zelle bewirkt. Die besonderen Eigenschaften von AMPA-Rezeptoren werden durch Co-Expression verschiedener AMPA-Untereinheiten bestimmt. Wenn die AMPA-Untereinheiten 1 und 3 einzeln oder zusammen exprimiert werden, erzeugt das Kanäle, die permeabel für Calcium sind. Im Gegensatz dazu führt jede Co-Expression der gerade genannten Untereinheiten mit der AMPA-Rezeptoruntereinheit 2 zur Entstehung von Kanälen, die undurchlässig für Calcium sind (HOLLMANN und HEINEMANN, 1994). Die AMPA-Rezeptoruntereinheit 2 spielt also eine entscheidende Rolle für die CalciumPermeabilität von AMPA-Rezeptoren. So konnten BURNASHEV et al. (1992) zeigen, dass das Ersetzen eines einzelnen Aminosäurerestes, nämlich Arginin an Position 607 gegen Glutamin, in der TM2-Domäne der AMPA-Rezeptoruntereinheit 2 zum Umstellen des AMPA-Rezeptors von Calcium-undurchlässig zu Calcium-durchlässig führt. TACHIBANA et al. (1994) ermittelten durch Immuncytochemie die Lokalisation der AMPA-Rezeptoren im Rückenmark von adulten Ratten. Sie fanden heraus, dass der Grossteil der AMPA-Rezeptoren im superficialen Dorsalhorn, in Motoneuronen und in Kernen, die autonome präganglionäre Neurone enthalten, lokalisiert ist (siehe Kap.5.5.2). Von besonderem Interesse sind die spinalen Motoneurone, da sie eine selektive Anfälligkeit für eine durch AMPA-Rezeptoren ausgelöste GlutamatExzitotoxizität aufweisen. SUN et al. (2005) stellten im Rückenmark von adulten 5. Diskussion 83 Ratten die niedrigsten AMPA-GluR2 mRNA-Expressions-Level in Motoneuronen fest. Dieses Expressionsprofil der Motoneurone könnte sie selektiv anfällig für AMPARezeptor-mediierte Exzitotoxizität machen. Eine solche Glutamat-induzierte Exzitotoxizität spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) eine Rolle. In der vorliegenden Arbeit konnte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen nachgewiesen werden, dass die Untereinheiten 3 und 4 des AMPA-TypGlutamatrezeptors signifikant hinunterreguliert werden. Die reduzierte Expression von AMPA-GluR3 und AMPA-GluR4 im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen, könnte eine vermehrte Anzahl von Calcium-permeablen AMPA-Rezeptoren im Rückenmark zur Folge haben, welches diese Tiere möglicherweise für eine Glutamat-Exzitotoxizität prädispositionieren könnte. Dies ist jedoch recht unwahrscheinlich, da die für die Calcium-Permeabilität entscheidende AMPA-GluR2Untereinheit im Rückenmark der FGF-2 knock-out Mäuse nicht hinunterreguliert wird. Bisher sind keine Forschungsergebnisse bekannt, die belegen, dass FGF-2 knockout Mäuse anfällig für eine Glutamat-induzierte Exzitotoxizität sind. 5.4.3 Der Dopamin1-Rezeptor Dopaminrezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen. Ihr N-terminaler Bereich liegt auf der extrazellulären, der Cterminale Bereich auf der intrazellulären Seite der Membran (BUNZOW et al., 1988). Die Familie der Dopaminrezeptoren besteht aus fünf Mitgliedern, die in zwei Untergruppen eingeteilt werden (DOHLMAN et al., 1991). Dopamin1-artige Rezeptoren (D1R und D5R) stimulieren über G-Proteine die Aktivität der Adenylatcyclase und erhöhen dadurch den intrazellulären cAMP-Spiegel (KEBABAIN und CALNE, 1979). Die Dopamin2-artigen Rezeptoren hemmen die AdenylatcyclaseAktivität, steigern dafür aber die Leitfähigkeit von Kalium-Ionenkanälen. Zusätzlich hemmen sie die Leitfähigkeit von Calcium-Ionenkanälen und können auch die 5. Diskussion Phospholipase 84 C aktivieren (VALLAR et al., 1988). Die sieben Transmembrandomänen der Dopamin1-artigen Rezeptoren unterscheiden sich signifikant in ihren intrazellulären Schleifen von den Dopamin2-artigen Rezeptoren (MONSMA et al., 1990). D1- und D2-Rezeptoren scheinen wichtige Regulatoren der striatalen Neurochemie, besonders der Peptidexpression zu sein. Beide Rezeptoren kommen im Striatum vor, wobei D1-Rezeptoren (exzitatorisch) nur postsynaptisch zu finden sind, während D2-Rezeptoren (inhibitorisch) prä- und postsynaptisch lokalisiert sind. Im ZNS existieren drei wichtige dopaminerge Systeme. Die nigrostriatalen Bahnen gehen von melaninhaltigen Neuronen der Substantia nigra aus und innervieren das Striatum. Als Teil der Basalganglien mindern sie den Tonus der Muskulatur und wirken an der Umsetzung von Bewegungsabläufen mit. Beim Morbus Parkinson kommt es zum Verlust der dopaminergen Innervation des Striatums, welches sich in den typischen Symptomen Tremor, Rigor und Akinese äußert. Das mesolimbische (mesokortikale) System zieht vom ventralen tegmentalen Bereich im Mittelhirn zu den limbischen Bereichen (Nucleus accumbens, ventrales Striatum, Amygdala) und zum Cortex. Dieses System beeinflusst das psychische Befinden. Schizophrenien z.B. werden durch Störungen des mesolimbischen Systems verursacht. Der dritte Pfad ist das tuberoinfundibuläre System vom Hypothalamus (Nucleus arcuatus und Nucleus periventricularis) zur Hypophyse (Pars intermedia) und der Eminentia mediana am Boden des III. Ventrikels. Dieses System hemmt die Freisetzung von Prolactin aus der Hypophyse und wird von Dopamin2-Rezeptoren mediiert (MARSDEN, 2006). Bei der Ratte gibt es zusätzlich Anzeichen für einen supraspinalen dopaminergen Pfad zu sympathischen präganglionären Neuronen (SPN) im Rückenmark, der seinen Ursprung in rostralen und dorsalen Kerngebieten des Hypothalamus (BJÖRKLUND und SKAGEBERG, 1979; BLESSING und CHALMERS, 1979) und im Nucleus paraventricularis hat (SWANSON et al., 1981; STRACK et al., 1989). Spezifische Regionen werden von diesen Fasern innerviert, wobei die höchsten 5. Diskussion 85 Dopamin-Level in den Laminae III und IV im Dorsalhorn, in Lamina X und im Nucleus intermediolateralis nachweisbar sind (DIETL et al., 1985). Die Region des Nucleus intermediolateralis im thorakalen Bereich des Rückenmarks zeigt eine reiche dopaminerge Innervation (RIDET et al., 1992; HOLSTEGE et al., 1996). Weil im Nucleus intermediolateralis die Mehrzahl der sympathischen präganglionären Neurone lokalisiert ist, scheint Dopamin einen großen Einfluss auf die sympathische Aktivität zu besitzen (BACON und SMITH, 1988; STRACK et al., 1988). GLADWELL und COOTE (1996a,1996b,1997,1999) konnten in elektrophysiologischen Studien zeigen, dass eine Applikation von Dopamin auf Rattenrückenmarks-Abschnitte eine direkte Hyperpolarisation und eine indirekte Depolarisation von sympathischen präganglionären Neuronen verursacht. Diese Reaktionen werden von zwei Rezeptoren mediiert. Dopamin1-Rezeptoren rufen eine Hyperpolarisation hervor, die Aktivierung von Dopamin2-Rezeptoren im Gegensatz dazu eine Depolarisation (GLADWELL und COOTE, 1999). Ob dieser zusätzliche supraspinale dopaminergen Pfad zu sympathischen präganglionären Neuronen (SPN) im Rückenmark bei der Maus ebenfalls vorkommt, ist bisher unbekannt. Die Auswertungen der semiquantitativen RT-PCRs ergaben eine signifikante Hochregulierung der D1R-mRNA-Expression im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen. Mit der ISH konnte im zervikalen Rückenmark von FGF-2 knock-out- und Wildtyp-Mäusen die D1R-mRNA-Expression in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz, besonders aber in motorischen Wurzelzellen des Ventralhorns, nachgewiesen werden. Bezüglich der zellulären Verteilung der D1RmRNA-Expression gab es keinen Unterschied zwischen beiden Mäusegruppen. Welche Effekte die Hochregulierung der D1R-Expression auf den Phänotyp der FGF2 knock-out Mäuse haben könnte, wird in Kapitel 5.6 diskutiert. 5. Diskussion 5.5 86 Verteilung von Dopamin- und Glutamatrezeptoren im Rattenrückenmark In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression ausgewählter mRNA-Transkripte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen untersucht, wobei im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen veränderte Expressionen von Dopamin- und Glutamatrezeptoren festgestellt wurden. Um einen Überblick über die Lokalisationen der oben genannten Rezeptoren im Rückenmark zu schaffen, werden in diesem Kapitel anhand schematischer Abbildungen die Verteilungen der Rezeptoren im Rückenmark der Ratte dargestellt. Das Beispiel Ratte wird verwendet, da für die Maus bezüglich der Verteilung der Dopamin- und Glutamatrezeptoren kaum fundierte Daten existieren. Dabei muss darauf hingewiesen werden, dass die Neurotransmitterverteilungen bei Ratte und Maus zwar ähnlich sind, tierartliche Unterschiede aufgrund mangelnder Daten aber nicht ausgeschlossen werden können. 5.5.1 Überblick über die Verteilung der Dopaminrezeptoren im Rückenmark der Ratte GLADWELL et al. (1999) konnten mittels Autoradiographie im thorakalen Rückenmark von Ratten zeigen, dass Dopamin1-Rezeptoren (D1R) hauptsächlich in den sympathischen Wurzelzellen des Nucleus intermediolateralis lokalisiert sind. Interessanterweise wird auch FGF-2 in autonomen Wurzelzellen des Nucleus intermediolateralis exprimiert und das Überleben dieser Neurone durch exogen applizierten FGF-2 reguliert (BLOTTNER et al., 1989; BLOTTNER und BAUMGARTEN, 1992; BLOTTNER et al., 1997). VAN DIJKEN et al. (1996) entdeckten durch Immuncytochemie, dass der Dopamin2Rezeptor (D2R) am stärksten in Neuronen der sakralen parasympathischen Gegend und in zwei motorischen Kerngebieten des lumbosakralen Rückenmarks, dem 5. Diskussion 87 spinalen Kerngebiet des Muskulus bulbocavernosus und dem dorsolateralen Kerngebiet, nachzuweisen ist. LEVANT und MCCARSON (2001) observierten mittels Autoradiographie die höchsten Dichten für den Dopamin3-Rezeptor (D3R) in den superfizialen Schichten des Dorsalhorns (Zona marginalis sive spongiosa, Substantia gelatinosa) auf zervikaler und lumbarer Ebene, gefolgt von der Substantia intermedia centralis (=Lamina X). 5. Diskussion 88 B A C F D D3 R d a c e D3 R D1 R D2 R b G f D2 R E A Sulcus medianus dorsalis; B Sulcus intermedius dorsalis; C Sulcus lateralis dorsalis; D Septum medianum dorsale; E Fissura mediana ventralis; F Radix dorsalis; G Radix ventralis a Dorsalhorn; b Ventralhorn; c Substantia intermedia centralis (= Lamina X); d Substantia intermedia lateralis; e Canalis centralis; f motorische Wurzelzelle (Motoneuron) Abb. 16: Schematische Verteilung der Dopaminrezeptoren 1 bis 3 im Rückenmark der Ratte Dopamin1-Rezeptoren (D1R) sind hauptsachlich in sympathischen Wurzelzellen des Nucleus intermediolateralis im thorakalen Rückenmark lokalisiert (GLADWELL et al., 1999). Dopamin2-Rezeptoren (D2R) lassen sich in Neuronen der sakralen parasympathischen Gegend und in motorischen Kerngebieten des lumbosakralen Rückenmarks nachweisen (VAN DIJKEN et al., 1995). Dopamin3-Rezeptoren (D3R) sind in superfizialen Schichten des Dorsalhorns auf zervikaler und lumbarer Ebene, als auch in der Substantia intermedia centralis (Lamina X) zu finden (LEVANT und MCCARSON, 2001). 5. Diskussion 5.5.2 89 Überblick über die Verteilung der ionotropen Glutamatrezeptoren vom AMPATyp im Rückenmark der Ratte TACHIBANA et al. (1994) stellten durch Verwendung von Immuncytochemie an Rückenmarkschnitten von Ratten fest, dass sich eine Markierung mit Antikörpern gegen die AMPA-Typ-Glutamatrezeptoruntereinheiten 1 bis 4 hauptsächlich in den superfizialen Schichten des Dorsalhorns (Zona marginalis sive spongiosa, Substantia gelatinosa), in Motoneuronen und in Kerngebieten, die präganglionäre autonome Neurone enthalten (Nucleus intermediolateralis), nachweisen lässt. Auch im Kerngebiet des Nucleus proprius ventralis (Gruppe von Zellen, die sich aus der Substantia intermedia ins Ventralhorn hineinschieben), welches auch Renshaw- und Ia-inhibitorische Zellen enthält, konnte eine Markierung durch Anti-GlutamatrezeptorAntikörper gezeigt werden. Insgesamt war die Färbung mit Anti-GluR1-Antikörpern schwächer als mit den übrigen Untereinheiten. Hiervon ausgenommen waren sogenannte "GluR1-intensiven" Neurone, die ausschießlich mit GluR1-Antikörpern anfärbten und hauptsächlich in Lamina X (Substantia intermedia centralis) anzutreffen waren. 5. Diskussion 90 B C A F R4 R1 R2 R3 D d a R1 c b G e R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 f E A Sulcus medianus dorsalis; B Sulcus intermedius dorsalis; C Sulcus lateralis dorsalis; D Septum medianum dorsale; E Fissura mediana ventralis; F Radix dorsalis; G Radix ventralis a Dorsalhorn; b Ventralhorn; c Substantia intermedia centralis (= Lamina X); d Substantia intermedia lateralis; e Canalis centralis; f motorische Wurzelzelle (Motoneuron) Abb. 17: Schematische Verteilung der Glutamatrezeptoren 1 bis 4 vom AMPA-Typ im Rückenmark der Ratte (nach TACHIBANA et al., 1994) Die AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren 1 bis 4 (R1, R2, R3, R4) lassen sich hauptsächlich in superfizialen Schichten des Dorsalhorns, in Motoneuronen, im Nucleus intermediolateralis und im Kerngebiet des Nucleus proprius ventralis nachweisen. Neurone die eine intensive Färbung mit Anti-R1-Antikörpern ergeben, sind in der Lamina X (Substantia intermedia centralis) anzutreffen. 5. Diskussion 5.5.3 91 Überblick über die Verteilung der Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren im Rückenmark der Ratte ALVAREZ et al. (2000) klärten mittels Immuncytochemie die Lokalisation der Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren im Rattenrückenmark auf. Dabei markierten Anti-mGluR1α-Antikörper spezifisch die dendritischen und somatischen Membranen von Neuronen in den Laminae III bis V des Dorsalhorns und in den Laminae VI bis IX des Ventralhorns. Sehr starke Immunreaktivität wurde in somatischen Motoneuronen (Lamina IX) nachgewiesen. Anti-mGluR1β-Antikörper zeigten eine Immunreaktivität vor allem in Lamina X (Substantia intermedia centralis). AntimGluR5-Antikörper konnten in den Laminae I und II (Zona marginalis sive spongiosa; Substantia gelatinosa) sowie in autonomen Regionen (Nucleus intermediolateralis) detektiert werden. 5. Diskussion 92 A B C F R5 D R1α d c b G a e R1β R5 R1α f E A Sulcus medianus dorsalis; B Sulcus intermedius dorsalis; C Sulcus lateralis dorsalis; D Septum medianum dorsale; E Fissura mediana ventralis; F Radix dorsalis; G Radix ventralis a Dorsalhorn; b Ventralhorn; c Substantia intermedia centralis (= Lamina X); d Substantia intermedia lateralis; e Canalis centralis; f motorische Wurzelzelle (Motoneuron) Abb. 18: Schematische Verteilung der Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluR1α, mGluR1β und mGluR5) im Rattenrückenmark (nach ALVAREZ et al., 2000) Die mGluR1α-Rezeptoren (R1α) lassen sich sowohl in Neuronen der Laminae III bis V des Dorsalhorns, als auch in den Laminae VI bis IX des Ventralhorns, besonders in somatischen Motoneuronen (Lamina IX), nachweisen. mGluR1β-Rezeptoren (R1β) sind vor allem in Lamina X (Substantia intermedia centralis) lokalisiert. Während mGluR5Rezeptoren (R5) in den Laminae I und II und in autonomen Neuronen (Nucleus intermediolateralis) dargestellt werden können. 5. Diskussion 5.6 93 FGF-2 und differentielle Expression. Welche Rolle spielt dies für den Phänotyp der FGF-2 knock-out Mäuse? Zeigen FGF-2 knock-out Mäuse Parallelen zu neurodegenerativen Erkrankungen? Neurodegenerative Erkrankungen sind sporadische, seltener erblich auftretende Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), die ein oder mehrere Neuronensysteme oder das gesamte ZNS betreffen. Sie treten vorwiegend im vorgerückten Lebensalter auf und zeigen einen fortschreitenden Funktionsverlust und Ausfall spezifischer Neurone und ihrer Verbindungen. Häufig kommt es durch Störungen von Proteinverarbeitung und –abbau zu Ablagerungen unlöslicher, fehlgefalteter Proteinpartikel in Nervenzellen und Glia, weshalb diese Erkrankungen auch als "Proteinopathien" bezeichnet werden. Angesichts der sich verändernden Alterszusammensetzung der Bevölkerung stellen neurodegenerative Erkrankungen nicht nur ein sozialmedizinisches, sondern auch ein gesundheitspolitisches Problem dar. Daher ist die Forschung in diesem Bereich äußerst sinnvoll (JELLINGER et al., 2005). Um die Konsequenzen der, bei FGF-2-Abwesenheit nachgewiesenen, differentiell exprimierten Proteine auf den Phänotyp der knock-out-Mäuse und eine mögliche Beteiligung von FGF-2 an neurodegenerativen Erkrankungen besser diskutieren zu können, sollen hier drei wichtige Krankheitsbilder kurz erläutert werden und mit bekannten Forschungsergebnissen von FGF-2 knock-out Mäusen und den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen (Abb. 15) verglichen werden. Die Parkinson-Krankheit ist die häufigste extrapyramidale Erkrankung (Prävalenz 3-6 pro 100.000) im höheren Lebensalter, wobei Männer doppelt so häufig wie gleichaltrige Frauen betrofffen sind. Sie ist gekennzeichnet durch fortschreitenden Verlust der striatonigralen dopaminergen Neurone und extranigralen Neuronensysteme und das Auftreten vorwiegend subkortikaler "Lewy-Körperchen" (= pathologische Ablagerungen des veränderten und fehlgefalteten Hirnproteins α- 5. Diskussion 94 Synuclein in Nervenzellen und Neuriten). Durch den Verlust der striatonigralen dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta kommt es im Striatum zum Dopaminmangel. Der verminderte dopaminerge Zufluss zum Putamen bewirkt verstärkte Aktivität der GABA-ergen, " indirekten", striatären, efferenten Bahn über retikuläre Nigra, inneres Pallidum und ventrolateralen Thalamus zur Hirnrinde. Die Hemmung der thalamokortikalen motorischen Schleife führt durch reduzierte Rindenaktivität zu Rigor und Akinese. Der sogenannte Ruhetremor kommt durch gesteigerte Aktivität im ventralen intermediären Thalamus und durch Störungen der kortikozerebellären Bahnen zustande. Ätiologie und Pathogenese dieser Erkrankung sind bisher ungeklärt. Die Parkinson Krankheit ist wahrscheinlich ein multifaktorielles Geschehen, da neben genetischen auch Umweltfaktoren über komplexe Läsionskaskaden zu Degeneration und Tod von Nervenzellen führen (JELLINGER et al., 2005). Welche Rolle FGF-2 im nigrostriatalen System spielt, ist bisher unbekannt. Unsere Arbeitsgruppe fand jedoch heraus, dass die 21 kDa- und 23 kDa-FGF-2-Isoformen das Überleben und neuriteninduzierende Aktivitäten von kultivierten embryonalen dopaminergen Neuronen der Substantia nigra stimulieren, also protektive Effekte auf diese Neurone haben (GROTHE et al., 2000). CLAUS et al. (2004) zeigten, dass es nach Schädigung von nigralen dopaminergen Neuronen durch das Neurotoxin 6Hydroxydopamin (6-OHDA) in Ratten zu keiner Veränderung der FGF-2- und der FGF-Rezeptor-Expression im nigrostriatalen System kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass es bei Abwesenheit von FGF-2 zu keiner signifikanten Änderung der Dopaminrezeptor-Expression im Striatum kommt. Andere Dopamin-Marker, wie z.B. Tyrosin-Hydroxylase (TH) und vesikulärer Monoamintransporter (VMAT) wurden nicht untersucht. Die neurodegenerative Erkrankung Chorea Huntington wird autosomal-dominant vererbt mit einer Prävalenz von 5-10 pro 100.000 und manifestiert sich meist zwischen dem 50. und 80. Lebensjahr, doch sind auch juvenile Formen bekannt. Ursache ist eine verlängerte Anzahl von Cytosin-Adenosin-Guanidin (CAG)- 5. Diskussion 95 Wiederholungen im Huntingtin-Gen. Die mutierte Form des Proteins Huntingtin ist neurotoxisch und bildet mit Ubiquitin neuronale Kerneinschlüsse, deren Rolle bislang ungeklärt ist. Die genaue Pathogenese der Erkrankung ist noch unbekannt, jedoch werden Exzitotoxizität und Mitochondrienschäden durch Interaktionen des mutierten Huntingtin mit anderen Proteinen sowie Schädigung des Proteosomen- Ubiquitinsystems vermutet (JELLINGER et al., 2005). Anfängliche Symptome sind Verhaltensstörungen und unwillkürliche Bewegungen größerer Muskelgruppen. Im Endstadium kann die Krankheit in ein Parkinsonähnliches Bild mit Bewegungsarmut und Steifheit der Muskulatur übergehen, da striäre Efferenzen zum Pallidum verloren gehen. Der Ausfall inhibitorischer, Dopamin2-Rezeptor-exprimierender GABA-Neurone, führt zu vermehrter Hemmung des Subthalamus und Überaktivität dopaminerger striatonigraler und thalamo-kortikaler Bahnen mit verstärkter glutamaterger Stimulation der Rinde, also zu einer Hyperkinese. KORADA et al. (2002) zeigten, dass FGF-2 knock-out Mäuse eine ca. 40%ige Abnahme der Anzahl glutamaterger pyramidaler Neurone im frontalen und parietalen Cortex aufweisen. Daher wurde eine Imbalance zwischen exzitatorischen (glutamatergen) und inhibitorischen (GABA-ergen) Neuronen vermutet und gezeigt, dass FGF-2 knock-out Mäuse bei Applikation von Pentobarbital, einem GABARezeptor-Agonisten, einen verlängerten Nachschlaf haben. Die erregende Wirkung von Glutamat auf inhibitorische GABA-Neurone im Striatum könnte bei diesen Mäusen geringer ausfallen. Somit könnten die dopaminergen nigrostriatalen und thalamo-kortikalen Bahnen überwiegen und zu gesteigerter motorischer Aktivität führen, wie es von BEDOGNI et al. (2004) für FGF-2 knock-out Mäuse berichtet wurde: FGF-2-defiziente Mäuse zeigten im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen eine gesteigerte motorische Aktivität. Entsprechende Mäuse wurden für zwei Stunden verglichen, wobei besonders in der ersten Stunde ein signifikant höherer Bewegungsdrang der FGF-2 knock-out Mäuse auffiel, der sich im Laufe des Versuches lediglich abschwächte. Da man die Vermutung hatte, dass die Hyperaktivität ihre Ursache im dopaminergen System hat, wurde beiden 5. Diskussion 96 Mäusegruppen Amphetamin (1 mg/kg) injiziert, welches zur Freisetzung von Dopamin führt und somit den extrazellulären Gehalt an Dopamin erhöht. WildtypMäuse zeigten bei dieser Dosierung keine Verhaltensänderungen, FGF-2 knock-out Mäuse eine signifikant gesteigerte Aktivität. Der Verhaltensunterschied konnte durch Verabreichung von Apomorphin (0,1 mg/kg), einem Dopamin-Agonisten, der präsynaptische Dopamin-Rezeptoren blockiert, wieder aufgehoben werden. Damit wurde ein erhöhtes Niveau und Ansprechen des dopaminergen Systems bei FGF-2 knock-out Mäuse bewiesen. In ein Mausmodell der Chorea Huntington (HD R6/2 Mäuse) injizierten JIN et al. (2005) ab einem Alter von 8 Wochen bis zum Tod FGF-2 s.c. und berichteten, dass durch diese Behandlung die Anzahl proliferierender Zellen in der subventrikularen Zone um ca. 150% anstieg, des weiteren bewirkte FGF-2 die Rekrutierung von neuen Neuronen, die dem Phänotyp der untergegangenen Neurone entsprachen, aus der subventrikularen Zone in das Striatum und den cerebralen Cortex der HD R6/2 Mäuse. Durch die FGF-2-Behandlung konnte außerdem die Lebensspanne dieser Mäuse um etwa 20% verlängert werden. Durch Degeneration der striatalen, inhibitorischen GABA-Neurone müsste die D2RExpression bei HD R6/2 Mäusen im Striatum geringer ausfallen. Bei FGF-2 knockout Mäusen wurden in dieser Arbeit keine Veränderung der Dopamin2-RezeptorExpression im Striatum nachgewiesen. Ebenso waren die D1R- und D3RExpressionen nicht verändert. Allerdings konnte eine differentielle Expression des D1R im Rückenmark der FGF-2 knock-out Mäuse gezeigt werden. Da bei Abwesenheit von FGF-2 die D1RExpression im Rückenmark der knock-out Mäuse erhöht wird, stellt sich die Frage, welchen Effekt dies auf den Phänotyp dieser Tiere besitzt. Die elektrophysiologischen Studien von GLADWELL und COOTE (1996a, 1996b, 1997, 1999) legen die Vermutung nahe, dass FGF-2 knock-out Mäuse bei DopaminApplikation auf zervikale Rückenmarksabschnitte mit einer verstärkten Hyperpolarisation von Neuronen reagieren. Hierzu wäre eine elektrophysiologische Untersuchung nötig. Weiter wäre es interessant zu untersuchen, ob eine Applikation 5. Diskussion 97 von Kalium eine eventuell vorliegende Hyperpolarisation normalisieren könnte. Hyperpolarisationen von Zellmembranen bewirken eine verminderte Erregbarkeit dieser Zellen. Daher könnte möglicherweise bei FGF-2-Abwesenheit eine verminderte Erregbarkeit von Neuronen vorliegen. Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine progressive, meist sporadisch auftretende Erkrankung. Mit einer Prävalenz von 2-3 pro 100.000 ist sie die häufigste Motoneuronenerkrankung des Erwachsenalters (ROWLAND et al., 1994). Klinisch manifestiert sich der Untergang von Motoneuronen durch Spastik, zentrale und periphere Lähmungen sowie Muskelatrophie; der Tod tritt meist nach 3-5 Jahren durch Atemlähmung ein. In 5% der Fälle liegt eine familiäre, meist autosomaldominant vererbte ALS vor, wovon 20% eine Punktmutation im Kupfer/ZinkSuperoxid-Dismutase (SOD1)-Gen zeigen. Kennzeichnen der ALS sind die Atrophie der spinalen Vorderwurzeln, der Ausfall der motorischen Neurone in den spinalen Vorderhörnern und den motorischen Hirnnerven sowie die Degeneration der Seitenstränge im Rückenmark und der kortikospinalen Systeme. In Motoneuronen finden sich hyaline, strähnenartige, Ubiquitin-immunreaktive Zytoplasmaeinschlüsse und runde Bunina-Körper, die aus Neurofilamentfäden bestehen. Auch bei dieser Krankheit ist die Pathogenese noch unbekannt, es wird aber ebenfalls ein multifaktorielles Geschehen, an dem Glutamat-induzierte Exzitotoxizität, Mitochondriendysfunktionen, oxidativer Stress usw. beteiligt sind, angenommen (ALMER et al., 2003; JELLINGER et al., 2005). Die ALS ist gekennzeichnet durch den fortschreitenden Verlust somatischer Motoneurone. Autonome Motoneurone hingegen bleiben fast unverändert, sogar in fortgeschrittenen Stadien der Krankheit. Der Grund für diese selektive Anfälligkeit ist bisher unbekannt. Ein wichtiger Faktor, der bei der Pathogenese dieser Erkrankung eine Rolle spielt, ist die AMPA-Rezeptor-mediierte Exzitotoxizität (HEATH und SHAW, 2002). Hierbei kommt der AMPA-Rezeptoruntereinheit 2 (AMPA-GluR2) eine besondere Bedeutung zu, da sie die Calcium-Permeabilität von AMPA-Rezeptoren reguliert (HOLLMANN und HEINEMANN, 1994). Forschungen an Kupfer/Zink- 5. Diskussion 98 Superoxid-Dismutase-überexprimierenden (SOD1) Mäusen, welche ein Tiermodell der ALS darstellen, ergaben erniedrigte AMPA-GluR2-Level in Motoneuronen dieser Tiere (TORTAROLO et al., 2006). Die Abwesenheit oder eine Hinunterregulierung von AMPA-GluR2 führt zu erhöhter Calcium-Permeabilität der AMPA-Rezeptoren und begünstigt so die Anfälligkeit für Glutamat-Exzitotoxizität (VAN DAMME et al., 2005). In dieser Arbeit wurde eine signifikante Hinunterregulierung der AMPA-TypGlutamatrezeptoren 3 und 4 im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen festgestellt, welches sich mit Ergebnissen von PETRI et al., 2005 deckt, die feststellten, dass SOD1-Mäuse im Endstadium der Krankheit eine signifikante Abnahme der AMPA-GluR3- und AMPA-GluR4-Expression im Rückenmark zeigten. Da jedoch keine Hinunterregulierung der für die Calcium-Permeabilität entscheidenden AMPA-GluR2-Expression bei FGF-2 knock-out Mäusen festgestellt wurde, ist es unwahrscheinlich, dass diese Mäuse eine erhöhte Anfälligkeit für eine AMPA-Rezeptor-mediierte Exzitotoxizität aufweisen. Bisher existieren keine Forschungsergebnisse, die zeigen, dass FGF-2 knock-out Mäuse für eine GlutamatExzitotoxizität prädispositioniert sind. Auch über eine verringerte Anzahl an Motoneuronen bei FGF-2 knock-out Mäusen gibt es noch keine Befunde. Daher beschäftigt sich unsere Arbeitsgruppe zur Zeit mit der Quantifizierung der Motoneurone bei gealterten FGF-2 knock-out- und transgenen (FGF-2- überexprimierenden) Mäusen. Nicht nur ionotrope Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ, sondern auch metabotrope Glutamatrezeptoren scheinen eine Funktion in der Pathogenese von ALS zu besitzen. So fand man bei ALS-Patienten eine erhöhte Expression von Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluR1 und mGluR5) in Motoneuronen, aber auch in reaktiven Astroglia (ARONICA et al., 2001; ANNESER et al., 2004). In vitroStudien an kultivierten Astrozyten aus Hühnerrückenmark-Gewebe zeigten, dass die Stimulation glialer Gruppe I mGluRs, sowohl mit einem Gruppe I-Agonisten als auch durch Applikation des Liquor cerebrospinalis von ALS-Patienten, eine verstärkte Proliferation in Astroglia verursachte (ANNESER et al., 2004). Bisherige Daten sprechen für die Hypothese, dass erhöhte Glutamat-Konzentrationen im Liquor 5. Diskussion 99 cerebrospinalis von ALS-Patienten (ROTHSTEIN et al., 1995) sowohl eine verstärkte Stimulation von Gruppe I mGluRs und dadurch verstärkte Glia-Proliferation und Astrogliose hervorrufen (ARONICA et al., 2001; ANNESER et al., 2004) sowie eine Exzitotoxizität via AMPA-Rezeptoren, die ebenfalls zum Absterben von Motoneuronen führt (ROTHSTEIN et al.,1996). Es ist ebenfalls bekannt, dass FGF-2 ein wichtiges Zytokin in Astrozyten ist (GOMEZ-PINILLA et al., 1992) und dass Astroglia Dopamin-Rezeptoren (HANSON und RÖNNBACK, 1988; MUDRICKDONNON et al., 1993; ZANASSI et al., 1999) und auch Glutamat-Rezeptoren (KETTENMANN et al., 1984) exprimieren, deren Aktivierung intrazelluläre CalciumSpiegel in Astrozyten erhöht (FINKBEINER, 1993). Aufgrund der soeben beschriebenen Fakten könnte FGF-2 durchaus einen Einfluss auf die Pathogenese der ALS besitzen. In dieser Arbeit konnte im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen ebenfalls eine signifikant erhöhte Expression eines Gruppe I mGluRs (mGluR1), wie sie auch bei ALS-Patienten vorliegt, nachgewiesen werden. Aufgrund der Parallelen in der Expression von AMPA-GluR3 und 4 zwischen FGF-2 knock-out Mäusen und SOD1Mäusen, einem Tiermodell der ALS, liegt die Vermutung nahe, dass FGF-2 eine Rolle in der Pathogenese dieser neurodegenerativen Erkrankung spielen könnte, indem es z.B. die Expression der Glutamatrezeptoren verändert und somit eine Exzitotoxizität begünstigt oder beispielsweise über die Gruppe I mGluRs und/oder den Dopamin1-Rezeptor die Glia-Proliferation beeinflusst . 6. Zusammenfassung 100 6. Zusammenfassung Katrin Schlarmann Differentielle Genexpression im Rückenmark von Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) knock-out Mäusen Der Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) bindet direkt an Proteine der SpleissingMaschinerie, wie das survival of motoneuron (SMN)-Protein und die Spleissfaktoruntereinheit SF3a66 (CLAUS et al., 2003, 2004; GRINGEL et al., 2004). Diese Interaktionen legen die Vermutung nahe, dass FGF-2 einen Einfluss auf das prä-mRNA-Spleissen besitzt. Im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen wurde daher alternatives Spleissen bestimmter Transkripte analysiert. Ein Nachweis von alternativ-gespleissten mRNA-Transkripten bei FGF-2-Abwesenheit wäre ein Hinweis auf eine mögliche regulatorische Funktion von FGF-2 im Zusammenspiel mit Komponenten der Spleissing-Maschinerie. Hierzu wurde zunächst ein "Screening"Experiment durchgeführt, bei dem bekannte, alternativ-gespleisste Transkripte im Rückenmark untersucht wurden (JENSEN et al., 2000). Diese Suche ergab keinen Hinweis auf alternativ-gespleisste mRNAs in FGF-2 knock-out Mäusen, erbrachte aber den Nachweis, dass mehrere Gene im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen differentiell exprimiert werden. Mit semiquantitativer Reverser TranskriptasePolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde das Rückenmark von FGF-2 knock-outund Wildtyp-Mäusen analysiert. Folgende Befunde wurden dabei im Rückenmark von FGF-2 knock-out Mäusen erhoben: 6. Zusammenfassung • Die Expression 101 des metabotropen Glutamatrezeptors (mGluR1) wird signifikant hochreguliert. • Die Expression der ionotropen Glutamatrezeptoruntereinheiten 3 und 4 vom AMPA-Typ (AMPA-GluR3 + 4) wird signifikant hinunterreguliert. • Die Expression des Dopamin1-Rezeptors (D1R) wird signifikant hochreguliert. Zusätzlich wurde in Wildtyp- und FGF-2 knock-out Mäusen mittels in-situHybridisierung D1R-mRNA in multipolaren Nervenzellen der gesamten grauen Substanz des zervikalen Rückenmarks, besonders in Motoneuronen des Ventralhorns, lokalisiert. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, differentielle Genexpression in Abwesenheit von FGF-2 nachzuweisen. Damit wurde gezeigt, dass FGF-2 einen regulierenden Effekt auf die Transkription bestimmter Gene hat. Da die Mechanismen, über die FGF-2 eine Expressionsänderung bewirkt, größtenteils noch unbekannt sind, sind weitere Untersuchungen erforderlich. 7. Summary 102 7. Summary Katrin Schlarmann Differential gene expression in the spinal cord of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) knock-out mice Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) binds directly to proteins of the splicingmachinery, particularly to the survival of motoneuron (SMN)-protein and the splicing factor subunit SF3a66 (CLAUS et al., 2003, 2004; GRINGEL et al., 2004). These interactions suggest that FGF-2 influences pre-mRNA splicing. Therefore, alternative splicing of specific transcripts was analyzed in spinal cords of FGF-2 knock-out mice. Evidence of alternatively spliced mRNA transcripts in the absence of FGF-2 would indicate a possible regulatory function of FGF-2 while interacting with components of the splicing-machinery. First, a screening-experiment was performed to examine alternatively spliced transcripts in the spinal cord (JENSEN et al., 2000). This approach did not detect alternatively spliced mRNAs, but it proved that several genes in the spinal cord of FGF-2 knock-out mice are expressed differentially. Second, spinal cords of FGF-2 knock-out and wild-type mice were analyzed by using semiquantitative reverse transcriptase polymerase chainreaction (RT-PCR). The following results were obtained in spinal cords of FGF-2 knock-out mice: • The expression of the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) is upregulated significantly . • The expression of the AMPA-type glutamate receptor subunits 3 and 4 (ionoGluR3 + 4) is down-regulated significantly. • The expression of the dopamine receptor 1 (D1R) is up-regulated significantly. 7. Summary 103 In addition, D1R-mRNA was localized in multipolar neurons of the entire grey matter in the thoracic spinal cord, particularly in motoneurons, of wild-type and FGF-2 knock-out mice, as detected by in-situ hybridization. The present work provides insights into differential gene expression in the absence of FGF-2. Thus, FGF-2 has a regulating effect on transcription of specific genes. 8. Literaturverzeichnis 104 8. Literaturverzeichnis ALMER, G. (2003): Amyotrophe Lateralsklerose: Überlegungen zu Ursprung und Pathophysiologie der Erkrankung. J Neurol Neurochir Psychiatr 4, 6-12 ALVAREZ, F. J., R. M. VILLALBA, P. A. CARR, P. GRANDES u. P. M. SOMOHANO (2000): Differential distribution of metabotropic glutamate receptors 1a, 1b, and 5 in the rat spinal cord. J Comp Neurol 422, 464-487 ANNESER, J. M., C. CHAHLI, P. G. INCE, G. D. BORASIO u. P. J. SHAW (2004): Glial proliferation and metabotropic glutamate receptor expression in amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 63, 831-840 APOSTOLAKOS, M. J., W. H. SCHUERMANN, M. W. FRAMPTON, M. J. UTEL u. J. C. WILLEY (1993): Measurement of gene expression by multiplex competitive polymerase chain reaction. Anal Biochem 213, 277-284 ARAKAWA, Y., M. 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REES (1991): Three-dimensional structures of acidic and basic fibroblast growth factors. Science 251, 90-93 Danksagung Frau Prof. Dr. Claudia Grothe danke ich ganz herzlich für die Überlassung des Dissertationsthemas und die stets hilfreiche Beratung. Großer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. für die Betreuungsübernahme meiner Arbeit an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Bei Herrn PD Dr. Peter Claus möchte ich mich für die hervorragende Betreuung bedanken. Seine hilfreiche Beratung und Unterstützung während der laufenden Versuche und bei der Anfertigung des Manuskriptes haben entscheidend zur Fertigstellung der Arbeit beigetragen. Ein großes Dankeschön geht an Frau Hella Brinkmann und Frau Kerstin Kuhlemann für ihre stete Hilfsbereitschaft in allen Belangen des Laboralltags und darüber hinaus. Mein Dank gilt ebenfalls Frau Natascha Heidrich für die Durchführung der GewebePerfusion, sowie Frau Hildegard Streich für die Anfertigung der Paraffinschnitte. Für die heitere Atmosphäre im Labor und die lustigen Unternehmungen in der Freizeit bedanke ich mich ganz herzlich bei Natascha, Esther, Christina, Alex, Gunther, Jeroen und Jürgen. Allen Mitarbeitern der Abteilung Neuroanatomie möchte ich für das angenehme Arbeitsklima, die gute Zusammenarbeit und die interessanten Gespräche danken. Ein ganz herzliches Dankeschön geht an meine Eltern für ihre moralische und finanzielle Unterstützung nicht nur während des Studiums und der Dissertation. Mein besonderer Dank gilt Bianca, Steffi und Björn für ihre Unterstützung und die gelegentlich notwendige Aufmunterung und Ablenkung. Ich danke dem Praxisteam in der Güntherstrasse 17, das immer an mich geglaubt hat.
