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Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Fakultät für Biologie
Autotrophe CO2-Fixierung
in thermophilen
Mikroorganismen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
vorgelegt von
Michael Hügler
aus Giengen a. d. Brenz
Freiburg, Oktober 2003
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Hans Kleinig
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Georg Fuchs
Referent:
Prof. Dr. Georg Fuchs
Koreferent:
Prof. Dr. Jürgen Oelze
Tag der Promotion:
17.12.2003
Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Juli 2000 bis September 2003 am
Institut für Biologie II der Biologischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
i. Br. unter der Leitung von Prof. Dr. Georg Fuchs durchgeführt. Die Züchtung einiger
Mikroorganismen wurde am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Universität Regensburg in
Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Karl Otto Stetter und Dr. Harald Huber durchgeführt. NMRspektroskopische Untersuchungen wurden am Lehrstuhl für Organische Chemie und
Biochemie der Technischen Universität München in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Adelbert
Bacher und Dr. Wolfgang Eisenreich durchgeführt.
Ein Großteil der Ergebnisse ist in folgenden Artikeln veröffentlicht:
Hügler, M., C. Menendez, H. Schägger, and G. Fuchs. 2002. Malonyl-coenzyme A
reductase from Chloroflexus aurantiacus, a key enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle for
autotrophic CO2 fixation. J. Bacteriol. 184:2404–2410.
Hügler, M., H. Huber, K.O. Stetter, and G. Fuchs. 2003. Autotrophic CO2 fixation
pathways in Archaea (Crenarchaeota). Arch. Microbiol. 179:160–173.
Hügler, M., R.S. Krieger, M. Jahn, and G. Fuchs. 2003. Characterization of acetyl-CoA/
propionyl-CoA carboxylase in Metallosphaera sedula. Carboxylating enzyme in the 3hydroxypropionate cycle for autotrophic carbon fixation. Eur. J. Biochem. 270:736–744.
INHALT
INHALT
INHALT
ZUSAMMENFASSUNG
1
EINLEITUNG
4
1. Autotrophe CO2-Fixierung
4
2. Autotrophe CO2-Fixierungswege
5
2.1 Calvin-Zyklus
5
2.2 Reduktiver Citrat-Zyklus
7
2.3 Reduktiver Acetyl-CoA-Weg
9
2.4 3-Hydroxypropionat-Zyklus
10
3. Thermophilie und Hyperthermophilie
12
4. Organismen
13
4.1 Bakterien
13
4.1.1 Chloroflexus aurantiacus
4.2 Archaea
13
14
4.2.1 Crenarchaeota
14
4.2.2 Euryarchaeota
18
4.2.3 Nanoarchaeota
18
5. CO2-Fixierungswege bei Archaea
19
6. RubisCO bei Archaea
20
7. Ziele der Arbeit
22
MATERIAL UND METHODEN
24
1. Material
24
2. Organismenstämme und Züchtung
25
2.1 Organismenstämme
25
2.2 Züchtung von Chloroflexus aurantiacus
25
INHALT
2.3 Züchtung von Metallosphaera sedula
26
2.4 Züchtung von Ralstonia eutropha
28
2.5 Züchtung von Desulfobacterium autotrophicum und Desulfobacter
hydrogenophilus
28
2.6 Züchtung von Acidianus ambivalens, Ignicoccus islandicus, Ignicoccus
pacificus, Pyrobaculum islandicum, Pyrodictium abyssi, Pyrodictium occultum
und Sulfolobus sp. VE 6
28
2.7 Züchtung von Escherichia coli
30
3. Synthesen
30
3.1 Malonyl-CoA
30
3.2 Acetyl-CoA, Propionyl-CoA und Succinyl-CoA
30
3.3 L-(S) Malyl-CoA
30
3.4 3-Hydroxypropionat
31
13
3.5 [1,4- C1]-Succinat
4. Herstellung von Zellextrakten
31
31
4.1 Zellaufschluss in einer French-Press-Zelle
31
4.2 Zellaufschluss mit der Zellmühle
31
4.3 Zellaufschluss mit Ultraschall
31
5. Enzymatische Tests
32
5.1 ATP-Citrat-Lyase
32
5.2 Reduktion von Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat (Malonyl-CoAReduktase)
32
5.3 Reduktion von 3-Hydroxypropionat zu Propionyl-CoA
32
5.4 α-Ketoglutarat- und Pyruvat-Dehydrogenase
33
5.5 Malat-Dehydrogenase
33
5.6 Isocitrat-Dehydrogenase
33
5.7 Aconitase
33
5.8 Pyruvat-Kinase
33
5.9 Acetyl-CoA-Carboxylase
33
5.10 α-Ketoglutarat und Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase
34
5.11 CO-Dehydrogenase
34
5.12 L-Malyl-CoA-Lyase
34
5.13 Succinyl-CoA:L-Malat CoA-Transferase
34
5.14 Isocitrat-Lyase
35
5.15 Fumarat-Hydratase
35
5.16 Citrat-Synthase
35
INHALT
5.17 Succinat-Dehydrogenase
35
5.18 Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RubisCO)
35
5.19 Acetyl-CoA- und Propionyl-CoA-Carboxylase
36
5.20 PEP-Carboxylase
36
5.21 PEP-Carboxykinase
36
5.22 Pyruvat-Carboxylase
36
5.23 Pyruvat:Wasser-Dikinase (PEP-Synthetase)
36
5.24 Pyruvat:Phosphat-Dikinase
37
6. Reinigung von Enzymen
37
6.1 Reinigung der Malonyl-CoA-Reduktase aus Chloroflexus aurantiacus
37
6.2 Reinigung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase aus Metallosphaera
sedula
38
7. Radioaktive Enzymumsetzungen
39
14
39
14
39
7.1 Umsetzung von C-markiertem Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat
7.2 Umsetzung von CO2 mit Ribulose-1,5-bisphosphat durch Zellextrakt von Pd.
abyssi, Pd. occultum, R. eutropha, I. islandicus und I. pacificus
8. Isolierung von Aminosäuren und anderen Zellbausteinen aus 13Cmarkierten Zellen
39
8.1 Isolierung der Proteine
39
8.2 Saure Hydrolyse der Zellproteine
40
8.3 Isolierung der Aminosäuren
40
9. Bestimmung von molekularen Enzymeigenschaften
41
9.1 Bestimmung der nativen Molekularmasse
41
9.2 Bestimmung der N-terminalen Aminosäurensequenz
41
9.3 Nachweis von biotinylierten Proteinen
41
10. Molekularbiologische Methoden
42
10.1 Isolierung und Reinigung von DNA
42
10.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
42
10.3 Klonierungstechniken
43
10.4 Sequenzierung von DNA-Fragmenten
43
11. Produktanalyse
43
11.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
43
11.2 Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie
44
12. Analytische Methoden
44
12.1 Proteinbestimmung
44
INHALT
12.2 Bestimmung von Radioaktivität
13. Elektrophoretische Methoden
44
44
13.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
44
13.2 Agarose-Gelelektrophorese
45
ERGEBNISSE
46
1. Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus
46
1.1 Malonyl-CoA-Reduktion im Zellextrakt
46
1.2 Reinigung und Charakterisierung der Malonyl-CoA-Reduktase
47
1.3 Katalytische Eigenschaften der Malonyl-CoA-Reduktase
49
1.4 Malonatsemialdehyd als Intermediat der Malonyl-CoA-Reduktase
51
1.5 Sequenzierung des Malonyl-CoA-Reduktase Gens (mcr)
53
2. Schlüsselenzyme der CO2-Fixierungswege in Crenarchaeota
55
2.1 Biotinylierte Proteine in Zellextrakten von Crenarchaeota
56
2.2 Enzymaktivitäten der Crenarchaeota
57
2.2.1 Pyrodictiaceae
57
2.2.2 Desulfurococcaceae
59
2.2.3 Sulfolobaceae
60
2.2.4 Thermoproteaceae
61
3. RubisCO in Pyrodictiaceae
62
4. Vergleich der Enzymaktivitäten in autotroph und heterotroph gewachsenen
Zellen von Metallosphaera sedula
65
5. Langzeitmarkierung von Metallosphaera sedula mit [1,4-13C1]-Succinat
68
5.1 Wachstum mit [1,4-13C1]-Succinat
69
5.2
13
70
5.3
13
71
C-Markierungsmuster in Aminosäuren
C-Markierungsmuster in zentralen Metaboliten
5.4 Schlussfolgerungen für den Weg der Acetyl-CoA-Regeneration in
Metallosphaera sedula
6. Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von Metallosphaera sedula
73
75
6.1 Carboxylase-Aktivitäten im Zellextrakt
75
6.2 Analyse der Carboxylase-Gene
76
6.3 Reinigung und Charakterisierung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoACarboxylase
77
6.4 Katalytische Eigenschaften der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
78
INHALT
DISKUSSION
82
1. Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus
82
2. Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Chloroflexus aurantiacus
83
3. Schlüsselenzyme bekannter CO2-Fixierungswege bei Vertretern der
Crenarchaeota
85
3.1 Pyrodictiaceae
85
3.2 Desulfurococcaceae
86
3.3 Sulfolobaceae
86
3.4 Thermoproteaceae
87
4. RubisCO in Pyrodictium spp.
88
5. Regulation von Enzymaktivitäten in Metallosphaera sedula.
90
6.
13
C-Markierungsstudien in Metallosphaera sedula
91
7. Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von Metallosphaera sedula
93
8. Verteilung der CO2-Fixierungswege in Archaea
97
LITERATUR
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ANHANG
DANKSAGUNG
99
109
I
ZUSAMMENFASSUNG
1
ZUSAMMENFASSUNG
Derzeit sind bei Mikroorganismen vier verschiedene Stoffwechselwege zur autotrophen
CO2-Fixierung bekannt. Dies sind der Calvin-Zyklus, der reduktive Citrat-Zyklus, der
reduktive Acetyl-CoA-Weg und der 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Letzterer wurde bisher nur
im phototrophen Bakterium Chloroflexus aurantiacus durch Markierungsexperimente und
Enzymaktivitätsmessungen nachgewiesen. Beim 3-Hydroxypropionat-Zyklus wird AcetylCoA zu Malonyl-CoA carboxyliert. Dieses wird zu 3-Hydroxypropionat reduziert, welches
wiederum reduktiv in Propionyl-CoA umgewandelt wird. In einer zweiten Carboxylierungsreaktion wird aus Propionyl-CoA Methylmalonyl-CoA gebildet. Durch mehrere Reaktionsschritte entsteht daraus Succinyl-CoA und schließlich Malyl-CoA. Malyl-CoA wird durch die
Malyl-CoA-Lyase in Acetyl-CoA und Glyoxylat gespalten. So wird Acetyl-CoA regeneriert
und Glyoxylat entsteht als erstes CO2-Fixierungsprodukt.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche thermophile und hyperthermophile Vertreter
der Crenarchaeota isoliert, die autotroph wachsen können. Es gibt sehr wenige Untersuchungen zur autotrophen CO2-Fixierung in dieser großen Organismengruppe. Erste
Arbeiten deuten auf einen 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Vertretern der Familie der
Sulfolobaceae hin.
In dieser Arbeit sollte der 3-Hydroxypropionat-Zyklus sowohl in C. aurantiacus, als
auch in Metallosphaera sedula, einem Mitglied der Sulfolobaceae, näher untersucht werden.
Außerdem wurde die Art der jeweiligen CO2-Fixierung in verschiedenen Vertretern der
Crenarchaeota untersucht.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1.
Die Malonyl-CoA-Reduktase, ein charakteristisches Enzym des 3-Hydroxypropionat-
Zyklus, wurde aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Das entsprechende Gen wurde
ZUSAMMENFASSUNG
2
kloniert und sequenziert. Die Malonyl-CoA-Reduktase katalysiert die NADPH-abhängige,
zweistufige Reduktion von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat.
Sie ist damit ein bifunktionelles Enzym mit einer Aldehyd- und einer Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität. Das Holoenzym besteht aus zwei gleichen Untereinheiten von je 132 kDa
Molekularmasse. Die Sequenz jeder Untereinheiten zeigt zwei Dehydrogenase-Domänen. Da
die Malonyl-CoA-Reduktase in keinem anderen Stoffwechselweg benötigt wird, kann sie als
Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus angesehen werden.
2.
Es wurden in autotrophen Vertretern aller Familien der Crenarchaeota die Schlüssel-
enzymaktivitäten der bekannten CO2-Fixierungswege untersucht. Bei Pyrodictium abyssi und
Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) wurde eine Ribulose-1,5-bisphosphat-CarboxylaseAktivität nachgewiesen. Allerdings konnte die Phosphoribulokinase-Aktivität, die zweite
Schlüsselaktivität des Calvin-Zyklus, nicht gemessen werden. Es wird deshalb ein
modifizierter Calvin-Zyklus vermutet. In Ignicoccus islandicus und Ignicoccus pacificus
(Desulfurococcaceae) konnte nur die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase als Enzym eines
bekannten CO2-Fixierungswegs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sprechen für einen
neuartigen, bisher unbekannten CO2-Fixierungsweg in dieser Familie. In den Vertretern der
Sulfolobaceae, Acidianus ambivalens, M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6, konnten
Aktivitäten der Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus nachgewiesen werden.
Zusätzlich konnte in M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6 auch die Aktivitäten der αKetoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase gemessen werden. Die Sulfolobaceae haben demnach
vermutlich einen modifizierten 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Bei Pyrobaculum islandicum
(Thermoproteaceae) wurden nur die Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus gefunden,
der hier vermutlich als autotropher CO2-Fixierungsweg dient.
3.
Die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität in Pd. abyssi und Pd. occultum
wurde näher charakterisiert. Über HPLC-Analyse konnte 3-Phosphoglycerat als primäres
CO2-Fixierungsprodukt nachgewiesen werden. Das Enzym war noch in kochendem Wasser
aktiv und scheint, wie die anderen RubisCO-Proteine der Archaea, ein Enzym der Form III zu
sein.
4.
Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus in M. sedula wurde näher charakterisiert, indem die
Regulation von Enzymen des zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsels untersucht wurde. Die
Aktivitäten wichtiger Enzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus waren unter autotrophen
ZUSAMMENFASSUNG
3
Wachstumsbedingungen hochreguliert, ebenso die α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase
und die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase. Die Enzyme des Citrat-Zyklus waren dagegen
unter heterotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert. Die Enzymaktivität einer MalylCoA-Lyase konnte nicht gefunden werden. Die gefundenen Enzyme können damit eine
Umwandlung von Acetyl-CoA mit 2 Molekülen CO2 bis hin zum Succinyl-CoA erklären. Die
Regeneration von Acetyl-CoA aus Succinyl-CoA scheint im Vergleich zu C. aurantiacus
variiert.
5.
Um eine eventuelle Beteiligung der α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der
autotrophen CO2-Fixierung in M. sedula zu überprüfen, wurden 13C-Markierungsexperimente
in M. sedula durchgeführt. Autotroph wachsende Zellen wurden mit 13C-Succinat gefüttert
und das 13C-Markierungsmuster der isolierten Aminosäuren analysiert. Die Ergebnisse
zeigen, dass eine Beteiligung der α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der autotrophen
CO2-Fixierung ausgeschlossen ist. Gleichzeitig unterstützte der Vergleich der 13CMakierungsmuster von M. sedula und C. aurantiacus die These eines alternativen Wegs der
Acetyl-CoA-Regeneration.
6.
Die Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase, das CO2-fixierende Enzym des 3-
Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus M. sedula gereinigt und charakterisiert. Sie ist aus 3
Untereinheiten (Biotincarboxylase AccB, Biotin-Carrier-Protein AccC, Carboxyltransferase
PccB) aufgebaut und katalysiert beide Carboxylierungsreaktionen mit der gleichen Rate. Im
Gegensatz zu den Carboxylasen der meisten anderen Organismen ist das Enzym aus M.
sedula stabil und konnte als Holoenzym gereinigt werden. Wahrscheinlich hat es eine (AccB,
AccC, PccB)4-Struktur. Das Enzym aus M. sedula wäre ein ideales Objekt für die
Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse dieses wichtigen Enzyms. Es konnte bestätigt
werden, dass die vermuteten Gensequenzen von M. sedula für diese Carboxylase codieren.
EINLEITUNG
4
EINLEITUNG
1.
Autotrophe CO2-Fixierung
Die Nutzung von Kohlendioxid (CO2) als ausschließliche Quelle zum Aufbau der
Kohlenstoffverbindungen der Zelle wird als autotrophe CO2-Fixierung bezeichnet. Bei der
biologischen CO2-Fixierung handelt es sich um einen der wichtigsten biochemischen Prozesse
der Erde. Jährlich werden etwa 120 Milliarden Tonnen Kohlenstoff aus dem CO2 der
Atmosphäre durch terrestrische und aquatische Organismen in organischem Material fixiert.
Dies sind mehr als 15 % der Gesamtmenge an CO2 in der Atmosphäre, welche sich auf ca.
720 Milliarden Tonnen Kohlenstoff beläuft. Der Anteil an CO2 in der Luft beträgt 0,0355 %
(Bliefert, 2002). Neben Pflanzen und Algen spielen auch Mikroorganismen bei der
autotrophen CO2-Fixierung eine wichtige Rolle. Autotrophe Mikroorganismen findet man in
fast allen Gruppen der Bakterien (Eubakterien), und auch bei den Archaea (Archaebakterien)
gibt es zahlreiche Vertreter, die ihr Zellmaterial über autotrophe CO2-Fixierung aufbauen. Die
autotrophe Lebensweise ist dabei nicht notwendigerweise an eine phototrophe Lebensweise
geknüpft, d. h. an die Nutzung der Energie des Sonnenlichtes. Viele Mikroorganismen leben
chemoautotroph, sie gewinnen ihre Energie aus exergonen chemischen Reaktionen und
nutzen CO2 als alleinige Kohlenstoffquelle.
Es wird vermutet, dass es sich bei den ersten Organismen der Erde um chemoautotrophe
Prokaryoten gehandelt haben könnte (z. B. Wächtershäuser, 1990; Martin und Russell, 2003).
Kohlenstoff-Isotopen-Daten in Gesteinen mit einem Alter von 3,8 Milliarden Jahren weisen
auf eine biologische CO2-Fixierung hin (Mojzsis et al., 1996; Rosing, 1999; Nisbet und Sleep,
2001). Diese geologischen Funde sind gleichzeitig auch die ersten Spuren irdischen Lebens
überhaupt. Die Photosynthese hat sich vermutlich später entwickelt. Die ältesten Funde von
wahrscheinlich photosynthetischen Prokaryoten stammen aus 3,5 Milliarden Jahre alten
Gesteinen. Diese so genannten Stromatolithen ähneln in ihrer Struktur den heutigen
Cyanobakterien, weshalb sie als erste photosynthetische Prokaryoten gedeutet werden (Nisbet
und Sleep, 2001).
EINLEITUNG
2.
5
Autotrophe CO2-Fixierungswege
Zurzeit sind 4 verschiedene autotrophe CO2-Fixierungswege bekannt: der Calvin-
Zyklus, der reduktive Citrat-Zyklus, der reduktive Acetyl-CoA-Weg, sowie der 3Hydroyxpropionat-Zyklus.
2.1
Calvin-Zyklus
Der Calvin-Zyklus (auch Calvin-Bassham-Benson-Zyklus oder reduktiver Pentose-
phosphat-Zyklus) ist in Abbildung 1 dargestellt. Es handelt sich um den am weitesten
verbreiteten CO2-Fixierungsweg und er kommt in den Chloroplasten von grünen Pflanzen und
Algen vor. Auch unter den Bakterien ist er weit verbreitet. So benutzen die meisten Bakterien,
wie z. B. die fast ubiquitär vorkommenden Cyanobakterien, den Calvin-Zyklus zur CO2Fixierung. Nach derzeitigem Kenntnisstand beschränkt sich seine Verbreitung allerdings auf
aerobe und fakultativ aerobe Bakterien, weder bei den Archaea noch bei anaeroben Bakterien
konnte der Calvin-Zyklus bislang eindeutig nachgewiesen werden. Eine zentrale Rolle im
Calvin-Zyklus spielt das CO2-fixierende Enzym Ribulose-1,5-bisphospat-Carboxylase/
Oxygenase (RubisCO). Es ist vermutlich das häufigste Enzym der Erde und das Schlüsselenzym dieses CO2-Fixierungswegs. Die RubisCO ist das einzige CO2-fixierende Enzym im
Calvin-Zyklus. Sie katalysiert die Addition von CO2 an Ribulose-1,5-bisphosphat wodurch
sich ein Zwischenprodukt bildet, welches sogleich hydrolytisch in zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat gespalten wird. 3-Phosphoglycerat ist das primäre CO2-Fixierungsprodukt im CalvinZyklus. Neben der RubisCO wird die Phosphoribulokinase (Ribulose-5-phosphat-Kinase) als
weiteres Schlüsselenzym des Calvin-Zyklus angesehen. Sie katalysiert die ATP-abhängige
Phosphorylierung von Ribulose-5-phosphat, wodurch Ribulose-1,5-bisphosphat gebildet wird,
das Substrat der RubisCO. Insgesamt werden im Zyklus 3 Moleküle CO2 zu einem TriosePhosphat (Glycerinaldehyd-3-Phosphat) umgesetzt, dabei werden 9 ATP und 6 NAD(P)H
verbraucht. Der Calvin-Zyklus ist damit ein sehr energieaufwändiger CO2-Fixierungsweg.
Die RubisCO ist vermutlich ein sehr altes Enzym. Es gibt Hinweise, dass
Mikroorganismen die RubisCO schon vor 3,5 Milliarden Jahren besessen haben könnten
(Nisbet und Sleep, 2001). Neben der Carboxylierungsreaktion katalysiert die RubisCO auch
eine Oxygenasereaktion. Dabei reagiert Ribulose-1,5-bisphosphat mit molekularem
Sauerstoff zu einem Molekül 3-Phosphoglycerat und einem Molekül Phosphoglycolat.
EINLEITUNG
6
Obwohl die Affinität der RubisCO gegenüber CO2 sehr viel höher ist als gegenüber
Sauerstoff, kommt es alleine aufgrund des hohen Anteils an Sauerstoff in der Luft (fast 21 %)
oft zur Oxygenasereaktion. Dies führt zu einer Ineffizienz der RubisCO, da Phosphoglycolat
eigentlich ein Abfallprodukt darstellt. Diese scheinbare Ineffizienz ist aus biochemischer
Sicht schwer zu verstehen, sie ist allerdings wichtig in Bezug auf den globalen KohlenstoffZyklus der Biosphäre. Mit einer effizienteren RubisCO wäre der CO2-Gehalt der Atmosphäre
wahrscheinlich sehr viel niedriger (Nisbet und Sleep, 2001).
CH2OH
C O
5 x Glycerinaldehyd3-phosphat
CHOH
Glycerinaldehyd3-phosphat
CHOH
CH2O P
3 x Ribulose-5-phosphat
3 ATP
6 ADP + 6 Pi
1
6 NADPH
3 ADP
COOH
CH2O P
CHOH
C O
CH2O P
CHOH
6 x 3-Phosphoglycerat
CHOH
CH2O P
6 ATP
3 CO2
2
3 x Ribulose1,5-bisphosphat
3 H2O
Abb. 1: Der Calvin-Zyklus mit den zentralen Intermediaten. Die Reaktionen, die durch
Schlüsselenzyme katalysiert werden, sind durch dicke Pfeile dargestellt. Die beiden Schlüsselenzyme
sind: (1) Ribulose-5-phosphat-Kinase (Phosphoribulokinase) (E.C. 2.7.1.19) und (2) Ribulose-1,5bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RubisCO) (E.C. 4.1.1.39).
EINLEITUNG
2.2
7
Reduktiver Citrat-Zyklus
Beim reduktiven Citrat-Zyklus (auch Arnon-Buchanan-Zyklus) handelt es sich um
einen CO2-Fixierungsweg, der bisher nur bei Mikroorganismen gefunden wurde. Er ist in
Abbildung 2 dargestellt. Im Prinzip stellt er eine Umkehr des oxidativen Citrat-Zyklus dar,
der im heterotrophen Stoffwechsel zur Acetyl-CoA-Assimilation genutzt wird. Im reduktiven
Citrat-Zyklus müssen die drei Enzyme des Citrat-Zyklus, welche irreversible Reaktionen
katalysieren, durch andere ersetzt werden. Anstelle der Citrat-Synthase, die die irreversible
Bildung von Citrat aus Oxalacetat und Acetyl-CoA katalysiert, ist im reduktiven CitratZyklus die ATP-Citrat-Lyase vorhanden (Ivanovsky et al., 1980; Antranikian et al., 1982). Sie
ist ein Schlüsselenzym des reduktiven Citrat-Zyklus, das ATP-abhängig die Spaltung von
Citrat in Oxalacetat und Acetyl-CoA katalysiert. Ein weiteres Schlüsselenzym des Zyklus ist
die α-Ketoglutarat:Ferredoxin-Oxidoreduktase (α-Ketoglutarat-Synthase). Diese katalysiert
die reversible reduktive Carboxylierung von Succinyl-CoA zu α-Ketoglutarat. Sie ersetzt
damit die α-Ketoglutarat-Dehydrogenase, welche im oxidativen Citrat-Zyklus die irreversible
Decarboxylierung von α-Ketoglutarat katalysiert. Das dritte ersetzte Enzym ist die SuccinatDehydrogenase, an ihre Stelle tritt im reduktiven Citrat-Zyklus die Fumarat-Reduktase,
welche Fumarat zu Succinat reduziert.
Im reduktiven Citrat-Zyklus wird ein Molekül Acetyl-CoA aus 2 Molekülen CO2
gebildet, dabei erfolgen die Carboxylierungsreaktionen durch die α-Ketoglutarat:FerredoxinOxidoreduktase und die Isocitrat-Dehydrogenase. Das primäre CO2-Fixierungsprodukt
Acetyl-CoA wird über die Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase (Pyruvat-Synthase) zu Pyruvat
carboxyliert. Diese reversible reduktive Carboxylierung kommt auch im reduktiven AcetylCoA-Weg vor, einem weiteren CO2-Fixierungsweg. Das Enzym Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase kann also nicht als Schlüsselenzym des reduktiven Citrat-Zyklus bezeichnet
werden, dennoch ist der Nachweis dieses Enzyms erforderlich, um eine sichere Aussage über
das Vorhandensein dieses Stoffwechselwegs machen zu können. Insgesamt werden im
reduktiven Citrat-Zyklus 3 Moleküle CO2 zu Pyruvat umgesetzt, dabei werden 2 ATP
verbraucht. Die Bildung eines Triose-Phosphats erfordert 5 ATP und Reduktionsäquivalente
in Form von 3 NAD(P)H, 2 Ferredoxinred und einem unbekannten Elektronendonor (Lengeler
et al., 1999).
Der reduktive Citrat-Zyklus wurde zunächst nur in strikt anaeroben Bakterien, wie dem
phototrophen grünen Schwefelbakterium Chlorobium limicola (Evans et al., 1966; Fuchs et
EINLEITUNG
8
al., 1980a; Fuchs et al., 1980b) oder dem Sulfatreduzierer Desulfobacter hydrogenophilus
(Schauder et al., 1987) gefunden. Spätere Untersuchungen zeigten aber, dass er auch in
einigen mikroaerophilen Bakterien, wie Hydrogenobacter thermophilus (Shiba et al., 1985)
oder Aquifex pyrophilus (Beh et al., 1993) vorkommt. Auch im Archaeon Thermoproteus
neutrophilus konnte der reduktive Citrat-Zyklus nachgewiesen werden (Schäfer et al., 1986;
Schäfer et al., 1989a; Schäfer et al., 1989b; Strauss et al., 1992; Beh et al., 1993). Der
reduktive Citrat-Zyklus wird von Wächtershäuser als ursprünglicher CO2-Fixierungsweg
angesehen (Wächtershäuser, 1990). Dabei könnten statt CoA-Estern Thiosäuren verwendet
worden sein.
COOH
C
CO2
O
2 Fdred
CH3
4
COSCoA
CH3 Acetyl-CoA
CoA
Pyruvat
COOH
COOH
C
O
ATP
ADP+Pi
1
CH2
C COOH
HO
CH2
CH2
COOH
COOH
Oxalacetat
Citrat
COOH
CHOH
COSCoA
HC COOH
CH2
CH2
CH2
COOH
Succinyl-CoA
COOH
CO2
2
C O
3
CO2
CH2
2 Fdred
CoA
CH2
COOH
Isocitrat
NAD(P)H
COOH
α-Ketoglutarat
Abb. 2: Der reduktive Citrat-Zyklus mit den zentralen Intermediaten. Die wichtigsten
Reaktionen des reduktiven Citrat-Zyklus sind dargestellt, die Schlüsselreaktionen sind durch dicke
Pfeile hervorgehoben. (1) ATP-Citrat-Lyase (E.C. 4.1.3.8), (2) α-Ketoglutarat:FerredoxinOxidoreduktase (E.C. 1.2.7.3), (3) Isocitrat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.42), (4) Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase (E.C. 1.2.7.1). Fdred: reduziertes Ferredoxin.
EINLEITUNG
2.3
9
Reduktiver Acetyl-CoA-Weg
Beim reduktiven Acetyl-CoA-Weg (auch Wood-Ljungdahl-Weg oder CO-
Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase-Weg) handelt es sich um den einzigen nichtzyklischen
CO2-Fixierungsweg, der bisher bekannt ist. Er ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Schlüsselenzym dieses Wegs ist das CO2-fixierende Enzym CO-Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase
(Ljungdahl, 1986; Pezacka und Wood, 1986; Wood et al., 1986; Ragsdale, 1991). Es
katalysiert die reduktive Bildung von Acetyl-CoA aus einer enzymgebundenen Carbonylgruppe und einer an Tetrahydropterin gebundenen Methylgruppe. Es werden unabhängig
voneinander 2 Moleküle CO2 reduziert (eines auf die Stufe einer CO-Gruppe, eines auf die
Stufe einer Methylgruppe) und zu einem Molekül Acetyl-CoA zusammengefügt. Um Pyruvat
zu bilden, wird auch bei diesem Stoffwechselweg das Enzym Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase benötigt. Das Vorhandensein dieses Enzyms deutet, wie schon erwähnt,
entweder auf den reduktiven Citrat-Zyklus oder auf den reduktiven Acetyl-CoA-Weg hin.
Insgesamt werden im reduktiven Acetyl-CoA Weg 3 Moleküle CO2 zu Pyruvat umgesetzt,
hierfür benötigt man nur 1 ATP. Die Bildung eines Triose-Phosphats benötigt insgesamt 4 – 5
ATP und Reduktionsäquivalente in Form von 3 – 4 NAD(P)H und 2 – 3 Ferredoxinred
(Lengeler et al., 1999). Damit wird mit diesem Weg am wenigsten Energie für die CO2Fixierung benötigt.
6 [H]
[CH3 ]
CO2
2 H2O
2 [H]
H2O
CH3 COSCoA
CoASH
1
[CO ]
CO2
1
Acetyl-CoA
CO2
2 Fdred
2
CH3 CO COOH
Pyruvat
Abb. 3: Der reduktive Acetyl-CoA-Weg in einer vereinfachten Darstellung. Die Reaktionen, die
durch die beiden Schüsselenzyme katalysiert werden sind durch dicke Pfeile hervorgehoben. (1) CODehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase Komplex (E.C. 1.2.99.2), (2) Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase (E.C. 1.2.7.1). Fdred: reduziertes Ferredoxin, [H]: Reduktionsäquivalent, [CH3-]:
enzymgebundene Methylgruppe, [CO-]: enzymgebundene Kohlenmonoxidgruppe.
EINLEITUNG
10
Der reduktive Acetyl-CoA-Weg kommt in strikt anaeroben Bakterien vor. Hierzu
gehören die grampositiven acetogenen Bakterien (Eden und Fuchs, 1983; Fuchs, 1986) oder
sulfatreduzierende Proteobakterien, wie Desulfobacterium autotrophicum (Länge et al., 1989;
Schauder et al., 1989). Auch in zahlreichen Archaea der Gruppe Euryarchaeota ist dieser
CO2-Fixierungsweg verwirklicht: vor allem bei den methanogenen Archaea (Fuchs und
Stupperich, 1982; Fuchs, 1989; Fuchs, 1990), aber auch bei dem Sulfatreduzierer
Archaeglobus lithotrophicus (Vorholt et al., 1995) oder bei dem Denitrifizierer Ferroglobus
placidus (Vorholt et al., 1997). Der reduktive Acetyl-CoA-Weg wird ebenso wie der
reduktive Citrat-Zyklus als sehr früh entstandener Stoffwechselweg diskutiert (Fuchs, 1989;
Martin und Russell, 2003). Er wird sogar als Startpunkt des Metabolismus bezeichnet. Hierfür
sprechen vor allem die Linearität des CO2-Fixierungswegs und die weite Verbreitung unter
Archaea und Bakterien. Er könnte daher der ursprüngliche CO2-Fixierungsweg bei einem
chemoautrophen Ursprung des Lebens sein.
2.4
3-Hydroxypropionat-Zyklus
Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus ist in Abbildung 4 dargestellt. In diesem Weg wird aus
2 Molekülen Bicarbonat das primäre CO2-Fixierungsprodukt Glyoxylat gebildet. Die beiden
CO2-fixierenden Enzyme sind dabei die Acetyl-CoA-Carboxylase und die Propionyl-CoACarboxylase. Als Eingangsreaktion katalysiert die Acetyl-CoA-Carboxylase die ATP-und
Bicarbonat-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA. Malonyl-CoA wird
mit zwei Molekülen NADPH über das Zwischenprodukt Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat reduziert. Dieses ist das charakteristische Zwischenprodukt, nach dem der Zyklus
benannt wurde. 3-Hydroxypropionat wird anschließend in Propionyl-CoA umgewandelt.
Diese Umwandlung umfasst 3 Reaktionen: die ATP-abhängige Aktivierung von 3-Hydroxypropionat zum entsprechenden CoA-Ester, die anschließende Dehydratisierung zu AcryloylCoA und die abschließende NADPH-abhängige Reduktion. Propionyl-CoA wird durch die
Propionyl-CoA-Carboxylase ATP- und Bicarbonat-abhängig zu Methylmalonyl-CoA
carboxyliert, welches dann zu Succinyl-CoA umgelagert wird. Über eine CoA-Transferase
und die Enzyme des Citrat-Zyklus Succinat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase wird aus
Succinyl-CoA Malyl-CoA gebildet. Dieses wird durch die Malyl-CoA-Lyase in Glyoxylat
und Acetyl-CoA gespalten. Somit wird das primäre CO2-Fixierungsprodukt Glyoxylat
erhalten und der primäre CO2-Akzeptor Acetyl-CoA regeneriert.
EINLEITUNG
11
COOH
HCO3-
1
COSCoA
CH3
COOH
ATP Acetyl-CoA
COSCoA
ADP+Pi
HO CH
CH2
2 NADPH
CHO Glyoxylat
10
CH2
COOH
COSCoA
Malonyl-CoA
Malyl-CoA
2
7
8
9
CoA
CH2OH
COOH
CH2
CH2
COOH
CH2
3-Hydroxypropionat
H2O
CoA
ATP
3
AMP+PPi
COSCoA
CH3
NADPH
HOOC CH
CH3
CH2
HCO3-
COSCoA
Propionyl-CoA
Succinyl-CoA
5
6
COSCoA
Methylmalonyl-CoA
ATP
ADP+Pi
4
Abb. 4: Der 3-Hydroxypropionat Zyklus, wie er für die CO2-Fixierung bei Chloroflexus
aurantiacus vorgeschlagen wurde. Anders als in den anderen CO2-Fixierungswegen wird
ausschließlich HCO3- fixiert, Glyoxylat ist das erste CO2-Fixierungsprodukt. (1) Acetyl-CoACarboxylase (E.C. 6.4.1.2), (2) Reduktion von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd zu 3Hydroxypropionat (beinhaltet 2 Enzymaktivitäten: Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase und 3Hydroxypropionat-Dehydrogenase), (3) Reduktion von 3-Hydroxypropionat zu Propionyl-CoA über
3-Hydroxypropionyl-CoA und Acryloyl-CoA (beinhaltet 3 Enzymaktivitäten: 3-Hydroxypropionat:
CoA-Ligase, Acryloyl-CoA-Hydratase und Acryloyl-CoA-Reduktase), (4) Propionyl-CoACarboxylase (E.C. 6.4.1.3), (5) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (E.C. 5.1.99.1), (6) MethylmalonylCoA-Mutase (E.C. 5.4.99.2), (7) Succinyl-CoA:L-Malat CoA-Transferase, (8) SuccinatDehydrogenase (E.C. 1.3.5.1), (9) Fumarat-Hydratase (E.C. 4.2.1.2), (10) L-Malyl-CoA-Lyase (E.C.
4.1.3.24).
Zu Beginn dieser Arbeit waren nur die Grundzüge dieses Stoffwechselzyklus bekannt.
Die benötigten Enzymaktivitäten wurden in vitro gemessen (Strauss und Fuchs, 1993),
allerdings wurde bisher keines der Enzyme gereinigt und charakterisiert. Darüber hinaus war
unklar, wie die Assimilation von Glyoxylat abläuft. Als Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus werden die Enzyme betrachtet, die Malonyl-CoA zu Propionyl-CoA
umwandeln. Diese Reaktionsabfolge ist bisher aus keinem anderen Stoffwechselweg bekannt.
EINLEITUNG
12
Auch die Malyl-CoA-Lyase kann als Schlüsselenzym betrachtet werden. Die beiden
carboxylierenden Enzyme Acetyl-CoA-Carboxylase und Propionyl-CoA-Carboxylase werden
in Bakterien nicht als Enzyme zum Nachweis dieses Zyklus angesehen, da die Acetyl-CoACarboxylase hier den ersten Schritt der Fettsäure-Biosynthese katalysiert, und die PropionylCoA-Carboxylase in vielen Bakterien für die Assimilation von Propionat verwendet wird.
Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus wurde aufgrund der Ergebnisse von Markierungsexperimenten erstmals für das grüne Nichtschwefelbakterium Chloroflexus aurantiacus
postuliert. (Holo und Sirevåg, 1986; Holo und Grace, 1987; Holo, 1989; Strauss et al., 1992;
Eisenreich et al., 1993). Bislang wurde kein weiteres Bakterium gefunden, in dem dieser
Stoffwechselweg aktiv ist. Allerdings gab es Hinweise auf einen ähnlichen CO2-Fixierungsweg bei Vertretern der Archaea. Bei Acidianus brierleyi, Sulfolobus metallicus und
Metallosphaera sedula wurden Acetyl-CoA- und Propionyl-CoA-Carboxylase-Aktivitäten
gemessen (Norris et al., 1989; Ishii et al., 1997; Burton et al., 1999; Menendez et al., 1999).
Für A. brierleyi und M. sedula wurde ein Vorhandensein des 3-Hydroxypropionat-Zyklus
vorgeschlagen (siehe Einleitung, Abschnitt 5).
3.
Thermophilie und Hyperthermophilie
Bei Organismen unterscheidet man hinsichtlich ihrer optimalen Wachstumstemperatur
psychrophile, mesophile, thermophile und hyperthermophile Organismen. Bei psychrophilen,
d. h. Kälte liebenden Organismen liegt diese zwischen 5° und 25°C. Der Großteil der
Mikroorganismen wächst mesophil zwischen 25° und 50°C. Als thermophil, d. h. Wärme
liebend, bezeichnet man Organismen die zwischen 50° und 80°C optimal wachsen. Hyperthermophile Organismen schließlich haben eine optimale Wachstumstemperatur von mehr als
80°C.
In dieser Arbeit wurden ausschließlich thermophile und hyperthermophile
Mikroorganismen untersucht. Die Untersuchung thermophiler Organismen bringt einige
Probleme mit sich. So können gekoppelte Enzymtests nicht eingesetzt werden, da sie mit
mesophilen Hilfsenzymen arbeiten und diese bei hohen Temperaturen nicht aktiv sind.
Photometrische Enzymtests im Wasserbad sind nur bis etwa 80°C möglich, bei höheren
Temperaturen muss ein Glycerinbad verwendet werden. Auch die Stabilität zahlreicher
Verbindungen (wie z. B. ATP) ist bei hohen Temperaturen eingeschränkt; eine ausreichende
Konzentration an benötigten Substraten muss in Enzymtests gewährleistet sein.
EINLEITUNG
4.
Organismen
4.1
Bakterien
13
Aus dem Reich der Bakterien wurde als einziger Vertreter Chloroflexus aurantiacus in
dieser Arbeit näher untersucht. Weitere Vertreter der Bakterien, deren CO2-Fixierungswege
bekannt sind, dienten als Referenzorganismen. Dies waren: Ralstonia eutropha (Familie
Burkholderiaceae, β-Gruppe der Proteobakterien), Desulfobacterium autotrophicum und
Desulfobacter hydrogenophilus (beide Familie Desulfobacteraceae, δ-Gruppe der
Proteobakterien).
4.1.1 Chloroflexus aurantiacus
Beim phototrophen Bakterium Chloroflexus aurantiacus Stamm OK-70-fl handelt es
sich um ein gramnegatives Bakterium, das unter thermophilen Bedingungen lebt. Es gehört
zur Familie der Chloroflexaceae und wird der Gruppe der grünen Nichtschwefelbakterien
zugeordnet. Die phylogenetische Position dieser Gruppe ist nahe dem Ursprung des
Bakterien-Stammbaums (siehe Abbildung 5). Chloroflexus kann damit als eine sehr
ursprüngliche Gattung angesehen werden, ihre phylogenetische Distanz zu anderen photosynthetischen Bakterien ist relativ hoch. C. aurantiacus wurde als Modellorganismus für den
Ursprung der Photosynthese herangezogen.
Der Stamm OK-70-fl wurde aus einer heißen Quelle des Ka-Nee-Ta-Fluss im „Warm
Spring India“ Reservat in Oregon (USA) isoliert (Pierson und Castenholz, 1974), C.
aurantiacus kommt aber ubiquitär in neutralen heißen Quellen vor (z. B. Yellowstone
National Park USA, heiße Quellen auf Island und Neuseeland). C. aurantiacus wächst
fakultativ autotroph bei einer optimalen Wachstumstemperatur von 55°C und einem pH-Wert
von 8,0 – 8,5. Optimales Wachstum erfolgt unter photoheterotrophen Bedingungen, aber auch
mit CO2 als alleiniger Kohlenstoffquelle ist gutes Wachstum zu beobachten. C. aurantiacus
wird auf einem mineralischen Minimalmedium gezüchtet, als Elektronendonor dient hier
molekularer Wasserstoff. In der Natur wächst der filamentöse, orangefarbene Organismus in
Gesellschaft mit Cyanobakterien und bildet große Mikrobenmatten aus, die sehr
wahrscheinlich autotroph wachsen (van der Meer et al., 2000). Eine elektronenmikroskopische Aufnahme von C. aurantiacus ist in Abbildung 7 zu sehen.
EINLEITUNG
14
Bakterien (Eubacteria)
Archaea (Archaebacteria)
Eukaryoten
Euryarchaeota
Purpurbakterien
(Proteobacteria)
Grampositive
Cyanobakterien
Chloroplasten
Tiere
Entamöben
Methanobacteriales
Archaeo- Halobacteriales Schleimpilze
globales
DesulfuroMethanococcales
Pilze
coccales
Crenarchaeota
Thermoproteales
Flavobakterien
Thermococcales
Sulfolobales
Grüne Schwefelbakterien
Chloroflexus
Nanoarchaeota
Thermoplasmatales
Pflanzen
Methanopyrales
Ciliaten
Flagellaten
Nanoarchaeum
Aquifex
Mikrosporidien
Diplomonaden
Abb. 5: Universeller phylogenetischer Stammbaum, abgeleitet von 16S- und 18S-rRNASequenzen. Der Stammbaum zeigt die Stellung von Chloroflexus innerhalb der Bakterien und die
einzelnen Zweige der Archaea (modifiziert nach Burggraf et al., 1997; Madigan et al., 2000).
4.2
Archaea
Neben den Bakterien bilden die Archaea das zweite große Organismenreich der
Prokaryoten. Phylogenetisch nehmen sie eine Zwischenstellung zwischen Eukaryoten und
Bakterien ein (siehe Abbildung 5). Zu den Archaea zählen ubiquitär vorkommende
Organismen, die häufig extreme Lebensräume besiedeln. Die Archaea werden in drei Phyla
eingeteilt, die Crenarchaeota, die Euryarchaeota und die Nanoarchaeota. Ein viertes Phylum,
die Korarchaeota, wird postuliert, allerdings gelang es bisher noch nicht, einen Vertreter
dieses Phylums zu isolieren, lediglich Gensequenzen aus Umweltproben geben Hinweise auf
dessen Existenz.
4.2.1 Crenarchaeota
In dieser Arbeit wurden neben C. aurantiacus nur Organismen der Crenarchaeota
untersucht. Aus diesem Phylum wurden bisher mit einer Ausnahme nur thermophile und
hyperthermophile Organismen isoliert. Vertreter der Crenarchaeota findet man vor allem in
vulkanischen Gebieten, wie heißen Quellen, Tiefseeschloten („Black Smokers“), oder
EINLEITUNG
15
Solfataren (heiße, schwefelhaltige Schlämme und Böden). Zusätzlich zu Anpassungen an
hohe Temperaturen findet man oft Anpassungen an saure pH-Werte (z. B. bei den Vertretern
der Sulfolobaceae). Innerhalb der Crenarchaeota findet man 3 Ordnungen mit insgesamt 5
Familien, die ausschließlich thermophile Organismen beinhalten: die Desulfurococcales (mit
den Familien Pyrodictiaceae und Desulfurococcaceae), die Sulfolobales (Familie
Sulfolobaceae) und die Thermoproteales (Familien Thermoproteaceae und Thermofiliaceae).
Der einzige nichtthermophile Vertreter der Crenarchaeota „Cenarchaeum symbiosum“ gehört
zu einer eigenen Ordnung (Cenarchaeales) (Preston et al., 1996). Eine Übersicht über die
Phylogenie der Crenarchaeota geben die Abbildungen 5 und 6. In Abbildung 6 sind alle in
dieser Arbeit untersuchten Organismen hervorgehoben. Elektronenmikroskopische
Aufnahmen einzelner Vertreter zeigt Abbildung 7. Im Folgenden werden die untersuchten
Organismen kurz vorgestellt.
Hyperthermus butylicus
Pyrodictiaceae
Pyrodictium occultum
Pyrodictium abyssi
Pyrolobus fumarii
Thermosphaera aggregans
Desulfurococcus mobilis
Sulfophobococcus zilligii
Staphylothermus marinus
Desulfurococcaceae
Ignicoccus pacificus
Ignicoccus islandicus
Thermodiscus maritimus
Aeropyrum pernix
Stetteria hydrogenophila
Metallosphaera sedula
Acidianus brierleyi
Acidianus ambivalens
Acidianus infernus
Sulfolobaceae
Sulfolobus solfataricus
Sulfolobus sp. VE 6
Sulfolobus acidocaldarius
Stygiolobus azoricus
Sulfolobus metallicus
Pyrobaculum islandicum
Thermoproteus neutrophilus
Thermoproteus tenax
Thermofilum pendens
Thermoproteaceae
Thermofilaceae
0,1
Abb. 6: Phylogenetischer Stammbaum der Crenachaeota, abgeleitet von 16S-rRNA-Sequenzen.
Es sind die fünf Familien mit thermophilen Vertretern dargestellt. Organismen, bei denen autotrophes
Wachstum nachgewiesen ist, sind rot dargestellt, die in dieser Arbeit verwendeten Organismen sind
unterstrichen dargestellt. Die Länge des angegebenen Standards (0,1) entspricht 10 % Sequenzunterschied.
EINLEITUNG
16
Aus der Familie der Pyrodictiaceae wurden in dieser Arbeit zwei Vertreter untersucht:
Pyrodictium abyssi und Pyrodictium occultum. Beide Organismen sind an Temperaturen von
bis zu 110°C angepasst und wurden aus der Umgebung von „Black Smokers“ isoliert. Pd.
occultum wird als strikt chemolithoautotropher Organismus beschrieben (Stetter et al., 1983),
allerdings kann durch den Zusatz von geringen Mengen Hefeextrakt ein geringfügig
schnelleres Wachstum erreicht werden (mixotrophes Wachstum). Die Energie gewinnt Pd.
occultum aus der Reduktion von elementarem Schwefel mit molekularem Wasserstoff
(Wasserstoff-Schwefel-Autotrophie). Wachstum ist in einem Temperaturbereich von 95° –
110°C möglich, optimales Wachstum findet bei 105°C statt. Im Gegensatz zu Pd. occultum
wurde Pd. abyssi zunächst als strikt heterotropher Organismus beschrieben (Pley et al., 1991).
Neuere Untersuchungen zeigten allerdings, dass auch Pd. abyssi über Wasserstoff-SchwefelAutotrophie vollkommen autotroph wachsen kann (H. Huber, Universität Regensburg,
mündliche Mitteilung). Wachstum findet in einem Temperaturbereich von 80° – 110°C statt,
optimales Wachstum bei 97°C. Beide Pyrodictium spp. wachsen strikt anaerob.
Aus der Familie der Desulfurococcaceae wurden die beiden Vertreter Ignicoccus
islandicus und Ignicoccus pacificus untersucht. Beide Organismen sind strikte Anaerobier
und wachsen obligat chemolithoautotroph. Sie sind damit die einzigen bisher bekannten
autotrophen Vertreter dieser Familie (Abbildung 6) (Huber et al., 2000). Sie wurden ebenfalls
aus der Umgebung von „Black Smokers“ isoliert, allerdings aus völlig verschiedenen
Gegenden, nämlich aus dem Atlantik nördlich von Island und vom Ostpazifischen Rücken.
Die Energiegewinnung erfolgt über die Reduktion von Schwefel mit Wasserstoff, Wachstum
erfolgt über einen Temperaturbereich von 70° – 98°C, mit einem Optimum bei 90°C.
Aus der Familie der Sulfolobaceae wurden mit Acidianus ambivalens, Metallosphaera
sedula und Sulfolobus sp. Stamm VE 6 drei Organismen untersucht. Bei M. sedula handelt es
sich um unseren Modellorganismus aus dieser Familie, daher wurde er in größerem Maßstab
gezüchtet und auch für die Enzymreinigung der Carboxylasen und die 13C-Markierungsstudien herangezogen. M. sedula wächst thermophil zwischen 50° und 80°C, das Temperaturoptimum beträgt 75°C. Alle Vertreter der Sulfolobaceae sind acidophil, so wächst M. sedula
in einem pH-Bereich von 1,0 – 4,5 (Optimum 2,0) (Huber et al., 1989). Bezüglich der
Kohlenstoffquelle ist sowohl heterotrophes Wachstum mit Hefeextrakt oder anderen
organischen Verbindungen, als auch autotrophes Wachstum mit CO2 möglich. M. sedula
wächst strikt aerob, dabei wird beim chemolithoautotrophen Wachstum die Energie aus der
Knallgasreaktion bezogen, der Reduktion von Sauerstoff mit Wasserstoff (Huber et al., 1992).
Sulfolobus sp. VE 6 ist nahe verwandt mit Sulfolobus solfataricus (Abbildung 6).
EINLEITUNG
17
Metallosphaera
Chloroflexus
Acidianus
Pyrobaculum
Ignicoccus
Pyrodictium
Abb. 7: Elektronenmikroskopische Aufnahmen der untersuchten Organismen. Die Aufnahmen
wurden mir freundlicherweise von Dr. Jochen Golecki, Universität Freiburg, (Chloroflexus und
Metallosphaera) und Dr. Harald Huber, Universität Regensburg, (Acidianus, Ignicoccus, Pyrobaculum
und Pyrodictium) zur Verfügung gestellt. Pyrodictium ist sowohl im Dünnschnitt, als auch als
rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Zellen im typischen netzartigen Verbund gezeigt.
EINLEITUNG
18
Der Stoffwechsel entspricht dem von M. sedula, sowohl chemoorganoheterotrophes als auch
chemolithoautotrophes Wachstum ist möglich. Sulfolobus sp. VE 6 wächst in einem
Temperaturbereich von 70° – 93 °C (Optimum 90°C) und ist damit ein hyperthermophiler
Organismus (H. Huber, Universität Regensburg, mündliche Mitteilung). Bei A. ambivalens
handelt es sich um einen weiteren hyperthermophilen Vertreter der Sulfolobaceae. Im
Gegensatz zu M. sedula und Sulfolobus kann A. ambivalens auch anaerob wachsen. A.
ambivalens ist obligat chemolithoautotroph, aerob gewinnt er die Energie aus der Knallgasreaktion, anaerob aus der Reduktion von Schwefel mit Wasserstoff (Zillig et al., 1986; Fuchs
et al., 1996). Die Wachstumstemperatur beträgt 70° – 87°C, mit einem Optimum von 80°C.
Aus der Familie der Thermoproteaceae wurde Pyrobaculum islandicum untersucht.
Dabei handelt es sich um einen Organismus, der schon aus verschiedenen heißen Quellen
weltweit isoliert wurde (Island, Azoren, Italien) und zwischen 74° und 102°C (Optimum
100°C) wächst (Huber et al., 1987). Der strikt anaerobe Organismus wächst fakultativ
chemolithoautotroph über die Reduktion von Schwefel mit Wasserstoff. Die Zellen sind im
aktiven Zustand extrem sauerstoffempfindlich. Im Gegensatz dazu kann Pyrobaculum
aerophilum, ein nahe verwandter Organismus, auch aerob wachsen.
4.2.2 Euryarchaeota
Zum Phylum der Euryarchaeota gehören u. a. die methanbildenden Mikroorganismen.
Diese sind phylogenetisch nicht einheitlich und verteilen sich über mehrere Ordnungen
(Methanobacteriales, Methanococcales, Methanopyrales). Eine weitere wichtige Ordnung
sind die Halobacteriales. Hierbei handelt es sich um Archaea, die an extrem hohe Salzgehalte
angepasst sind. Darüber hinaus findet man drei weitere Ordnungen innerhalb der
Euryarchaeota (die Archaeoglobales, Thermoplasmatales und Thermococcales). Sie
beinhalten sulfatreduzierende und denitrifizierende Organismen.
4.2.3 Nanoarchaeota
Erst vor kurzem wurde das Reich der Archaea um das Phylum der Nanoarchaeota
erweitert. Ein symbiotisch lebender Organismus „Nanoarchaeum equitans“ wurde entdeckt
(Huber et al., 2002). Dieser hyperthermophile und coccoide Organismus ist mit einem
Durchmesser von 0,4 µm sehr klein und lebt in Symbiose mit Ignicoccus sp. KIN 4/I, einem
Vertreter der Desulfurococcales (Crenarchaeota). Über die Art des Zusammenlebens ist bisher
EINLEITUNG
19
noch sehr wenig bekannt, allerdings scheint „N. equitans“ auf direkten Zell-Zell-Kontakt mit
Ignicoccus angewiesen zu sein (Huber et al., 2003a).
5.
CO2-Fixierungswege bei Archaea
Bei Organismen aus dem Phylum Euryarchaeota wurden schon viele Untersuchungen
zur autotrophen CO2-Fixierung durchgeführt. So wurden einige methanogene Mikroorganismen, wie Methanobacterium thermoautotrophicum (Fuchs und Stupperich, 1982),
Methanosarcina barkeri (Kenealy und Zeikus, 1982) oder Methanococcus maripaludis (Shieh
und Whitman, 1988) untersucht. Es wurde festgestellt, dass alle den reduktiven Acetyl-CoAWeg zur CO2-Fixierung nutzen (siehe auch Fuchs, 1989; Fuchs, 1990; Fuchs, 1994). Auch
innerhalb der Ordnung der Archaeoglobales ist dieser Weg verbreitet. Es wurde gezeigt, dass
sowohl der sulfatreduzierende Organismus Archaeoglobus lithotrophicus (Vorholt et al.,
1995), wie auch der denitrifizierende Organismus Ferroglobus placidus (Vorholt et al., 1997)
den reduktiven Acetyl-CoA-Weg nutzen. Innerhalb der Ordnungen Halobacteriales und
Thermococcales sind keine autotroph wachsenden Organismen bekannt. Unter den
Thermoplasmatales kennt man einen Vertreter der autotroph wächst, Ferroplasma
acidiphilum, allerdings ist hier der CO2-Fixierungsweg nicht untersucht. Alle bisher
untersuchten autotrophen Vertreter der Euryarchaeota nutzen den reduktiven Acetyl-CoAWeg zur CO2-Fixierung.
Mit Organismen des Phylum der Crenarchaeota fanden bisher nur wenige Untersuchungen zur autotrophen CO2-Fixierung statt, obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl
neuer Vertreter isoliert wurden, die autotroph wachsen können. Für einen Vertreter der
Thermoproteales, Thermoproteus neutrophilus, wurde der reduktive Citrat-Zyklus als CO2Fixierungsweg vorgeschlagen (Schäfer et al., 1986; Schäfer et al., 1989a; Schäfer et al.,
1989b; Strauss et al., 1992; Beh et al., 1993). Darüber hinaus gibt es Hinweise auf das
Vorhandensein eines modifizierten 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Vertretern der
Sulfolobales. So wurden bei A. brierleyi, S. metallicus und M. sedula Aktivitäten der CO2fixierenden Enzyme Acetyl-CoA-Carboxylase und Propionyl-CoA-Carboxylase gemessen
(Norris et al., 1989; Ishii et al., 1997; Burton et al., 1999; Menendez et al., 1999). Die AcetylCoA-Carboxylase katalysiert im Allgemeinen die erste Reaktion der Fettsäuren-Biosynthese.
Da Archaea keine Fettsäuren in ihren Lipiden besitzen, ist ein Vorhandensein der AcetylCoA-Carboxylase bei ihnen ungewöhnlich. Die Acetyl-CoA-Carboxylase könnte daher eine
Aufgabe in einem anderen Stoffwechselweg übernehmen, vermutlich bei der autotrophen
EINLEITUNG
20
CO2-Fixierung. Die Propionyl-CoA-Carboxylase Aktivität sollte ebenfalls nicht vorhanden
sein, da diese Organismen autotroph wachsen und nicht mit Propionat als Substrat. Weitere
Enzymaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus wurden in A. brierleyi und M. sedula
gemessen (Ishii et al., 1997; Menendez et al., 1999). So konnte in beiden Organismen eine
NADPH-abhängige Reduktion von Malonyl-CoA nachgewiesen werden, in M. sedula
zusätzlich die reduktive Bildung von Propionyl-CoA aus 3-Hydroxypropionat. Aus diesen
Gründen wurde für beide Organismen der 3-Hydroxypropionat-Zyklus postuliert.
6.
RubisCO bei Archaea
Verschiedene Vertreter der Archaea besitzen RubisCO-Proteine. So wurde aus einem
aeroben Vertreter der Halobacteriales, Haloferax mediterranei, eine funktionelle RubisCO
gereinigt (Altekar und Rajagopalan, 1990; Rajagopalan und Altekar, 1994). Dies ist
überraschend, da es sich um einen heterotroph wachsenden Organismus handelt. Auch in dem
heterotroph wachsenden, anaeroben Vertreter der Euryarchaeota, Thermococcus
kodakaraensis (früher Pyrococcus kodakaraensis), wurde ein RubisCO-Gen identifiziert,
welches in Escherichia coli funktionell überexprimiert werden konnte (Ezaki et al., 1999).
Dieses Protein wurde mittlerweile auch gereinigt und kristallisiert (Maeda et al., 1999; Atomi
et al., 2001; Kitano et al., 2001; Maeda et al., 2002). Neben diesen RubisCO-Proteinen
heterotropher Organismen fand man über Genomprojekte auch in autotrophen Euryarchaeota
RubisCO-Gene, so bei den thermophilen Organismen Archaeoglobus fulgidus (Klenk et al.,
1997) und Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996). Diese Organismen nutzen den
reduktiven Acetyl-CoA-Weg zur autotrophen CO2-Fixierung (Zellner et al., 1989; Sprott et
al., 1993). Auch die Genome der mesophilen Archaea Methanosarcina acetivorans (Galagan
et al., 2002), Methanosarcina mazei (Deppenmeier et al., 2002) und Methanosarcina barkeri
enthalten Gene, die möglicherweise für eine RubisCO codieren. Für A. fulgidus, M.
jannaschii und M. acetivorans konnte in jüngster Zeit auch eine RubisCO-Aktivität im
Zellextrakt nachgewiesen werden, die RubisCO-Gene von A. fulgidus, M. jannaschii, M.
acetivorans und M. barkeri konnten funktionell in E. coli überexprimiert werden (Finn und
Tabita, 2003). Bei Vertretern der Crenarchaeota wurde bisher weder eine RubisCO-Aktivität
noch ein RubisCO-Gen gefunden.
Die Funktion der RubisCO bei Archaea ist bisher nicht geklärt. Zum einen wurde sie in
Organismen gefunden, die ausschließlich heterotroph wachsen, oder zwar autotroph wachsen
können, aber über den reduktiven Acetyl-CoA-Weg CO2 fixieren; zum anderen konnten
EINLEITUNG
21
weitere Schlüsselenzyme des Calvin-Zyklus, wie die Phosphoribulokinase, in diesen
Organismen nicht nachgewiesen werden. Es ist daher sehr unwahrscheinlich, dass der CalvinZyklus zur autotrophen CO2-Fixierung genutzt wird.
Die untersuchten RubisCO-Enzyme der Archaea weisen eine neuartige pentagonale
Proteinstruktur auf und werden deshalb als RubisCO-Form III bezeichnet (Watson et al.,
1999; Maeda et al., 1999). Sie lassen sich durch Sauerstoff fast vollständig hemmen, wobei
diese Hemmung reversibel ist. Die RubisCO-Proteine der Form I und Form II sind
sauerstoffunempfindlich. Form I-Enzyme sind aus 8 großen und 8 kleinen Untereinheiten
aufgebaut, sind also Hexadecamere. Sie kommen in Pflanzen und Cyanobakterien, aber auch
in Proteobakterien vor. Form II-Enzyme sind Dimere und enthalten nur große Untereinheiten.
Sie kommen bei vielen phototrophen Bakterien vor. Bei den genannten RubisCO-Enzymen
der Formen I, II und III handelt es sich um aktive, CO2-fixierende Enzyme. Es wurden in der
Natur auch so genannte „RubisCO-ähnliche“ Proteine gefunden. Diese wurden als Form IV
bezeichnet und besitzen keine CO2-Fixierungsaktivität. Es gibt Hinweise darauf, dass Form
IV-Proteine im Schwefelstoffwechsel eine Rolle spielen könnten (Sekowska und Danchin,
2002), auch über eine Beteiligung an der Antwort auf oxidativen Stress wird nachgedacht
(Hanson und Tabita, 2001). Eine Übersicht über das Vorkommen der verschiedenen
RubisCO-Formen zeigt Abbildung 8.
Form I
Pflanzen Cyanobakterien
Rhodobacter sphaeroides
Purpurbakterien
Xanthobacter flavus
Mn-oxidierendes Bakterium
Cylindrotheca-N1
Rhodobacter sphaeroides
Olisthodiscus luteus
Rhodobacter capsulatus
Rhodospirillum
rubrum
Pyrococcus
horikoshii
Form III
Thiobacillus
denitrificans
Methanococcus
jannaschii
Form II
Hydrogenovibrio
marinus
Thermococcus
kodakaraensis
Archaeoglobus
fulgidus-2
0,1
Bacillus subtilis
Chlorobium tepidum
Chlorobium limicola
Archaeoglobus
fulgidus-1
Form IV
Abb. 8: Phylogenetischer Stammbaum der verschiedenen RubisCO-Formen. Es wurden
„Multiple Sequenz Alignments“ durchgeführt und graphisch dargestellt. Es sind dabei sowohl die
Aminosäuresequenzen von RubisCO-Proteinen (Form I-III), als auch die Sequenzen von RubisCOähnlichen Proteinen verwendet worden (Hanson und Tabita, 2001). Die Länge des angegebenen
Standards (0,1) entspricht 10 % Sequenzunterschied.
EINLEITUNG
7.
22
Ziele der Arbeit
Eine autotrophe sowie thermophile Lebensweise wird häufig als die ursprüngliche
Lebensweise auf der frühen Erde angesehen (z. B. Huber und Wächtershäuser, 1998).
Thermophile und hyperthermophile Organismen könnten daher Relikte eines heißen
Erdzeitalters sein. Sie kommen heute nur noch in vulkanischen Lebensräumen vor, sind aber
dennoch auf der Erde weit verbreitet. Das ubiquitäre Vorkommen von hyperthermophilen
Organismen untermauert die These einer wichtigen Rolle in frühen Erdzeitaltern. In den
vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl thermophiler Organismen isoliert, die vor allem dem
Phylum der Crenarchaeota angehören. Unter ihnen ist eine autotrophe Lebensweise weit
verbreitet. Über Art und Weise der CO2-Fixierung, sowie die Charakteristika der daran
beteiligten Enzyme war bisher wenig bekannt. Diese Arbeit soll erste Einblicke in die
faszinierende Welt der CO2-Fixierung bei diesen Organismen geben.
In dieser Arbeit wurden folgende Fragestellungen angegangen:
1.
Die Grundzüge des 3-Hydroxypropionat-Zyklus in C. aurantiacus waren bekannt,
allerdings sind noch keine Enzyme dieses neuartigen Stoffwechselwegs gereinigt und
charakterisiert worden. Dies ist jedoch eine Voraussetzung für den zweifelsfreien Nachweis
des CO2-Fixierungswegs. Es sollte daher eine Schlüsselreaktion, die zweistufige
Umwandlung von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd in 3-Hydroxypropionat,
untersucht werden. Die daran beteiligten Enzyme sollten gereinigt und charakterisiert, die
entsprechenden Gene kloniert und analysiert werden. Gleichzeitig mit dieser Arbeit wurden
weitere Schlüsselenzyme des Zyklus, die an der Umwandlung von 3-Hydroxypropionat in
Propionyl-CoA und an der Spaltung von Malyl-CoA beteiligt sind von Dr. Birgit Alber und
Sylvia Herter in unserer Arbeitsgruppe untersucht. Insgesamt sollte so das Bild des CO2Fixierungszyklus vervollständigt werden.
2.
Verschiedene Vertreter aus den Familien der Crenarchaeota sollten auf Aktivitäten von
Schlüsselenzymen bekannter CO2-Fixierungswege hin untersucht werden. Dadurch sollte
herausgefunden werden, welche der bekannten CO2-Fixierungswege in dieser Gruppe
vorkommen. Darüber hinaus sollten auch Hinweise auf weitere neuartige Stoffwechselwege
beachtet werden. Da die Züchtung dieser Organismen besondere Ausrüstung und besonderes
EINLEITUNG
23
Fachwissen erfordert, arbeiteten wir bei dieser Fragestellung mit Dr. Harald Huber und Prof.
Karl Otto Stetter von der Universität Regensburg zusammen. Sie stellten uns Zellmaterial
dieser zum Teil sehr mühsam zu züchtenden Organismen zur Verfügung.
3.
Im Zuge dieser oben genannten Enzymstudien wurde bei Vertretern der Gattung
Pyrodictium eine RubisCO-Enzymaktivität nachgewiesen. Diese Aktivität sollte weitergehend
charakterisiert werden. Auch die mögliche Existenz eines Calvin-Zyklus in dieser Familie
sollte untersucht werden.
4.
Bei Vertretern der Familie Sulfolobaceae wurden die Schlüsselenzyme des 3-Hydroxy-
propionat-Zyklus nachgewiesen. Der Zyklus sollte in M. sedula, unserem Modellorganismus,
näher charakterisiert werden. Hierzu sollte die Regulation der an der CO2-Fixierung
beteiligten Enzymaktivitäten betrachtet werden. Die Enzymaktivitäten in Extrakten autotroph
und heterotroph gewachsener Zellen sollten verglichen werden.
5.
Neben den Schlüsselenzymen des 3-Hydroxypropionat-Zyklus wurden bei M. sedula
auch die Enzymaktivitäten der α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und der Pyruvat:
Akzeptor-Oxidoreduktase nachgewiesen. Da es sich bei den beiden Oxidoreduktasen
eigentlich um Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus handelt, stellte sich die Frage
ihrer eventuellen Beteiligung an der autotrophen CO2-Fixierung in M. sedula. Zur Klärung
dieser Frage sollten 13C-Langzeitmarkierungsexperimente durchgeführt werden. Autotroph
wachsenden Zellen von M. sedula sollte 13C-Succinat angeboten werden. Die 13CMarkierungsmuster der Aminosäuren sollten über NMR analysiert werden. Aus diesen sollten
Aussagen über den Stoffwechselweg gemacht werden können. Die NMR-Analyse wurde in
Zusammenarbeit mit Dr. Wolfgang Eisenreich und Prof. Adelbert Bacher von der
Technischen Universität München durchgeführt.
6.
Aus Untersuchungen von Dr. Martina Jahn und Dr. Robert Krieger aus unserer
Arbeitsgruppe war bekannt, dass M. sedula die Gene für eine Acetyl-CoA-Carboxylase
besitzt. Dieses Enzym ist in Archaea ungewöhnlich, da es hier nicht für die Fettsäuresynthese
gebraucht wird. Daher vermuteten wir eine Beteiligung an der autotrophen CO2-Fixierung.
Die Acetyl-CoA- und auch die Propionyl-CoA-Carboxylase sollten aus M. sedula gereinigt
und charakterisiert werden. Dabei sollte herausgefunden werden, ob zwei Enzyme vorhanden
sind, oder ob beide Carboxylierungsreaktionen von einem Enzym katalysiert werden.
MATERIAL UND METHODEN
24
MATERIAL UND METHODEN
1.
Material
Chemikalien und Biochemikalien. Chemikalien und Biochemikalien wurden von den
Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Deisenhofen), Serva
(Heidelberg), Roth (Karlsruhe), Applichem (Darmstadt), Gerbu (Gaiberg), Roche Diagnostics
(Mannheim), Bio-Rad (München) und Amersham Biosciences (Freiburg) bezogen.
Enzyme. Enzyme stammten von MBI Fermentas (St. Leon-Rot), New England Biolabs
(Frankfurt), Stratagen (Amsterdam, Niederlande) und Eppendorf (Wesseling-Berzdorf).
Gase. Alle Gase und Gasgemische wurden von den Sauerstoffwerken Friedrichshafen
bezogen.
Isotopenmarkierte Verbindungen. Natrium-[14C]-carbonat (spezifische Aktivität 2,1 GBq
mmol-1) und [2-14C]-Malonyl-CoA (spezifische Aktivität 2,0 GBq mmol-1) wurden von der
Firma Amersham Biosciences (Freiburg) bezogen. [1,4-14C]-Succinat (spezifische Aktivität
1,9 GBq mmol-1) stammte von der Firma American Radiolabeled Chemicals (USA).
Chromatographiematerial. Materialien für die HPLC-Analyse stammten von Merck
(Darmstadt) und Waters (Eschborn). Die Ausrüstung und das Material für die Proteinreinigung wurden von den Firmen Amersham Biosciences (Freiburg), Sigma-Aldrich
(Deisenhofen) und Millipore (Eschborn) bezogen.
Reagenziensätze. „Topo TA Cloning Kit“ stammte von der Firma Invitrogen (Karlsruhe),
„E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit“ und „E.Z.N.A. Gel Extraction Kit“ wurden von der Firma
Peqlab (Erlangen) bezogen.
Plasmide. Es wurde das Plasmid pCRII-TOPO (Genotyp ampR, kanR, lacZQ) von der Firma
Invitrogen (Karlsruhe) verwendet.
Primer. Die verwendeten Oligonukleotide wurden von Dr. Gabor Igloi (Institut für Biologie
III, Universität Freiburg), oder von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) synthetisiert. Die
Primer für Sequenzierungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Verwendete Primer.
Bezeichnung
Mcr-for
Mcr-Start
Mcr-End
M13-rev
M13-for
Sequenz
5´-TGCTCTATCTCAACTTGCTGCGC-3´
5´-ATGAGCGGAACAGGACGACTGG-3´
5´-TTACACGGTAATCGCCCGTC-3´
5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´
5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´
MATERIAL UND METHODEN
2.
Organismenstämme und Züchtung
2.1
Organismenstämme
25
Folgende Organismenstämme wurden verwendet: Acidianus ambivalens (DSMZ 3772),
Chloroflexus aurantiacus OK-70-fl (DSMZ 636), Desulfobacterium autotrophicum (DSMZ
3382), Desulfobacter hydrogenophilus (DSMZ 3380), Escherichia coli K12 (DSMZ 423),
Ignicoccus islandicus (DSMZ 13165), Ignicoccus pacificus (DSMZ 13166), Metallosphaera
sedula (DSMZ 5348), Pyrobaculum islandicum (DSMZ 4184), Pyrodictium abyssi (DSMZ
6158), Pyrodictium occultum (DSMZ 2709), Ralstonia eutropha JPM 134 (DSMZ 4058) und
Sulfolobus sp. Stamm VE 6 (von Dr. Harald Huber, Universität Regensburg).
Für die Klonierungsexperimente wurden E. coli TOP10-Zellen der Firma Invitrogen
(Karlsruhe) verwendet (Genotyp: F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74
recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG).
2.2
Züchtung von Chloroflexus aurantiacus
C. aurantiacus OK-70-fl wurde bei 55°C und einem pH-Wert von 8,0 in einem 12 L
Glasfermenter sowohl unter photoautotrophen, als auch unter photoheterotrophen
Bedingungen gezüchtet.
Wachstum unter photoautotrophen Bedingungen. Um photoautotrophes Wachstum zu
erreichen, wurde C. aurantiacus unter anaeroben Bedingungen auf einem mineralischen
Minimalmedium gezüchtet, welches mit Vitaminen und Spurenelementen supplementiert, und
mit einem Gasgemisch aus H2 und CO2 (80 %, 20 % (v/v)) begast wurde. Die für das
Wachstum benötigte Energie bezog C. aurantiacus dabei aus dem Licht, Elektronen
stammten aus molekularem Wasserstoff, Kohlenstoff ausschließlich aus CO2. Das Medium
bestand aus folgenden Komponenten: Grundmedium, Spurenelemente, Vitamine, Eisenlösung, Natriumsulfidlösung und Ammoniumchlorid (nach Strauss und Fuchs, 1993).
Grundmedium (20fach). Nitrilotriessigsäure (2 g L-1), CaCl2 x 2 H2O (1 g L-1), MgSO4 x 7
H2O (2 g L-1), NaCl (0,16 g L-1), K2HPO4 (2,4 g L-1). Die Nitrilotriessigsäure wurde zunächst
in dest. Wasser unter Erwärmen gelöst, dann die weiteren Komponenten dazugegeben.
Spurenelementelösung (50fach). H2SO4 (2,5 mL L-1), MnSO4 x 7 H2O (11,4 g L-1), ZnSO4 x 7
H2O (2,5 g L-1), H3BO3 (2,5 g L-1), CuSO4 x 5 H2O (125 mg L-1), Na2MoO4 x 2 H2O (125 mg
L-1), CoCl2 x 6 H2O (225 mg L-1).
Vitaminlösung (1000fach). Thiamin/HCl (0,9 g L-1), Biotin (0,2 g L-1), Folsäure (0,8 g L-1),
Vitamin B12 (0,5 g L-1). Die Lösung wurde steril filtriert und bei 4°C vor Licht geschützt
aufbewahrt.
Eisenlösung (1000fach). FeCl3 x 6 H2O (2,9 g L-1). Die Lösung wurde steril filtriert.
Natriumsulfidlösung (200fach). Na2S x 9 H2O (40 g L-1).
12 L Ansatz. Für die Anzucht im Fermenter wurden 12 L Medium angesetzt. Hierzu wurden
7,2 g Ammoniumchlorid in 600 mL Grundmedium gelöst und mit Wasser auf ein
Endvolumen von 12 L aufgefüllt. Der pH-Wert von 8,0 wurde mit 6 M NaOH eingestellt und
die Lösung autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen wurden anschließend 240 mL
Spurenelementelösung, 12 mL Eisenlösung, 12 mL Vitaminlösung und 60 mL Natriumsulfidlösung zugegeben. Um anaerobe Bedingungen zu erhalten wurde der befüllte und
autoklavierte Fermenter mit dem H2/CO2-Gasgemisch bei einer Flussrate von 100 mL min-1
für 30 min unter Rühren durchgast. Vor dem Animpfen wurde der pH-Wert mit steriler 6 M
NaOH erneut eingestellt. Der Fermenter wurde mit 2 – 5 % (v/v) einer Vorkultur (gewachsen
MATERIAL UND METHODEN
26
in 100 mL Glasflaschen, im gleichen Medium) angeimpft. Das Wachstum fand unter
ständiger Begasung mit dem erwähnten Gasgemisch statt (50 – 150 mL min-1), für die
Belichtung sorgten 6 Glühbirnen (60 Watt). Die Lichtintensität betrug 10.000 – 12.000 Lux.
Wachstum unter photoheterotrophen Bedingungen. Um Wachstum unter photoheterotrophen Bedingungen zu erhalten, wurde C. aurantiacus auf einem Minimalmedium
gezüchtet, dem Casaminosäuren (0,25 % (w/v)), Hefeextrakt (0,1 % (w/v)) und Spurenelemente zugesetzt wurden. C. aurantiacus bezog dabei die Energie aus dem Licht, die
Elektronen und der assimilierte Kohlenstoff stammten aus organischen Quellen. Das mit
Glycylglycin gepufferte Medium bestand aus folgenden Komponenten: Casaminosäuren,
Hefeextrakt, Glycylglycin/Na+-Puffer, Grundmedium, Spurenelemente-, Vitamin- und
Eisenlösung.
Grundmedium (10fach). EDTA (1g L-1), CaSO4 x 2 H2O (0,6 g L-1), MgSO4 x 7 H2O (1g L-1),
NaCl (0,08 g L-1), Na2HPO4 (1,11 g L-1).
Spurenelementelösung (2000fach). MnSO4 x 7 H2O (2,28 g L-1), ZnSO4 x 7 H2O (0,5 g L-1),
H3BO3 (0,5 g L-1), CuSO4 x 5 H2O (25 mg L-1), Na2MoO4 x 2 H2O (25 mg L-1), CoCl2 x 6
H2O (45 mg L-1).
Vitaminlösung (800fach). Vitamin B12 (80 mg L-1), Thiamin/HCl (24 mg L-1), Nikotinsäure
(400 mg L-1), 4-Aminobenzoesäure (40 mg L-1), Biotin (80 mg L-1), Calcium-DPantothensäure (40 mg L-1), Pyridoxal/HCl (8 mg L-1), Myoinosit (400 mg L-1), Riboflavin (8
mg L-1), Folsäure (80 mg L-1). Die einzelnen Komponenten wurden nacheinander in Wasser
gelöst, und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde steril filtriert und bei 4°C vor
Licht geschützt aufbewahrt.
Eisenlösung (1000fach). FeCl3 x 6 H2O (2,9 g L-1).
12 L Ansatz. Im Fermenter wurden 1,2 L Grundmedium, 12 g Hefeextrakt, 30 g Casaminosäuren, 6 g Glycylglycin und 6 mL Spurenelementelösung mit Wasser auf 12 L aufgefüllt.
Der pH-Wert wurde mit 6 M NaOH eingestellt (pH 8,0) und die Lösung autoklaviert.
Anschließend wurden steril 15 mL Vitaminlösung und 12 mL Eisenlösung zugegeben. Im
Gegensatz zur photoautotrophen Züchtung wurde der Fermenter mit Stickstoffgas
anaerobisiert und während des Wachstums nicht begast.
Generationszeiten. Für das Wachstum von C. aurantiacus unter photoautotrophen
Bedingungen betrug die Generationszeit während der exponentiellen Wachstumsphase 17 –
24 h, zum Zeitpunkt der Zellernte lag sie bei 26 – 40 h. Unter photoheterotrophen
Bedingungen verdoppelten sich die Zellen während der exponentiellen Phase innerhalb von 3
h, zum Zeitpunkt der Ernte innerhalb von 6 – 10 h.
Zellernte und Zelllagerung. Die Zellen wurden bei einer OD578nm von 3,5 – 4,0
abzentrifugiert (20 min, 6000 g, 4°C) und das Zellpellet in flüssigem Stickstoff bis zur
Weiterverarbeitung gelagert.
2.3
Züchtung von Metallosphaera sedula
M. sedula wurde mikroaerob bei 75°C und einem pH-Wert von 2,0 gezüchtet. Die
Zellzucht erfolgte in einem 200 L Edelstahlfermenter (Bioengineering, Wald, Schweiz),
Vorkulturen wurden in 2 L Glasfermentern angezogen. Die Zellen wurden sowohl unter
chemolithoautotrophen, als auch unter chemoorganoheterotrophen Bedingungen gezüchtet.
Wachstum unter autotrophen Bedingungen. Um autotrophes Wachstum von M. sedula zu
erreichen wurde ein mineralisches Minimalmedium verwendet, das mit Spurenelementen
MATERIAL UND METHODEN
27
supplementiert und mit einem Gasgemisch aus H2, CO2 und O2 (78 %, 19 %, 3 % (v/v))
begast wurde. Die Zellen bezogen dabei die Energie aus der Oxidation von Wasserstoff mit
Sauerstoff (Knallgasreaktion). Der Zellkohlenstoff wurde aus CO2 bezogen, die benötigten
Elektronen stammten aus Wasserstoff. Das Medium setzte sich aus folgenden Komponenten
zusammen: Grundmedium, Spurenelementelösung und Eisenlösung.
Grundmedium (10fach). KH2PO4 (4,0 g L-1), (NH4)2SO4 (13 g L-1), MgSO4 x 7 H2O (4,0 g
L-1), CaCl2 x 2 H2O (0,7 g L-1). Der pH-Wert wurde mit 5 M H2SO4 auf einen Wert von 2,0
eingestellt.
Spurenelementelösung (1000fach). MnCl2 x 4 H2O (1,8 g L-1), H3BO4 (150 mg L-1), ZnSO4 x
7 H2O (220 mg L-1), CuCl2 x 2 H2O (250 mg L-1), Na2MoO4 x 2 H2O (30 mg L-1), VOSO4 x 7
H2O (30 mg L-1), CoCl2 x 6 H2O (100 mg L-1), KJ (200 mg L-1), KAl(SO4)2 x 12 H2O (1,75 g
L-1).
Eisenlösung (1000fach). FeCl3 x 6 H2O (20 g L-1).
200 L Ansatz. Der 200 L Gesamtansatz beinhaltete 20 L Grundmedium, 200 mL
Spurenelementelösung und 200 mL Eisenlösung. Der pH-Wert sollte 2,0 betragen, falls nötig
wurde mit 6 M NaOH nachjustiert. Die Lösung wurde im Fermenter autoklaviert und
anschließend mit dem Gasgemisch bei einer Flussrate von 1 – 5 L min-1 begast.
Wachstum unter heterotrophen Bedingungen. Um heterotrophes Wachstum von M. sedula
zu erreichen wurde ein mineralisches Minimalmedium verwendet, dem Hefeextrakt,
Spurenelementelösung und Eisenlösung zugesetzt wurden, und das mit Pressluft begast
wurde. Die Zellen wuchsen mikroaerob, als Energie- und Kohlenstoffquelle diente
Hefeextrakt. Das Medium bestand aus folgenden Komponenten: Grundmedium, Hefeextrakt,
Spurenelementelösung und Eisenlösung. Das Grundmedium, die Spurenelementelösung und
die Eisenlösung entsprachen den Lösungen, die für die autotrophe Zellzüchtung verwendet
wurden.
200 L Ansatz. Der 200 L Gesamtansatz beinhaltete 20 L Grundmedium, 200 mL
Spurenelementelösung, 200 mL Eisenlösung sowie 100 g Hefeextrakt (0,05 %
Endkonzentration). Die Lösung wurde im Fermenter autoklaviert und anschließend mit
Pressluft bei einer Flussrate von 0,5 – 1,5 L min-1 begast.
Generationszeiten. Die Generationszeit von M. sedula betrug in der exponentiellen Phase 8 –
16 h. Diese Generationszeit wurde sowohl bei Wachstum unter autotrophen, als auch unter
heterotrophen Bedingungen erreicht. Die Zellernte fand während der exponentiellen
Wachstumsphase statt.
Zellernte und Zelllagerung. Die Zellen wurden bei einer OD578 nm von 0,2 – 0,3 geerntet. Die
Zentrifugation erfolgte in einer Durchlaufzentrifuge (CEPA, Typ Z41-101, Lahr) bei 20.000
U min-1 und einer Flussrate von 1 L min-1. Das Zellpellet wurde in flüssigem Stickstoff bis
zur weiteren Verwendung gelagert.
Wachstum mit [1,4-13C1]-Succinat. Für 13C-Langzeit-Markierungsstudien wurde M. sedula
unter autotrophen Bedingungen in der Gegenwart von [1,4-13C1]-Succinat gezüchtet. Die
Züchtung erfolgte dabei in einem 10 L Glasfermenter. Ab einer OD578nm von 0,1 wurde über
eine Braun-Pumpe (Perfusor F; B.Braun, Melsungen) [1,4-13C1]-Succinat zugeführt. Die
Zufütterungsrate von Succinat wurde so eingestellt, dass maximal 10 % des Zellkohlenstoffs
aus Succinat stammten, der Rest wurde aus CO2 aufgebaut. So sollte sichergestellt werden,
dass M. sedula autotroph wuchs und nicht auf heterotrophe Succinat-Assimilierung umstellte.
MATERIAL UND METHODEN
28
Insgesamt wurden 600 µmol [1,4-13C1]-Succinat mit einer Rate von 15 – 30 µmol h-1
zugeführt. Die Zellernte erfolgte bei einer OD578 nm von 0,25.
2.4
Züchtung von Ralstonia eutropha
R. eutropha wurde aerob bei 25°C auf Fructose-Minimalmedium gezüchtet (nach
Friedrich et al., 1979). Zusätzlich wurden dem Medium Natriumbicarbonat und
Natriumformiat zugesetzt, da hierdurch eine höhere RubisCO-Aktivität erreicht wurde. Unter
diesen Bedingungen wuchs R. eutropha schneller als unter autotrophen Bedingungen, die
Enzyme des Calvin-Zyklus wurden dennoch ausreichend exprimiert. Dem Grundmedium
wurden nach dem Autoklavieren Spurenelemente und Fructose zugesetzt. Die Züchtung
erfolgte in 1 L Erlenmeyerkolben.
Grundmedium. Na2HPO4 x 12 H2O (9 g L-1), KH2PO4 (1,5 g L-1), NH4Cl (1 g L-1), MgSO4 x 7
H2O (0,2 g L-1), NaHCO3 (1 g L-1), Natriumformiat (0,2 g L-1), CaCl2 x 2 H2O (10 mg L-1),
Eisen(III)Ammoniumcitrat (5 mg L-1), Spurenelementelösung SL-6 (1 mL L-1).
Spurenelementelösung SL-6 (1000fach). ZnSO4 x 7 H2O (100 mg L-1), MnCl2 x 4 H2O (30 mg
L-1), H3BO3 (300 mg L-1), CoCl2 x 6 H2O (200 mg L-1), CuCl2 x 2 H2O (10 mg L-1), NiCl2 x
6 H2O (20 mg L-1), Na2MoO4 x 2 H2O (30 mg L-1).
Fructose-Lösung (50fach). Es wurden 5 g Fructose in 20 mL Wasser gelöst und steril filtriert.
Zellernte und Zelllagerung. Die Zellen wurden bei einer OD578nm von 1,5 – 2,0 geerntet,
abzentrifugiert (20 min, 6000 g, 4°C) und in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung
aufbewahrt.
2.5
Züchtung von Desulfobacterium autotrophicum und Desulfobacter hydrogenophilus
Die sulfatreduzierenden Bakterien D. autotrophicum und D. hydrogenophilus wurden
anaerob auf einem marinen Mineralsalzmedium gezüchtet (Schauder et al., 1987; Länge et al.,
1989). Molekularer Wasserstoff diente als Elektronendonor, CO2 als alleinige Kohlenstoffquelle. Die Zellen wurden im unserem Labor vor längerer Zeit gezüchtet und mir freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Lagerung der Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff.
2.6
Züchtung von Acidianus ambivalens, Ignicoccus islandicus, Ignicoccus pacificus,
Pyrobaculum islandicum, Pyrodictium abyssi, Pyrodictium occultum und Sulfolobus
sp. VE 6
Die hyperthermophilen Crenarchaeoten I. islandicus, I. pacificus, Pb. islandicum, Pd.
abyssi, Pd. occultum und Sulfolobus sp. VE 6 wurden unter autotrophen Bedingungen von Dr.
Harald Huber (Universität Regensburg) gezüchtet und mir freundlicherweise zur Verfügung
gestellt. Zellen von A. ambivalens wurden mir freundlicherweise von Dr. Arnulf Kletzin (TU
Darmstadt) zur Verfügung gestellt. Die Bedingungen der Zellzüchtung sind in den Referenzen
in Tabelle 2 angegeben. Die Berechnung der spezifischen CO2-Fixierungsrate erfolgte nach
der Gleichung dS/dt = (µ/Y) X. Dabei steht S für die Menge assimiliertem CO2 (in mol) und t
für die Zeit. µ ist die spezifische Wachstumsrate, Y der Wachstumsertrag und X die
Zellmasse der Kultur. Es wird davon ausgegangen, dass 50 % der Zelltrockenmasse
Kohlenstoff sind. Ein Gramm Trockenmasse beinhaltet ca. 0,5 g Protein. Diese Annahmen
stimmen bei allen Bakterien, sofern sie nicht große Mengen an kohlenstoffhaltigem
Speichermaterial aufbauen. In diesem Falle würde die berechnete Rate zu klein ausfallen.
Werden dagegen andere Speicherstoffe, wie Polyphosphaten oder Schwefel angelegt, so
stimmt die berechnete Rate.
MATERIAL UND METHODEN
29
Tabelle 2: Mikroorganismen, die auf Schlüsselenzyme von autotrophen CO2-Fixierungswegen untersucht wurden und ihre Wachstumseigenschaften.
Stamm
Familie
Wachstumstemperatur
in °C
(Optimum)
Substrate
Elektronenakzeptor
Ungefähre
Generationszeit (h)
Acidianus ambivalens
(DSMZ 3772)
Chloroflexus
aurantiacus OK-70-fl
(DSMZ 636)
Desulfobacterium
autotrophicum
(DSMZ 3382)
Desulfobacter
hydrogenophilus
(DSMZ 3380)
Ignicoccus islandicus
(DSMZ 13165)
Ignicoccus pacificus
(DSMZ 13166)
Metallosphaera sedula
(DSMZ 5348)
Pyrobaculum
islandicum
(DSMZ 4184)
Pyrodictium abyssi
(DSMZ 6158)
Sulfolobaceae
85 (85)
H2 / CO2
S0
Chloroflexaceae
55 (55)
H2 / CO2
Desulfobacteriaceae
28 (28)
Desulfobacteriaceae
CO2-Fixierungsweg
Referenz für
Wachstumsbedingungen
8
Berechnete
spezifische CO2 Fixierungsrate
(nmol min-1
(mg protein)-1)
120
unbekannt
26
40
H2 / CO2
anaerobes,
phototrophes
Wachstum
SO42-
20
48
30 (30)
H2 / CO2
SO42-
16
60
3-Hydroxypropionat
Zyklus
Reductiver
Acetyl-CoA
Weg
Reduktiver
Citrat-Zyklus
Zillig et al.,
1986
Strauss and
Fuchs, 1993
Desulfurococcaceae
90 (90)
H2 / CO2
S0
1,7
560
unbekannt
Desulfurococcaceae
90 (90)
H2 / CO2
S0
1,6
600
unbekannt
Sulfolobaceae
75 (75)
H2 / CO2
O2
8
120
unbekannt
Thermoproteaceae
90 (100)
H2 / CO2
S0
4,5
210
unbekannt
Pyrodictiaceae
95 (97)
H2 / CO2,
Hefeextrakt
S2O32-
< 960
unbekannt
Pley et al., 1991
Pyrodictium occultum
(DSMZ 2709)
Pyrodictiaceae
95 (105)
H2 / CO2,
Hefeextrakt
S0
< 240
unbekannt
Stetter et al.,
1983
Ralstonia eutropha
JPM 134 (DSMZ 4058)
Sulfolobus sp. VE 6
Burkholderiaceae
25 (30)
Fructose
O2
1,0
(mixotrophes
Wachstum)
4
(mixotrophes
Wachstum)
2
< 480
Calvin-Zyklus
Sulfolobaceae
80 (90)
H2 / CO2
O2
8
120
unbekannt
Friedrich et al.,
1979
siehe M. sedula
Brysch et al.,
1987
Widdel, 1987
Huber et al.,
2000
Huber et al.,
2000
Huber et al.,
1989
Huber et al.,
1987
MATERIAL UND METHODEN
2.7
30
Züchtung von Escherichia coli
E. coli K12 und E. coli TOP10 wurden auf Luria-Bertani (LB)-Medium gezüchtet
(Sambrook et al., 1989). Bei Bedarf wurde das Antibiotikum Ampicillin (50 µg/mL)
zugesetzt. Für Agarplatten wurde dem Medium 2 % (w/v) Agar zugesetzt.
3.
Synthesen
3.1
Malonyl-CoA
Die chemische Synthese der Vorstufe von Malonyl-CoA, Monothiophenylmalonat
wurde von Dr. Castor Ménendez und Dr. Richard Krieger (Organische Chemie, Universität
Freiburg) durchgeführt (nach Imamoto et al., 1982; Pollmann und Schramm, 1964).
Monothiophenylmalonat wurde unter Stickstoffatmosphäre bei – 20°C gelagert. Der
Reaktionsansatz (40 mL) zur Umesterung von Monothiophenylmalonat mit freiem CoA zu
Malonyl-CoA und Monothiophenol enthielt 0,1 M NaHCO3 (pH 7,5), 1,5 mM CoA (50 mg)
und 3 mM Monothiophenylmalonat (24 mg). Nach 90 min anaerober Inkubation bei
Raumtemperatur unter ständigem Rühren wurde der pH durch Zugabe von 1 M HCl auf einen
Wert von 3 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend zweimal mit je 40 mL Diethylether
extrahiert und die wässrige Phase lyophilisiert. Das Pulver wurde bei – 20 °C gelagert. Die
Reinheit des synthetisierten Malonyl-CoA wurde über HPLC (Trennbedingung 1, siehe
unten) analysiert.
3.2
Acetyl-CoA, Propionyl-CoA und Succinyl-CoA
Die CoA-Ester von Acetat, Propionat und Succinat wurden aus deren Anhydriden
hergestellt. Dabei wurden die Methoden von Simon (1957) und Sadtman (1957) verwendet,
die leicht abgewandelt wurden.
Das Reaktionsgemisch (40 mL) enthielt 0,1 M NaHCO3 (pH 7,5), 2,4 mM CoA (80 mg)
und 3 mM Essigsäure-, Propionsäure- oder Bernsteinsäureanhydrid. Nach 40 min anaerober
Inkubation bei Raumtemperatur unter Rühren wurde der pH mit 1 M HCl auf einen Wert von
3 eingestellt. Im Falle von Succinyl-CoA wurde 2 h auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde
zweimal mit 40 mL Diethylether extrahiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene
Pulver wurde bei – 20°C gelagert, die Reinheit der CoA-Ester wurde mittels HPLC
(Trennbedingung 1 für Acetyl-CoA und Propionyl-CoA, Trennbedingung 2 für SuccinylCoA) überprüft.
3.3
L-(S) Malyl-CoA
L-Malylcaprylcysteamin (S-[β-Hydroxysuccinyl]-N-Caprylcysteamin), die Vorstufe
von L-Malyl-CoA, wurde von Dr. Richard Krieger (Organische Chemie, Universität
Freiburg) nach der Methode von Eggerer und Grünwälder (1964) und Mohrhauer et al. (1968)
synthetisiert. Das Reaktionsgemisch (20 mL) für die Umesterung enthielt 0,5 M KHCO3 (pH
7,5), 6,1 mM CoA (100 mg) und 18,3 mM L-Malylcaprylcysteamin. Das Reaktionsgemisch
wurde 5 h unter anaeroben Bedingungen bei Raumtemperatur gerührt und der pH
anschließend mit 1 M HCl auf einen Wert von 2 eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde
filtriert und zehnmal mit 30 mL Diethylether extrahiert. Die wässrige Lösung wurde
gefriergetrocknet und das Pulver bei – 20°C gelagert. Die Reinheit wurde über HPLC
(Trennbedingung 1) analysiert.
MATERIAL UND METHODEN
3.4
31
3-Hydroxypropionat
3-Hydroxypropionat wurde aus 3-Hydroxypropioninitril durch alkalische Hydrolyse
hergestellt. Hierfür wurden 60 mL einer alkalischen 3-Hydroxypropioninitril-Lösung (16 g
NaOH, 0,13 mol 3-Hydroxypropioninitril) solange erhitzt bis das gebildete Ammoniak
komplett verdampft war. Der pH der Lösung wurde mit 1 M HCl auf einen Wert von 2
eingestellt und die freie Säure mit Diethylether über eine Kutscher-Steudel-Apparatur
extrahiert. Das Produkt (ca. 5 M 3-Hydroxypropionat) wurde bei – 20°C gelagert.
3.5
[1,4-13C1]-Succinat
Die Synthese von [1,4-13C1]-Succinat erfolgte aus 3-Chloropropionsäure-Ethylester und
C-markiertem Kaliumcyanat (IC-Chemikalien, München) nach der Methode von Ives und
Sames (1943). [1,4-13C1]-Succinat wurde vor längerer Zeit in unserem Labor synthetisiert und
mir freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Synthese ist in Strauss et al. (1992)
beschrieben.
13
4.
Herstellung von Zellextrakten
4.1
Zellaufschluss in einer French-Press-Zelle
Zellextrakte wurden sowohl unter aeroben, als auch unter anaeroben Bedingungen
hergestellt. Frisch geerntete oder gefrorene Zellen wurden in einem Volumen 100 mM
Tris/HCl (pH 7,8) aufgenommen, mit 0,1 mg DNAse I pro mL versetzt und resuspendiert. Der
Zellaufschluss erfolgte durch Passage durch eine French-Press-Zelle (American Instruments
Company, Maryland, USA) bei einem Druck von 137 MPa. Der Extrakt wurde anschließend
in einer Ultrazentrifuge (Beckmann Ultrazentrifuge, 70 Ti-Festwinkelrotor, München) bei
100.000 g 1 h zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort verwendet oder bei – 70°C
aufbewahrt.
4.2
Zellaufschluss mit der Zellmühle
Um kleinere Zellmengen aufzuschließen (< 0,5 g Feuchtgewicht) wurde eine Zellmühle
(Retsch MM 200, Haan) verwendet. Hierfür wurden Zellen mit dem vierfachen Volumen an
Aufschlusspuffer (100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 3 mM DTE, 0,1 mg DNAse I mL-1) versetzt
und 0,6 mL dieser Zellsuspension in ein Eppendorfreaktionsgefäß gegeben. Nachdem 1 g
Glaskugeln (Durchmesser 0,1 – 0,25 mm) hinzugefügt wurde, wurde die Lösung in der
Zellmühle 6 min bei 100 % Intensität (30 Hz) geschüttelt. Es folgten 10 min Zentrifugation
bei 20.000 g (Centrifuge 5420, Eppendorf, Hamburg). Im Falle eines anaeroben Zellaufschlusses wurden zuvor 0,6 mL anaerobisierte Zellsuspension in ein 1 mL DurhamRöhrchen gegeben, in der Anaerobenkammer 1 g Glaskugeln hinzugefügt und das Röhrchen
mit einem Gummistopfen verschlossen. Der Zellextrakt wurde sofort verwendet.
4.3
Zellaufschluss mit Ultraschall
Für die Aufarbeitung von 13C-markierten Zellen von M. sedula wurden diese über
Ultraschall aufgeschlossen. Hierfür wurden 3 g Zellen mit 6 mL H2Obidest versetzt und mit
Hilfe eines Branson-Sonifier 450 (Branson, USA) über mehrere Ultraschallstöße (je 20 s bei
20 kHz) aufgeschlossen.
MATERIAL UND METHODEN
5.
32
Enzymatische Tests
Die Enzymtests wurden in 0,5 mL Glasküvetten (d = 1 cm) oder in 1 mL Glasgefäßen
durchgeführt. Die anaeroben Enzymtests wurden unter striktem Sauerstoffausschluss mit
Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Die Enzymtests wurden bei der Wachstumstemperatur
durchgeführt, im Falle von hyperthermophilen Organismen wurde meistens bei 75°C
gemessen. Ausnahmen sind jeweils angegeben.
PHOTOMETRISCHE ENZYMTESTS
Nachweise mit NADH, NADPH, NAD+ oder NADP+. Reaktionen mit den Dinukleotiden
NADH, NADPH, NAD+ oder NADP+ wurden im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge
von 365 nm verfolgt. Der Extinktionskoeffizient für NAD(P)H beträgt 3,4 · 103 M-1 cm –1.
5.1
ATP-Citrat-Lyase
Die ATP-Citrat-Lyase-Aktivität wurde in einem gekoppelten Enzymtest mit zelleigener
L-Malat-Dehydrogenase-Aktivität gemessen. Die Citrat-, CoA- und MgATP-abhängige
Oxidation von NADH wurde verfolgt. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH
7,5), 5 mM MgCl2, 3 mM ATP, 0,5 mM CoA, 0,4 mM NADH und 3 mM D-Citrat. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von Citrat gestartet. Um sicherzustellen, dass die endogene
L-Malat-Dehydrogenase-Aktivität nicht limitierend war, wurde diese Enzymaktivität unter
den gleichen Bedingungen durch die Zugabe von 1 mM Oxalacetat gemessen.
5.2
Reduktion von Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat (Malonyl-CoA-Reduktase)
Vorwärtsreaktion. Die Malonyl-CoA-abhängige Oxidation von NADPH wurde gemessen.
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 2 mM MgCl2, 3 mM DTE, 0,4
mM NADPH und 0,5 mM Malonyl-CoA. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von
Malonyl-CoA gestartet.
Für die Bestimmung des pH-Optimums wurden 2 verschiedene Puffersysteme
verwendet (MOPS/NaOH (pH 5,9 – 7,2) sowie Tris/HCl (pH 6,3 – 8,4), die angegebenen pHWerte beziehen sich auf 55°C). Der Standard-Enzymtest wurde auch zur Bestimmung der KmWerte für Malonyl-CoA und NADPH herangezogen. Hierbei wurde die Konzentration eines
Substrates variiert (für Malonyl-CoA 0,004 – 1 mM, für NADPH 0,004 – 0,4 mM), während
die Konzentration des anderen Substrates im gesättigten Bereich konstant gehalten wurde.
Rückreaktion. Es wurde die 3-Hydroxypropionat-abhängige Reduktion von NADP+ verfolgt.
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 2 mM MgCl2, 3 mM DTE, 0,5
mM CoA, 5 mM NADP+ und 10 mM 3-Hydroxypropionat. Die Reaktion wurde durch die
Zugabe von 3-Hydroxypropionat gestartet.
5.3
Reduktion von 3-Hydroxypropionat zu Propionyl-CoA
Die 3-Hydroxypropionat-, CoA- und MgATP-abhängige Oxidation von NADPH wurde
verfolgt. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 10 mM KCl, 5 mM
MgCl2, 3 mM ATP, 0,5 mM CoA, 0,4 mM NADPH und 1 mM 3-Hydroxypropionat. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 3-Hydroxypropionat gestartet.
MATERIAL UND METHODEN
5.4
33
α-Ketoglutarat- und Pyruvat-Dehydrogenase
Die α-Ketoglutarat- bzw. Pyruvat- und CoA-abhängige Reduktion von NAD+ oder
NADP+ wurde verfolgt. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 5 mM
MgCl2, 1 mM NAD+ oder NADP+, 0,5 mM CoA und 2 mM α-Ketoglutarat bzw. Pyruvat. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von α-Ketoglutarat bzw. Pyruvat gestartet.
5.5
Malat-Dehydrogenase
Es wurde die Oxalacetat-abhängige Oxidation von NADPH oder NADH gemessen. Das
Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 0,4 mM NADPH oder NADH und 1
mM Oxalacetat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Oxalacetat gestartet.
5.6
Isocitrat-Dehydrogenase
Es wurde die Isocitrat-abhängige Reduktion von NADP+ gemessen. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 1 mM NADP+, 5 mM βMercaptoethanol und 10 mM D/L-Isocitrat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von
Isocitrat gestartet.
5.7
Aconitase
Um Aconitase-Aktivität zu messen wurde diese an endogene Isocitrat-DehydrogenaseAktivität gekoppelt. Das Reaktionsgemisch entsprach dem der Isocitrat-DehydrogenaseAktivität. Die Reaktion wurde jedoch mit 10 mM D-Citrat statt mit Isocitrat gestartet.
5.8
Pyruvat-Kinase
Um die MgATP-abhängige Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) in Pyruvat zu
messen wurde ein diskontinuierlicher Enzymtest entwickelt. Die Menge entstandenen
Pyruvats wurde mit Hilfe der L-Lactat-Dehydrogenase gemessen, welche Pyruvat NADHabhängig zu L-Lactat umwandelt. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8),
5 mM MgCl2, 5 mM DTE, 5 mM ADP und 2 mM PEP. Das Reaktionsgemisch wurde bei
65°C inkubiert, und die Reaktion durch die Zugabe von PEP gestartet. Nach 5 min
Reaktionszeit wurde die Reaktion gestoppt, indem das Reaktionsgemisch auf 4°C gekühlt
wurde. Es wurden 0,4 mM NADH und 1 U (1 µmol min-1) L-Lactat-Dehydrogenase
zugesetzt. Der Pyruvat-abhängige NADH-Verbrauch wurde photometrisch bei 37°C
gemessen.
5.9
Acetyl-CoA-Carboxylase
Ein gekoppelter spektrophotometrischer Enzymtest aus Acetyl-CoA-Carboxylase und
Malonyl-CoA-Reduktase wurde entwickelt. Teilweise gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase
von C. aurantiacus (50 µL, 0,1 mg Protein, reduziert 0,1 µmol Malonyl-CoA pro min bei
65°C) wurde hierfür dem Reaktionsansatz zugesetzt. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM
MOPS/NaOH (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 4 mM DTE, 4 mM ATP, 10 mM NaHCO3, 0,4 mM
NADPH und teilweise gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase. Nach 3 min Inkubation des
Reaktionsgemischs bei 65°C, wurde die Reaktion durch den Zusatz von 0,5 mM Acetyl-CoA
gestartet. Die Acetyl-CoA-abhängige Reduktion von NADPH konnte spektrophotometrisch
verfolgt werden. In diesem gekoppelten Enzymtest wird Malonyl-CoA, das Produkt der
MATERIAL UND METHODEN
34
Acetyl-CoA-Carboxylase, durch die Malonyl-CoA-Reduktase zu 3-Hydroxypropionat
reduziert. Dabei werden 2 Moleküle NADPH pro Molekül Malonyl-CoA oxidiert.
Nachweise mit Benzyl- und Methylviologen. Umsetzungen mit Benzyl- oder Methylviologen wurden spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 578 nm verfolgt. Die
Extinktionskoeffizienten sind 8,6 · 103 M-1 cm-1 für Benzylviologen (BV) und 9,8 · 103 M-1
cm-1 für Methylviologen (MV). Es wurde folgender Grundansatz für die Messungen
verwendet: 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 4 mM DTE, 2 mM MgCl2 und 2 mM BV bzw. 4 mM
MV. Die Enzymtests wurden strikt anaerob in Glasküvetten mit Gummistopfen und Stickstoff
als Gasphase durchgeführt. Zu den Ansätzen wurde mit einer gasdichten HamiltonGlasspritze eine kleine Menge einer 5 mM Natriumdithionit-Lösung zugegeben, so dass die
Lösung leicht violett bzw. blau gefärbt wurde. Diese Färbung zeigte vollkommen anoxische
Bedingungen an und blieb auch beim Schütteln der Küvette erhalten.
5.10 α-Ketoglutarat und Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase
Es wurde die α-Ketoglutarat- bzw. Pyruvat- und CoA-abhängige Reduktion von BV
bzw. MV verfolgt. Das Reaktionsgemisch entsprach dem Grundansatz und enthielt zusätzlich
1 mM CoA und 3 mM α-Ketoglutarat oder Pyruvat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
von α-Ketoglutarat oder Pyruvat gestartet.
5.11 CO-Dehydrogenase
Es wurde die CO-abhängige Reduktion von MV gemessen. Hierzu wurde die StickstoffGasphase in der Küvette gegen eine Kohlenmonoxid-Gasphase ausgetauscht (1 bar Druck).
Das Reaktionsgemisch entsprach dem Grundansatz. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
von Zellextrakt gestartet. In Kontrollexperimenten wurde CO durch N2 ersetzt.
Weitere spektrophotometrische Nachweise.
5.12 L-Malyl-CoA-Lyase
Es wurde die L-Malyl-CoA-abhängige Bildung von Glyoxylat-Phenylhydrazon
spektrophotometrisch bei 324 nm verfolgt (ε324=1,7 · 104 M-1 cm-1) (Herter et al., 2001). Das
Reaktionsgemisch enthielt 200 mM MOPS/KOH (pH 7,7), 10 mM MgCl2, 3,5 mM Phenylhydrazoniumchlorid und 0,2 mM L-Malyl-CoA. Durch die Zugabe von L-Malyl-CoA wurde
die Reaktion gestartet.
5.13 Succinyl-CoA:L-Malat CoA-Transferase
Die Aktivität der Succinyl-CoA:L-Malat CoA-Transferase wurde in einem gekoppeltem
Enzymtest mit Hilfe der endogenen L-Malyl-CoA-Lyase gemessen. Es wurde die SuccinylCoA- und L-Malat-abhängige Bildung von Glyoxylat-Phenylhydrazon spektrophotometrisch
bei einer Wellenlänge von 324 nm verfolgt (ε324=1,7 · 104 M-1 cm-1) (Herter et al., 2001). Das
Reaktionsgemisch enthielt 200 mM MOPS/KOH (pH 6,5), 10 mM MgCl2, 3,5 mM Phenylhydrazoniumchlorid, 1 mM Succinyl-CoA und 5 mM L-Malat. Die Reaktion konnte sowohl
durch die Zugabe von Succinyl-CoA als auch durch die Zugabe von L-Malat gestartet
werden.
MATERIAL UND METHODEN
35
5.14 Isocitrat-Lyase
Die Isocitrat-abhängige Bildung von Glyoxylat-Phenylhydrazon wurde spektrophotometrisch bei 324 nm verfolgt (ε324=1,7 · 104 M-1 cm-1). Das Reaktionsgemisch enthielt
100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 3,5 mM Phenylhydrazoniumchlorid und 2,5 mM
D/L-Isocitrat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Isocitrat gestartet.
5.15 Fumarat-Hydratase
Der Fumarat-Verbrauch durch die Fumarat-Hydratase wurde direkt spektrophotometrisch bei 240 nm verfolgt (ε240=2,44 · 103 M-1 cm-1) (Bergmeyer, 1970). Das
Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8) und 0,2 mM Fumarat. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe von Fumarat gestartet.
5.16 Citrat-Synthase
Die Acetyl-CoA- und Oxalacetat-abhängige Freisetzung von CoA wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 412 nm verfolgt. 5,5´-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) wurde als CoA-abfangende Substanz eingesetzt, es bildete sich ein gemischtes
Disulfid aus CoA und Thionitrobenzoat, welches eine intensive gelbe Farbe hat (ε420=1,36 ·
104 M-1 cm-1) (Dawson et al., 1986). Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH
7,8), 0,25 mM DTNB, 0,2 mM Acetyl-CoA und 2 mM Oxalacetat. Die Reaktion konnte
sowohl durch die Zugabe von Acetyl-CoA, als auch durch die Zugabe von Oxalaxetat
gestartet werden.
5.17 Succinat-Dehydrogenase
Die Succinat-abhängige Reduktion von oxidiertem 2,6-Dichlorophenolindophenol
(DCPIP) wurde spektrophotometrisch bei 546 nm verfolgt (ε546=1,38 · 104 M-1 cm-1) (Dawson
et al., 1986; Herter et al., 2001). Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8),
2,5 mM DCPIP, 1 mM Phenazinmethosulfat und 1 mM Succinat. Die Reaktion wurde durch
die Zugabe von Succinat gestartet.
RADIOAKTIVE ENZYMTESTS
Carboxylierungsreaktionen wurden mit Hilfe von 14CO2 gemessen. Dabei wurde der
Substrat-abhängige Einbau von 14C aus14C-Carbonat in säurestabile Produkte verfolgt. Die
Menge an gebildetem Produkt wurde aus der Menge an Radioaktivität, die in säurestabilen
Produkten fixiert wurde bestimmt. Zur Berechnung wurde dabei die spezifische Radioaktivität des eingesetzten 14C-Carbonat herangezogen. Diese betrug 2,15 kBq nmol-1. Im
Testansatz betrug die endgültige spezifische Radioaktivität des Gemisches aus 14Cmarkiertem und unmarkiertem Bicarbonat/CO2 7,4 Bq nmol-1. Die Enzymtests wurden in 1
mL Glasgefäßen mit Gummistopfen durchgeführt. Diese enthielten 0,5 mL Reaktionsgemisch
und 0,5 mL N2-Gas. Das Reaktionsgemisch wurde 3 min bei der Messtemperatur
vorinkubiert.
5.18 Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RubisCO)
Das Reaktionsgemisch (0,5 mL Ansatz) enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), 10 mM
MgCl2, 5 mM DTE, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM [14C]Na2CO3) und 1 mM
MATERIAL UND METHODEN
36
Ribulose-1,5-bisphosphat. Die Reaktion wurde unter strikt anaeroben Bedingungen
durchgeführt und durch die Zugabe von Ribulose-1,5-bisphosphat gestartet.
5.19 Acetyl-CoA- und Propionyl-CoA-Carboxylase
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM MOPS/NaOH (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 4 mM
DTE, 4 mM ATP, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM [14C]Na2CO3) und 0,4 mM
Acetyl-CoA oder Propionyl-CoA. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Acetyl-CoA
oder Propionyl-CoA gestartet.
Für die Bestimmung des pH-Optimums wurden drei verschiedene Puffersysteme
verwendet: MOPS/NaOH (pH 6,5 – 8,0), Tris/HCl (pH 7,5 – 8,5) sowie Taps/NaOH (pH 7,5
– 9,0). Der pH-Wert wurde bei Raumtemperatur eingestellt, die Abweichung des pH-Wertes
durch die hohe Temperatur bei der Enzymmessung wurde berücksichtigt. Dieser StandardEnzymtest wurde auch für die Bestimmung der apparenten Km-Werte herangezogen. Dabei
wurde die Konzentration eines Substrates variiert (bei Acetyl-CoA und Propionyl-CoA
zwischen 0,002 und 2 mM, bei ATP zwischen 0,002 und 4 mM, bei Bicarbonat zwischen 0,05
und 10 mM), während die Konzentrationen der anderen Substrate im sättigenden Bereich
konstant gehalten wurden. Die tatsächliche Bicarbonat-Konzentration bei pH 7,5 wurde
berechnet (nach Stadtmann, 1957).
5.20 PEP-Carboxylase
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Imidazol/HCl (pH 6,5), 5 mM MgCl2, 5 mM
DTE, 2 mM NADH, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM [14C]Na2CO3), 5 mM
GDP und 2 mM PEP. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von PEP gestartet.
5.21 PEP-Carboxykinase
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Imidazol/HCl (pH 6,5), 5 mM MgCl2, 5 mM
DTE, 2 mM NADH, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM [14C]Na2CO3) und 2 mM
PEP. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von PEP gestartet.
5.22 Pyruvat-Carboxylase
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 5 mM DTE,
2 mM NADH, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM [14C]Na2CO3) und 2 mM
Pyruvat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Pyruvat gestartet. Die Fixierung von
14
CO2 über die Pyruvat:Wasser-Dikinase oder die Pyruvat:Phosphat-Dikinase und die PEPCarboxylase bzw. PEP-Carboxykinase konnte von der Fixierung über die Biotin-abhängige
Pyruvat-Carboxylase unterschieden werden, indem dem Reaktionsgemisch 1nM Avidin
zugesetzt wurde und das Gemisch vor der Messung 5 min bei 25°C vorinkubiert wurde. Der
Zusatz von Avidin führte zur kompletten Hemmung der Biotin-abhängigen PyruvatCarboxylase.
5.23 Pyruvat:Wasser-Dikinase (PEP-Synthetase)
Es wurde die Pyruvat- und MgATP-abhängige 14C-Fixierung aus [14C]Na2CO3 in
säurestabile Produkte verfolgt. Das durch die Pyruvat:Wasser-Dikinase gebildete PEP wird
über die im Extrakt vorhandene PEP-Carboxylase bzw. PEP-Carboyxkinase zu Oxalacetat
carboxyliert. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 mM CAPSO (pH 8,5), 5 mM MgCl2, 5 mM
DTE, 5 mM ATP, 5 mM GDP, 2 mM NADH, 10 mM NaHCO3, 37 kBq [14C]Na2CO3 (30 µM
MATERIAL UND METHODEN
37
[14C]Na2CO3) und 2 mM Pyruvat. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Pyruvat
gestartet.
5.24 Pyruvat:Phosphat-Dikinase
Für die Messung der Pyruvat:Phosphat-Dikinase wurde derselbe Testansatz wie für die
Messung der Pyruvat:Wasser-Dikinase verwendet. Zusätzlich wurde dem Reaktionsgemisch 5
mM KH2PO4 zugesetzt. Die zusätzliche Menge an säurestabilen fixiertem 14C aus 14CO2 sollte
auf die Aktivität der Pyruvat:Phosphat-Dikinase zurückzuführen sein.
6.
Reinigung von Enzymen
6.1
Reinigung der Malonyl-CoA-Reduktase aus Chloroflexus aurantiacus
Die Reinigung der Malonyl-CoA-Reduktase wurde bei 4°C durchgeführt. Alle Puffer
enthielten, sofern nicht anders vermerkt, 3 mM DTE. Für die Reinigung wurden jeweils 20 g
Zellen (Feuchtgewicht) mit der French Press aufgeschlossen. Es wurde hitzegefällter
Rohextrakt über 4 Chromatographiesäulen aufgereinigt. Die Enzymreinigung wurde sowohl
mit Zellextrakt von autotroph gewachsenen, als auch von heterotroph gewachsenen C.
aurantiacus-Zellen durchgeführt.
Hitzefällung. Zellextrakt wurde nach einer Ultrazentrifugation (1 h, 100.000 g, 4°C) für 30
min bei 65°C im Wasserbad inkubiert. Durch diesen Schritt wurde unerwünschtes Protein,
sowie Lipide und Pigmente ausgefällt. Diese konnten in einem weiteren Ultrazentrifugationsschritt (40 min, 100.000 g, 4°C) abgetrennt werden.
Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose. Der Überstand nach der
Hitzefällung (45 mL) wurde auf eine DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule (Amersham
Biosciences, Freiburg; Durchmesser: 5 cm, Volumen: 80 mL) aufgetragen. Die Säule war mit
Puffer A (20 mM Tris/HCl (pH 7,8), 10 % (v/v) Glycerin) bei einer Flussrate von 3 mL min-1
äquilibriert worden. Nach dem Proteinauftrag wurde die Säule mit 160 mL Puffer A, 160 mL
Puffer A plus 100 mM NaCl und 160 mL Puffer A mit 140 mM NaCl gewaschen.
Anschließend wurde der Hauptanteil der Enzymaktivität mit 150 mL Puffer A mit 200 mM
NaCl von der Säule eluiert.
Chromatographie an Phenyl-Sepharose. Zu den gepoolten aktiven Fraktionen der DEAESepharose-Säule wurde gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Endkonzentration
von 10 % (v/v) hinzugegeben. Diese Lösung wurde auf eine Phenyl-Sepharose-Säule
(Amersham Biosciences, Freiburg; Durchmesser: 3 cm, Volumen: 20 mL) mit einer Flussrate
von 1 mL min-1 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit Puffer B (100 mM Tris/HCl (pH
7,8), 200 mM (NH4)2SO4, 5 mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin) äquilibriert. Nach dem Auftrag
wurde die Säule mit 80 mL Puffer B gewaschen. Die Elution der Aktivität wurde über einen
linearen Gradienten über 250 mL mit einer sinkenden Ammoniumsulfatkonzentration von 200
– 0 mM erreicht. Die Enzymaktivität eluierte zwischen 160 und 100 mM (NH4)2SO4. Die
aktiven Fraktionen wurden gepoolt, über Ultrafiltration (10 kDa Membran, Filtron, Karlstein)
ankonzentriert und durch die Zugabe von Puffer A entsalzt. Das Endvolumen der Probe
betrug 25 mL.
Affinitätschromatographie an Blue-Sepharose. Die gepoolten und entsalzten aktiven
Fraktionen nach der Phenyl-Sepharose-Säule wurden auf eine Blue-Sepharose CL-6B-Säule
(Amersham Biosciences, Freiburg; Durchmesser: 2,2 cm, Volumen: 10 mL) mit einer
MATERIAL UND METHODEN
38
Flussrate von 1 mL min-1 aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A ohne DTE äquilibriert.
Für den weiteren Chromatographielauf wurde ein modifizierter Puffer verwendet: Puffer C
(100 mM Tris/HCl (pH 8,5), 10 % (v/v) Glycerin). Nachdem die Säule über 4 Schritte
gewaschen wurde (30 mL Puffer A, 30 mL Puffer C, 30 mL Puffer C mit 200 mM NaCl, 30
mL Puffer C mit 300 mM NaCl), wurde die Aktivität mit 10 mL Puffer C mit 400 mM NaCl
eluiert. Die gepoolten aktiven Fraktionen wurden über Ultrafiltration (10 kDa Membran) auf
ein Endvolumen von 10 mL ankonzentriert und dabei durch die Zugabe von Puffer C entsalzt.
Der pH-Wert wurde anschließend mit 0,1 M HCl auf 7,8 eingestellt.
Affinitätschromatographie an Reactive Blue 4. Das Enzym wurde über eine Reactive Blue
4-Säule (Sigma-Aldrich, Deisenhofen; Durchmesser: 1,5 cm, Volumen: 5 mL) weiter
aufgereinigt. Hierzu wurde die aktive Fraktion der Blue-Sepharose-Säule mit einer Flussrate
von 1 mL min-1 auf die Reactive Blue 4-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A
ohne DTE äquilibriert. Nach 3 Waschschritten (20 mL Puffer A, 20 mL Puffer C, 20 mL
Puffer C mit 200 mM NaCl) wurde die Aktivität mit 5 mL Puffer C mit 300 mM NaCl eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden über Ultrafiltration (10 kDa Membran) ankonzentriert (1 mL
Endvolumen).
6.2
Reinigung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase aus Metallosphaera sedula
Die Reinigung wurde bei Raumtemperatur (20°C) durchgeführt. Als Ausgangsmaterial
wurden 3 g (Feuchtgewicht) M. sedula-Zellen verwendet, die unter autotrophen Bedingungen
angezogen wurden. Die Reinigung bestand aus 4 Chromatographieschritten.
Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose. Zellextrakt (100.000 g
Überstand, 4 mL) wurde mit einer Flussrate von 1 mL min-1 auf eine DEAE-Sepharose Fast
Flow-Säule (Amersham Biosciences, Freiburg; Durchmesser: 1,6 cm, Volumen: 10 mL)
aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit 20 mM Triethanolamin/NaOH (pH 7,8) (Puffer D)
äquilibriert. Nach 2 Waschschritten (30 mL Puffer D, 30 mL Puffer D mit 70 mM NaCl)
wurde die Aktivität mit 50 mL Puffer D mit 250 mM NaCl eluiert.
Chromatographie an Phenyl-Superose. Zu den gepoolten aktiven Fraktionen der DEAESepharose wurde gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 30
% (v/v) zugesetzt. Diese Lösung wurde in 2 Säulenläufen mit einer Flussrate von 0,5 mL min1
auf eine Phenyl-Superose HR 5/5-Säule (Amersham Biosciences, Freiburg; Durchmesser:
0,5 cm, Volumen: 1 mL) aufgetragen. Die Säule wurde mit 10 mL 50 mM Tris/HCl (pH 7,8),
0,5 M (NH4)2SO4 äquilibriert, die Aktivität anschließend innerhalb eines Gradienten über 20
mL von 500 – 0 mM (NH4)2SO4 im selben Puffer eluiert. Die Enzymaktivität eluierte
zwischen 150 und 50 mM (NH4)2SO4. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über
Ultrafiltration (10 kDa Membran) auf ein Endvolumen von 5 mL eingeengt und entsalzt.
Anionenaustauschchromatographie an Resource Q. Die gepoolten und entsalzten aktiven
Fraktionen der Phenyl-Superose wurden mit einer Flussrate von 4 mL min-1 auf eine Resource
Q-Säule (Amersham Biosciences, Freiburg; Volumen: 1 mL) aufgetragen. Die Säule wurde
zuvor mit 20 mM Triethanolamin/NaOH (pH 7,8) äquilibriert. Nach einem Waschschritt mit
20 mL dieses Puffers wurde die Enzymaktivität in einem ansteigenden linearen Gradienten
über 20 mL von 0 – 1 M NaCl im selben Puffer eluiert. Sie eluierte in einem Volumen von 4
mL zwischen 100 und 200 mM NaCl.
Gelfiltrationschromatographie. Die aktiven Fraktionen der Resource Q-Säule wurde mit
einer Flussrate von 1 mL min-1 auf eine FPLC Superdex 200 HR 16/60 Gelfiltrations-Säule
MATERIAL UND METHODEN
39
(Amersham Biosciences, Freiburg; Durchmesser: 1,6 cm, Volumen: 120 mL) aufgetragen.
Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl (pH 7,8), 100 mM NaCl äquilibriert und eluiert. Die
aktiven Fraktionen wurden sofort über Ultrafiltration (10 kDa Membran) auf ein Endvolumen
von 2,5 mL ankonzentriert.
7.
Radioaktive Enzymumsetzungen
7.1
Umsetzung von 14C-markiertem Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat
Um die Umsetzungsprodukte der Malonyl-CoA-Reduktase nachzuweisen, wurde
radioaktiv markiertes Malonyl-CoA mit gereinigtem Enzym inkubiert. Das Reaktionsgemisch
(250 µL) enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 7,8), 2 mM MgCl2, 1 mM NADPH, 0,15 mM [214
C]-Malonyl-CoA und 3 µg gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase. Die Reaktion wurde bei
55°C im Wasserbad durchgeführt und durch die Zugabe von Malonyl-CoA gestartet. Nach
verschiedenen Zeitpunkten (0 min, 1 min, 15 min) wurden Proben von 50 µL genommen und
die Reaktion durch die Zugabe von 3 µL 6 M HCl gestoppt. Das Protein wurde durch
Zentrifugation (10 min, 20.000 g) entfernt, und 10 µL des Überstandes wurden über HPLC
(Trennbedingung 3) analysiert.
7.2
Umsetzung von 14CO2 mit Ribulose-1,5-bisphosphat durch Zellextrakt von Pd.
abyssi, Pd. occultum, R. eutropha, I. islandicus und I. pacificus
Um 3-Phosphoglycerat als CO2-Fixierungsprodukt der RubisCO nachzuweisen, wurde
Zellextrakt von Pd. abyssi, Pd. occultum, R. eutropha, I. islandicus und I. pacificus mit 14CCarbonat und Ribulose-1,5-bisphosphat inkubiert. Die Reaktion wurde in 1 mL Glasröhrchen
mit Gummistopfen unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch (600
µL) enthielt 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 5 mM DTE, 10 mM NaHCO3, 185
kBq [14C]Na2CO3 (143 µM), 1 mM Ribulose-1,5-bisphosphat, sowie 100 µL Zellextrakt
(entspricht 0,8 – 2,0 mg Gesamtprotein). Im Falle von R. eutropha wurden nur 74 kBq
[14C]Na2CO3 (57 µM) und 0,1 mg Gesamtprotein eingesetzt. Die Reaktion wurde bei 90°C
(Pd. abyssi, Pd. occultum, I. islandicus und I. pacificus) bzw. 25°C (R. eutropha) im
Wasserbad durchgeführt und durch die Zugabe von Ribulose-1,5-bisphosphat gestartet. Nach
verschiedenen Zeitpunkten (0 min, 5 min, 10 min) wurden Proben von 200 µL entnommen
und die Reaktion durch die Zugabe von 30 µL 1 M HCl abgestoppt. Protein wurde durch
Zentrifugation (10 min, 20.000 g) entfernt, und 100 µL des Überstandes wurden über HPLC
(Trennbedingung 4) analysiert.
8.
Isolierung von Aminosäuren und anderen Zellbausteinen aus 13C-markierten
Zellen
8.1
Isolierung der Proteine
Die Aufarbeitung von 13C-markierten Zellen von M. sedula vom Zellaufschluss bis zum
Proteinpellet ist in Abbildung 9 schematisch dargestellt. Ausgangsmaterial waren 3 g M.
sedula-Zellen (Feuchtgewicht), die mit 6 mL H2Obidest versetzt, und mit Ultraschall
aufgeschlossen wurden. Über mehrere Schritte wurden Lipide und Nukleinsäuren abgetrennt.
Das erhaltene Proteinpellet wurde anschließend bei 80°C für 12 h getrocknet.
MATERIAL UND METHODEN
8.2
40
Saure Hydrolyse der Zellproteine
Das erhaltene Proteinpellet wurde auf 2 Glasampullen verteilt und mit jeweils 2 mL 6
M HCl versetzt. Die Proteinhydrolyse erfolgte über 24 h bei 112°C in den zugeschmolzenen
Glasampullen. Es wurde eine braune Lösung mit einem groben schwarzen Niederschlag
erhalten. Um die Salzsäure zu entfernen wurde diese Lösung in einem Rotationsverdampfer
dreimal bis zur Trockene eingeengt und jeweils danach in 20 mL H2Obidest aufgenommen. Der
pH wurde anschließend mit 2 M NaOH auf einen Wert von 5,3 eingestellt und der
Niederschlag durch Zentrifugation (10 min, 10.000 g) entfernt.
13C-markierte
Zellen
Zellaufschluss
mit Ultraschall
aufgeschlossene Zellen
+ 3 mL 70 % HClO4
30 min Eisbad
Zentrifugation (15 min, 48.000 g)
Proteinfällung
Pellet
Entfernung niedermolekularer Bestandteile
+ 10 mL 0,5 M HClO4
Zentrifugation (5 min, 48.000 g)
3 mal wiederholen
Pellet
+ 10 mL 0,5 M HClO4
20 min Wasserbad bei 70°C
5 min Eisbad
Zentrifugation (15 min, 20.000 g)
2 mal wiederholen
Entfernung von
Nukleinsäuren
Pellet
+ 10 mL Ethanol/Diethylether (3:1 v/v)
1 h Wasserbad bei 40°C
Zentrifugation (15 min, 20.000 g)
Entfernung von Lipiden
Pellet
+ 10 mL Diethylether
Zentrifugation (15 min, 20.000 g)
Proteinpellet
Abb. 9: Schematische Darstellung der Proteinisolierung aus 13C-markierten Zellen von M.
sedula.
8.3
Isolierung der Aminosäuren
Um die sauren Aminosäuren Aspartat und Glutamat aus dem Aminosäurengemisch zu
isolieren, wurde eine Anionenaustauscher-Chromatographie durchgeführt. Das Aminosäurengemisch wurde mit einer Flussrate von 3 mL min-1 auf eine Dowex 1X8-Säule (Serva,
Heidelberg; Formiat-Form, Durchmesser: 1,6 cm, Volumen: 15 mL) aufgetragen. Die Säule
war zuvor bei gleicher Flussrate mit H2Obidest äquilibriert worden, und wurde nach Auftrag mit
H2Obidest gewaschen. Unter diesen Bedingungen eluierten die neutralen und basischen
MATERIAL UND METHODEN
41
Aminosäuren, da sie nicht vom Säulenmaterial gebunden wurden. Die sauren Aminosäuren
Aspartat und Glutamat wurden anschließend mit 100 mM Ameisensäure eluiert.
Der Nachweis der Aminosäuren in den einzelnen Fraktionen erfolgte mit Ninhydrinreagenz. Hierzu wurden jeweils 100 µL der zu testenden Fraktionen auf Filterpapier
(Whatman 3M) aufgetropft und anschließend getrocknet. Nach Aufsprühen von Ninhydrinreagenz (250 mg Ninhydrin, 47,5 mL n-Butanol, 2,5 mL Essigsäure) konnten Aminosäuren
durch Blaufärbung nachgewiesen werden.
Die Asp/Glu-Fraktionen, sowie die Fraktionen mit dem Gemisch der weiteren Aminosäuren wurden in einem Rotationsverdampfer zur Trockenen eingeengt und anschließend zur
NMR-Analyse gesendet. Die weitere Aufarbeitung und die NMR-Spektroskopie wurde von
Dr. Wolfgang Eisenreich an der TU München durchgeführt (Eisenreich et al., 1991).
9.
Bestimmung von molekularen Enzymeigenschaften
9.1
Bestimmung der nativen Molekularmasse
Die Bestimmung der nativen Molekülmasse erfolgte über Chromatographie an einer
Gelfiltrationssäule (FPLC Superdex 200 HR 16/60, Amersham Biosciences, Freiburg;
Durchmesser: 1,6 cm, Volumen: 120 mL). Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl (pH 7,8),
100 mM NaCl bei einer Flussrate von 1 mL min-1 äquilibriert. Die Chromatographie erfolgte
unter den gleichen Bedingungen. Für die Bestimmung des Molekulargewichtes der MalonylCoA-Reduktase wurde die Blue-Sepharose-Proteinfraktion verwendet, für die Bestimmung
des Molekulargewichtes des Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase wurde die Resource
Q-Proteinfraktion verwendet. Das Molekulargewicht wurde aus dem Mittelwert von
mindestens 3 Läufen bestimmt. Zur Eichung wurden auf die Säule Proteine mit verschiedenen
Molekülmassen als Markerproteine aufgetragen. Diese waren Ferritin (450 kDa), Katalase
(240 kDa), Alkohol-Dehydrogenase (150 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa) und
Ovalbumin (45 kDa).
9.2
Bestimmung der N-terminalen Aminosäurensequenz
Zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäurensequenz der gereinigten Malonyl-CoAReduktase und Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase wurden die Proteine über SDSPAGE aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran
(Millipore, Eschborn) übertragen. Die N-terminale Aminosäurenbestimmung der MalonylCoA-Reduktase wurde von Prof. Hermann Schägger (Biochemisches Institut, Universität
Frankfurt a. M.) durchgeführt, die N-terminalen Sequenzen der Untereinheiten der AcetylCoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase wurden von der Firma TopLab (Martinsried) bestimmt.
Dabei wurde ein Applied Biosystems Procise 492 Sequencer (Weiterstadt) verwendet. Die
Phenylthiohydantoinderivate wurden mit einem Applied Biosystems Analyzer 140C
identifiziert.
9.3
Nachweis von biotinylierten Proteinen
Biotinylierte Proteine in Zellextrakten wurden mit Avidin-Peroxidase (Sigma,
Deisenhofen) nachgewiesen. Nachdem die Zellproteine über SDS-PAGE aufgetrennt wurden
(12,5 % Polyacrylamidgel, siehe Abschnitt 13.1), erfolgte ein elektrophoretischer Transfer auf
eine Nitrocellulose-Membran (Typ 885, Schleicher & Schüll, Dassel). Die Membran wurde
zunächst blockiert, indem sie 2 h in einer Lösung aus 5 % (w/v) Magermilchpulver in Trisgepufferter Salzlösung (TBS, 20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl) geschwenkt wurde.
Nach dreimaligem Waschen mit TBS (jeweils 15 min) wurde die Membran für 1,5 h mit
MATERIAL UND METHODEN
42
Avidin-Peroxidase-Lösung (0,4 mg Avidin-Peroxidase in 50 mL TBS) inkubiert. Nach
erneutem dreimaligem Waschen (15 min) mit TBS wurde die an die Membran gebundene
Peroxidase über ein Gemisch aus 4-Chlornaphtol und Wasserstoffperoxid nachgewiesen (60
mg 4-Chlornaphtol in 30 mL kaltem Methanol, 60 µL 30 % H2O2 in 100 mL TBS) (nach
Ausubel et al., 1987).
10.
Molekularbiologische Methoden
10.1 Isolierung und Reinigung von DNA
Isolierung genomischer DNA aus C. aurantiacus. Die Isolierung von genomischer DNA
wurde nach der Methode von Murray und Thompson (1980) durchgeführt. Hierzu wurden 20
mg tiefgefrorene Zellen in ein 1,5 mL Eppendorf-Reaktionsgefäß eingewogen und in 570 µL
TE-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert. Es wurden 30 µL einer 10
% (w/v) SDS-Lösung und 3 µL Proteinase K-Lösung (20 mg/mL) zugesetzt und 1 h bei 52°C
inkubiert. Danach wurden 100 µL 5 M NaCl-Lösung zugegeben, gemischt und anschließend
80 µL 10 % (w/v) Cetryltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Lösung zugesetzt. Die
Komplexe von CTAB mit Zellwandfragmenten und Proteinen wurden mit 780 µL
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 v/v) extrahiert und 5 min bei 20.000 g zentrifugiert. Die
wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und die Extraktion
wurde wiederholt. Nachdem die wässrige Phase nun frei von Pigmenten war wurde sie mit
400 µL Isopropanol überschichtet. Beim vorsichtigen Mischen beider Phasen präzipitierte die
chromosomale DNA. Sie konnte nun mit einer Pasteurpipette aufgenommen und in 200 µL 70
% (v/v) Ethanol überführt werden. Nach Zentrifugation (5 min, 20.000 g) konnte der
Überstand abgezogen und die DNA nach Trocknung in 100 µL TE-Puffer gelöst werden.
Isolierung von Plasmid-DNA. Plasmid-DNA wurde aus 4 mL Übernacht-Kulturen von
transformierten E. coli TOP10-Zellen mit einem „E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit“ der Firma
Peqlab (Erlangen) nach Anleitung des Herstellers isoliert.
Isolierung von DNA aus Agarosegelen. Um DNA-Fragmente zu reinigen bzw. einzelne
DNA-Fragmente aus Gemischen zu isolieren wurden diese in einem Agarosegel getrennt
(siehe Abschnitt 13.2). Anschließend wurde die gewünschte Bande unter UV-Licht (312 nm)
ausgeschnitten und die DNA mit dem „E.Z.N.A. Gel Extraction Kit“ der Firma Peqlab
(Erlangen) nach Anleitung des Herstellers aus dem Gel eluiert.
10.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Um DNA-Fragmente gezielt zu vervielfältigen, wurde die Polymerase-Kettenreaktion
durchgeführt. Die Methode wurde zur Amplifikation von DNA-Fragmenten und zur Kontrolle
von Klonen auf Besitz der gewünschten Plasmide eingesetzt. Der PCR-Reaktionsansatz (100
µL) enthielt: 10 µL 10fach Taq-PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf), 10
µL dNTP-Mix (2 mM je Nukleotid), 10 µL up-Primer (2 pmol/µL), 10 µL down-Primer (2
pmol/µL), 6 µL Dimethylsulfoxid, 10 – 50 ng chromosomale DNA oder Plasmid-DNA, 0,6
µL Taq-Polymerase (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf) und 50 – 60 µL H2Obidest. Es wurde
folgendes Standardprogramm gewählt, wobei die Temperatur für das Annealing der Primer
(X°C) entweder 50°C (Ansatz mit einem unspezifischen Primer) oder 60°C (Ansatz mit zwei
spezifischen Primern) betrug. Nach einer Anfangsdenaturierung (95°C, 5 min) folgten 31
Zyklen bestehend aus: Denaturierung (95°C, 45 s), Annealing (X°C, 45 s) und Extension
(72°C, 1 min pro kb). Nach dem letzten Zyklus wurde 5 min bei 72°C inkubiert, um
unvollständige Amplifikate fertig zu stellen.
MATERIAL UND METHODEN
43
10.3 Klonierungstechniken
Für die Klonierung von PCR-Produkten wurde der „TOPO-TA Cloning Kit“ der Firma
Invitrogen (Karlsruhe) verwendet. Hierbei konnte ein über Gelextraktion gereinigtes PCRFragment direkt in das Plasmid pCRII-TOPO ligiert werden. Das Plasmid wurde anschließend
in E. coli TOP10-Zellen transformiert. Die Durchführung erfolgte nach Angabe des
Herstellers.
10.4 Sequenzierung von DNA-Fragmenten
Grundlage für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten ist die Methode von Sanger
(Sanger et al., 1977). Die Sequenzierungen von doppelsträngiger Plasmid-DNA bzw. von
PCR-Produkten wurden nach Bereitstellung der hochreinen DNA im Labor für Molekularbiologie und Genetik von Dr. Gabor Igloi (Institut für Biologie III, Universität Freiburg)
durchgeführt.
11.
Produktanalyse
11.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Die HPLC wurde zur Trennung und Identifizierung von Substraten, Intermediaten und
Produkten der CO2-Fixierungswege eingesetzt. Es wurde eine Waters 2690-HPLC-Anlage
(Waters, Eschborn) verwendet. Die gleichzeitige Detektion von Standardkomponenten und
14
C-markierten Reaktionsprodukten wurde durch 2 hintereinander geschaltene Detektoren
ermöglicht. UV/VIS-Spektren wurden mit einem Photo-Dioden-Array-Detektor L-3000
(Waters) aufgenommen, zur Radioaktivitätsbestimmung wurde ein Ramona-Feststoffszintillations-Radioaktivitätsdetektor (Raytest, Straubenhardt) benutzt.
Trennbedingung 1. Zur Auftrennung von CoA-Estern wurde eine RP-C18-Säule
(LiChrospher 100, 125 x 4 mm, Merck) eingesetzt. Die Säule wurde zunächst mit 1 % (v/v)
Acetonitril in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,7) äquilibriert. Die CoA-Ester wurden
über einen linearen Gradienten von 1 – 8 % (v/v) Acetonitril in 50 mM KaliumphosphatPuffer (pH 6,7) über 30 min bei einem Fluss von 1 mL min-1 getrennt.
Retentionszeiten: Malonyl-CoA (10 min), L-Malyl-CoA (10 min), CoA (13 min), SuccinylCoA (13 min), Acetyl-CoA (19 min), Propionyl-CoA (26 min).
Trennbedingung 2. Zur Auftrennung von CoA-Estern wurde eine RP-C18-Säule
(LiChrospher 100, 125 x 4 mm, Merck) eingesetzt. Die Säule wurde zunächst mit 2 % (v/v)
Acetonitril in 200 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 4,5) äquilibriert. Die CoA-Ester wurden
über einen linearen Gradienten von 2 – 10 % (v/v) Acetonitril in 50 mM KaliumphosphatPuffer (pH 6,7) über 40 min bei einem Fluss von 1 mL min-1 getrennt.
Retentionszeiten: L-Malyl-CoA (8 min), CoA (10 min), Succinyl-CoA (18 min).
Trennbedingung 3. Zur Trennung von freien organischen Säuren wurde eine Polyspher OA
HY-Säule (300 x 6,5 mm, Merck) eingesetzt. Als Eluent diente 12,5 mM H2SO4 bei einer
Flussrate von 0,8 mL min-1.
Retentionszeiten: Malonyl-CoA (4,4 min), 3-Hydroxypropionat (8,3 min).
Trennbedingung 4. Um 3-Phosphoglycerat als Fixierungsprodukt der RubisCO
nachzuweisen wurde eine Nucleosil 100-10SB-Säule verwendet (Machery-Nagel, Düren). Die
MATERIAL UND METHODEN
44
Säule wurde mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,7) bei einer Flussrate von 0,6 mL
min-1 gewaschen, anschließend erfolgte die Elution über einen Gradienten von 0 – 500 mM
KCl innerhalb von 20 min.
Retentionszeiten: Glycerat (7,5 min), Pyruvat (10 min), 2-Phosphoglycerat (20 min), 3Phosphoglycerat (20,5 min), 2,3-Bisphosphoglycerat (25,5 min).
11.2 Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie
Die 13C-NMR-spektroskopischen Messungen wurden am Institut für Organische
Chemie und Biochemie der Technischen Universität München von Dr. Wolfgang Eisenreich
in der Arbeitsgruppe von Prof. Adelbert Bacher durchgeführt. Die Messungen erfolgten an
einem AVANCE 360 Spektrometer (Bruker, Karlsruhe) bei 360 bzw. 90 MHz. Die
Auswertung der Daten erfolgte mit XWIN-NMR-Software 3.1 (Bruker, Karlsruhe). Als
Lösungsmittel wurde eine 0,1 M deuterierte Salzsäure verwendet. 13C-Anreicherungen
wurden durch Vergleich der Signalintegrale mit entsprechenden Signalintegralen aus
Spektren von Proben natürlicher 13C-Anreicherung bestimmt (Eisenreich und Bacher, 2000).
Die Berechnung der relativen 13C-Anreicherung erfolgte nach der Formel E = 1,1 (Imark/Ina ·
1/k). Dabei sind: E = 13C-Anreicherung, Imark = Integral der Linien des Kohlenstoffatoms der
untersuchten Substanz, Ina = Integral der Linien des Kohlenstoffatoms der Referenzsubstanz
mit natürlicher Anreicherung, k ist jeweils durch den Wert von Imark/Ina des Kohlenstoffatoms
mit der geringsten 13C-Anreicherung gegeben. Das Kohlenstoffatom mit der geringsten
Anreicherung diente als interner Standard. Die natürliche Anreicherung wurde als 1,1 %
angenommen.
12.
Analytische Methoden
12.1 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung erfolgte über die Methode nach Bradford (Bradford, 1976). Als
Standard diente Rinderserumalbumin (BSA).
12.2 Bestimmung von Radioaktivität
Die Radioaktivität von 14C-markierten Proben wurde über Flüssigszintillationsmessung
bestimmt. Bis zu 200 µL Probe wurden mit 3 ml Szintillationscocktail (Rotiszint eco plus,
Roth, Karlsruhe) versetzt und in einem Szintillationszähler (Tri Carb 2100TR, Packard,
Meriden, USA) gemessen. Die Zählausbeute wurde über das Kanalverhältnis bestimmt und
lag bei 75 – 90 %. Die gemessenen Werte wurden entsprechend korrigiert.
13.
Elektrophoretische Methoden
13.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer apparenten Molekülmasse wurde die
diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli 1970) verwendet.
Gel. Die Proteine wurden im Sammelgel (4 % Polyacrylamid, pH 6,8) fokussiert und im
Trenngel (8 %, 12,5 % oder 15 % Polyacrylamid, pH 8,8) nach ihrer Molekülmasse
aufgetrennt.
Probenvorbereitung. Die Proteinproben (3 – 20 µg) wurden mit 1 Volumen Probenpuffer
versetzt und zur vollständigen Denaturierung 5 min auf 95°C erhitzt. Der Probenpuffer
MATERIAL UND METHODEN
45
(zweifach konzentriert) bestand aus 0,25 mM DTE, 60 % (w/v) Glycerin, 0,2 M Tris/HCl (pH
6,8), 2 % (w/v) SDS und 0,01 % (w/v) Bromphenolblau. Proben mit geringem Proteingehalt
(< 1 mg/mL) wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit Trichloressigsäure (TCA) gefällt.
Die Proteinfällung erfolgte in einer 8 %igen TCA-Lösung. 100 µL Probe wurden mit 33 µL
einer 24 %igen TCA-Lösung versetzt und 15 min auf Eis inkubiert. Das ausgefallene Protein
wurde anschließend abzentrifugiert (20 min, 20.000 g) und das Pellet in 10 µL 1 M NaOH
und 10 µL Probenpuffer aufgenommen.
Molekularmassenmarker. Die Molekülmasse von Enzymuntereinheiten wurde durch den
Vergleich mit Standardproteinen abgeschätzt. Als Molekülmassenmarker dienten: Kaninchen
Myosin (205 kDa), β-Galactosidase (116 kDa), Phosphorylase B (97 kDa),
Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (45 kDa), L-Lactat-Dehydrogenase (34 kDa),
Carboanhydrase (29 kDa) und Lysozym (14 kDa).
Gelfärbung. Die Färbung der Polyacrylamidgele mit Coomassie erfolgte mit getrennten
Fixier- und Färbeschritten (H. Schägger, Universität Frankfurt a. M., mündliche Mitteilung).
Direkt nach der Elektrophorese wurde das Gel in Fixierlösung (30 % (v/v) Methanol, 20 %
(v/v) Essigsäure) gelegt und darin 30 min geschwenkt. Anschließend wurde das Gel für etwa
1 h in der Färbelösung (0,25 % (w/v) Coomassie-Blue R 250, 30 % (v/v) Ethanol) gefärbt.
Zur Entfärbung wurde das Gel zunächst 30 min in Entfärbelösung I (30 % (v/v) Ethanol, 10
% (v/v) Essigsäure) geschwenkt, und anschließend zur Entfärbung des Hintergrundes mehrere
Stunden in Entfärbelösung II (8 % (v/v) Essigsäure) gelegt.
13.2 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung von DNA-Molekülen nach ihrer Größe wurde die AgaroseGelelektrophorese verwendet (nach Sambrook et al., 1989). Es wurden 1 % (w/v)
Agarosegele verwendet.
ERGEBNISSE
46
ERGEBNISSE
1.
Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus
Die Reduktion von Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat ist eine Schlüsselreaktion des
3-Hydroxypropionat-Zyklus. Sie besteht aus zwei Reduktionsschritten, zunächst aus der
Reduktion von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd (Malonatsemialdehyd-DehydrogenaseAktivität), dann aus der weiteren Reduktion von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat
(3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase-Aktivität). In Zellextrakten von C. aurantiacus sollten
diese Schlüsselaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus näher untersucht werden. Die
Enzyme dieser Aktivitäten sollten gereinigt und charakterisiert werden. Dabei war zu Beginn
der Untersuchungen unklar, ob zwei unabhängige Enzyme, eine CoA-acylierende AldehydDehydrogenase und eine Alkohol-Dehydrogenase existieren, oder ob beide Aktivitäten von
einem bifunktionellen Enzym katalysiert werden. Solche bifunktionellen Enzyme, die eine
Aldehyd- und eine Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität besitzen, wurden bei Bakterien schon
beschrieben, so etwa die Alkohol-Dehydrogenase AdhE von E. coli (Goodlove et al., 1989).
Sie katalysiert die Reduktion von Acetyl-CoA über Acetaldehyd zum Ethanol.
1.1
Malonyl-CoA-Reduktion im Zellextrakt
Die Malonyl-CoA-Reduktion konnte sowohl in Extrakten von autotroph, als auch von
heterotroph gewachsenen C. aurantiacus-Zellen nachgewiesen werden. Für die Reduktion
von Malonyl-CoA war NADPH notwendig; daher konnte die Aktivität in einem photometrischen Enzymtest über die Oxidation von NADPH bei 365 nm verfolgt werden. Die
spezifische Aktivität in Extrakten autotropher Zellen betrug 80 nmol reduziertes MalonylCoA min-1 (mg Protein)-1, in Extrakten heterotroph gewachsener Zellen war sie mit 30 nmol
min-1 (mg Protein)-1 weniger als halb so hoch. Die Enzymaktivität war nicht sauerstoffempfindlich, die höchste Aktivität konnte bei einem pH-Wert von 7,8 nachgewiesen werden.
NADPH konnte nicht durch NADH ersetzt werden.
ERGEBNISSE
1.2
47
Reinigung und Charakterisierung der Malonyl-CoA-Reduktase
Das Enzym, das die NADPH-abhängige Reduktion von Malonyl-CoA katalysierte,
wurde sowohl aus autotroph, als auch aus heterotroph gewachsenen Zellen von C.
aurantiacus gereinigt. Wie sich herausstellte, handelte es sich um ein bifunktionelles Enzym
(siehe Ergebnisse, Abschnitt 1.3), daher wurde es als Malonyl-CoA-Reduktase bezeichnet.
Tabelle 3 zeigt eine Reinigungstabelle für die Malonyl-CoA-Reduktase aus autotroph
gewachsenen Zellen. Der erste Reinigungsschritt war eine Hitzefällung. Hierdurch konnten
Pigmente, Lipide und auch unerwünschtes Protein entfernt werden. Es schlossen sich 4
Chromatographieschritte an: DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose, Blue-Sepharose und
Reactive Blue 4. Mit einer Ausbeute von 6 % und einer 125fachen Anreicherung wurde ein
fast homogenes Protein erhalten (Tabelle 3). Die Größenbestimmung über GelfiltrationsChromatographie ergab eine Molekularmasse von 300 ± 50 kDa. Auf dem SDS-Gel war eine
einzelne Bande mit einem geschätzten Molekulargewicht von 145 ± 15 kDa zu sehen
(Abbildung 10). Diese molekularen Daten sprechen für einen homodimeren Aufbau des
nativen Proteins (α2). Auf dem SDS-Gel war eine kleinere Verunreinigung zu sehen. Diese
lief etwas oberhalb der Malonyl-CoA-Reduktase-Untereinheit und war in heterotroph
gewachsenen Zellen in einer größeren Menge vorhanden als in autotroph gewachsenen
Zellen. Aus diesem Grund konnte die Bande nicht zur Malonyl-CoA-Reduktase gehören,
denn in diesem Fall würde man erwarten, dass sie, wie die Bande der Malonyl-CoAReduktase selbst, in autotroph gewachsenen Zellen in größerer Menge vorhanden ist als in
heterotroph gewachsenen Zellen.
Das Enzym war bei – 20°C in der Gegenwart von 10 % (v/v) Glycerin über mehrere
Wochen stabil, allerdings war es empfindlich gegenüber wiederholtem Einfrieren und
Auftauen. Um Hinweise auf etwaige chromophore Gruppen zu erhalten, wurde ein UV/VISSpektrum des Enzyms von 200 – 800 nm aufgenommen. Dieses zeigte keine Hinweise auf
solche Gruppen, es war nur der Proteinpeak bei 280 nm zu sehen.
Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäurensequenz wurde von Herrn Prof.
Hermann Schägger (Universität Frankfurt) durchgeführt. Sie ergab folgende Sequenz:
XGTGRLAGKIALITG. Das X an der ersten Position steht dabei für eine nicht sicher
identifizierte Aminosäure, wahrscheinlich handelte es sich aber um ein Serin.
ERGEBNISSE
48
Tabelle 3: Reinigung der Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus. Als
Ausgangsmaterial dienten 20 g frische Zellmasse autotroph gezüchteter Zellen von C.
aurantiacus.
Reinigungsschritt
a
Protein
(mg)
Aktivität
(µmol min-1)
Zellextrakta
616
Hitzefällung
Anreicherung
(-fach)
Ausbeute
(%)
99
spezifische
Aktivität
(µmol min-1
(mg Protein)-1)
0,08
1,0
100
225
101
0,225
2,8
102
DEAE-Sepharose
142
60
0,210
2,6
61
Phenyl-Sepharose
14
28
1,0
10
28
Blue-Sepharose
1,0
15
7,5
94
15
Reactive Blue 4
0,3
6
10,0
125
6
100.000 g Überstand
1 2
3 4
5
6
7
kDa
205
Malonyl-CoAReduktase
116
97
67
45
Abb. 10: Reinigung der Malonyl-CoA-Reduktase. Die Proteine im Zellextrakt und in den einzelnen
Fraktionen der Reinigung wurden über SDS-PAGE aufgetrennt. Es handelte sich um ein 8 % Gel, das
mit Coomassie gefärbt wurde. Aufgetragen wurden: (1) Gesamtextrakt von heterotroph gewachsenen
Zellen (15 µg Protein), (2) Extrakt nach Hitzefällung (15 µg Protein), (3) Enzymfraktion nach DEAESepharose-Chromatographie (10 µg Protein), (4) Enzymfraktion nach Phenyl-SepharoseChromatographie (10 µg Protein), (5) Enzymfraktion nach Blue-Sepharose-Chromatographie (5 µg
Protein), (6) Enzymfraktion nach Reactive Blue 4-Chromatographie (3 µg Protein), (7) Molekülmassen-Standardproteine. Der Pfeil auf der linken Seite zeigt die 145 kDa großen Bande der MalonylCoA-Reduktase.
ERGEBNISSE
1.3
49
Katalytische Eigenschaften der Malonyl-CoA-Reduktase
Die katalytischen Eigenschaften der Malonyl-CoA-Reduktase wurden bei einer
Temperatur von 55°C untersucht. Dies entspricht der optimalen Wachstumstemperatur von C.
aurantiacus. Eine Übersicht über die Eigenschaften der Malonyl-CoA-Reduktase zeigt
Tabelle 4. Die pH-Abhängigkeit des gereinigten Enzyms wurde mit den Puffersystemen 100
mM Tris/HCl und 100 mM MOPS/NaOH untersucht. Der optimale pH-Wert lag bei 7,8,
halbmaximale Enzymaktivitäten konnten bei pH-Werten von 6,5 und 8,5 gemessen werden.
Die Enzymaktivität folgte einer Michaelis-Menten-Kinetik. Über die Variation der
Substratkonzentration von Malonyl-CoA und NADPH, bei sättigender Konzentration des
jeweils anderen Substrats (1 mM Malonyl-CoA, 0,4 mM NADPH), wurden die apparenten
Km-Werte bestimmt. Sie lagen bei 30 µM für Malonyl-CoA und 25 µM für NADPH. Um
herauszufinden, ob das Enzym nur eine Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität
aufweist oder ob es sich um ein bifunktionelles Enzym handelt, wurde das Verhältnis
zwischen oxidiertem NADPH und reduziertem Malonyl-CoA bestimmt. Hierfür wurde eine
bekannte, limitierende Menge an Malonyl-CoA eingesetzt, während NADPH im Überschuss
vorhanden war. So konnte die Stöchiometrie von oxidiertem NADPH zu reduziertem
Malonyl-CoA auf einen Wert von 2:1 bestimmt werden, d. h. für die Reduktion von 1 mol
Malonyl-CoA wurden 2 mol NADPH verbraucht. Diese Stöchiometrie war der erste Hinweis
auf ein bifunktionelles Enzym. Damit würde die Malonyl-CoA-Reduktase folgende
Gesamtreaktion katalysieren:
Malonyl-CoA + 2 NADPH + 2 H+
3-Hydroxypropionat + CoA + 2 NADP+
Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms betrug 10 µmol reduziertes MalonylCoA min-1 (mg Protein)-1, dies entspricht einer Wechselzahl von 50 s-1 pro nativem Enzym
oder 25 s-1 pro Untereinheit. Unter der Wechselzahl versteht man die Anzahl an Substratmolekülen, die ein Enzymmolekül pro Zeiteinheit umsetzen kann.
Untersuchungen mit alternativen Substraten zeigten, dass die Malonyl-CoA-Reduktase
hochspezifisch gegenüber den natürlichen Substraten Malonyl-CoA und NADPH war.
NADPH konnte nicht durch NADH ersetzt werden, auch war keine Reduktion von AcetylCoA, Propionyl-CoA oder Succinyl-CoA zu beobachten. Malonatsemialdehyd, das
wahrscheinliche Zwischenprodukt, konnte nicht im Enzymtest eingesetzt werden, da diese
ERGEBNISSE
50
Verbindung nicht käuflich erworben werden konnte und es auch kein geeignetes Protokoll für
eine Synthese gab. Stattdessen wurde Glyoxylat, ein mögliches Analogon zum Zwischenprodukt Malonatsemialdehyd, eingesetzt. Malonatsemialdehyd unterscheidet sich nur durch
eine zusätzliche CH2-Gruppe von Glyoxylat. Dennoch wurde Glyoxylat nicht reduziert. Es
konnte also keine alternative Substanz gefunden werden, die anstatt Malonyl-CoA oder
Malonatsemialdehyd vom Enzym umgesetzt wurde.
Tabelle 4: Eigenschaften der Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus.
Malonyl-CoA-Reduktase
Substrate
Malonyl-CoA, 2 NADPH
Produkte
3-Hydroxypropionat, 2 NADP+, CoA
Intermediat
Malonatsemialdehyd
Spezifische Aktivität
10 µmol min-1 (mg Protein)-1
Km-Werte
30 µM für Malonyl-CoA,
25 µM für NADPH
pH-Optimum
7,8
Natives Molekulargewicht
300 ± 50 kDa
Molekulargewicht der
Untereinheiten
145 ± 15 kDa
Zusammensetzung
α2
Wechselzahl pro
Holoenzym
50 s-1
Spezifität (mM)
Malonyl-CoA (1) 100 %, Acetyl-CoA (1) < 1 %,
Succinyl-CoA (1) < 1 %, Propionyl-CoA (1) < 1 %,
Glyoxylat (2) < 1 %
NADPH (0,4) 100 %, NADH (0,4) < 1 %
Einfluss von divalenten
Kationen (mM)
Mg2+(2) 100 %, Ca2+ (2) 100 %,
Fe2+ (0,2) 120 %, Fe2+ (0,02) 110 %, Fe2+ (0,002) 100 %,
Mn2+ (2) 40 %, Co2+ (2) 40 %, Ni2+ (2) 30 %, Zn2+ (2) < 2 %
N-terminale
Aminosäurensequenz
XGTGRLAGKIALITG
Um maximale Aktivität zu erreichen, benötigte die Malonyl-CoA-Reduktase
zweiwertige Kationen. So konnte sowohl durch die Zugabe von 0,02 mM Fe2+, als auch durch
die Zugabe von 2 mM Mg2+ oder 2 mM Ca2+ maximale Aktivität erhalten werden. Durch eine
höhere Konzentration an Fe2+ konnte die Enzymaktivität sogar noch etwas weiter gesteigert
ERGEBNISSE
51
werden (siehe Tabelle 4). Allerdings kommt Fe2+ in der Zelle nur in äußerst geringer
Konzentration vor und ist deshalb vermutlich kein natürlicher Cofaktor. Der Standardenzymtest enthielt 2 mM Mg2+; wurde dieses weggelassen, so konnte nur 50 % der
maximalen Enzymaktivität gemessen werden. Der Zusatz von 0,5 mM EDTA führte zu 90
%iger Hemmung der Enzymaktivität. Ein zweiwertiges Metallion scheint daher nötig zu sein.
Der Zusatz von 2 mM Ni2+, 2 mM Co2+ oder 2 mM Mn2+ führte ebenfalls zu einer reduzierten
Enzymaktivität. Durch die Zugabe von 2 mM Zn2+ konnte sogar eine Inaktivierung des
Enzyms erreicht werden (< 2 % verbleibende Aktivität). Dieser Effekt konnte nicht durch den
Zusatz anderer Ionen wieder aufgehoben werden.
Die gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase katalysierte auch die Rückreaktion, d. h. die
NADP+-abhängige Oxidation von 3-Hydroxypropionat. Diese wurde allerdings nur mit einer
sehr geringen Rate von ca. 5 % der Rate der Vorwärtsreaktion katalysiert. Dabei konnte
NADP+ nicht durch NAD+ ersetzt werden. Der Zusatz von freiem CoA war für diese
Enzymaktivität nicht erforderlich, d. h. die Rückreaktion stoppt vermutlich bei der Bildung
des Semialdehyds. Die gemessene Rückreaktion ist ein weiteres Indiz für ein bifunktionelles
Enzym und stellt sich folgendermaßen dar:
3-Hydroxypropionat + NADP+
1.4
Malonatsemialdehyd + NADPH + H+
Malonatsemialdehyd als Intermediat der Malonyl-CoA-Reduktase
Bei der Malonyl-CoA-Reduktase handelt es sich um ein großes bifunktionelles Enzym,
das eine Aldehyd-Dehydrogenase- (CoA-acylierend) und eine Alkohol-DehydrogenaseAktivität besitzt. Malonatsemialdehyd wird als Intermediat postuliert. Dabei könnte Malonatsemialdehyd entweder enzymgebunden bleiben oder zwischenzeitlich freigesetzt werden. Um
diese Frage zu klären, wurde die Umsetzung von 14C-markiertem Malonyl-CoA durch
gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase beobachtet. Die entstandenen radioaktiv markierten
Produkte wurden über HPLC aufgetrennt und analysiert (Abbildung 11). Es konnte die
Bildung eines Zwischenproduktes beobachtet werden. Bei diesem handelte es sich
wahrscheinlich um Malonatsemialdehyd, allerdings war eine eindeutige Identifikation über
Coelution nicht möglich, da Malonatsemialdehyd nicht zur Verfügung stand. Das beobachtete
Zwischenprodukt wurde im Verlauf der Reaktion vollständig verbraucht und schließlich war
nur noch 3-Hydroxypropionat als Endprodukt vorhanden. Im Substrat [2-14C]-Malonyl-CoA
war eine Verunreinigung vorhanden. Diese coeluierte mit dem Zwischenprodukt, allerdings
ERGEBNISSE
52
konnte eindeutig eine Zunahme der Peakfläche beobachtet werden, die auf das gebildete
Zwischenprodukt zurückzuführen war. Aus diesem Versuch könnte geschlossen werden, dass
Malonatsemialdehyd als freies Intermediat entsteht.
Relative Menge 14C
0 min
Malonyl-CoA
X
3-Hydroxypropionat
1 min
15 min
0
10
20
30
Retentionszeit (min)
Abb. 11: Produkte der Malonyl-CoA-Reduktase. Gezeigt ist die HPLC-Analyse von 14C-markierten
Produkten, die durch die gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase aus 14C-markiertem Malonyl-CoA
gebildet wurden. Die Abbildung zeigt die HPLC-Trennung des Reaktionsgemischs nach 3
Zeitpunkten. Bei Produkt X handelte es sich wahrscheinlich um Malonatsemialdehyd. Zum Zeitpunkt
0 min war ausschließlich die eingesetzte Menge von 0,15 mM [2-14C]-Malonyl-CoA detektierbar; der
kleine Peak, der mit Produkt X comigrierte, war wahrscheinlich freies [2-14C]-Malonat, eine
Verunreinigung von [2-14C]-Malonyl-CoA.
Wenn dies der Fall wäre, sollte Malonatsemialdehyd mit Aldehyd-abfangenden
Substanzen reagieren. Daher wurde die Stöchiometrie von oxidiertem NADPH zu
reduziertem Malonyl-CoA in Anwesenheit der Aldehyd-abfangenden Substanz Semicarbazidhydrochlorid untersucht. Durch die Addition von Aldehyden an Semicarbazid kommt es zur
Ausbildung eines Semicarbazons. Malonatsemialdehyd würde so aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden und die Weiterreaktion zu 3-Hydroxypropionat könnte nicht
stattfinden. Während eine Stöchiometrie von 2 mol oxidiertem NADPH pro 1 mol
zugegebenem Malonyl-CoA in Abwesenheit von Semicarbazid beobachtet wurde, war die
Stöchiometrie nach dessen Zusatz auf ein Verhältnis von 1:1 herabgesetzt. Dieses Ergebnis
ERGEBNISSE
53
unterstützte die Vermutung, dass Malonatsemialdehyd als freies Intermediat auftritt, denn nur
dann kann er mit Semicarbazid unter Bildung des Semicarbazons reagieren. Der Zusatz von
Semicarbazid resultierte zusätzlich in einer Abnahme der NADPH-Reduktions-Rate um 50 –
60 %. Dieses Ergebnis ist durch die Unterbindung der zweiten NADPH-verbrauchenden
Teilreaktion erklärbar. Die Ergebnisse lassen auf die Katalyse folgender Reaktionsschritte
durch die Malonyl-CoA-Reduktase schließen:
(1)
Malonyl-CoA + NADPH + H+
Malonatsemialdehyd + CoA + NADP+
(2)
Malonatsemialdehyd + NADPH + H+
1.5
Sequenzierung des Malonyl-CoA-Reduktase Gens (mcr)
3-Hydroxypropionat + NADP+
Das Genom von C. aurantiacus Stamm J-10-fl wird am „DOE Joint Genome Institute“
(USA) sequenziert. Diese Genomdatenbank, in der die noch unvollständige Genomsequenz
von C. aurantiacus veröffentlicht ist, wurde für die Identifikation des Gens der Malonyl-CoAReduktase (mcr) herangezogen (http://www.jgi.doe.gov/JGI_microbial/html/chloroflexus/
chloro_homepage.html). Bei dem sequenzierten Stamm handelt es sich allerdings um einen
anderen Stamm, als den für diese Untersuchung verwendeten (Stamm OK-70-fl). Ausgehend
von der N-terminalen Aminosäurensequenz der Malonyl-CoA-Reduktase
(SGTGRLAGKIALITG) konnte in der C. aurantiacus-Genbank ein mögliches offenes
Leseraster (ORF) gefunden werden, das für ein Protein codiert, welches dieselbe N-terminale
Aminosäurensequenz besitzt. Dieses ORF lag auf Contig 1090. Allerdings beinhaltete der
Contig nicht die komplette Gensequenz für das Protein, sondern nur einen kurzer Abschnitt,
der für 260 Aminosäuren codiert, der größte Teil der C-terminalen Sequenz fehlte. Um die
Gensequenz zu vervollständigen, wurde innerhalb der gefundenen Gensequenz ein Primer
(Mcr-for) abgeleitet. Dieser wurde als einziger Primer einer PCR-Reaktion eingesetzt. Dabei
wurde eine Annealingtemperatur von 50°C gewählt, um auch eine unspezifische Anlagerung
des Primers zu ermöglichen. Durch diese Methode wurden mehrere PCR-Fragmente erhalten.
Die prominenteste Bande wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und das ca. 2500 bp
große Fragment gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde in den Vektor pCRII-TOPO
kloniert und in E. coli TOP10 transformiert. Das Plasmid wurde isoliert und mit Hilfe der
Vektor-Primer M13-for und M13-rev ansequenziert. Es stellte sich heraus, dass auch die
Gensequenz am 3´-Ende des PCR-Fragments in der Gendatenbank von C. aurantiacus zu
ERGEBNISSE
54
finden war, auf Contig 764. Zwischen den beiden Sequenzen der unterschiedlichen Contigs
fehlten mehreren hundert bp. Durch Sequenzierung chromosomaler C. aurantiacus-DNA mit
abgeleiteten Primern der bekannten Sequenzen konnte die Sequenz vervollständigt werden.
Mit aus den Contigs abgeleiteten Primern vom Anfang (Mcr-Start) und Ende (Mcr-End) des
gesamten ORF konnte das gesamte mcr-Gen über PCR aus chromosomaler DNA von C.
aurantiacus amplifiziert werden. Die Sequenzierung dieses PCR-Fragments bestätigte die
bekannten Teilsequenzen des mcr-Gens.
Das gesamte ORF weist 3663 bp auf, das abgeleitete Protein besteht aus 1220
Aminosäuren. Beide Sequenzen sind im Anhang aufgelistet, die Eintragung der Sequenzen in
die Datenbank ist eingereicht. Das berechnete Molekulargewicht beträgt 132 kDa, dies
entspricht etwa dem über SDS-PAGE abgeschätzten Molekulargewicht der Untereinheit der
Malonyl-CoA-Reduktase von 145 ± 15 kDa. Abbildung 12 zeigt eine schematische
Darstellung der Domänen der Malonyl-CoA-Reduktase. Über Sequenzanalyse wurden zwei
Dehydrogenase-Domänen gefunden. Dabei handelt es sich um so genannte FabG-Domänen,
die Ähnlichkeiten zu Alkohol-Dehydrogenasen für kurzkettige Alkohole aufweisen. Die erste
Domäne besteht aus den Aminosäuren 5 bis 240, die zweite aus den Aminosäuren 590 bis
865. Datenbankanalysen zeigten für die beiden Proteinbereiche Ähnlichkeiten zu
verschiedenen Dehydrogenasen. Eine Sekundärstruktur-Analyse ergab für diese Bereiche
NAD(P)-Bindedomänen in der Rossmann-Faltung. Die restliche Proteinsequenz der MalonylCoA-Reduktase zeigte keine signifikanten Ähnlichkeiten zu Proteinen in Datenbanken. Auch
zueinander zeigten die beiden in Abbildung 12 schwarz dargestellten Domänen keine
Ähnlichkeiten.
1
200
400
ADH/FabG-Domäne
←Contig 1090
600
800
1000
1220 Aminosäuren
ADH/FabG-Domäne
Contig 764 →
Abb. 12: Schematische Darstellung der Malonyl-CoA-Reduktase. Die funktionellen Domänen des
1220 Aminosäuren langen Proteins sind rot dargestellt. Der schraffierte Kasten stellt den fehlenden
Sequenzabschnitt zwischen Contig 1090 und Contig 764 dar.
ERGEBNISSE
2.
55
Schlüsselenzyme der CO2-Fixierungswege in Crenarchaeota
In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl thermophiler und hyperthermophiler
Mikroorganismen isoliert, die autotroph wachsen können und dem Phylum der Crenarchaeota
angehören. Die meisten dieser Organismen wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Karl Otto
Stetter (Universität Regensburg) isoliert. Dr. Harald Huber aus dessen Arbeitsgruppe stellte
uns einige dieser Organismen zur Verfügung. Über die Art der autotrophen CO2-Fixierung bei
den Crenarchaeota war bislang wenig bekannt. Daher wurden repräsentative Vertreter herausgegriffen und in deren Zellextrakten nach Schlüsselenzymen bekannter CO2-Fixierungswege
gesucht. Es wurden folgende Mikroorganismen untersucht: Pyrodictium abyssi, Pyrodictium
occultum, Ignicoccus islandicus, Ignicoccus pacificus, Acidianus ambivalens, Metallosphaera
sedula, Sulfolobus sp. VE 6 und Pyrobaculum islandicum. Die Wachstumsbedingungen aller
untersuchten Organismen, sowie die berechneten CO2-Fixierungsraten bei autotrophem
Wachstum sind in Tabelle 2 (Material und Methoden, Abschnitt 2.6) zusammengefasst.
Zunächst wurde der Nachweis biotinylierter Proteine in Zellextrakten durchgeführt.
Diese Untersuchung sollte erste Hinweise auf ein Vorhandensein der Enzyme Acetyl-CoACarboxylase und Propionyl-CoA-Carboxylase geben, da diese eine Biotin-enthaltende
Untereinheit besitzen. Anschließend wurden die Enzymaktivitäten folgender Enzyme
gemessen: Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase als Schlüsselenzym des CalvinZyklus; ATP-Citrat-Lyase, α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und Pyruvat:AkzeptorOxidoreduktase als Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus; CO-Deydrogenase und
Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase als Schlüsselenzyme des reduktiven Acetyl-CoA-Wegs;
sowie die Reduktion von Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat, die reduktive Umformung
von 3-Hydroxypropionat zu Propionyl-CoA, Acetyl-CoA-Carboxylase und Propionyl-CoACarboxylase als Schlüsselenzymaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Als
Positivkontrollen wurden die Schlüsselenzyme zusätzlich bei Bakterien gemessen, deren CO2Fixierungsweg als etabliert gilt. Dies waren: Ralstonia eutropha (Calvin-Zyklus, Bowien et
al., 1976; Siebert et al., 1981), Desulfobacter hydrogenophilus (reduktiver Citrat-Zyklus,
Schauder et al., 1987), Desulfobacterium autotrophicum (reduktiver Acetyl-CoA-Weg,
Schauder et al., 1989) und Chloroflexus aurantiacus (3-Hydroxypropionat-Zyklus, Strauss
und Fuchs, 1993).
ERGEBNISSE
2.1
56
Biotinylierte Proteine in Zellextrakten von Crenarchaeota
Die Zellextrakte der acht Archaea wurden auf biotinhaltige Proteine untersucht, um
Hinweise auf die Acetyl-CoA- oder Propionyl-CoA-Carboxylase zu erhalten. Hierfür wurden
die Proteine in den Zellextrakten über ein SDS-Gel aufgetrennt, geblottet und anschließend
Biotinproteine mit einer Avidin-gekoppelten Peroxidase spezifisch nachgewiesen. Das
Ergebnis dieser Färbung ist in Abbildung 13 gezeigt. Diese empfindliche Methode zeigt die
Bande eines Biotinproteins in A. ambivalens, M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6. In den
anderen Organismen konnte dagegen kein biotinhaltiges Protein nachgewiesen werden. Diese
Ergebnisse deuten auf die Anwesenheit von Acetyl-CoA- und/oder Propionyl-CoACarboxylase und damit auf den 3-Hydroxypropionat-Zyklus als CO2-Fixierungsweg in den
an
us
a
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ic u
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m
ys
si
Vertretern der Familie Sulfolobaceae hin.
Abb. 13: Biotinproteine in Zellextrakten. Gezeigt ist die Anfärbung von biotinylierten Proteinen in
Zellextrakten der untersuchten Crenarchaeota mit Avidin-gekoppelter Peroxidase. Extrakt von E. coli
diente als Positivkontrolle. Die Proteine (80 µg pro Spur) wurden über ein 12,5 % Polyacrylamidgel
aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Gezeigt sind Biotinproteine
im Größenbereich von 40 – 10 kDa.
ERGEBNISSE
2.2
57
Enzymaktivitäten der Crenarchaeota
In den nachfolgenden Abschnitten sind die Ergebnisse der Untersuchungen nach
Schlüsselenzymen beschrieben. Dabei wurden die Organismen nach ihren Familien eingeteilt.
Tabelle 5 zeigt eine Übersicht über die Messergebnisse.
2.2.1 Pyrodictiaceae
Die Enzymaktivitäten der hyperthermophilen Mikroorganismen Pd. abyssi und Pd.
occultum wurden bei 75°C gemessen. Diese Temperatur liegt deutlich unterhalb der
optimalen Wachstumstemperatur der Organismen von 97°C bzw. 105°C; daher sollten die
tatsächlichen Aktivitäten der Enzyme in den lebenden Organismen deutlich höher als die
gemessenen Werte sein. Im Allgemeinen geht man von einer Verdopplung der Enzymaktivität
bei einer Temperatursteigerung von 10°C aus.
Von den untersuchten Schlüsselenzymen waren bei beiden Pyrodictium spp. Aktivitäten
der RubisCO und der Pyruvat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase zu finden (Tabelle
5). Die Rate der RubisCO-Aktivität betrug bei einer Messtemperatur von 75°C bei beiden
Organismen bis zu 15 nmol min-1 (mg Protein)-1. Extrapoliert man dies auf die optimalen
Wachstumstemperaturen von 97° bzw. 105°C, so ergeben sich theoretische Aktivitätsraten
von 60 bzw. 120 nmol min-1 (mg Protein)-1. Die Ergebnisse einer detaillierten Untersuchung
der RubisCO-Aktivität sind in Abschnitt 3 des Ergebnisteils gezeigt. Eine Phosphoribulokinase-Aktivität mit ATP als Phosphoryldonor war nicht nachweisbar.
Die Pyruvat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase war in beiden Organismen mit
ziemlich hohen Raten von 170 – 240 nmol min-1 (mg Protein)-1 bei Pd. abyssi und 120 – 140
nmol min-1 (mg Protein)-1 bei Pd. occultum messbar. Die Schlüsselenzyme des reduktiven
Citrat-Zyklus, ATP-Citrat-Lyase und α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase, waren nicht
nachzuweisen. Eine CO-Oxidation war in Pd. abyssi mit geringer Rate (10 nmol min-1 (mg
Protein)-1) zu beobachten. Diese Schlüsselaktivität des reduktiven Acetyl-CoA-Wegs konnte
dagegen in Pd. occultum nicht nachgewiesen werden. Wenn man bedenkt, wie hoch die
Aktivitäten der CO-Dehydrogenase in Organismen mit diesem Enzym im Allgemeinen sind
(z. B. 2000 nmol min-1 (mg Protein)-1 in D. autotrophicum), dann kann man die Aktivität von
Pd. abyssi nicht signifikant nennen.
ERGEBNISSE
58
Tabelle 5: Enzymaktivitäten von Schlüsselenzymen autotropher CO2-Fixierungswege. Die spezifischen Aktivitäten sind in nmol min-1 (mg Protein)-1 angegeben. Die
Ergebnisse wurden durch mehrere unabhängige Messungen bestätigt. Die Messtemperatur betrug bei den Crenarchaeota 75°C, die Enzyme der Kontrollorganismen wurden
bei der jeweiligen Wachstumstemperatur gemessen. (n. b. = nicht bestimmt).
Enzymaktivität
Pyrodictium Pyrodictium Ignicoccus
abyssi
occultum
islandicus
Ignicoccus
pacificus
Acidianus Metallosphaera Sulfolobus
ambivalens sedula
sp. VE 6
Pyrobaculum Kontrolle
islandicum
5 – 15
5 – 15
1 – 2,2
1 – 1,8
<1
<1
<1
<1
180
R. eutropha
• ATP-Citrat-Lyase
<1
n. b.
<1
<1
<1
<1
<1
15 – 25
• α-Ketoglutarat:AkzeptorOxidoreduktase (MV/BV)
• Pyruvat:AkzeptorOxidoreduktase (MV/BV)
<1
<1
<1
<1
≤1
20 – 35
15 – 20
430 – 480
170 – 240
120 – 140
190 – 260
140 – 230
≤1
10 – 25
≤1
140 – 170
900
D. hydrogenophilus
510
D. hydrogenophilus
330
D. hydrogenophilus
• CO-Dehydrogenase (MV)
≤ 10
<1
<1
<1
<1
<1
<1
≤5
• Pyruvat:AkzeptorOxidoreduktase (MV/BV)
170 – 240
120 – 140
190 – 260
140 – 230
≤1
10 – 25
≤1
140 – 170
<1
≤5
≤5
45 – 55
80 – 120
3 – 25
<1
Calvin-Zyklus
• Ribulose-1,5-bisphosphat
Carboxylase
Reduktiver Citrat-Zyklus
Reduktiver Acetyl-CoA-Weg
2000
D. autotrophicum
560
D. autotrophicum
3-Hydroxypropionat-Zyklus
<1
• Reduktion von MalonylCoA zu 3-Hydroxypropionat
<1
• Reduktion von 3-Hydroxypropionat zu Propionyl-CoA
n. b.
• Acetyl-CoA-Carboxylase
<1
<1
<1
45 – 60
40 – 50
10 – 20
<1
n. b.
≤1
≤1
55 – 65
40 – 45
2–5
<1
• Propionyl-CoA-Carboxylase n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
55 – 65
45 – 55
4–5
n. b.
160
C. aurantiacus
100
C. aurantiacus
18
C. aurantiacus
20
C. aurantiacus
ERGEBNISSE
59
2.2.2 Desulfurococcaceae
Die Enzymaktivitäten bei I. islandicus und I. pacificus, den autotrophen Vertretern der
Desulfurococcaceae wurden bei 75°C, also ebenfalls unterhalb ihrer optimalen Wachstumstemperatur von 90°C gemessen.
Beide Organismen enthielten die Enzymaktivität der Pyruvat:Akzeptor
(Methylviologen)-Oxidoreduktase. Die Raten waren dabei mit 190 – 260 nmol min-1 (mg
Protein)-1 für I. islandicus und 140 – 230 nmol min-1 (mg Protein)-1 für I. pacificus in einer
Größenordnung, wie sie für autotrophes Wachstum mit diesem carboxylierenden Enzym
benötigt wird (vergleiche Tabelle 2).
Relative Menge 14C
I. pacificus
5 min
10 min
5 min
R. eutropha
10 min
3-PGA
0
10
20
30
40
Retentionszeit (min)
Abb. 14: Produkte des RubisCO-Enzymtests. Gezeigt ist die HPLC-Analyse von 14C-markierten
Produkten, die in Zellextrakten von I. pacificus und R. eutropha bei der Ribulose-1,5-bisphosphatabhängigen Fixierung von 14C-Bicarbonat gebildet wurden. Die Auftrennung erfolgte jeweils 5 bzw.
10 min nach Reaktionsstart. Bei Zellextrakten von I. pacificus wurden geringe Mengen eines
Produktes gebildet, das nicht mit 3-Phosphoglycerat (3-PGA) coeluierte. Bei Extrakten von R.
eutropha bildete sich neben 3-Phosphoglycerat ein weiteres Produkt. Dieses hatte dieselbe
Retentionszeit wie Phosphoenolpyruvat.
ERGEBNISSE
60
Allerdings konnten keine weiteren Schlüsselenzyme autotropher CO2-Fixierungswege
nachgewiesen werden. Lediglich eine geringe Ribulose-1,5-bisphosphat-abhängige Fixierung
von 14C-markiertem CO2 war zu beobachten. Bei dem verwendeten Enzymtest wird die
Bildung säurestabiler, radioaktiv-markierter Produkte aus 14CO2 gemessen. Um die Frage zu
klären, welche Produkte dabei entstehen, wurde der Reaktionsansatz über HPLC aufgetrennt
(Abbildung 14). Aufgrund der Retentionszeit des gebildeten Produktes (6,5 min) kann
ausgeschlossen werden, dass es sich dabei um 3-Phosphoglycerat handelt (Retentionszeit 20,5
min). Es ist daher keine RubisCO-Aktivität vorhanden.
2.2.3 Sulfolobaceae
Aus der Gruppe der Sulfolobaceae wurden die Organismen A. ambivalens, M. sedula
und Sulfolobus sp. VE 6 untersucht. Die Enzymaktivitäten wurden bei M. sedula bei 65°C
gemessen, bei A. ambivalens und Sulfolobus sp. VE 6 bei 75°C. Die optimalen Wachstumstemperaturen betragen: 75°C für M. sedula, 85°C für A. ambivalens und 90°C für Sulfolobus
sp. VE 6.
In allen drei Organismen konnten die untersuchten Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus nachgewiesen werden. Bei A. ambivalens und M. sedula waren die
Aktivitäten hoch genug, um autotrophes Wachstum zu erklären. Lediglich bei Sulfolobus sp.
VE 6 waren die Aktivitäten niedriger, allerdings ließen sich die Schlüsselenzyme des 3Hydroxypropionat-Zyklus auch hier eindeutig nachweisen (siehe Tabelle 5). Die geringeren
Raten könnten möglicherweise auf den schlechten Zustand der Zellen zurückgeführt werden.
RubisCO-, ATP-Citrat-Lyase- und CO-Dehydrogenase-Aktivitäten waren in keinem der
Organismen zu finden; ein anderes Bild zeigte sich bei den Oxidoreduktase-Aktivitäten. In M.
sedula konnte sowohl α-Ketoglutarat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase-, als auch
Pyruvat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase-Aktivität nachgewiesen werden. Die
Raten betrugen 20 – 35 nmol min-1 (mg Protein)-1 bzw. 10 – 25 nmol min-1 (mg Protein)-1. In
Sulfolobus sp. VE 6 war ebenfalls eine α-Ketoglutarat:Akzeptor (Benzylviologen)Oxidoreduktase-Aktivität mit einer Rate von 15 – 20 nmol min-1 (mg Protein)-1 zu messen,
allerdings keine Pyruvat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase-Aktivität. In A.
ambivalens konnte keines der beiden Enzyme nachgewiesen werden.
ERGEBNISSE
61
2.2.4 Thermoproteaceae
Die Enzymaktivitäten bei Pb. islandicum wurden bei 75°C gemessen, das Wachstumsoptimum liegt bei diesem Organismus bei 100°C.
Pb. islandicum enthielt alle Aktivitäten der Schlüsselenzyme des reduktiven CitratZyklus. Die Aktivitäten der α-Ketoglutarat:Akzeptor (Methylviologen)-Oxidoreduktase (430
– 480 nmol min-1 (mg Protein)-1) und der Pyruvat:Akzeptor (Methylviologen)-Oxidoreduktase
(140 – 170 nmol min-1 (mg Protein)-1) waren dabei deutlich höher als die Aktivität der ATPCitrat-Lyase (15 – 25 nmol min-1 (mg Protein)-1). Es ist allerdings zu beachten, dass die
Enzymaktivitäten 15°C unterhalb der Wachstumstemperatur gemessen wurden. Darüber
hinaus wurde der ATP-Citrat-Lyase-Enzymtest nicht optimiert. Es kann daher davon
ausgegangen werden, dass die Enzymaktivitäten ausreichen, um das autotrophe Wachstum zu
erklären. Es wurden keine Schlüsselenzyme weiterer CO2-Fixierungswege gefunden, lediglich
eine geringe CO-Oxidations-Rate konnte beobachtet werden. Diese lag mit maximal 5 nmol
min-1 (mg Protein)-1 in einem zu vernachlässigenden Bereich.
ERGEBNISSE
3.
62
RubisCO in Pyrodictiaceae
Bei Pd. abyssi und Pd. occultum wurde, wie schon erwähnt, RubisCO-Aktivität im
Zellextrakt nachgewiesen. Diese beiden Organismen sind die ersten Vertreter der
Crenarchaeota, für die diese Aktivität nachgewiesen werden konnte; daher wurde sie näher
charakterisiert.
Pd. abyssi
5 min
3-PGA
10 min
relative Menge 14C
Pd. occultum
5 min
3-PGA
PEP 10 min
5 min
R. eutropha
3-PGA
0
10
PEP 10 min
20
30
40
Retentionszeit (min)
Abb. 15: Produkte des RubisCO-Enzymtests. Gezeigt ist die HPLC-Analyse von 14C-markierten
Produkten, die in Zellextrakten von Pd. abyssi, Pd. occultum und R. eutropha bei der Ribulose-1,5bisphosphat-abhängigen Fixierung von 14C-Bicarbonat gebildet wurden. Die Auftrennung erfolgte
jeweils 5 bzw. 10 min nach Reaktionsstart. Bei allen drei Organismen konnte die Bildung von 3Phosphoglycerat (3-PGA) beobachtet werden. In Extrakten von Pd. occultum und R. eutropha bildete
sich ein zweites Produkt, das mit Phosphoenolpyruvat (PEP) coeluierte. Ein weiteres Produkt, das im
späteren Reaktionsverlauf in Extrakten von Pd. abyssi und Pd. occultum gebildet wurde, eluierte mit 5
– 6 min Retentionszeit. Es ist unklar, wobei es sich hierbei handelt.
ERGEBNISSE
63
Zunächst sollte die Bildung von 3-Phosphoglycerat als primäres CO2-Fixierungsprodukt
nachgewiesen werden. Die HPLC-Analyse der 14C-markierten Produkte der Ribulose-1,5bisphosphat-abhängigen Fixierung von 14CO2 ist in Abbildung 15 gezeigt. 3-Phosphoglycerat
wurde als erstes Produkt gebildet und konnte über Cochromatographie nachgewiesen werden.
Sowohl in Pd. occultum, als auch im Kontrollorganismus R. eutropha wurde neben 3Phosphoglycerat ein weiteres Produkt gebildet. Dieses eluierte nach etwa 23 min und hatte
damit die Retentionszeit von Phosphoenolpyruvat. Weitere nichtphosphorylierte Reaktionsprodukte mit einer Retentionszeit von etwa 6 min entstanden im späteren Reaktionsverlauf.
Die weitere Umsetzung von 3-Phosphoglycerat ist nicht ungewöhnlich, da die Versuche mit
Zellextrakt durchgeführt wurden und darin Enzyme und Cosubstrate enthalten sind, die mit 3Phosphoglycerat reagieren können. Phosphoenolpyruvat kann über Enzyme der Glykolyse
(Phosphoglycerat-Mutase und Enolase) leicht aus 3-Phosphoglycerat gebildet werden.
Um die Temperaturabhängigkeit der RubisCO-Aktivität von Pd. abyssi zu untersuchen,
wurde die Aktivität bei drei verschiedenen Temperaturen gemessen, bei 75°C, bei 85°C und
in kochendem Wasser bei 97°C. Das Ergebnis ist in Abbildung 16 gezeigt. Bei einer
Temperaturerhöhung von 10°C verdoppelte sich die Enzymaktivität. Dieses Verhalten wird
für die meisten Enzymaktivitäten erwartet. Die maximale Aktivität war im kochenden
Wasserbad bei einer Temperatur von 97°C zu messen, dies entspricht der optimalen
Wachstumstemperatur von Pd. abyssi.
Ein Charakteristikum der RubisCO von Methanococcus jannaschii, einem Vertreter der
Euryarcheaota mit einer Form-III-RubisCO, ist eine Sauerstoffempfindlichkeit des Enzyms
(Watson et al., 1999). Dieser Effekt ist vollständig reversibel. Auch für die RubisCOAktivitäten von Pd. abyssi und Pd. occultum sollte daher die Empfindlichkeit gegenüber
Sauerstoff überprüft werden. Es zeigte sich, dass die Enzyme strikt anaerobe, reduzierende
Bedingungen benötigten. In einem aeroben Ansatz bei 85°C war bei Pd. abyssi weniger als 20
% der bei dieser Temperatur maximalen Aktivität messbar (Abbildung 16). Ein
vergleichbares Ergebnis ergab sich auch bei Pd. occultum. Die Sauerstoffempfindlichkeiten
waren vollkommen reversibel. Wurde aerob inkubierter Zellextrakt wieder anaerobisiert und
die Aktivitätsmessung unter strikt anaeroben Bedingungen durchgeführt, so konnte wieder die
ursprüngliche Enzymaktivität gemessen werden. Dieses Verhalten deutet auf ein RubisCOProtein der Form III hin (vergleiche Diskussion, Abschnitt 4).
ERGEBNISSE
64
nmol fixiertes CO2 (mg Protein)-1
120
100
80
60
40
20
0
0 1
5
10
Zeit (min)
Abb. 16: Temperaturabhängigkeit der RubisCO-Aktivität von Pyrodictium abyssi. Gezeigt ist die
Ribulose-1,5-bisphosphat-abhängige Fixierung von 14C aus 14C-Bicarbonat in säurestabile Produkte
durch Zellextrakt von Pd. abyssi bei verschiedenen Temperaturen. Der Enzymtest wurde unter
anaeroben Bedingungen durchgeführt, ein Experiment unter aeroben Bedingungen ist ebenfalls
gezeigt. (▼) 75°C, (■) 85°C, (●) 97°C, dies entsprach der Temperatur im kochenden Wasserbad,
(♦) 85°C, aerobe Versuchsdurchführung.
ERGEBNISSE
4.
65
Vergleich der Enzymaktivitäten in autotroph und heterotroph gewachsenen Zellen
von Metallosphaera sedula
Bei M. sedula handelt es sich um unseren Modellorganismus. Die Züchtung war in
größerem Maßstab sowohl unter autotrophen, als auch unter heterotrophen Wachstumsbedingungen möglich. Daher wurden die weiteren Untersuchungen zum CO2-Fixierungsweg
der Sulfolobaceae mit M. sedula durchgeführt. Um Aussagen über die Regulation wichtiger
Enzyme des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels machen zu können, wurden die Enzymaktivitäten in Extrakten von autotroph und heterotroph gewachsenen Zellen von M. sedula
verglichen. Es wurden folgende Enzyme bzw. Enzymaktivitäten überprüft: Acetyl-CoACarboxylase, Propionyl-CoA-Carboxylase, Malonyl-CoA-Reduktion, 3-HydroxypropionatReduktion, Succinat-Dehydrogenase, Fumarat-Hydratase, L-Malyl-CoA-Lyase mit SuccinylCoA:Malat CoA-Transferase, L-Malyl-CoA-Lyase, PEP-Carboxykinase, PyruvatCarboxylase, Pyruvat:Wasser-Dikinase, Pyruvat:Phosphat-Dikinase, Pyruvat-Kinase, CitratSynthase, Aconitase, Isocitrat-Dehydrogenase, α-Ketoglutarat-Dehydrogenase, αKetoglutarat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase, Malat-Dehydrogenase, PyruvatDehydrogenase, Pyruvat:Akzeptor (Benzylviologen)-Oxidoreduktase und Isocitrat-Lyase. Die
Enzymmessungen wurden bei 65°C durchgeführt, die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
M. sedula wächst sowohl unter autotrophen, als auch unter heterotrophen Bedingungen
mit einer minimalen Generationszeit von 8 h. Der Zellkohlenstoff stammt bei den
verschiedenen Wachstumsbedingungen aber aus unterschiedlichen Quellen. Demzufolge
werden andere Enzyme benötigt. Die Regulation von Enzymaktivitäten lässt Schlüsse auf die
Rolle der Enzyme im Metabolimus zu. Die Aktivitäten der Enzyme, die an der autotrophen
CO2-Fixierung beteiligt sind, sollten unter autotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert
sein. Enzyme, die für heterotrophes Wachstum benötigt werden, sollte man dagegen im
Extrakt heterotroph gewachsener Zellen mit höheren Aktivitäten messen können. Ihre
Beteiligung an der autotrophen CO2-Fixierung ist unwahrscheinlich.
ERGEBNISSE
66
Tabelle 6: Aktivitäten von Enzymen des zentralen Kohlenstoffmetabolismus in
Metallosphaera sedula. Vergleich von Enzymaktivitäten in Extrakten autotroph und
heterotroph gewachsener Zellen. Die Messungen wurden bei 65°C durchgeführt. Die Werte
sind Mittelwerte aus mindestens fünf verschiedenen unabhängigen Messungen. Die
Abweichung einzelner Messwerte vom Mittelwert betrug maximal 20 %.
Enzymaktivität
Acetyl-CoA-Carboxylase
spezifische Aktivität
(nmol min-1 (mg Protein)-1)
in autotroph
in heterotroph
gewachsenen Zellen gewachsenen Zellen
50
10
Propionyl-CoA-Carboxylase
50
10
Malonyl-CoA-Reduktion (NADPH)
120
10
3-Hydroxypropionat-Reduktion (NADPH)
50
25
Succinat-Dehydrogenase (DCPIP)
10
20
Fumarat-Hydratase
130
150
L-Malyl-CoA-Lyase plus SuccinylCoA:Malat CoA-Transferase
≤3
≤3
L-Malyl-CoA-Lyase
≤1
≤1
PEP-Carboxykinase
65
45
Pyruvat Carboxylase
10
1
Pyruvat:Wasser-Dikinase
<1
<1
Pyruvat:Phosphat-Dikinase
<1
<1
Pyruvat-Kinase
10
60
Citrat-Synthase
100
1500
Aconitase
25
70
Isocitrat-Dehydrogenase (NADP+)
550
3000
α-Ketoglutarat-Dehydrogenase
(NAD+)
(NADP+)
<1
<1
<1
<1
α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase (BV)
35
5
2200
800
6200
2000
Pyruvat-Dehydrogenase
(NAD+)
(NADP+)
<1
<1
<1
<1
Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase (BV)
20
1
Isocitrat-Lyase
4
7
Malat-Dehydrogenase
(NAD+)
(NADP+)
ERGEBNISSE
67
Eine höhere Aktivität in autotroph gewachsenen Zellen konnte bei Enzymaktivitäten des
3-Hydroxypropionat-Zyklus (Acetyl-CoA-Carboxylierungs-, Propionyl-CoA-Carboxylierungs-, Malonyl-CoA-Reduktions- und 3-Hydroxypropionat-Reduktions-Aktivität) nachgewiesen werden. Die L-Malyl-CoA-Lyase, ebenfalls ein Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus in C. aurantiacus, konnte dagegen in M. sedula nicht nachgewiesen werden.
Im Gegensatz zu den Enzymaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus waren die Aktivitäten
der Citrat-Zyklus-Enzyme Fumarat-Hydratase, Malat-Dehydrogenase, Citrat-Synthase,
Aconitase und Isocitrat-Dehydrogenase in heterotroph gewachsenen Zellen deutlich höher.
Interessanterweise konnten unter beiden Wachstumsbedingungen weder α-KetoglutaratDehydrogenase- noch Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität gemessen werden. Dagegen waren
die Aktivitäten der entsprechenden Oxidoreduktasen, welche im Enzymtest anstelle von
NAD(P)+ oxidierte Viologenfarbstoffe reduzieren, deutlich zu messen. Sie waren in Extrakten
autotroph gewachsener Zellen 5 – 10 fach höher als in Extrakten heterotroph gewachsener
Zellen. Diese Regulation könnte auf die Beteiligung am autotrophen Stoffwechsel schließen
lassen. Da zusätzlich keine L-Malyl-CoA-Lyase-Aktivität gemessen werden konnte, ist der
Weg der Acetyl-CoA-Regeneration in M. sedula unklar. Statt einer Malat-Spaltung könnte
hier die Carboxylierung von Succinyl-CoA zu α-Ketoglutarat eine Rolle spielen. Diese Frage
sollte über Markierungsexperimente geklärt werden (siehe Ergebnisse, Abschnitt 5).
Wie bildet M. sedula Oxalacetat? Auch diese Frage sollte über die Messung von
Enzymaktivitäten geklärt werden. Wenn man von Pyruvat als erstem zentralen Stoffwechselintermediat ausgeht, gibt es für dessen weitere Umsetzung mehrere Möglichkeiten. Zum einen
kann Phosphoenolpyruvat (PEP) direkt aus Pyruvat durch die Enzyme Pyruvat:WasserDikinase (PEP-Synthetase) oder Pyruvat:Phosphat-Dikinase gebildet werden. Die Bildung
von Oxalacetat aus PEP kann dann über die PEP-Carboxylase (irreversibel), die PEPCarboxykinase (reversibel) oder die PEP-Carboxytransphosphorylase (reversibel) erfolgen.
Zum anderen kann Oxalacetat auch direkt aus Pyruvat gebildet werden. Diese Reaktion wird
durch das Enzym Pyruvat-Carboxylase katalysiert. PEP würde dann aus Oxalacetat gebildet
werden, z. B. über die PEP-Carboxykinase. Die direkte Bildung von PEP aus Pyruvat ist für
M. sedula wahrscheinlich nicht möglich, da keine Enzymaktivitäten der Pyruvat:WasserDikinase oder der Pyruvat: Phosphat-Dikinase zu messen waren. Auch die PEP-Carboxylase
konnte nicht nachgewiesen werden. Stattdessen konnten Aktivitäten von Pyruvat-Carboxylase
und PEP-Carboxykinase gemessen werden. Damit könnte, ähnlich wie in Säugern, PEP in
zwei Schritten gebildet werden. Die direkte Carboxylierung von Pyruvat liefert Oxalacetat,
das dann zu PEP decarboxyliert wird.
ERGEBNISSE
5.
68
Langzeitmarkierung von Metallosphaera sedula mit [1,4-13C1]-Succinat
Die Aktivitäten von Schlüsselenzymen autotropher CO2-Fixierungswege und von
Enzymen des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels wurden in Zellextrakten von M. sedula
untersucht (vergleiche Ergebnisse, Abschnitte 2.2.3 und 4). Dabei konnten Enzymaktivitäten
des 3-Hydroxypropionat-Zyklus nachgewiesen werden. Die nachgewiesenen Enzymaktivitäten katalysieren die Reaktionsfolge von Acetyl-CoA über Malonyl-CoA und 3Hydroxypropionat zu Succinyl-CoA. Die Regeneration von Acetyl-CoA aus Succinyl-CoA
blieb dagegen unklar, da eine Malat-Spaltung über das Enzym L-Malyl-CoA-Lyase nicht
nachgewiesen werden konnte. Außerdem konnte die Enzymaktivität einer α-Ketoglutarat:
Akzeptor-Oxidoreduktase gemessen werden. Bemerkenswerterweise war diese Aktivität unter
autotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert. Dies legte nahe, dass die Oxidoreduktase
Succinyl-CoA reduktiv carboxylieren könnte. Das so entstandene α-Ketoglutarat könnte dann
Ausgangspunkt für die Regeneration von Acetyl-CoA sein.
Ob dieses Enzym am autotrophen Stoffwechselweg von M. sedula beteiligt ist, wurde
über Langzeitmarkierungsstudien mit [1,4-13C1]-Succinat überprüft. Hierfür wurde autotroph
wachsenden Zellen 13C-Succinat als zusätzliche Kohlenstoffquelle kontinuierlich zugefüttert.
Dabei wurde die Menge 13C-Succinat so dosiert, dass höchstens 10 % des Zellkohlenstoffs
aus Succinat stammten, mindestens 90 % aber aus CO2 (siehe Ergebnisse, Abschnitt 5.1)
Succinat wird so in die autotrophen Stoffwechselwege einbezogen und die 13C-Markierung
kann schließlich im Zellprotein wieder gefunden werden. Aus dem Markierungsmuster der
Aminosäuren können dann Aussagen über die genutzten Stoffwechselwege gemacht werden.
Die α-Ketoglutarat:Ferredoxin-Oxidoreduktase katalysiert die reduktive Carboxylierung
von Succinyl-CoA zu α-Ketoglutarat. Aus diesem leiten sich die Aminosäuren Glutamat und
Prolin ab. Über das 13C-Markierungsmuster dieser Aminosäuren kann auf das Markierungsmuster von α-Ketoglutarat geschlossen werden. Dieses unterscheidet sich eindeutig, wenn αKetoglutarat über die α-Ketoglutarat:Ferredoxin-Oxidoreduktase gebildet wird, oder wenn
eine Bildung über den Citrat-Zyklus stattfindet. Die beiden sich ergebenden Markierungsmuster sind in Abbildung 17 gezeigt.
ERGEBNISSE
69
A
COOH
● COSCoA
● COOH
CH2
CH2
CH2
+ CO2
●C O
CH2
+ Fdred
CH2
CH2
● COOH
COOH
● COOH
α-Ketoglutarat
Succinyl-CoA
[1-13C]-Succinat
(symmetrisch)
B
● COOH
● COOH
CH2
C
CH2
CH2
COOH
[1-13C]-Succinat
(symmetrisch)
COSCoA
COOH
COOH
CH3
CH2
CH2
O
„si “
● COOH
Oxalacetat
HO
C COOH
●
CH2
● COOH
Citrat
- CO2
●
CH2
C
O
● COOH
α-Ketoglutarat
Abb. 17: 13C-Markierungsmuster von α-Ketoglutarat bei der Bildung aus [1,4-13C1]-Succinat.
(A) Bildung über das Enzym α-Ketoglutarat:Ferredoxin-Oxidoreduktase. (B) Bildung über Enzyme
des Citrat-Zyklus (Citrat-Synthase, Aconitase, Isocitrat-Dehydrogenase). Es wurde eine si-spezifische
Citrat-Synthase zugrunde gelegt.
5.1
Wachstum mit [1,4-13C1]-Succinat
Beim autotrophen Wachstum nutzt M. sedula CO2 als alleinige Kohlenstoffquelle. In
einem ersten Experiment wurde geprüft, ob und wie viel Succinat eine autotroph gezüchtete
Kultur verbraucht, wenn ihr 0,5 mM Succinat angeboten wurden. Dieses Succinat war zu 20
% [1,4-13C1]-markiert und enthielt außerdem [1,4-14C]-Succinat (37 kBq L-1) als Tracer. Die
Zugabe erfolgte bei einer OD587 nm von 0,1. Im weiteren Verlauf des Wachstums wurde der
Einbau von 14C-Succinat in die Zellen verfolgt. Innerhalb einer Generationszeit (20 h) wurde
der Großteil an Succinat von den Zellen aufgenommen und in die Zellsubstanz eingebaut. Im
Zellpellet fanden sich rund 60 % der Radioaktivität wieder, das Medium wies noch ca. 20 %
Restaktivität auf. Die fehlenden 20 % gingen wahrscheinlich über Decarboxylierungsreaktionen in Form von 14CO2 verloren. Dieses Experiment belegte, dass Succinat von den M.
sedula-Zellen aufgenommen und verwertet werden kann. Unter diesen Bedingungen (viel
ERGEBNISSE
70
Succinat) stellten die Zellen allerdings ihren Stoffwechsel von einer autotrophen auf eine
heterotrophe Ernährungsweise um. Dies belegten die anschließenden NMRspektroskopischen Untersuchungen der isolierten Aminosäuren Aspartat und Glutamat (siehe
Ergebnisse, Abschnitt 5.2).
Deshalb wurde in einem zweiten Experiment Succinat in einer sehr geringen Menge
kontinuierlich zugepumpt. Die Rate wurde so berechnet, dass nur etwa 10 % des gebildeten
Zellkohlenstoffs aus Succinat stammten. Der restliche Kohlenstoffbedarf musste über
autotrophe CO2-Fixierung abgedeckt werden. Damit konnte gewährleistet werden, dass die
Zellen weiterhin autotroph wuchsen. Zu 10 L einer autotroph wachsenden Kultur wurde ab
einer OD578 nm von 0,1 [1,4-13C1]-Succinat (100 % 13C-markiert) zugeführt. Die
Zufütterungsrate betrug 15 – 30 µmol h-1, insgesamt wurden 600 µmol 13C-Succinat
zugeführt. Die Wachstumsrate wurde durch die Zufütterung von Succinat nicht beeinflusst.
Nach 1,5 Generationen (Generationszeit 15 h) wurden die Zellen bei einer OD578 nm von 0,25
geerntet. Über die relative 13C-Anreicherung der Aminosäuren konnte bestätigt werden, dass 5
bis 10 % des Zellkohlenstoffs aus [1,4-13C1]-Succinat stammten (siehe Tabelle 7).
5.2
13
C-Markierungsmuster in Aminosäuren
Aus den heterotroph auf Succinat gewachsenen Zellen des ersten Experiments wurden
die Aminosäuren Aspartat und Glutamat isoliert und deren 13C-Markierungsmuster über 13CNMR-Spektroskopie bestimmt. Die Messungen wurden freundlicherweise von Herrn Dr.
Wolfgang Eisenreich an der TU München durchgeführt. Dabei konnte im Aspartat eine 13CAnreicherung an C1 und C4 festgestellt werden. Beide Carboxylgruppen waren zu über 9 %
markiert, C2 und C3 dagegen unmarkiert (C1: 9,9 %, C2: 1,1 %, C3: 1,2 %, C4: 9,2 %). Auch in
der Aminosäure Glutamat waren die beiden Carboxylgruppen am stärksten markiert (C1: 5,1
%, C2: 1,1%, C3: 3,6 %, C4: 2,1 %, C5: 8,4 %). Die Markierung von Aspartat zeigt, dass
Oxalacetat direkt aus Succinat entstand. Über eine Transaminierungsreaktion wurde aus
Oxalacetat dann Aspartat gebildet. Beide Carboxylgruppen wiesen eine 13C-Anreicherung von
fast 10 % auf. Dies belegt, dass alles Aspartat aus dem eingesetzten Succinat entstanden sein
muss, dass M. sedula also heterotroph gewachsen ist. Das Markierungsmuster des Glutamats
zeigt, dass es im heterotrophen Stoffwechsel wie erwartet zu keiner reduktiven
Carboxylierung von α-Ketoglutarat durch die α-Ketoglutarat:Ferredoxin-Oxidoreduktase kam.
Das Muster deutet eher auf den herkömmlichen Bildungsweg von α-Ketoglutarat über den
Citrat-Zyklus hin, allerdings ist die Markierung auch dann nicht vollständig erklärbar.
ERGEBNISSE
71
Aus den autotroph gewachsenen Zellen des zweiten Experiments wurden die
Aminosäuren Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Aspartat, Glutamat, Prolin, Valin, Leucin,
Isoleucin und Histidin isoliert, und deren 13C-Markierungsmuster über 13C-NMRSpektroskopie bestimmt. In allen analysierten Aminosäuren war eine 13C-Anreicherung zu
sehen. Bei den Aminosäuren Aspartat und Glutamat gab es allerdings Probleme bei der
Aufnahme der Spektren, so dass für diese Aminosäuren keine Auswertung vorgenommen
werden konnte. Diese Probleme waren wahrscheinlich auf den hohen Salzgehalt der Proben
zurückzuführen.
Die 13C-Markierungsmuster der Aminosäuren von autotroph gewachsenen Zellen sind
in Tabelle 7 zusammengefasst. Zusätzlich zeigt diese Tabelle auch die 13C-Markierungsmuster von Aminosäuren der Organismen C. aurantiacus und Thermoproteus neutrophilus. In
früheren Untersuchungen in unserem Labor wurde mit diesen Organismen ebenfalls eine
Langzeitmarkierungsstudie mit [1,4-13C1]-Succinat durchgeführt, so dass die Ergebnisse hier
als Referenz dienen (Strauss et al., 1992). C. aurantiacus fixiert CO2 über den 3Hydroxypropionat-Zyklus, T. neutrophilus über den reduktiven Citrat-Zyklus.
5.3
13
C-Markierungsmuster in zentralen Metaboliten
Die Biosynthesewege der Aminosäuren sind universell verbreitet und bekannt, nur in
wenigen Ausnahmefällen kommen alternative Wege vor. Vom Markierungsmuster der
Aminosäuren ausgehend kann daher das 13C-Markierungsmuster der zentralen Metabolite
Acetyl-CoA, Pyruvat, Oxalacetat, α-Ketoglutarat und Triosephosphat (Glycerinaldehyd-3phosphat) rekonstruiert werden. Bei diesem retroanalytischen Ansatz betrachtet man, welche
Intermediate Ausgangssubstanzen für die Synthese der Aminosäuren sind. Über die 13CMarkierung eines bestimmten Kohlenstoffatoms in einer Aminosäure kann auf die
Markierung im ursprünglichen Intermediat geschlossen werden. So entsteht z. B. Alanin über
eine Transaminierungsreaktion direkt aus Pyruvat. Das Markierungsmuster von Alanin
entspricht daher direkt dem von Pyruvat. Die Ergebnisse des retroanalytischen Ansatzes sind
in Tabelle 8 aufgeführt.
ERGEBNISSE
72
Tabelle 7: 13C-Anreicherung in Aminosäuren von Metallosphaera sedula, Chloroflexus
aurantiacus und Thermoproteus neutrophilus beim autotrophen Wachstum mit [1,413
C1]-Succinat. Die Daten von C. aurantiacus und T. neutrophilus stammen von früheren
Untersuchungen aus unserem Labor (Strauss et al., 1992), sie dienen als Vergleichsdaten.
(n. b. = nicht bestimmt).
Relative Menge 13C in % in:
C-Position
M. sedula
C. aurantiacus
T. neutrophilus
Alanin
1
2
3
8,1
1,6
1,1
2,4
3,9
4,6
0,8
8,4
8,5
Glycin
1
2
4,6
1,1
4,1
3,7
1,0
7,3
Serin
1
2
3
5,6
1,2
1,1
n. b.
1,2
1,0
n.b.
n.b.
n.b.
Threonin
1
2
3
4
6,0
1,1
1,2
2,6
n.b.
3,0
3,0
3,0
0,8
7,9
7,2
1,1
Aspartat
1
2
3
4
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
4,3
4,7
5,1
4,3
1,1
7,9
7,8
0,7
Glutamat
1
2
3
4
5
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
6,3
3,7
4,5
4,1
7,1
0,7
5,4
5,5
5,3
4,7
Prolin
1
2
3
4
5
5,2
1,1
1,3
1,3
1,3
2,4
1,0
1,2
1,2
1,6
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
Relative Menge 13C in % in:
C-Position
M. sedula
C. aurantiacus
T. neutrophilus
Valin
1
2
3
4
5
5,2
1,2
1,2
1,1
1,1
3,4
3,4
4,1
5,4
5,4
1,1
5,6
5,7
6,6
6,6
Leucin
1
2
3
4
5
6
2,9
1,5
1,1
1,6
1,5
1,4
6,7
4,5
4,5
4,5
5,8
5,8
7,8
6,3
6,4
6,6
6,5
6,5
Isoleucin
1
2
3
4
5
6
4,4
1,1
1,7
1,3
2,3
1,2
6,7
3,9
4,3
4,7
5,1
5,1
5,6
7,9
8,1
8,5
6,4
7,5
Histidin
1
2
3
4
5
6
7,5
1,3
1,1
3,2
4,5
2,7
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
ERGEBNISSE
73
Tabelle 8: Mittlere 13C-Anreicherung von zentralen Stoffwechselintermediaten in
Metallosphaera sedula bei autotrophem Wachstum mit [1,4-13C1]-Succinat. Die relative
13
C-Anreicherung wurde aus dem Mittelwert der 13C-Anreicherungen der Kohlenstoffatome
der Aminosäuren berechnet. Es wurde von einer si-spezifischen Citrat-Synthase ausgegangen.
(σn = Standardabweichung, n = Anzahl der verfügbaren Werte für das arithmetische Mittel,
n. b. = nicht bestimmbar).
Position
entspricht C-Position (AS)
13
σn
n
Acetyl-CoA
1
2
C1(Leu), C5(Pro)
C2(Leu), C4 (Pro)
2,1
1,4
0,8
0,1
2
2
Pyruvat/PEP
1
2
C1(Val), C1(Ala)
C2(Val), C3(Val), C3(Ile),
C3(Leu), C4(Leu), C2(Ala)
C4(Val), C5(Val), C6(Ile),
C5(Leu), C6(Leu), C3(Ala)
6,7
1,4
1,5
0,2
2
6
1,2
0,2
6
3
C (%)
Oxalacetat
1
2
3
4
C1(Ile), C1(Thr)
C3(Pro), C2(Ile), C2(Thr)
C2(Pro), C4(Ile), C3(Thr)
C1(Pro), C5(Ile), C4(Thr)
5,2
1,2
1,2
3,4
0,8
0,1
0,1
1,3
2
3
3
3
α-Ketoglutarat
1
2
3
4
5
C1(Pro)
C2(Pro)
C3(Pro)
C4(Pro)
C5(Pro)
5,2
1,1
1,3
1,3
1,3
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
n. b.
1
1
1
1
1
Triosephosphat
1
2
3
C1(Gly), C1(Ser)
C2(Gly), C2(Ser)
C3(Ser)
5,1
1,2
1,1
0,5
0,1
n. b.
2
2
1
5.4
Schlussfolgerungen für den Weg der Acetyl-CoA-Regeneration in Metallosphaera
sedula
Betrachtet man das Markierungsmuster von α-Ketoglutarat bei autotrophem Wachstum
von M. sedula, welches sich von Glutamat und Prolin ableiten lässt, so war eine deutliche 13CAnreicherung an der C1-Position zu erkennen, während die anderen C-Atome kaum markiert
waren. Diese Markierung spricht gegen eine Beteiligung der α-Ketoglutarat:FerredoxinOxidoreduktase an der autotrophen CO2-Fixierung. Wäre diese beteiligt, so sollte C1 direkt
aus CO2 stammen und daher unmarkiert vorliegen. Bei T. neutrophilus ist die α-Ketoglutarat:
Ferredoxin-Oxidoreduktase am autotrophen Stoffwechsel beteiligt. Im Glutamat von T.
neutrophilus (Tabelle 9) sind daher die Positionen C2 – C5 markiert, C1 dagegen nicht.
ERGEBNISSE
74
Das Markierungsmuster von α-Ketoglutarat in M. sedula entspricht ziemlich gut dem
erwarteten, wenn man die Bildung von α-Ketoglutarat über Citrat und Isocitrat mit einer sispezifischen Citrat-Synthase zugrunde legt (vergleiche auch Abbildung 17). Eine reduktive
Carboxylierung von Succinyl-CoA ist also ausgeschlossen. Vielmehr scheint Succinyl-CoA
wie gewöhnlich zu Oxalacetat oxidiert zu werden. Eine Aussage darüber, wie Acetyl-CoA
regeneriert wird, ist allerdings aufgrund der NMR-Daten nicht möglich. Mögliche
Interpretationen dieser Daten sind in der Diskussion aufgeführt.
ERGEBNISSE
6.
75
Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von Metallosphaera sedula
Bei den Carboxylierungsreaktionen von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA und von
Propionyl-CoA zu Methylmalonyl-CoA handelt es sich um Schlüsselreaktionen der
autotrophen CO2-Fixierung bei Archaea. Bisher sind solche Carboxylierungsreaktionen in
Archaea unbekannt. Eine Acetyl-CoA-Carboxylase wird nicht für den Aufbau von Fettsäuren
benötigt, da die Lipide der Archaea langkettige Isoprenoidalkyle anstelle von Fettsäuren
enthalten. Es wurde bisher auch keine Propionyl-CoA-Carboxylase im heterotrophen
Stoffwechsel von Archaea nachgewiesen. Gene, die für eine mögliche Acetyl-CoACarboxylase codieren, sind dagegen aus Sulfolobus metallicus bekannt (Norris et al., 1989;
Burton et al., 1999). In unserem Labor wurden die entsprechenden Gene auch in M. sedula
gefunden und sequenziert (EMBL Datenbank, AF461115 und AF461116). Die Proteine, die
die Carboxylierung von Acetyl-CoA und Propionyl-CoA in M. sedula katalysieren, sollten
gereinigt und charakterisiert werden. Dabei sollten die Fragen geklärt werden, ob zwei
verschiedene Enzyme diese Reaktionen katalysieren, und ob die vermuteten Gensequenzen
tatsächlich für diese Carboxylasen codieren.
6.1
Carboxylase-Aktivitäten im Zellextrakt
In Zellextrakten von M. sedula konnte sowohl Acetyl-CoA-Carboxylase-, als auch
Propionyl-CoA-Carboxylase-Aktivität nachgewiesen werden (siehe Ergebnisse, Abschnitte
2.2.3 und 4). Diese Enzymaktivitäten wurden über einen radioaktiven Enzymtest gemessen.
Dabei wurde die Menge gebildeter säurestabiler radioaktiver Produkte aus 14C-Bicarbonat
über Szintillationsmessung bestimmt. Bei 65°C und einem pH-Wert von 7,5 wurde im
Zellextrakt von autotroph gewachsenen Zellen die MgATP- und Bicarbonat-abhängige
Carboxylierung von Acetyl-CoA bzw. Propionyl-CoA mit einer Rate von 55 – 70 bzw. 60 –
75 nmol fixiertes Bicarbonat min-1 (mg Protein)-1 nachgewiesen (siehe Tabellen 5 und 6). Im
Extrakt von heterotroph gewachsenen Zellen waren die Aktivitäten beider Carboxylierungsreaktionen ungefähr 6fach niedriger und lagen bei 10 nmol min-1 (mg Protein)-1.
Bei den bisher bekannten Acetyl-CoA-Carboxylasen handelt es sich um Biotinenzyme
und auch im Extrakt autotroph gewachsener M. sedula-Zellen konnte ein biotinyliertes
Protein nachgewiesen werden (vergleiche Abbildung 13). Zusätzlich wurden die
Biotinenzyme im Extrakt heterotroph gewachsener Zellen über die avidingekoppelte
ERGEBNISSE
76
Peroxidase angefärbt, und es konnte gezeigt werden, dass hier das Biotinprotein in einer viel
geringeren Menge vorhanden war (Abbildung 18 A). Die Regulation der CarboxylaseAktivitäten wurde damit auch über eine unterschiedliche Menge an Biotinprotein bestätigt.
Die Molekularmasse dieses Proteins wurde über Markerproteine abgeschätzt und betrug etwa
18 kDa.
A
B
A H
kDa
1 2 3 4
5 6
7
8
97
67
45
34
29
14
Abb. 18: Untereinheiten der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase. (A) Biotinproteine im
Zellextrakt von autotroph (A) und heterotroph (H) gewachsenen Zellen von M. sedula (80 µg Protein).
(B) Reinigung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase. Die Proteine im Zellextrakt und in den
einzelnen Fraktionen der Reinigung wurden über SDS-PAGE aufgetrennt. Es handelte sich um ein
12,5 % Gel das mit Coomassie gefärbt wurde. Aufgetragen wurden: (1) und (7) MolekülmassenStandardproteine, (2) Gesamtextrakt von autotroph gewachsenen Zellen (15 µg Protein), (3)
Enzymfraktion nach DEAE-Sepharose-Chromatographie (10 µg Protein), (4) Enzymfraktion nach
Phenyl-Superose-Chromatographie (10 µg Protein), (5) Enzymfraktion nach Resource QChromatographie (10 µg Protein), (6) Enzymfraktion nach Gelfiltrations-Chromatographie (5 µg
Protein), (8) Biotinproteine in der Enzymfraktion nach Gelfiltrations-Chromatographie (5 µg Protein).
6.2
Analyse der Carboxylase-Gene
Die Gene für eine putative Acetyl-CoA-Carboxylase wurden von Dr. Robert Krieger
und Dr. Martina Jahn aus unserer Arbeitsgruppe sequenziert. Dabei wurden drei offene
Leseraster gefunden. Aufgrund von Ähnlichkeiten der codierten Proteine mit Proteinen in den
Datenbanken wurden die Leseraster als accB, accC und pccB, die entsprechenden
Genprodukte als AccB, AccC und PccB bezeichnet. Wie sich herausstellte, stimmten die Nterminalen Aminosäurensequenzen der Untereinheiten der gereinigten Acetyl-CoA-/
Propionyl-CoA-Carboxylase mit den vorhergesagten Aminosäurensequenzen von AccB,
AccC und PccB überein (siehe Ergebnisse, Abschnitt 6.3). Über Datenbankvergleiche
konnten diesen Proteinen Funktionen zugeordnet werden: Das Gen accC codiert für die
Biotin-Carboxylase, ein Protein mit 510 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 57
ERGEBNISSE
77
kDa. Das an accC direkt anschließende Gen accB codiert für ein Protein mit 167
Aminosäuren und einer Größe von 18,6 kDa. AccB trägt den Cofaktor Biotin und wird
deshalb als Biotin-Carrier-Protein bezeichnet. Das Gen pccB findet sich an einer anderen
Stelle im Genom. Es codiert für ein 57 kDa großes Protein mit 524 Aminosäuren, das die
Funktion der Carboxyltransferase hat. Sequenzvergleiche zeigten für alle 3 Untereinheiten
große Ähnlichkeiten zu entsprechenden Genprodukten der Organismen Acidianus brierleyi, S.
metallicus, Sulfolobus solfataricus und Sulfolobus tokodaii. Ein Alignment dieser Proteinsequenzen ist im Anhang dargestellt.
6.3
Reinigung und Charakterisierung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
Die Acetyl-CoA-Carboxylase wurde aus autotroph gewachsenen Zellen von M. sedula
über vier Chromatographieschritte gereinigt. Dabei wurde zum Nachweis der Enzymaktivität
nach den Reinigungsschritten ein gekoppelter Enzymtest entwickelt. Dieser war schneller und
einfacher als der radioaktive Enzymtest. Zu den einzelnen Reinigungsfraktionen wurde
angereinigte Malonyl-CoA-Reduktase von C. aurantiacus gegeben. Das Produkt der AcetylCoA-Carboxylase, Malonyl-CoA, wird von der Malonyl-CoA-Reduktase reduziert. Dabei
wird NADPH oxidiert. Der Acetyl-CoA-abhängige NADPH-Verbrauch kann photometrisch
bei 365 nm verfolgt werden. Zur Charakterisierung des gereinigten Enzyms wurde wieder der
radioaktive Enzymtest eingesetzt. Nach Chromatographie an DEAE-Sepharose, PhenylSuperose, Resource Q und Gelfiltration wurde ein homogenes Protein mit einer Ausbeute von
17 % erhalten. Tabelle 9 zeigt die Reinigung des Enzyms. Das gereinigte Enzym katalysierte
sowohl die Carboxylierung von Acetyl-CoA, als auch die von Propionyl-CoA und wurde
deshalb als Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase bezeichnet.
Die Molekularmasse des gereinigten Enzyms wurde über GelfiltrationsChromatographie abgeschätzt und betrug 560 ± 50 kDa. Das mit Coomassie angefärbte SDSGel (Abbildung 18 B) zeigte beim gereinigten Protein 2 Banden mit einem Molekulargewicht
von 57 und 18 kDa. Es konnte über Biotin-Färbung gezeigt werden, dass die 18 kDa große
Bande Biotin trug und somit dem im Zellextrakt nachgewiesenen Biotinprotein entsprach. Die
N-terminale Aminosäurensequenz der beiden Proteinbanden wurde bestimmt. Dabei stellte
sich heraus, dass sich die 57 kDa große Bande aus 2 Proteinen zusammensetzte. Die erste
Sequenz PPFSR entsprach der abgeleiteten Sequenz der Biotincarboxylase AccC, dabei fehlte
das N-terminale Methionin. Die zweite Sequenz FEKPD entsprach der Carboxyltransferase
PccB, allerdings fehlten die ersten 4 Aminosäuren des N-Terminus. Diese beiden Proteine
ERGEBNISSE
78
konnten nicht über SDS-PAGE getrennt werden. Die Sequenz der 18 kDa großen
Proteinbande entsprach mit MKLYR der abgeleiteten Aminosäurensequenz des Biotin-CarrierProteins AccB. Um das Verhältnis von AccC zu AccB zu bestimmen, wurde natives Protein
direkt N-terminal ansequenziert, ohne vorher die einzelnen Untereinheiten über SDS-PAGE
zu trennen. Die Aminosäuren von 2 Sequenzen (PPFSR von der Biotincarboxylase AccC und
MKLYR vom Biotin-Carrier-Protein AccB) waren in gleicher Menge vorhanden. Der NTerminus der dritten Untereinheit (Carboxyltransferase PccB) war in diesem Experiment
allerdings blockiert. Aus diesen Experimenten konnte auf ein Untereinheitenverhältnis
AccB:AccC:PccB von 1:1:1 geschlossen werden. Aufgrund des nativen Molekulargewichts
sollte das Enzym einen tetrameren Aufbau haben, d. h. (AccB, AccC, PccB)4. Die aus den
Gensequenzen vorhergesagte Molekülmasse bei dieser Zusammensetzung wäre 530 kDa. Sie
entspricht der über Gelfiltration bestimmten Molekülmasse von 560 ± 50 kDa.
Tabelle 9: Reinigung der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von Metallosphaera
sedula. Als Ausgangsmaterial dienten 3 g gefrorene Zellmasse autotroph gezüchteter Zellen
von M. sedula. Die Werte beziehen sich auf die Acetyl-CoA-Carboxylase-Aktivität, die Werte
in Klammern auf die Propionyl-CoA-Carboxylase-Aktivität.
Anreicherung
(-fach)
Ausbeute
(%)
5,92 (6,32)
spezifische
Aktivität
(µmol min-1
(mg Protein)-1)
0,066 (0,070)
1,0 (1,0)
100 (100)
13,5
4,71 (4,87)
0,350 (0,360)
5,3 (5,2)
80 (77)
Phenyl-Sepharose
2,0
3,51 (3,63)
1,760 (1,820)
26,6 (25,9)
59 (57)
Resource Q
1,7
2,42 (2,56)
1,410 (1,500)
21,4 (21,4)
41 (41)
Gelfiltration
0,3
1,00 (1,03)
3,200 (3,300)
48,5 (47,1)
17 (16)
Reinigungsschritt
Protein
(mg)
Aktivität
(µmol min-1)
90
DEAE-Sepharose
Zellextrakta
a
100.000 g Überstand
6.4
Katalytische Eigenschaften der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
Bei der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase handelt es sich um die erste
gereinigte Acetyl-CoA-Carboxylase eines thermophilen Organismus. Die katalytischen
Eigenschaften wurden bei einer Messtemperatur von 65°C untersucht und sind in Tabelle 10
zusammengefasst.
ERGEBNISSE
79
Tabelle 10: Eigenschaften der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von
Metallosphaera sedula.
Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
Substrate
Acetyl-CoA, Propionyl-CoA, HCO3-, MgATP
Produkte
Malonyl-CoA, Methylmalonyl-CoA, ADP, Pi
Spezifische Aktivitäten
3,2 µmol min-1 (mg Protein)-1 für Acetyl-CoA ,
3,3 µmol min-1 (mg Protein)-1 für Propionyl-CoA
Km-Werte
60 µM für Acetyl-CoA,
70 µM für Propionyl-CoA,
40 µM für ATP,
0,3 mM für HCO3-
pH-Optimum
7,5
Temperaturoptimum
75° C
Natives Molekulargewicht
560 ± 50 kDa
Molekulargewicht der
Untereinheiten
18,6 kDa (AccB),
57 kDa (AccC),
57 kDa (PccB)
postulierte Zusammensetzung
(αβγ)4
Wechselzahl pro Holoenzym
28 s-1
Inhibitoren (mM) und
verbleibende Aktivität:
Avidin (10-6) < 1 % / < 1%
Malonyl-CoA (0,5) 20 % / 40 %,
Succinyl-CoA (0,5) 50 % / 80 %, CoA (1) 60 % / 80 %,
ADP (5) 20 % / 20 %
Spezifität (mM)
ATP (5) 100 %, GTP (5) 10 %, UTP (5) 40 %
Einfluss von divalenten
Kationen (mM)
keine Ionen < 1 %, Mg2+ (5) 100 %, Mn2+ (5) 10 %,
Ca2+ (5) 10 %, Co2+ (5) 38 %, Ni2+ (5) < 5 %
N-terminale
Aminosäurensequenz
AccB: MKLYR
AccC: PPFSR
PccB: FEKPD
Zunächst wurde die Temperaturabhängigkeit untersucht. Die TemperaturAktivitätskurve ist in Abbildung 19 A dargestellt. Das Enzym ist über einen sehr weiten
Temperaturbereich stabil. Die Carboxylierungsaktivität konnte bei allen untersuchten
Temperaturen von 30° – 85°C nachgewiesen werden, die optimale Temperatur lag bei 75°C
und entsprach damit sowohl der Züchtungstemperatur, als auch der optimalen Wachstumstemperatur von M. sedula. Oberhalb von 75°C sank die Enzymaktivität und das isolierte
Enzym war instabil. Aus der Temperatur-Aktivitätsabhängigkeit konnte über ein Arrhenius-
ERGEBNISSE
80
Diagramm die Aktivierungsenergie für die Carboxylierungsreaktion bestimmt werden. Hierzu
wurde der Logarithmus der Reaktionsgeschwindigkeit gegen den Kehrwert der absoluten
Temperatur (in Kelvin) aufgetragen. Es ergab sich eine Gerade, aus deren Steigung die
Aktivierungsenergie berechnet werden konnte. Sie betrug 59 kJ (mol HCO3-)-1.
Der optimale pH-Wert der Carboxylase wurde ebenfalls bestimmt. Die pHAktivitätskurven wurden mit verschiedenen Puffersystemen (100 mM Tris/HCl (pH 7,5 –
8,5), 100 mM MOPS/NaOH (pH 6,5 – 8,0) und 100 mM Taps/NaOH (pH 7,5 – 9,0)) ermittelt
und sind in Abbildung 19 B gezeigt. Der optimale pH-Wert lag bei 7,5. Die pH-Werte in
Abbildung 19 entsprachen den bei der Untersuchungstemperatur von 65°C gemessenen pHWerten, die Puffer hatten bei Raumtemperatur davon abweichende Werte (siehe oben).
B
A
2,5
3,5
2,5
2,0
A´
µmol min-1 (mg Protein)-1
3,0
lg (µmol min-1 (mg Protein)-1)
µmol min-1 (mg Protein)-1
10
1
0,1
Temperatur-1 (K-1)
1,5
1,0
2,0
1,5
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
20
30
40
50
60
70
80
Temperatur (°C)
90
5
6
7
8
9
pH-Wert
Abb. 19: Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase.
(A) Temperaturabhängigkeit gemessen in 100 mM MOPS/NaOH pH 7,5. (A´) Arrhenius-Diagramm
der gleichen Daten. Dabei wird der Logarithmus der Reaktionsgeschwindigkeit gegen den Kehrwert
der Temperatur (in K) aufgetragen. (B) pH-Abhängigkeit gemessen in 100 mM MOPS/NaOH (●)
bzw. 100 mM Taps/NaOH (○). Der pH-Wert entspricht dabei dem tatsächlich gemessenen Wert bei
65°C. Die Daten mit 100 mM Tris/HCl sind nicht gezeigt.
Die Enzymaktivität folgte einer Michaelis-Menten-Kinetik. Die Km-Werte für die
verschiedenen Substrate wurden über die Variation einer Substratkonzentration, bei
sättigenden Konzentrationen der anderen Substrate (1 mM Acetyl-CoA, 1 mM PropionylCoA, 4 mM ATP, 10 mM Bicarbonat) bestimmt. Sie betrugen: 60 µM für Acetyl-CoA, 70
ERGEBNISSE
81
µM für Propionyl-CoA, 40 µM für ATP und 0,3 mM für Bicarbonat. Die spezifische Aktivität
des gereinigten Enzyms betrug 3,2 µmol fixiertes Bicarbonat min-1 (mg Protein)-1 für AcetylCoA und 3,3 µmol fixiertes Bicarbonat min-1 (mg Protein)-1 für Propionyl-CoA. Dies
entspricht einer Wechselzahl von 28 s-1 pro Holoenzym. Die Enzymaktivität war abhängig
von MgATP. Der Ersatz von Mg2+ durch andere zweiwertige Ionen wie Co2+, Ca2+, Mn2+ oder
Ni2+ führte zu einer reduzierten Aktivität. Auch ATP konnte nur auf Kosten der Aktivität
durch UTP oder GTP ersetzt werden (siehe Tabelle 10).
Zuletzt wurde die Auswirkung verschiedener Hemmstoffe auf die Enzymaktivität
untersucht. Avidin ist ein spezifischer Hemmstoff für Biotinenzyme, daher sollte auch die
Aktivität der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase durch Avidin gehemmt werden. Der
Zusatz von Avidin führte schon in geringen Konzentrationen von 1 nM zur kompletten
Inhibition der Enzymaktivität. Diese Hemmung konnte durch den Zusatz eines Überschuss an
Biotin (1 mM) wieder aufgehoben werden. Dieses Verhalten war zu erwarten, da Biotin in der
Lösung das Avidin abfängt, und dieses dann nicht an das Biotin des Biotin-Carrier-Proteins
binden kann. Auch weitere Hemmstoffe, die auf bisher beschriebene Carboxylasen einen
Einfluss hatten, wurden untersucht. Die Produkte Malonyl-CoA, Succinyl-CoA oder ADP
führten zur teilweisen Hemmung der Enzymaktivität. Diese Produkthemmung könnte Teil der
Regulation der Carboxylase-Aktivitäten sein. Im Gegensatz dazu hatte der Zusatz von
möglichen allosterischen Regulatoren wie Citrat, Isocitrat oder NAD(P)H keinen Einfluss auf
die Aktivität der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von M. sedula.
DISKUSSION
82
DISKUSSION
1.
Malonyl-CoA-Reduktase von Chloroflexus aurantiacus
Die Malonyl-CoA-Reduktase, ein Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus,
wurde aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Es handelt sich um ein bifunktionelles
Enzym, das die Reduktion von Malonyl-CoA mit zwei Molekülen NADPH zu 3-Hydroxypropionat, dem namensgebenden Zwischenprodukt dieses CO2-Fixierungswegs, katalysiert.
Das Enzym beinhaltet eine Alkohol-Dehydrogenase- und eine Aldehyd-DehydrogenaseAktivität, es gehört damit den Enzymklassen E.C. 1.1.1.- und E.C. 1.2.1.- an.
In C. aurantiacus katalysiert die Malonyl-CoA-Reduktase die Reduktion von MalonylCoA zu 3-Hydroxypropionat. Die niedrigen Km-Werte, die hohe Spezifität gegenüber den
Substraten und die kaum messbare Rückreaktion lassen auf diese physiologische Rolle
schließen. Die Malonyl-CoA-Reduktion ist bisher aus keinem anderen Stoffwechselweg
bekannt. Da sie leicht zu messen, gut aktiv und sehr spezifisch ist, stellt sie eine ideale
Enzymaktivität dar, um weitere autotrophen Mikroorganismen mit unbekanntem CO2Fixierungsweg auf das Vorhandensein des 3-Hydroxypropionat-Zyklus zu testen. Allerdings
ist die Herstellung des Substrats Malonyl-CoA aufwändig und dieses daher teuer.
Die Malonyl-CoA-Reduktase ist bei autotrophem Wachstum ungefähr 2 – 3 fach
hochreguliert, obwohl die Zellen unter heterotrophen Bedingungen fünfmal schneller wachsen
als unter autotrophen Bedingungen. Die gemessene Rate von 80 nmol min-1 (mg Protein)-1
reicht bei weitem aus, um autotrophes Wachstum zu erklären. Bei einer Generationszeit von
26 h beträgt die berechnete CO2-Fixierungsrate 26 nmol min-1 (mg Protein)-1. Die minimale
geforderte Enzymaktivität wäre damit 13 nmol min-1 (mg Protein)-1, da mit der Acetyl-CoAund der Propionyl-CoA-Carboxylase zwei CO2-fixierende Aktivitäten vorhanden sind. Die
Enzymrate und die Regulation lassen auf eine Beteiligung der Malonyl-CoA-Reduktase an
der autotrophen CO2-Fixierung schließen.
Das Zwischenprodukt der Reduktion von Malonyl-CoA zu 3-Hydroxypropionat ist sehr
wahrscheinlich Malonatsemialdehyd. Experimente mit Semicarbazid als Aldehyd-
DISKUSSION
83
abfangender Substanz veränderten die Stöchiometrie von oxidiertem NADPH zu
eingesetztem Malonyl-CoA von 2:1 auf 1:1. Darüber hinaus zeigte die Umformung von 14Cmarkiertem Malonyl-CoA ein Zwischenprodukt, das während der Reaktion auftrat und
anschließend weiter zu 3-Hydroxypropionat umgewandelt wurde. Eine Cochromatographie
zum eindeutigen Nachweis von Malonatsemialdehyd konnte allerdings nicht durchgeführt
werden.
Die Malonyl-CoA-Reduktase besaß keinen enzymgebundenen Cofaktor, sie benötigte
aber divalente Kationen. Um maximale Aktivität zu erhalten, mussten dem Enzymtest 2 mM
Mg2+ zugesetzt werden. Beim Zusatz von Fe2+ reichten schon Konzentrationen von 0,02 mM
aus, um 100 % Aktivität zu bekommen. Da in Zellen Mg2+-Ionen in viel höheren Konzentrationen vorhanden sind als Fe2+-Ionen, ist die Beteiligung von Mg2+ an der Katalyse
wahrscheinlicher als die Beteiligung von Fe2+.
Bei der Malonyl-CoA-Reduktase handelt es sich um ein sehr großes Protein. Die über
das SDS-Gel ermittelte Größe der beiden identischen Untereinheiten konnte über die
Gensequenz bestätigt werden. Das berechnete Molekulargewicht beträgt 132 kDa. Die beiden
Aktivitäten lassen vermuten, dass das Protein aus der Fusion einer Alkohol-Dehydrogenase
mit einer Aldehyd-Dehydrogenase hervorgegangen sein könnte. Auch die Analyse der
Sequenz zeigte 2 Dehydrogenase-Domänen mit jeweils einer NAD(P)-Bindestelle. Zwischen
diesen Domänen finden sich Strukturen, die keine Sequenzhomologie zu Proteinen der
Datenbanken aufweisen. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass die Malonyl-CoAReduktase noch eine weitere Aufgabe erfüllt. Ein Beispiel für ein trifunktionelles Enzym ist
die AdhE von E. coli. Hier konnte neben der Alkohol- und der Aldehyd-DehydrogenaseAktivität eine Deaktivierungs-Aktivität der Pyruvat-Formiat-Lyase gefunden werden (Kessler
et al., 1991).
2.
Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Chloroflexus aurantiacus
Mit der Malonyl-CoA-Reduktase wurde das erste Schlüsselenzym des 3-Hydroxy-
propionat-Zyklus aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Dr. Birgit Alber aus
unserer Arbeitsgruppe gelang mit der Reinigung der Propionyl-CoA-Synthase die
Charakterisierung eines weiteren Schlüsselenzyms. Dabei handelt es sich um ein
trifunktionelles Enzym, welches die Umwandlung von 3-Hydroxypropionat zu PropionylCoA katalysiert (Alber und Fuchs, 2002). Sylvia Herter und Andreas Busch haben darüber
hinaus die Malyl-CoA-Lyase gereinigt und charakterisiert (Herter et al., 2002a). Dieses
DISKUSSION
84
Enzym erfüllt 2 Funktionen: die Spaltung von L-Malyl-CoA in Acetyl-CoA und Glyoxylat,
sowie die Kondensation von Glyoxylat und Propionyl-CoA zu β-Methylmalyl-CoA. Daher ist
der vollständige Name dieses Enzyms L-Malyl-CoA-Lyase/β-Methylmalyl-CoA-Lyase. Es
katalysiert auch den ersten Schritt des Methylmalyl-CoA-Zyklus, welcher zur Assimilation
von Glyoxylat dient (Herter et al., 2001; Herter et al., 2002b). So kann der 3-Hydroxypropionat-Zyklus von C. aurantiacus nun vollständig dargestellt werden. Es handelt sich um
einen Bizyklus, der sich aus dem 3-Hydroxypropionat-Zyklus und dem Methylmalyl-CoAZyklus zusammensetzt. Der Zyklus und die daran beteiligten Enzyme sind in Abbildung 20
dargestellt.
COOH
HCO3-
1
COSCoA
10
ATP
HC
HO CH
7
8
COOH
CH2
CH2
COOH
CH2
3-Hydroxypropionat
3
COSCoA
CH3
NADPH
H2O
AMP+PPi
2 NADPH
9
CoA
H2O
HOOC CH
CH3
HCO3-
COSCoA
Propionyl-CoA
6
COSCoA
CH2
C
COOH
CH3
CH2
HC
COSCoA
COOH
Mesaconyl-CoA
12
HO C CH3
Citramalat
ADP+Pi
4
Malonyl-CoA
1
ATP
COOH
Methylmalonyl-CoA
ATP
ADP+Pi
Succinyl-CoA
5
2
CoA
COSCoA
CH2OH
CoA
ATP
CH2 3-Hydroxypropionat
CH2OH
Methylmalyl-CoA
11
Malyl-CoA
2
COOH
ATP
CoA
COOH
COSCoA
Malonyl-CoA
NADPH
AMP+PPi
Propionyl-CoA
HC OH
CH2
COOH
CH3
CH3
3
H2O
CH2
COSCoA
COOH
Acetyl-CoA
ADP+Pi
CH2
2 NADPH
COSCoA
Glyoxylat
CH3
COSCoA
10
CHO
COOH
CH2
13
HCO3-
COSCoA
HO C CH3
CH2
COOH
CH3
Acetyl-CoA
14
COSCoA
Citramalyl-CoA
COOH
C O
CH3
Pyruvat
Abb. 20: Der bizyklische autotrophe CO2-Fixierungsweg bei C. aurantiacus. Im ersten Zyklus (3Hydroxypropionat-Zyklus) werden 2 Moleküle Bicarbonat zu einem Molekül Glyoxylat fixiert. Im
zweiten Zyklus (Methylmalyl-CoA-Zyklus) wird aus Glyoxylat und Bicarbonat Pyruvat gebildet. Die
beteiligten Enzymreaktionen sind: (1) Acetyl-CoA-Carboxylase (E.C. 6.4.1.2), (2) Malonyl-CoAReduktase (E.C. 1.1.1.- und E.C. 1.2.1.-), (3) Propionyl-CoA-Synthase (E.C. 6.2.1.-, E.C. 4.2.1.-, und
E.C. 1.3.1.-; Alber und Fuchs 2002), (4) Propionyl-CoA-Carboxylase (E.C. 6.4.1.3), (5) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (E.C. 5.1.99.1), (6) Methylmalonyl-CoA-Mutase (E.C. 5.4.99.2), (7)
postulierte Succinyl-CoA:L-Malat CoA-Transferase, (8) Succinat-Dehydrogenase (E.C. 1.3.5.1), (9)
Fumarat-Hydratase (E.C. 4.2.1.2), (10) L-Malyl-CoA-Lyase und β-Methylmalyl-CoA-Lyase (E.C.
4.1.3.24; Herter et al., 2002a), (11) postulierte Mesaconyl-CoA-Hydratase, (12) postulierte
Mesaconat-Hydratase, (13) postulierte Succinyl-CoA:Citramalat CoA-Transferase, (14) postulierte LCitramalyl-CoA-Lyase.
DISKUSSION
3.
85
Schlüsselenzyme bekannter CO2-Fixierungswege bei Vertretern der
Crenarchaeota
3.1
Pyrodictiaceae
Aus der Familie der Pyrodictiaceae wurden Pyrodictium abyssi und Pyrodictium
occultum untersucht. In beiden Organismen konnten Schlüsselenzyme von zwei
verschiedenen CO2-Fixierungswegen nachgewiesen werden, die RubisCO und die Pyruvat:
Akzeptor-Oxidoreduktase. Der Nachweis dieser Enzyme gibt Rätsel auf, da keine weiteren
Schlüsselenzyme der bekannten Wege, wie die Phosphoribulokinase, das zweite Schlüsselenzym des Calvin-Zyklus, nachgewiesen werden konnten.
Die Aktivität der Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase könnte sowohl auf den reduktiven
Citrat-Zyklus, als auch auf den reduktiven Acetyl-CoA-Weg hindeuten. Allerdings könnte das
Enzym auch die Funktion der Pyruvat-Dehydrogenase übernehmen. Die beiden weiteren
Enzyme des reduktiven Citrat-Zyklus, die α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und die
ATP-Citrat-Lyase, konnten nicht gemessen werden. Insbesondere die α-Ketoglutarat:
Akzeptor-Oxidoreduktase sollte sich unter den gewählten Bedingungen leicht messen lassen,
da sie vermutlich die gleichen Reaktionsbedingungen wie die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase benötigt. Der reduktive Citrat-Zyklus kann daher mit hoher Wahrscheinlichkeit
ausgeschlossen werden. Bei der Suche nach der CO-Dehydrogenase-/Acetyl-CoA-SynthaseAktivität konnten Spuren einer CO-Oxidations-Aktivität in Pd. abyssi nachgewiesen werden.
Diese Aktivität fehlte allerdings vollständig in Pd. occultum. Bei den bisher untersuchten
Organismen mit CO-Dehydrogenase-Aktivität ließ sich diese sehr gut und mit hoher Rate
nachweisen. Wir gehen daher davon aus, dass die beiden Pyrodictium spp. keine CODehydrogenase-Aktivität haben und nicht den reduktiven Acetyl-CoA-Weg zur CO2Fixierung benutzen.
Da die Pyrodictium spp. damit zwei Enzymaktivitäten verschiedener CO2-Fixierungswege haben, aber ansonsten keine weiteren Enzymaktivitäten eines Weges nachgewiesen
werden konnten, bleibt der Weg der CO2-Fixierung unklar. Es wäre sowohl ein CalvinZyklus, in einer modifizierten Variante (siehe Diskussion, Abschnitt 4), als auch ein
neuartiger, bisher unbekannter CO2-Fixierungsweg denkbar. Im ersten Fall könnte die
Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase die gewöhnliche Pyruvat-Dehydrogenase ersetzte. Im
zweiten Fall wäre das Vorhandensein der RubisCO unverständlich.
DISKUSSION
3.2
86
Desulfurococcaceae
Aus der Familie der Desulfurococcaceae ist bisher nur eine Gattung bekannt, die
autotroph wachsen kann, die Gattung Ignicoccus. Es wurden drei Ignicoccus spp. isoliert, von
denen in dieser Arbeit mit Ignicoccus islandicus und Ignicoccus pacificus zwei untersucht
wurden. Sowohl I. islandicus, als auch I. pacificus zeigten hohe Aktivitäten der Pyruvat:
Akzeptor-Oxidoreduktase. Ein weiteres Schlüsselenzym autotropher CO2-Fixierungswege
konnte nicht nachgewiesen werden. Man kann daher aus den gleichen Gründen wie bei den
Pyrodictium spp. davon ausgehen, dass weder der reduktive Citrat-Zyklus, noch der reduktive
Acetyl-CoA-Weg zur CO2-Fixierung genutzt wird. Es wurden Spuren einer Ribulose-1,5bisphosphat-abhängigen 14CO2-Fixierung nachgewiesen, allerdings handelte es sich beim
Fixierungsprodukt nicht um 3-Phosphoglycerat. Darüber hinaus ist die Aktivität viel zu
niedrig, um das autotrophe Wachstum erklären zu können. Die Anwesenheit einer RubisCO
kann daher ausgeschlossen werden. Eine geringe Ribulose-1,5-bisphosphat-abhängige 14CO2Fixierungsrate wird gelegentlich beobachtet, auch wenn ein RubisCO-Protein nachweislich
nicht vorhanden ist. Die Ursache dieser Beobachtung ist bislang unklar.
Die Frage, wie Ignicoccus spp. CO2 fixieren, bleibt daher unbeantwortet. Das Fehlen
von Schlüsselenzymen bekannter CO2-Fixierungswege deutet auf einen neuartigen CO2Fixierungsweg hin. Weitergehende Untersuchungen sind interessant, und es ist davon
auszugehen, dass die Ignicoccus spp. noch einige Überraschungen parat haben werden.
Ignicoccus sp. KIN 4/I lebt in Gesellschaft mit „Nanoarchaeum equitans“. Auch diese
Ignicoccus sp. lebt strikt autotroph (Huber et al., 2002; Huber et al., 2003a). Die Untersuchung der CO2-Fixierung in dieser höchstwahrscheinlich symbiotischen Gemeinschaft ist
ein weiterer interessanter Aspekt von zukünftigen Untersuchungen in dieser Familie der
Archaea.
3.3
Sulfolobaceae
Aus der Familie der Sulfolobaceae wurden mit Acidianus ambivalens, Metallosphaera
sedula und Sulfolobus sp. VE 6 drei Organismen für die Untersuchungen ausgewählt. Damit
wurden Vertreter der wichtigsten Gattungen dieser Familie untersucht. Alle Organismen
enthielten die Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Die Aktivitätsraten waren
auch ausreichend, um ein autotrophes Wachstum zu erklären. Lediglich bei Sulfolobus sp. VE
DISKUSSION
87
6 waren die Enzymaktivitäten niedriger, jedoch eindeutig messbar. Ein Grund für die
niedrigen Raten könnte in der Qualität der Zellen liegen. Von Sulfolobus sp. VE 6 stand nur
eine Zellcharge zur Verfügung, während bei A. ambivalens und M. sedula mehrere
Zellchargen frisch gezüchteter Zellen für die Untersuchungen herangezogen werden konnten.
Die Enzymaktivitäten, die für die Umwandlung von Acetyl-CoA mit zwei Molekülen
Bicarbonat zur C4-Einheit Methylmalonyl-CoA benötigt werden, konnten in den Organismen
der Sulfolobaceae eindeutig nachgewiesen werden. Dies waren Acetyl-CoACarboxylierungs-, Malonyl-CoA-Reduktions-, 3-Hydroxypropionat-Reduktions- und
Propionyl-CoA-Carboxylierungs-Aktivität. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit dem
Nachweis von Acetyl-CoA- und Propionyl-CoA-Carboxylase-Aktivitäten bzw. Genen in den
nahe verwandten Organismen Acidianus brierleyi und Sulfolobus metallicus (Norris et al.,
1989; Ishii et al., 1997; Burton et al., 1999; Chuakrut et al., 2003).
Außer den Enzymaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus zeigte M. sedula auch
Aktivitäten der α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und der Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase. Auch Sulfolobus sp. VE 6 zeigte die Enzymaktivität der α-Ketoglutarat:AkzeptorOxidoreduktase. In Zellextrakten von A. ambivalens dagegen konnte keine dieser Enzymaktivitäten nachgewiesen werden. Warum diese Aktivitäten vorhanden sind, ist unklar. Eine
Nutzung des reduktiven Citrat-Zyklus ist unwahrscheinlich, da keinerlei Aktivität der ATPCitrat-Lyase nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus wäre die Frage, wofür in diesem
Fall die Acetyl-CoA- und Propionyl-CoA-Carboxylase benötigt würden. Es könnte sein, dass
die Oxidoreduktasen die Aufgabe der entsprechenden Dehydrogenasen übernehmen (siehe
auch Diskussion, Abschnitte 5 und 6).
3.4
Thermoproteaceae
Aus der Familie der Thermoproteaceae wurde mit Pyrobaculum islandicum ein
Vertreter untersucht. Im Zellextrakt von Pb. islandicum konnten nur Enzymaktivitäten der
Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus nachgewiesen werden. Die Aktivitäten von αKetoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase waren
ausreichend, um das autotrophe Wachstum zu erklären. Auch die ATP-Citrat-Lyase war gut
messbar, allerdings reichte die Aktivität nicht aus, um die maximale Wachstumsrate zu
erklären. Dies könnte damit zusammenhängen, dass der Enzymtest nicht optimiert wurde,
oder dass bei 75°C und damit unterhalb der Wachstumstemperatur von 90°C gemessen
wurde. Beim reduktiven Citrat-Zyklus gibt es vier CO2-fixierende Enzyme: α-Ketoglutarat:
DISKUSSION
88
Ferredoxin-Oxidoreduktase, Isocitrat-Dehydrogenase, Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase
und PEP-Carboxylase. Bei einer berechneten CO2-Fixierungsrate von 210 nmol min-1 (mg
Protein)-1 wären somit spezifische Aktivitäten von je 50 nmol min-1 (mg Protein)-1 für die
Enzyme des Zyklus nötig. Die Aktivitäten der beiden Oxidoreduktasen sind weit höher, die
theoretische Aktivität der ATP-Citrat-Lyase würde bei 90°C 75 nmol min-1 (mg Protein)-1
betragen, wenn man von einer Verdopplung der Enzymaktivität bei einem Temperaturanstieg
um 10°C ausgeht. Damit würde auch die ATP-Citrat-Lyase ausreichend aktiv sein. Von den
Schlüsselenzymen der anderen CO2-Fixierungswege konnte keine Aktivität nachgewiesen
werden. Dies lässt den Schluss zu, dass Pb. islandicum den reduktiven Citrat-Zyklus zur
autotrophen CO2-Fixierung nutzt.
Auch bei einem weiteren Mitglied der Thermoproteaceae, bei Thermoproteus
neutrophilus, konnte der reduktive Citrat-Zyklus nachgewiesen werden (Schäfer et al., 1986;
Schäfer et al., 1989a; Schäfer et al., 1989b; Strauss et al., 1992; Beh et al., 1993). Der
reduktive Citrat-Zyklus scheint daher unter den Mitgliedern der Thermoproteaceae verbreitet
oder sogar der allgemeine autotrophe CO2-Fixierungsweg zu sein.
4.
RubisCO in Pyrodictium spp.
Bei den beiden Organismen Pd. abyssi und Pd. occultum konnte die erste RubisCO-
Aktivität innerhalb der Crenarchaeota nachgewiesen werden. Diese Aktivität wurde daher
genauer untersucht. Im Standardenzymtest wurde die Ribulose-1,5-bisphosphat-abhängige
Fixierung von 14C aus 14CO2 in säurestabile radioaktive Produkte gemessen. Beim CO2Fixierungsprodukt handelte es sich um 3-Phosphoglycerat. Das wurde durch Cochromatographie über HPLC-Analyse nachgewiesen. Die RubisCO-Aktivität bei Pd. abyssi wurde bei
verschiedenen Temperaturen gemessen, wobei sich herausstellte, dass die höchste Aktivität
im kochenden Wasserbad bei 97° C zu messen war. Da die Pyrodictiaceae bei einer
Temperatur von über 100°C wachsen können, ist die RubisCO vermutlich oberhalb von
100°C noch aktiv. Neben der kürzlich nachgewiesenen RubisCO von Thermococcus
kodakaraensis (Ezaki et al., 1999), die ebenfalls bis 100°C aktiv ist, handelt es sich um das
hitzestabilste bisher beschriebene RubisCO-Protein. Sauerstoff führt zu einer reversiblen
Hemmung der Enzymaktivität.
Vermutlich handelt es sich um eine Form III-RubisCO. Zum einen wurde eine
reversible Sauerstoffhemmung bisher nur bei der klonierten RubisCO von Methanococcus
jannaschii beobachtet (Watson et al., 1999), einer Form III-RubisCO, zum anderen konnte ein
DISKUSSION
89
Abschnitt des RubisCO-Gens von Pd. occultum von Stephan Saum aus unserer Arbeitsgruppe
sequenziert werden. Die Sequenz weist große Ähnlichkeiten zur Sequenz der RubisCO von T.
kodakaraensis auf, einem Protein der Form III (Ezaki et al., 1999; Maeda et al., 1999).
Die Funktion von Form III-RubisCO-Proteinen ist bisher unklar. Sie wurden bis zu
diesen Untersuchungen nur in Vertretern der Euryarchaeota gefunden. Diese können entweder
nicht autotroph wachsen (z.B. Haloferax mediterranei, T. kodakaraensis) oder sie nutzen
unter den bisher untersuchten Bedingungen nicht den Calvin-Zyklus, sondern den reduktiven
Acetyl-CoA-Weg zur CO2-Fixierung (z. B. Archaeoglobus fulgidus, M. jannaschii)
(Rajagopalan und Altekar, 1994; Bult et al., 1996; Klenk et al., 1997; Ezaki et al., 1999). Pd.
abyssi und Pd. occultum sind die einzigen Archaea mit einer RubisCO-Aktivität, die
autotroph wachsen und bei denen kein alternativer CO2-Fixierungsweg nachgewiesen wurde.
Die Frage, ob die RubisCO tatsächlich eine Rolle in der autotrophen CO2-Fixierung spielt, ist
aber unklar, da das zweite Schlüsselenzym des Calvin-Zyklus, die Phosphoribulokinase, nicht
nachgewiesen werden konnte. Ein alternativer Weg der Regeneration von Ribulose-1,5bisphosphat ist aber vorstellbar, so dass die Phosphoribulokinase eventuell gar nicht benötigt
wird. So könnte z. B. 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat involviert sein. Über eine Phosphathydrolyse und eine anschließende Isomerisierungsreaktion könnte Ribulose-1,5-bisphosphat
gebildet werden. Beim Calvin-Zyklus, wie er z. B. bei Pflanzen vorkommt, handelt es sich um
einen energetisch sehr aufwändigen CO2-Fixierungsweg. Es werden für die Bildung eines
Triosephosphats 9 Moleküle ATP verbraucht. Da Pflanzen und auch phototrophe Bakterien,
die den Calvin-Zyklus benutzen, ihre Energie aus dem Licht beziehen, ist bei ihnen kein
Energieengpass vorhanden. Nicht so bei Pyrodictium spp.; diese beziehen ihre Energie aus
dem Elektronentransport von H2 zu S0. Das Redoxpotential ist mit 150 mV Differenz
zwischen Elektronenakzeptor und Elektronendonor recht gering. Damit ist auch die ATPAusbeute über einen Protonengradienten durch die ATP-Synthase gering. Aus energetischen
Gesichtspunkten ist daher der Calvin-Zyklus, so wie er bisher bekannt ist, schwer vorstellbar.
Der reduktive Acetyl-CoA-Weg und der reduktive Citrat-Zyklus sind deutlich weniger
energieaufwändig als der Calvin-Zyklus. Diese CO2-Fixierungswege kommen daher bei
Mikroorganismen vor, die mit Energielimitierung zurechtkommen müssen. Der CO2Fixierungsweg bei den Pyrodictium spp. sollte einen mit diesen Wegen vergleichbaren
Energiebedarf haben. Eine Forderung für einen modifizierten Calvin-Zyklus wäre daher wohl
ein geringerer Energiebedarf.
Eine Übersicht über ATP- und Reduktionsmittelbedarf der verschiedenen CO2Fixierungswege gibt Tabelle 11.
DISKUSSION
90
Tabelle 11: Vergleich der autotrophen CO2-Fixierungswege. Die Übersicht gibt den
Bedarf an ATP und Reduktionsäquivalenten an (verändert nach Lengeler et al., 1999).
CO2-Fixierungsweg
Bedarf an ATP für die
Synthese von 1 Triosephosphat
Bedarf an Reduktionsäquivalenten für die
Synthese von
1 Triosephosphat
Calvin-Zyklus
9 ATP
6 NAD(P)H
Reduktiver Citrat-Zyklus
5 ATP
3 NAD(P)H
2 Ferredoxinred
1 unbekannter e--Donor
Reduktiver Acetyl-CoAWeg
4 – 5 ATP
3 – 4 NAD(P)H
2 – 3 Ferredoxinred
1 H2 (in Methanogenen)
3-HydroxypropionatZyklus
10 ATP
6 NADPH
1 Chinon als e--Akzeptor
5.
Regulation von Enzymaktivitäten in Metallosphaera sedula.
Die wichtigsten Enzymaktivitäten des zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsels wurden in
M. sedula näher untersucht. Dabei wurden die Enzyme ausgewählt, die möglicherweise an der
autotrophen CO2-Fixierung beteiligt sein könnten. Um Aussagen über die Regulation dieser
Enzyme machen zu können, wurden die Enzymaktivitäten von Zellen, die autotroph
gewachsen waren, mit denen heterotroph gewachsener Zellen verglichen.
Die Enzymaktivitäten des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, die für die Acetyl-CoACarboxylierung, Malonyl-CoA-Reduktion, 3-Hydroxypropionat-Reduktion und PropionylCoA-Carboxylierung benötigt werden, sind unter autotrophen Wachstumsbedingungen
hochreguliert. Die Malyl-CoA-Lyase-Aktivität, eine weitere Schlüsselaktivität des 3Hydroxypropionat-Zyklus in C. aurantiacus, konnte dagegen nicht nachgewiesen werden.
Damit ist, wie schon erwähnt, die Bildung der C4-Einheit Methylmalonyl-CoA und damit
auch die Bildung von Succinyl-CoA aus Acetyl-CoA und zwei Molekülen Bicarbonat
möglich. Der Weg der Acetyl-CoA-Regeneration aus Methylmalonyl-CoA bzw. SuccinylCoA ist dagegen unklar. Es ist möglich, dass der 3-Hydroxypropionat-Zyklus bei M. sedula
im Vergleich zu C. aurantiacus in einer abgewandelten Form vorkommt. Hierfür sprechen
auch die Ergebnisse der 13C-Markierungsstudie (siehe Diskussion, Abschnitt 6).
DISKUSSION
91
Andere Enzyme, wie die Enzyme des Citrat-Zyklus, Fumarat-Hydratase, MalatDehydrogenase, Citrat-Synthase, Aconitase oder Isocitrat-Dehydrogenase waren unter
heterotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert.
Interessanterweise waren die Aktivitäten der α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase
und der Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase unter autotrophen Wachstumsbedingungen
nachweisbar und im Vergleich zur Situation bei heterotrophen Wachstumsbedingungen
deutlich hochreguliert. Wofür diese Oxidoreduktasen im autotrophen Stoffwechsel benötigt
werden, ist unklar. Eine Enzymaktivität von α-Ketoglutarat-Dehydrogenase und PyruvatDehydrogenase konnte nicht nachgewiesen werden. Es kann daher sein, dass die Oxidoreduktasen diese Enzymaktivitäten ersetzen. Die Enzyme eines modifizierten Citrat-Zyklus
könnten die komplette Oxidation von Pyruvat katalysieren. Das wäre nicht sinnvoll, da M.
sedula unter autotrophen Bedingungen Pyruvat synthetisieren muss. Auch der umgekehrte
Ablauf als reduktiver Citrat-Zyklus ist unwahrscheinlich, da keine ATP-Citrat-LyaseAktivität gemessen, die Citrat-Synthase-Aktivität dagegen nachgewiesen werden konnte. Vor
allem die Ergebnisse der 13C-Markierungsstudie sprechen gegen eine reduktive
Carboxylierung von Succinyl-CoA bzw. Acetyl-CoA (siehe auch Diskussion, Abschnitt 6).
Unter autotrophen Wachstumsbedingungen konnten in M. sedula auch die Enzymaktivitäten von Pyruvat-Carboxylase und PEP-Carboxykinase gemessen werden. Dies legt
nahe, dass Pyruvat zu Oxalacetat carboxyliert, und dieses wiederum in PEP umgewandelt
wird. Dieser Teil des Stoffwechsels unterscheidet sich im Detail damit von dem von C.
aurantiacus. Dort wurden die Enzyme Pyruvat:Phosphat-Dikinase und PEP-Carboxylase
nachgewiesen. In C. aurantiacus wird daher zuerst PEP gebildet und dieses dann zu
Oxalacetat carboxyliert (Herter et al., 2001).
6.
13
C-Markierungsstudien in Metallosphaera sedula
Um eine Beteiligung der Enzyme α-Ketoglutarat:Akzeptor- und Pyruvat:AkzeptorOxidoreduktase am autotrophen CO2-Fixierungsweg zu überprüfen und um Aussagen über
den noch ungeklärten Weg der Acetyl-CoA-Regeneration in M. sedula machen zu können,
wurden 13C-Langzeitmarkierungsexperimente mit 13C-Succinat durchgeführt. Zu autotroph
wachsenden Zellen wurden geringe Mengen 13C-Succinat zugefüttert. Die 13C-Markierung
wurde über die in M. sedula aktiven Stoffwechselwege in die Aminosäuren des Zellproteins
eingebaut. Aus deren Markierungsmuster kann auf die vorhandenen Stoffwechselwege
geschlossen werden (Bacher et al., 1999; Eisenreich und Bacher, 2000).
DISKUSSION
92
Kernpunkt der Untersuchung war das Markierungsmuster von α-Ketoglutarat. Im
Markierungsmuster von Prolin, welches sich vom α-Ketoglutarat ableitet, war eine 13CAnreicherung an C1 (5,2 %) messbar. Damit ist die Bildung von α-Ketoglutarat aus SuccinylCoA über die α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase ausgeschlossen, da in diesem Fall C1
unmarkiert sein sollte. Die Markierung spricht eher für die Bildung aus Oxalacetat und
Acetyl-CoA über Citrat und Isocitrat (siehe Abbildung 21). Geht man von zweifach
markiertem Oxalacetat (an C1 und C4) und unmarkiertem Acetyl-CoA aus, so entsteht αKetoglutarat mit einer C1-Markierung. Die ursprüngliche Markierung von Acetyl-CoA ließ
sich aus der Markierung von Leucin ableiten. Demnach war Acetyl-CoA an C1 schwach
markiert (2,9 %). Diese Markierung sollte dann im C5 von Prolin wieder zu finden sein, das
aber wiederum nur minimal markiert (1,3 %) war. Es bleibt damit noch ein Fragezeichen
hinter dem Bildungsweg von α-Ketoglutarat. Die Bildung könnte über den Citrat-Zyklus
erfolgen, wie in Abbildung 21 gezeigt. Die hierfür benötigten Enzymaktivitäten wurden in M.
sedula nachgewiesen (vergleiche Tabelle 6). Es ist aber unverständlich, wozu bei der
autotrophen Lebensweise von M. sedula eine α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase
benötigt wird. Succinyl-CoA wird über den 3-Hydroxypropionat-Zyklus geliefert, daher sollte
die Bildung von Succinyl-CoA aus α-Ketoglutarat eigentlich nicht nötig sein.
○ COSCoA
+ CO2
CH2
CH3
COOH
?
Alanin
Valin
Leucin
Isoleucin
?
COOH
CH2
CHOH
CH2O P
CH3
●
CH2
○ CH3
● COOH
C O
- CO2
Leucin
○ CH2OH
● COOH
○ COSCoA
● COOH
● COOH
○ COOH
CH2
C O
CH2
CH2
CH2
● COOH
● COOH
HO
Serin
Glycin
C COOH
CH2
●
● COOH
COSCoA
- CO2
+ CO2
○ CH3
HOOC CH
COSCoA
COOH
○ CH2
CH2
COSCoA
Aspartat
Threonin
●
○ COOH
CH2
CH2
C
Glutamat
Prolin
O
● COOH
Abb. 21: 13C-Markierungsmuster im postulierten autotrophen CO2-Fixierungsweg von
Metallosphaera sedula. (verändert nach Strauss et al., 1992).
DISKUSSION
93
Das Markierungsmuster von Pyruvat (abgeleitet von Alanin und Valin) zeigt eine starke
Anreicherung an C1. Das spricht gegen eine reduktive Carboxylierung von Acetyl-CoA zu
Pyruvat über die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase, da dann C1 aus CO2 stammen würde und
damit unmarkiert vorliegen müsste. Das Markierungsmuster ließe sich durch eine Decarboxylierung von zweifach markiertem Oxalacetat erklären.
Es können daher noch keine abschließenden Aussagen über die Bildung von αKetoglutarat und Pyruvat, sowie über die Regeneration von Acetyl-CoA in M. sedula gemacht
werden. Fest steht, dass die α-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase nicht daran beteiligt ist.
Auch die Malat-Spaltung über die Malyl-CoA-Lyase ist fraglich, da dieses Enzym nicht
gemessen werden konnte und die Markierungsmuster von C. aurantiacus und M. sedula
deutliche Unterschiede zeigen. M. sedula nutzt daher wahrscheinlich einen modifizierten 3Hydroxypropionat-Zyklus zur CO2-Fixierung.
7.
Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase von Metallosphaera sedula
Aus M. sedula wurde ein Enzym gereinigt und charakterisiert, das sowohl die Carboxy-
lierung von Acetyl-CoA, als auch die Carboxylierung von Propionyl-CoA katalysiert. Dabei
handelt es sich um ein Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus der Archaea, da diese
im Gegensatz zu den Bakterien keine Fettsäuren besitzen und deshalb auch keine AcetylCoA-Carboxylase für die Synthese von Fettsäuren benötigen. Das Vorhandensein dieses
Enzyms ist daher ein starkes Indiz für den 3-Hydroxypropionat-Zyklus in einem Archaeon.
Das Enzym Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase (E.C. 6.4.1.2 und E.C. 6.4.1.3)
besteht aus 3 Untereinheiten (16,8 kDa (AccB), 57 kDa (AccC), 57 kDa (PccB)). Es
katalysiert beide Carboxylierungsreaktionen, was durch folgende Ergebnisse nahegelegt wird:
Erstens erfolgt der Umsatz von Acetyl-CoA und Propionyl-CoA mit fast derselben Rate.
Zweitens wurden über Southern Blot-Experimente, die von Dr. Robert Krieger durchgeführt
wurden, nur eine Kopie des pccB-Gens gefunden. Dieses codiert für eine Carboxyltransferase,
die demnach die Carboxylgruppe auf beide Substrate übertragen kann. Auch der Zusatz der in
E. coli überexprimierten, gereinigten Carboxyltransferase PccB führte nicht zu einer höheren
Carboxylase-Aktivität, weder mit Acetyl-CoA, noch mit Propionyl-CoA. Schließlich konnte
in den verwandten Organismen Sulfolobus solfataricus und Sulfolobus tokodaii, deren
Genome bereits vollständig sequenziert wurden (She et al., 2001; Kawarabayasi et al., 2001),
nur drei Gene gefunden werden, die für die Untereinheiten einer Acetyl-CoA-/PropionylCoA-Carboxylase codieren. Die Proteine, für die diese Gene codieren, weisen eine hohe
DISKUSSION
94
Homologie zu denen von M. sedula auf. Einen Überblick über die Anordnung der
Carboxylase-Gene in M. sedula, A. brierleyi, S. metallicus, S. solfataricus und S. tokodaii ist
in Abbildung 22 gezeigt. In den anderen Vertretern der Sulfolobaceae liegen die 3 Gene, die
für die Carboxylase codieren, nebeneinander. Bei M. sedula dagegen ist pccB in einem
anderen Bereich des Genoms zu finden als die Gene accB und accC. Ein Alignment der
Proteinsequenzen der Carboxylasen der Sulfolobaceae ist im Anhang gezeigt. Ein Vergleich
der Aminosäurensequenzen der Carboxylasen von Archaea mit bekannten Carboxylasen von
Bakterien und Eukaryoten zeigt eine höhere Homologie der Archaea-Enzyme zu den
Bakterien-Enzymen als zu den Eukaryoten-Enzymen.
In Abbildung 22 ist zusätzlich die Analyse der M. sedula-Sequenzen hinsichtlich
Promotor- und Terminationsstrukturen gezeigt. Vor den Genen pccB und accC finden sich
Sequenzen für einen möglichen starken Promotor (TTTAAA ca. 30 Basen vor dem Startcodon), sowie die für Archaea typische Sequenz für eine Ribosomenbindestelle (ShineDalgarno-Sequenz GTGA). Hinter den Genen pccB und accB findet sich ein Poly-T-Strang,
ein mögliches Terminationssignal in Archaea. Das Stopp-Codon für accC (TGA) und das
Start-ATG von accB überlappen sich (zur Transkription und Translation in Archaea siehe:
Reiter et al., 1988; Thomm und Wich, 1988; Dennis, 1997; Bell und Jackson, 1998; Condò et
al., 1999).
Durch einen Vergleich der Genprodukte von M. sedula mit bakteriellen Carboxylasen
lassen sich den einzelnen Proteinen Funktionen zuordnen. AccB ist eine biotinhaltige
Untereinheit. Sie kann über eine Biotinfärbung nachgewiesen werden. Bei AccC handelt es
sich um eine Biotincarboxylase, PccB ist eine Carboxyltransferase. Bei E. coli wurden die
Untereinheiten der Acetyl-CoA-Carboxylase einzeln gereinigt, da das Holoenzym instabil ist.
Erst durch hohe Konzentrationen der einzelnen Komponenten lässt sich die Enzymaktivität
rekonstituieren (Cronan und Rock, 1996). Das E. coli-Enzym setzt sich aus vier Untereinheiten zusammen: der Biotincarboxylase AccC, dem Biotin-Carrier-Protein AccB, sowie
der Carboxyltransferase, die wiederum aus den Untereinheiten AccA und AccD zusammengesetzt ist (Li und Cronan, 1992; Cronan und Rock, 1996; Choi-Rhee und Cronan, 2003). Die
Acetyl-CoA-Carboxylase von M. sedula besteht dagegen nur aus drei Untereinheiten. Sie ist
sehr stabil, kann im Zellextrakt gemessen und als Holoenzym gereinigt werden. Aus dem
nativen Molekulargewicht von 560 ± 50 kDa und einem Untereinheitenverhältnis von 1:1:1,
das durch N-terminale Aminosäurensequenzierung ermittelt wurde, ergibt sich ein Enzym mit
(AccB, AccC, PccB)4-Struktur. Die berechnete Molekularmasse beträgt 530 kDa. Da es sich
um eine als Holoenzym gereinigte Acetyl-CoA-Carboxylase handelt, ist das Enzym ein
DISKUSSION
95
ideales Objekt für Kristallisationsstudien, um einen weitergehenden Einblick in die Struktur
dieses wichtigen Enzyms zu bekommen. Bisher sind nur die Kristallstrukturen einzelner
Untereinheiten von prokaryotischen Acetyl-CoA-Carboxylasen bekannt, z. B. die BiotinCarboxylase und das Biotin-Carrier-Protein von E. coli (Waldrop et al., 1994; Athappilly und
Hendrickson, 1995). Die Interaktion der einzelnen Untereinheiten ist daher noch weitgehend
unklar.
Da M. sedula bei einem optimalen pH-Wert von 1,5 – 2,5 wächst, und bei diesem pHWert das CO2/HCO3--Gleichgewicht stark auf Seite des CO2 liegt, ist anzunehmen, dass CO2
von der Zelle aufgenommen wird. Die Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase nutzt aber
Bicarbonat als Substrat. Eine Umwandlung von CO2 in Bicarbonat könnte im Zellplasma von
einer Carboanhydrase (E.C. 4.2.1.1) katalysiert werden. In den Genomsequenzen von S.
solfataricus und S. tokodaii wurde ein Gen gefunden, das für eine mögliche Carboanhydrase
codieren könnte.
Die katalytischen Eigenschaften der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase wie
Vmax und die Km-Werte wurden bestimmt. Sie liegen alle im physiologischen Bereich. Das
Enzym benötigt ATP und Mg2+ als divalentes Kation. Ein Ersatz durch andere Nukleotide
oder andere divalente Kationen führt zu einer geringeren Enzymaktivität. In der Zwischenzeit
wurde eine weitere Acyl-CoA-Carboxylase aus dem Reich der Archaea gereinigt, nämlich aus
A. brierleyi (Chuakrut et al., 2003). Auch dieses Enzym scheint am 3-HydroxypropionatZyklus beteiligt zu sein und es katalysiert ebenfalls die Carboxylierung von Acetyl-CoA und
Propionyl-CoA. Das Enzym aus A. brierleyi ist in seinen Eigenschaften der Carboxylase von
M. sedula sehr ähnlich.
DISKUSSION
96
A
Metallosphaera sedula
1
B
pccB
E
2
3
D
accB
C
accC
Acidianus brierleyi
accC
accB
pccB
Sulfolobus metallicus
accB
accC
pccB
Sulfolobus solfataricus
ABC
accC
accB
pccB
Helicase
HP
accB
pccB
Helicase
HP
Sulfolobus tokodaii
ABC
accC
Poly A-Strang Promotor
A: 601ACTAAAGTTTAAATGATAAAAATTTTAAGAGAGAACTTACA
RBS
Start-Codon
ATAGGTCTTGATTAGACATGACTG665
Stopp-Codon Terminationssignal
B: 2221TATACCCCTCTAAGGCCTTCTTTTCTTTACCAAGAGCCTA2260
Poly A-Strang Promotor
C: 271TAAGAAAAACTGATAGATAAAAACTTTTTAAACTATTCGAG
RBS
Start-Codon
TTATATTTATGTGATTCTTATGCCAC337
Start- und Stopp-Codon
D: 1851GATGTGGGGATGAAACTGTATAGGGTTCAT1870
Stopp-Codon
Terminationssignal
E: 2351GGTGATAAAGTAAGCTGGTTATTCTGGGAG2380
Abb. 22: Anordnung der Carboxylase-Gene in M. sedula, A. brierleyi, S. metallicus, S.
solfataricus und S. tokodaii. Im oberen Teil der Abbildung sind die Carboxylase-Gene in ihrer
genomischen Umgebung dargestellt. Der untere Teil der Abbildung zeigt die Nukleotidsequenzen der
Fragmente A bis E der Sequenz von M. sedula. Es wurden darin die Start- und Stopp-Codons,
Promotor- und Terminationssequenzen, sowie Ribosomenbindestellen (RBS) hervorgehoben. ABC:
Gen codiert für einen möglichen ABC-Transporter, HP: Gen codiert für ein hypothetisches Protein.
DISKUSSION
8.
97
Verteilung der CO2-Fixierungswege in Archaea
Durch diese Arbeit wurde erstmals ein umfassender Einblick in die CO2-Fixierung der
Crenarchaeota gegeben. Ein Verständnis des Metabolismus dieser wichtigen Organismengruppe könnte auch interessante Einblicke in die Evolution von Stoffwechselwegen geben, da
die Crenarchaeota als ursprüngliche Organismen angesehen werden. Es scheint, dass jede der
verschiedenen Familien mit autotrophen Mitgliedern einen eigenen CO2-Fixierungsmechanismus besitzt. Eine Übersicht gibt Abbildung 23. So nutzen Vertreter der Thermoproteaceae den reduktiven Citrat-Zyklus, Vertreter der Sulfolobaceae einen 3-Hydroxypropionat-Zyklus und Vertreter der Pyrodictiaceae ein RubisCO-Protein, das an der CO2Fixierung beteiligt sein könnte. Bei den Vertretern der Desulfurococcaceae konnte noch
wenig über deren CO2-Fixierungsweg herausgefunden werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit
legen einen neuartigen Stoffwechselweg nahe.
Hyperthermus butylicus
Pyrodictiaceae
Pyrodictium occultum
Pyrodictium abyssi
Modifizierter Calvin-Zyklus ?
Pyrolobus fumarii
Thermosphaera aggregans
Desulfurococcus mobilis
Sulfophobococcus zilligii
Staphylothermus marinus
Desulfurococcaceae
Neuartiger CO2-Fixierungsweg ?
Ignicoccus pacificus
Ignicoccus islandicus
Thermodiscus maritimus
Aeropyrum pernix
Stetteria hydrogenophila
Metallosphaera sedula
Acidianus brierleyi
Acidianus ambivalens
Sulfolobaceae
Acidianus infernus
Sulfolobus solfataricus
Sulfolobus sp. VE 6
Sulfolobus acidocaldarius
Modifizierter
3-HydroxypropionatZyklus
Stygiolobus azoricus
Sulfolobus metallicus
Pyrobaculum islandicum
Thermoproteus neutrophilus
Thermoproteus tenax
Thermofilum pendens
Thermoproteaceae
Reduktiver Citrat-Zyklus
Thermofilaceae
0,1
Abb. 23: Phylogenetischer Stammbaum der Crenarchaeota und die postulierten CO2Fixierungswege.
DISKUSSION
98
Bei den Bakterien konnte bislang kein Zusammenhang zwischen phylogenetischer
Position und CO2-Fixierungsweg gefunden werden, daher überrascht das Ergebnis dieser
Arbeit. So gehören zum Beispiel die sulfatreduzierenden Gattungen Desulfobacter und
Desulfobacterium zur gleichen Familie innerhalb der δ-Gruppe der Proteobakterien und
Vertreter beider können unter autotrophen Bedingungen Acetyl-CoA aus CO2 bilden. Ihre
Stoffwechselwege sind allerdings verschieden. Während die Desulfobacter spp. den
reduktiven Citrat-Zyklus nutzen, kommt bei den Desulfobacterium spp. der reduktive AcetylCoA-Weg vor (Schauder et al., 1987; Länge et al., 1989; Thauer et al., 1989). Dies zeigt, dass
zwei völlig verschiedene Stoffwechselwege in derselben Bakteriengruppe vorkommen
können. Derselbe Stoffwechselweg kommt auch in sehr verschiedenen Organismengruppen
vor, die nicht miteinander verwandt sind. So kommt der reduktive Acetyl-CoA-Weg nicht nur
in verschiedenen Ordnungen der Euryarchaeota vor, wie z. B. bei den Archaeoglobales oder
in mehreren Ordnungen der Methanogenen, sondern ist auch unter den Bakterien weit
verbreitet. Aufgrund dieser Beispiele könnte man argumentieren, dass Phylogenie für die
Verbreitung eines Stoffwechselweges weniger bedeutend ist als andere Faktoren. So kann die
Umwelt der Mikroorganismen z. B. einen Stoffwechselweg mit sauerstoffempfindlichen
Enzymen oder einen energieaufwändigen Weg verhindern. Für endgültige Schlussfolgerungen sind die Datenmengen aber bei weitem nicht ausreichend.
Auch für die Diskussion, welcher CO2-Fixierungsweg in der Evolution zuerst entstand,
sind die Ergebnisse dieser Arbeit interessant. So plädierte Fuchs schon früh für den
reduktiven Acetyl-CoA-Weg als Modell für einen ersten CO2-Fixierungsweg bei einem
chemoautotrophen Ursprung des Lebens (Fuchs 1989). Diese Thesen wurden in jüngster Zeit
wieder aufgegriffen (Huber und Wächtershäuser, 1997; Martin und Russell, 2003; Huber et
al., 2003b). Interessanterweise konnte der reduktive Acetyl-CoA-Weg bei keinem Vertreter
der Crenarchaeota nachgewiesen werden, obwohl diese thermophilen Organismen als
ursprünglich angesehen werden. Der reduktive Citrat-Zyklus, den Wächtershäuser als
vielleicht ältesten CO2-Fixierungsweg vermutete (Wächtershäuser, 1990), ist dagegen
innerhalb der Thermoproteaceae zu finden. Eine endgültige Antwort auf diese Frage kann
derzeit nicht gegeben werden.
Die Existenz eines RubisCO-Proteins innerhalb der Pyrodictiaceae ist ebenfalls
interessant, da man hier möglicherweise etwas über die Evolution der RubisCO und des
Calvin-Zyklus lernen kann. Weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der CO2-Fixierung der
Crenarchaeota sind durchaus lohnend. Ein erster wichtiger Schritt, um die vielen Rätsel, die
noch mit diesen Organismen verbunden sind zu lösen, wurde mit dieser Arbeit gegangen.
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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
109
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A.
Abb.
ADP
ATP
AMP
BSA
BV
C.
CAPSO
CoA
CTAB
d
D.
DCPIP
DEAEDTE
DTNB
E.
EDTA
Fd
FPLC
g
GDP
GTP
HPLC
I.
Km
LB
M.
MOPS
MV
N.
NAD(H)
NADP(H)
NMR
OD
ORF
PAGE
Pb.
PCR
Pd.
Acidianus oder Archaeoglobus
Abbildung
Adenosindiphosphat
Adenosintriphosphat
Adenosinmonophosphat
Rinderserumalbumin
Benzylviologen
Chloroflexus
Cyclohexylamino-2-hydroxy-1-propansulfonsäure
Coenzym A
Cetryltrimethylammoniumbromid
Dicke
Desulfobacter oder Desulfobacterium
Dichlorophenolindophenol
DiethylaminoethylDithioerythritol
Dithiobis-2-nitrobenzoesäure
Escherichia
Ethyldiaminotetraessigsäure
Ferredoxin
Fast Performance Liquid Chromatography
Erdbeschleunigung
Guanosindiphosphat
Guanosintriphosphat
High Performance Liquid Chromatography
Ignicoccus
Michaelis-Menten-Konstante
Luria-Bertani
Metallosphaera oder Methanococcus oder Methanosarcina
Morpholinopropansulfonsäure
Methylviologen
Nanoarchaeum
Nicontinamidadenindinucleotid
Nicontinamidadenindinucleotidphosphat
Nuclear Magnetic Resonance
Optische Dichte
Offenes Leseraster
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Pyrobaculum
Polymerase-Kettenreaktion
Pyrodictium
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
PEP
3-PGA
Pi
PPi
PVDF
R.
RP
RubisCO
S.
SDS
sp.
spp.
T.
Taps
TBS
TCA
TE
Tris
U
UTP
UV/VIS
Vmax
v/v
w/v
110
Phosphoenolpyruvat
3-Phosphoglycerat
Phosphat
Pyrophosphat
Polyvinylidendifluorid
Ralstonia
Reversed Phase
Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase
Sulfolobus
Natriumdodecylsulfat
Spezies (Einzahl)
Spezies (Mehrzahl)
Thermoproteus oder Thermococcus
Tris-(hydroxymethyl-)methyl-3-aminopropansulfonsäure
Tris-gepufferte Salzlösung
Trichloressigsäure
Tris-EDTA-Puffer
Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
Umdrehungen
Uridintriphosphat
Ultraviolet/Visible
maximale Enzymaktivität
Volumenprozent
Gewichtsprozent
ANHANG
I
1. Nukleotid- und abgeleitete Proteinsequenz von mcr
Das Gen mcr codiert für die Malonyl-CoA-Reduktase. Start- und Stopp-Codon des offenen
Leserasters sind jeweils fett gedruckt.
CATGCTCACAGAAGTATGCACGCGCATGCCATTGGCAACCGCTTTCTATCACGGTTGTCA
AAAAATCACTTAAGCCATATCAACAGTCATACATTCTTAACCATCCGTGAAATTTGGAAC
AACATCATGGTATACTATACCTATCGATAATTCTTCAACTAATTGCATAACAGAACAGCG
ATGGCGACGGGGGAGTCCATGAGCGGAACAGGACGACTGGCAGGAAAGATTGCGTTAATT
1
M S G T G R L A G K I A L I
ACCGGTGGCGCCGGCAATATCGGCAGTGAATTGACACGTCGCTTTCTCGCAGAGGGAGCG
15 T G G A G N I G S E L T R R F L A E G A
ACGGTCATTATTAGTGGACGGAATCGGGCGAAGTTGACCGCACTGGCCGAACGGATGCAG
35 T V I I S G R N R A K L T A L A E R M Q
GCAGAGGCAGGAGTGCCGGCAAAGCGCATCGATCTCGAAGTCATGGATGGGAGTGATCCG
55 A E A G V P A K R I D L E V M D G S D P
GTCGCGGTACGTGCCGGTATCGAAGCGATTGTGGCCCGTCACGGCCAGATCGACATTCTG
75 V A V R A G I E A I V A R H G Q I D I L
GTCAACAATGCAGGAAGTGCCGGTGCCCAGCGTCGTCTGGCCGAGATTCCACTCACTGAA
95 V N N A G S A G A Q R R L A E I P L T E
GCTGAATTAGGCCCTGGCGCCGAAGAGACGCTTCATGCCAGCATCGCCAATTTACTTGGT
115 A E L G P G A E E T L H A S I A N L L G
ATGGGATGGCATCTGATGCGTATTGCGGCACCTCATATGCCGGTAGGAAGTGCGGTCATC
135 M G W H L M R I A A P H M P V G S A V I
AATGTCTCGACCATCTTTTCACGGGCTGAGTACTACGGGCGGATTCCGTATGTCACCCCT
155 N V S T I F S R A E Y Y G R I P Y V T P
AAAGCTGCTCTTAATGCTCTATCTCAACTTGCTGCGCGTGAGTTAGGTGCACGTGGCATC
175 K A A L N A L S Q L A A R E L G A R G I
CGCGTTAATACGATCTTTCCCGGCCCGATTGAAAGTGATCGCATCCGTACAGTGTTCCAG
195 R V N T I F P G P I E S D R I R T V F Q
CGTATGGATCAGCTCAAGGGGCGGCCCGAAGGCGACACAGCGCACCATTTTTTGAACACC
215 R M D Q L K G R P E G D T A H H F L N T
ATGCGATTGTGTCGTGCCAACGACCAGGGCGCGCTTGAACGTCGGTTCCCCTCCGTCGGT
235 M R L C R A N D Q G A L E R R F P S V G
GATGTGGCAGACGCCGCTGTCTTTCTGGCCAGTGCCGAATCCGCCGCTCTCTCCGGTGAG
255 D V A D A A V F L A S A E S A A L S G E
ACGATTGAGGTTACGCACGGAATGGAGTTGCCGGCCTGCAGTGAGACCAGCCTGCTGGCC
275 T I E V T H G M E L P A C S E T S L L A
CGTACTGATCTGCGCACGATTGATGCCAGTGGCCGCACGACGCTCATCTGCGCCGGCGAC
295 R T D L R T I D A S G R T T L I C A G D
CAGATTGAAGAGGTGATGGCGCTCACCGGTATGTTGCGTACCTGTGGGAGTGAAGTGATC
315 Q I E E V M A L T G M L R T C G S E V I
ANHANG
II
ATCGGCTTCCGTTCGGCTGCGGCGCTGGCCCAGTTCGAGCAGGCAGTCAATGAGAGTCGG
335 I G F R S A A A L A Q F E Q A V N E S R
CGGCTGGCCGGCGCAGACTTTACGCCTCCCATTGCCTTGCCACTCGATCCACGCGATCCG
355 R L A G A D F T P P I A L P L D P R D P
GCAACAATTGACGCTGTCTTCGATTGGGGGGCCGGCGAGAATACCGGCGGGATTCATGCA
375 A T I D A V F D W G A G E N T G G I H A
GCGGTGATTCTGCCTGCTACCAGTCACGAACCGGCACCGTGCGTGATTGAGGTTGATGAT
395 A V I L P A T S H E P A P C V I E V D D
GAGCGGGTGCTGAATTTTCTGGCCGATGAAATCACCGGGACAATTGTGATTGCCAGTCGC
415 E R V L N F L A D E I T G T I V I A S R
CTGGCCCGTTACTGGCAGTCGCAACGGCTTACCCCCGGCGCACGTGCGCGTGGGCCGCGT
435 L A R Y W Q S Q R L T P G A R A R G P R
GTCATTTTTCTCTCGAACGGTGCCGATCAAAATGGGAATGTTTACGGACGCATTCAAAGT
455 V I F L S N G A D Q N G N V Y G R I Q S
GCCGCTATCGGTCAGCTCATTCGTGTGTGGCGTCACGAGGCTGAACTTGACTATCAGCGT
475 A A I G Q L I R V W R H E A E L D Y Q R
GCCAGCGCCGCCGGTGATCATGTGCTGCCGCCGGTATGGGCCAATCAGATTGTGCGCTTC
495 A S A A G D H V L P P V W A N Q I V R F
GCTAACCGCAGCCTTGAAGGGTTAGAATTTGCCTGTGCCTGGACAGCTCAATTGCTCCAT
515 A N R S L E G L E F A C A W T A Q L L H
AGTCAACGCCATATCAATGAGATTACCCTCAACATCCCTGCCAACATTAGCGCCACCACC
535 S Q R H I N E I T L N I P A N I S A T T
GGCGCACGCAGTGCATCGGTCGGATGGGCGGAAAGCCTGATCGGGTTGCATTTGGGGAAA
555 G A R S A S V G W A E S L I G L H L G K
GTTGCCTTGATTACCGGTGGCAGCGCCGGTATTGGTGGGCAGATCGGGCGCCTCCTGGCT
575 V A L I T G G S A G I G G Q I G R L L A
TTGAGTGGCGCGCGCGTGATGCTGGCAGCCCGTGATCGGCATAAGCTCGAACAGATGCAG
595 L S G A R V M L A A R D R H K L E Q M Q
GCGATGATCCAATCTGAGCTGGCTGAGGTGGGGTATACCGATGTCGAAGATCGCGTCCAC
615 A M I Q S E L A E V G Y T D V E D R V H
ATTGCACCGGGCTGCGATGTGAGTAGCGAAGCGCAGCTTGCGGATCTTGTTGAACGTACC
635 I A P G C D V S S E A Q L A D L V E R T
CTGTCAGCTTTTGGCACCGTCGATTATCTGATCAACAACGCCGGGATCGCCGGTGTCGAA
655 L S A F G T V D Y L I N N A G I A G V E
GAGATGGTTATCGATATGCCAGTTGAGGGATGGCGCCATACCCTCTTCGCCAATCTGATC
675 E M V I D M P V E G W R H T L F A N L I
AGCAACTACTCGTTGATGCGCAAACTGGCGCCGTTGATGAAAAAACAGGGTAGCGGTTAC
695 S N Y S L M R K L A P L M K K Q G S G Y
ATCCTTAACGTCTCATCATACTTTGGCGGTGAAAAAGATGCGGCCATTCCCTACCCCAAC
715 I L N V S S Y F G G E K D A A I P Y P N
CGTGCCGATTACGCCGTCTCGAAGGCTGGTCAGCGGGCAATGGCCGAAGTCTTTGCGCGC
ANHANG
735 R
III
A
D
Y
A
V
S
K
A
G
Q
R
A
M
A
E
V
F
A
R
TTCCTTGGCCCGGAGATACAGATCAATGCCATTGCGCCGGGTCCGGTCGAAGGTGATCGC
755 F L G P E I Q I N A I A P G P V E G D R
TTGCGCGGTACCGGTGAACGTCCCGGCCTCTTTGCCCGTCGGGCGCGGCTGATTTTGGAG
775 L R G T G E R P G L F A R R A R L I L E
AACAAGCGGCTGAATGAGCTTCACGCTGCTCTTATCGCGGCTGCGCGCACCGATGAGCGA
795 N K R L N E L H A A L I A A A R T D E R
TCTATGCACGAACTGGTTGAACTGCTCTTACCCAATGATGTGGCCGCACTAGAGCAGAAT
815 S M H E L V E L L L P N D V A A L E Q N
CCCGCAGCACCTACCGCGTTGCGTGAACTGGCACGACGTTTTCGCAGCGAAGGCGATCCG
835 P A A P T A L R E L A R R F R S E G D P
GCGGCATCATCAAGCAGTGCGCTGCTGAACCGTTCAATTGCCGCTAAATTGCTGGCTCGT
855 A A S S S S A L L N R S I A A K L L A R
TTGCATAATGGTGGCTATGTGTTGCCTGCCGACATCTTTGCAAACCTGCCAAACCCGCCC
875 L H N G G Y V L P A D I F A N L P N P P
GATCCCTTCTTCACCCGAGCCCAGATTGATCGCGAGGCTCGCAAGGTTCGTGACGGCATC
895 D P F F T R A Q I D R E A R K V R D G I
ATGGGGATGCTCTACCTGCAACGGATGCCGACTGAGTTTGATGTCGCAATGGCCACCGTC
915 M G M L Y L Q R M P T E F D V A M A T V
TATTACCTTGCCGACCGCAATGTCAGTGGTGAGACATTCCACCCATCAGGTGGTTTGCGT
935 Y Y L A D R N V S G E T F H P S G G L R
TACGAACGCACCCCTACCGGTGGCGAACTCTTCGGCTTGCCCTCACCGGAACGGCTGGCG
955 Y E R T P T G G E L F G L P S P E R L A
GAGCTGGTCGGAAGCACGGTCTATCTGATAGGTGAACATCTGACTGAACACCTTAACCTG
975 E L V G S T V Y L I G E H L T E H L N L
CTTGCCCGTGCGTACCTCGAACGTTACGGGGCACGTCAGGTAGTGATGATTGTTGAGACA
995 L A R A Y L E R Y G A R Q V V M I V E T
GAAACCGGGGCAGAGACAATGCGTCGCTTGCTCCACGATCACGTCGAGGCTGGTCGGCTG
1015 E T G A E T M R R L L H D H V E A G R L
ATGACTATTGTGGCCGGTGATCAGATCGAAGCCGCTATCGACCAGGCTATCACTCGCTAC
1035 M T I V A G D Q I E A A I D Q A I T R Y
GGTCGCCCAGGGCCGGTCGTCTGTACCCCCTTCCGGCCACTGCCGACGGTACCACTGGTC
1055 G R P G P V V C T P F R P L P T V P L V
GGGCGTAAAGACAGTGACTGGAGCACAGTGTTGAGTGAGGCTGAATTTGCCGAGTTGTGC
1075 G R K D S D W S T V L S E A E F A E L C
GAACACCAGCTCACCCACCATTTCCGGGTAGCGCGCAAGATTGCCCTGAGTGATGGTGCC
1095 E H Q L T H H F R V A R K I A L S D G A
AGTCTCGCGCTGGTCACTCCCGAAACTACGGCTACCTCAACTACCGAGCAATTTGCTCTG
1115 S L A L V T P E T T A T S T T E Q F A L
GCTAACTTCATCAAAACGACCCTTCACGCTTTTACGGCTACGATTGGTGTCGAGAGCGAA
1135 A N F I K T T L H A F T A T I G V E S E
ANHANG
IV
AGAACTGCTCAGCGCATTCTGATCAATCAAGTCGATCTGACCCGGCGTGCGCGTGCCGAA
1155 R T A Q R I L I N Q V D L T R R A R A E
GAGCCGCGTGATCCGCACGAGCGTCAACAAGAACTGGAACGTTTTATCGAGGCAGTCTTG
1175 E P R D P H E R Q Q E L E R F I E A V L
CTGGTCACTGCACCACTCCCGCCTGAAGCCGATACCCGTTACGCCGGGCGGATTCATCGC
1195 L V T A P L P P E A D T R Y A G R I H R
GGACGGGCGATTACCGTGTAAATTCTACGCCACAGGAACCACTACCAAACCAGCATAGTA
1215 G R A I T V *
AGAGAACGATAGAGACGTTGCAATGCGACGTCTCTATCATATTTCCGGCCCCCCCTAGAC
AAACCCCCACGTCTTCGTGTAGACTAGAAACAGGAGGCTGTATGCACGTCCAACAAGA
ANHANG
V
2. Alignment der Untereinheiten der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
Gezeigt ist der Vergleich der Proteinsequenz der Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase
aus M. sedula mit Proteinsequenzen möglicher Carboxylasen aus nahe verwandten Vertretern
der Sulfolobaceae. Dies sind: A. brierleyi, S. metallicus, S. solfataricus und S. tokodaii.
2.1 Biotincarboxylase AccC
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
1
MPPFSRVLVA
MPPFSRVLVA
MPPFGKVLVS
MSPFNKVLVA
MPPFGKVLVA
NRGEIAVRVM
NRGEIATRVL
NRGEIAVSVM
NRGEIAIRVM
NRGEIAVRVM
KAIKEMGMTA
KAIKEMGMTA
KRIKEMGMKA
KAVKEMGMKA
KAIKEMGMKA
IAVYSEADKY
IAVYSEADKY
VAVYSEADKY
VAVYSDADKY
VAVYSEADKY
50
AVHVKYADEA
AVHTKYADEA
ALHVKYADEA
APHVKYADEA
ALHVKYADEA
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
51
YYIGPSPALE
YYIGKAPALD
YYIGPAPSIE
YWIGPPPALE
YYIGPPPALE
SYLNIPHIID
SYLNIEHIID
SYLNIERIID
SYLNIERIID
SYLNIQAIID
AAEKAHADAV
AAEKAHVDAI
AAEKAHADAV
AAEKAHADAV
AAEKAHADAV
HPGYGFLSEN
HPGYGFLSEN
HPGYGFLSER
HPGYGFLSEN
HPGYGFLSEN
100
ADFVEAVEKA
AEFAEAVEKA
ADFAEAVEKA
ASFVEAVEKA
ADFAEAVVKA
M.
A.
S.
S.
S.
101
sedula
GMTYIGPSAE
brierleyi
GITFIGPSSE
metallicus
GMTFIGPSSE
solfataricus GMVFIGPSAS
tokodaii
GLTWIGPPVD
VMRKIKDKLD
VMRKIKDKLD
VMNRVKSKLD
VMNRIKDKLE
AMRAIKSKLD
GKRIAQLSGV
GKRLANMAGV
GKRIAKEAGT
GKMIARKAGV
GKRIAKQAGV
PIAPGSDGPV
PTAPGSDGPV
PIAPGSDGPV
PTSPGPLTPI
PISPGSDGPV
150
ESIDEALKLA
TSIDEALKLA
GSLDEALKLT
ENVDEALKIA
DSLDEALKLA
M.
A.
S.
S.
S.
151
sedula
EKIGYPIMVK
brierleyi
EKIGYPIMVK
metallicus
EKIGYPVMVK
solfataricus GEIGYPIMLK
tokodaii
EKIGYPIMVK
AASGGGGVGI
AASGGGGVGI
AAYGGGGIGI
AAGGGAGVGI
AAFGGGGTGI
TKIDTPDQLI
TRVDNQDQLM
TRADNPDQLM
IKVDNPSELA
TRVDNPDQLV
DAWERNKRLA
DVWERNKRLA
DIWGRNQRLA
EAFERSKRLA
EVWERNKRLA
200
TQAFGRSDLY
YQAFGKADLF
KEAFGRPDLY
YSAFGRAEIY
YQAFGKADLY
M.
A.
S.
S.
S.
201
sedula
IEKAAVNPRH
brierleyi
IEKYAVNPRH
metallicus
IEKAAVRPRH
solfataricus IEKAAIKPKH
tokodaii
IEKAAVNPRH
IEFQLIGDKY
IEFQLIGDKY
IETQLIGDKY
IETQLIGDKY
IEFQLIGDKY
GNYVVAWERE
GNYVVAWERE
GTYVVAFERE
GNYVVAFERE
GNYVVAWERE
CTIQRRNQKL
CTIQRRNQKL
CTIQRRNQKL
CTIQRRNQKL
CTIQRRNQKL
250
IEEAPSPAIT
IEEAPSPALK
IEEAPSPALT
IEEAPSPSIK
IEEAPSPALK
M.
A.
S.
S.
S.
251
sedula
MEERSRMFEP
brierleyi
MEERESMFEP
metallicus
WEKREEFIDA
solfataricus EEERKEIIEA
tokodaii
MEERERMFEP
IYKYGKLINY
IIKFGKLINY
SVKFGKKIGY
SIRFGKEINY
IIKFGQIIHY
FTLGTFETVF
FTLGTFETAF
FALGTMEFAY
FTLGTMEFVF
YTLGTFETVF
SDATREFYFL
SDVSRDFYFL
SDTTKDLYFL
SPVTREFYFL
SDTTREFYFL
300
ELNKRLQVEH
ELNKRLQVEH
ELNKRLQVEH
EINKRVQVEH
ELNKRLQVEH
M.
A.
S.
S.
S.
301
sedula
PVTELIFRID
brierleyi
PTTELIFRID
metallicus
GITELVTGID
solfataricus TVTEFITGID
tokodaii
PITEMIFRID
LVKLQIRLAA
LVKLQIKLAA
LVKLQIRLVA
LVKLQIRLAA
LVKLQINIAA
GEHLPFTQEE
GEHLPFSQED
GEHMPFTQEE
GEYLPFSQE.
GEPLPFTQEE
LNKRARGAAI
LNKRVRGTAI
LKKRLRGHAI
.DLKIRGHAI
LNKRVRGHAI
350
EFRINAEDPI
EYRINAEDAL
EYRINAEDPL
QFRINAEDPL
EYRINAEDPL
351
400
ANHANG
VI
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
NNFSGSSGFI
NNFTGSSGFV
NNFTGSSGFV
NNFTPQSGYI
NDFTGSSGFI
TYYREPTGPG
TYYREPTGPG
TYYKEPSGPG
TYYKEPTGPG
TYYKEPTGPG
VRMDSGVTEG
VRVDSGIESG
VRLDTGIMEG
VRVDSGIELG
VRVDSGVTLG
SWVPPFYDSL
SYVPPYYDSL
SYVPPFYDSL
SWVPPYYDPL
SYVPPFYDSL
VSKLIVYGED
VSKLIVYGES
VAKLMVYGEN
VSKLIVYGQS
ISKLIVYGEN
M.
A.
S.
S.
S.
401
sedula
RQYAIQTAMR
brierleyi
REYAIQAGIR
metallicus
RARAIEVGRR
solfataricus RDYAIQVGLR
tokodaii
RAYAIQAGIR
ALDDYKIGGV
ALADYKIGGI
ALRDLQIGGI
ALNDYKIGGV
ALNDYKIGGV
KTTIPLYKLI
KTTIELYKWI
KTTIPLYKLI
KTTIPLYKLI
RTTIELYKWI
MRDPDFQEGR
MQDPDFQEGK
MDDEDYQNGN
LQDPDFWEGN
SQEEDFQKGK
450
FSTAYISQKI
FSTSYISQKT
FTTAYIADKS
FTTAYISEKA
FSTAYIAEKR
M.
A.
S.
S.
S.
451
sedula
DSMVKKLKAE
brierleyi
DQFVKYLREQ
metallicus
EIFTKKLREK
solfataricus EYFTTKLKEE
tokodaii
EQYLKYLKAK
EEMMASVAAV
EEIKAAIAAE
EMLKTALAAS
QEIQIAIAIS
EQMKAALAAT
LQSRGLLRKK
IQSRGLLRTS
VYNRGLLRGS
IYNRGLMKKK
LYQRGLLKKA
ASAPQEQAKP
STDNKGKAQS
SGNNNVQAQD
KTEQKVPIST
TTTVNSTQPQ
500
G....SGWKS
K....SGWKT
NGKPRSAWKT
SNG.KSNWKT
NQTKRSNWKT
M.
A.
S.
S.
S.
501
sedula
YGIMMQSTPR
brierleyi
YGIITQSSTR
metallicus
YGVQAQASAR
solfataricus YGIIFQSSPR
tokodaii
YGLLQQSSYR
514
VMWG
VMW~
VMW~
VLW~
VMW~
2.2 Biotin-Carrier-Protein AccB
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
1
~~~~~~~~~~
~~~~~~~~~~
~~~~~~~~~~
MENLWYHIPI
~~~~~~~~~~
~~~~~~~MKL
~~~~~~~MKL
~~~~~~~MKL
LSKGVVVMRL
~~~~~MVMKL
YRVHADTGDT
YRAYADTGDT
LRVYMETGET
FRLYSELGDM
LRVSSELGDS
FIVAHDQKEN
YIMAIDSKGD
YIASYDQKDN
YLVSYEQSNN
YVMTYDQQGN
50
.KDRLKTENN
.KDKIKTENN
.KDTVKMEEG
SLDKIKIGDK
.KDTVSFEDN
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
51
EFEIEYVGQG
EFEIEYLGKG
ELNVEFLGRG
NYEVKYLGSG
KFEIEYIGPG
TREGEIILKI
TRENEYLFKV
TRENEYLFKV
NRENEYLFEI
WREGELLFKI
NGEMHRVFID
NGKVHRAFID
GNEVHSITID
NGKKYYVFIE
NGEVHRVYVD
N.GWIILDNA
N.GYILLDNA
R.GFLILDQE
SDGTLIFNHQ
N.GFIVIDDE
100
RIFRAERVTE
SVFRLERLTE
EEYKVDRITE
DFLRLDKVTE
TIFKVDRITE
M.
A.
S.
S.
S.
101
sedula
LPTQEGQTLD
brierleyi
LPSKEGESIE
metallicus
LPVKEGQSVE
solfataricus IPIKGEERVE
tokodaii
TPIEQGKSIE
EMIKGKEGEV
EMIKGKEGEV
ELMKGKEGEV
EIIRGKEGEI
ELIKGKEGEI
LSPLQGRVVQ
ISPLQGRIVT
LSPLQGRVVA
VSPLFGRVVK
LSPMQGRIVQ
VRVKEGDAVN
IRVNEGDAVN
IRVKEGDAVT
IRVKEGDAVN
IRVKEGDAVN
150
KGQPLLSIEA
KGQPLLSVEA
KGQPLLSVEA
KGQPLLSIEA
KGQPLLSIEA
M.
A.
S.
S.
S.
151
sedula
MKSETIVSAP
brierleyi
MKSETIISAP
metallicus
MKSETIISAP
solfataricus MKAETVISSP
tokodaii
MKSETVISAP
ISGLVEKVLV
IAGIVEKIIV
IAGVIEKIAV
IGGIVQKILI
VGGVVQKIMV
KAGQGVKKGD
KPGQGVKKGD
KPGQGVKKGD
KEGQGVKKGD
KPGQGVKKGD
186
ILVVIK
TLLIIK
LLVVLK
ILIVIK
LLLIIK
ANHANG
VII
2.3 Carboxyltransferase PccB
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
1
MTATFEKPDM
MAITSEKSDM
~~~~~~~~~M
~MALYEKPSM
~MSMYEKPPV
SKLVEELRAL
DKIIAQLREI
DKLIEEMKSL
DKLIEDLKIL
EKLIEELRQL
KAKAYMGGGE
KAKAFQGGGE
KAKAMAGGGE
KEKVYKGGGE
KEKAYKGGGD
ERVQAQHAKG
DKIKAQHDKG
DKIKAQHEKG
EKINFQHGKG
ERIQFQHSKG
50
KLTARERLNL
KLTARERLAL
KMTARERIAL
KLTARERLNQ
KLTARERLAL
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
51
LFDEGTFNEV
LFDEGSFNEI
LFDEGTFSEI
LFDEGKFNEI
LFDDGKFNEI
MTFATTKATE
MPLATTRATE
MTFARTQSTE
LTFATTRATE
MTFATTRATE
FGLDKSKVYG
FGLDKNKFYG
FGLDKTDLYG
FGLDKNRFYG
FGLDKQRFYG
DGVVTGWGQV
DGVVTGWGKI
DGVVTGWGKI
DGVIAGWGKI
DGVVTGWGKV
100
EGRTVFAFAQ
EGRTVFAFSQ
DGRTAFVYSQ
DGRQVFAYAQ
DGRTVFAYAQ
M.
A.
S.
S.
S.
101
sedula
DFTSIGGTLG
brierleyi
DFTELGGTLG
metallicus
DFTSLGGTLG
solfataricus DFTILGGSLG
tokodaii
DFTVLGGSLG
ETHASKIAKV
ETHANKIGKV
EMHASKIGKV
ETHANKIVRA
ETHANKIVRA
YELALKVGAP
YELALKVGAP
YELALKVGAP
YELALKVGAP
YELALKVGAP
VVGINDSGGA
VIGINDSGGA
VIGINDSGGA
VIGINDSGGA
VVGINDSGGA
150
RIQEGAVALE
RIQEGAIALE
RIQEGAASLE
RIQEGALSLE
RIQEGALSLE
M.
A.
S.
S.
S.
151
sedula
GYGTVFKANV
brierleyi
GYATVFKMNT
metallicus
GYGLVFKNNV
solfataricus GYGAVFKMNV
tokodaii
GYGAVFKMNV
MASGVVPQIT
LASGVIPQIT
MASGVIPQIT
MASGVIPQIT
MASGVIPQIT
IMAGPAAGGA
IMAGPAAGGA
IMAGPAAGGA
IMAGPAAGGA
IMAGPAAGGA
VYSPALTDFI
VYSPALTDFI
VYSPALTDFL
VYSPALTDFL
VYSPALTDFI
200
IMIKGDAYYM
IMIKGDAYYM
IMVKGDAYYM
IMIKGDAYYM
IMIKGDAYYM
M.
A.
S.
S.
S.
201
sedula
FVTGPEITKV
brierleyi
FVTGPEITKV
metallicus
FVTGPEITKV
solfataricus FVTGPEITKV
tokodaii
FVTGPEITKV
VLGEDVSFQD
VLGEEVTFQD
VLGEDVSMQD
SIGEEVSYQD
VLGEEVSFQD
LGGAVIHATK
LGGAVVHATK
LGGAVVHASK
LGGAIIHATK
LGGAVVHATK
SGVVHFIAEN
SGVVHFLAEN
SGVVHFMVDS
SGVVHFVAEN
SGVVHFMVDS
250
EQDSINITKR
EQDAISIAKR
EQEAINTAKR
EQDAINITKR
EQEAINLTKR
M.
A.
S.
S.
S.
251
sedula
LLSYLPSNNM
brierleyi
LLSYLPSNNM
metallicus
LLSYLPSNNM
solfataricus LLSYLPSNNM
tokodaii
LLSYLPSNNM
EEPPFMDTGD
EDPPYMDTGD
EEPPYMDTGD
EEPPYVDTGD
EEPPYIDTGD
PADREMKDVE
PSDRETKDVE
TNDREVKDAE
PADRAVQSAE
PADRDATGVE
SVVPTDTVKP
SIVPTDSAKP
SIVPTDSAKT
SIVPTDSVKP
QIVPNDAAKP
300
FDMREVIYRT
FDMREVIYRI
FDIRDLVYAV
FDIRDLIYNI
YNMREIIYKI
M.
A.
S.
S.
S.
301
sedula
VDNGEFMEVQ
brierleyi
VDNGEFMEVH
metallicus
VDNGEFLEVH
solfataricus VDNSEFLEVH
tokodaii
VDNGEFLEVH
KHWAQNMVVG
RHWAQNIVVG
KHWAQNITVG
KLWAQNITVG
KHWAQNIIVG
FGRVAGNVVG
FARVAGNVIG
FARVAGNVVG
FGRINGNVVG
FARIAGNVVG
IVANNSAHLG
IVANNSNTLG
IVANNSAYAS
IVANNSAYYG
IVANNPEEFG
350
AAIDIDASDK
AAIDIDAADK
GAIDIDAADK
GAIDIDAADK
GSIDIDAADK
M.
A.
S.
S.
S.
351
sedula
AARFIRFCDA
brierleyi
AARFIRFCDA
metallicus
AARFIRFCDA
solfataricus AARFIRFCDA
tokodaii
AARFIRFCDA
FNIPLISLVD
FNIPLLSLVD
FNIPLVSIVD
FNIPVISLVD
FNIPLISLVD
TPGYMPGTDQ
TPGYIPGTEQ
TPGYIPGTDQ
TPGYVPGTDQ
TPGYVPGTDQ
EYKGIIRHGA
EYKGIIRHGA
EYRGIIRHGA
EYKGIIRHGA
EYKGIIRHGA
400
KMLYAFAEAT
KMLYAFSEAT
KMLYAFAEAT
KMLYAFAEAT
KMLYAFAEAT
401
450
ANHANG
VIII
M.
A.
S.
S.
S.
sedula
brierleyi
metallicus
solfataricus
tokodaii
VPKVTVVVRR
VPKISVIIRK
VPKITVVVRR
VPKITVIVRR
VPKITVIVRK
SYGGAHIAMS
SYGGAHIAMS
SYGGAHIAMS
SYGGAHIAMS
SYGGAHIAMS
IKSLGADLIY
IKNLGADLVY
IKSLGADVIY
IKSLGADLVY
IKSLGADLVY
AWPSAEIAVT
AWPTAEIAVT
AWPSAEIAVT
AWPSAEIAVT
AWPTAEIAVT
GPEGAVRILY
GPEGAVRILY
GPEGAVRILY
GPEGAVRILY
GPEGAVRILY
M.
A.
S.
S.
S.
451
sedula
RREIQNSKSP
brierleyi
KRDIQNSQNP
metallicus
KKELQAASNP
solfataricus RREIQSAQNP
tokodaii
RKEIQQASNP
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DANKSAGUNG
Ganz besonders möchte ich Herrn Prof. Dr. Georg Fuchs für das spannende Thema auf dem
Gebiet der CO2-Fixierung, die hervorragenden Arbeitsbedingungen und die ausgezeichnete
Betreuung danken.
Ich danke Herrn Dr. Harald Huber und Herrn Prof. Dr. Karl Otto Stetter von der Universität
Regensburg für die hervorragende Kooperation und die Kultivierung und Bereitstellung
zahlreicher Archaeabakterien. Ich danke auch allen Mitarbeitern ihrer Gruppe, die an der
Züchtung beteiligt waren.
Ich danke Herrn Dr. Wolfgang Eisenreich und Herrn Prof. Adelbert Bacher von der TU
München für die hervorragende Kooperation und die Aufnahme und Analyse der NMRSpektren.
Herrn Dr. Arnulf Kletzin von der Universität Darmstadt danke ich für Zellen von Acidianus
ambivalens.
Ein besonderer Dank an Victor Gad´on für seine Hilfe bei der Züchtung von Chloroflexus und
Metallosphaera. Ein Dankeschön an Christa Ebenau-Jehle für ihre Hilfe im Laboralltag.
Ich möchte mich bei allen „autotrophen“ Mitarbeitern unserer Arbeitsgruppe, Silke
Friedmann, Stephan Saum, Dr. Robert Krieger, Jan Farfsing und Dr. Castor Ménendez, für
die gute Zusammenarbeit bedanken. Ein besonderer Dank an Dr. Birgit Alber und Sylvia
Herter für zahlreiche konstruktive Diskussionen und ihren inspirierenden Optimismus.
Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe, besonders Johannes Gescher, Björn Jobst, Knut
Verfürth, Wael Ismail, Karola Schühle, Mihaela Unciuleac und Annette Zaar, sowie den
„Chefs“ PD Dr. Matthias Boll und PD Dr. Hans Heider, danke ich für die angenehme
Arbeitsatmosphäre und für zahlreiche praktische und theoretische Ratschläge. Special thanks
to Tahar Mechichi.
Besonders möchte ich mich auch bei meiner Familie für die Unterstützung während dieser
Arbeit und während des gesamten Studiums bedanken.
Mein herzlichster Dank gilt meiner Freundin Johanna Lampert. Ich danke ihr für das intensive
Korrekturlesen der Arbeit und dafür, dass sie mich immer unterstützt hat und immer für mich
da war.