DISS. ETH NO. 18990
Recombinant antibodies for the imaging and treatment of
rheumatoid arthritis and endometriosis
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Kathrin Annina Schwager
MSc Pharmaceutical Sciences, ETH
born 22.09.1981
citizen of Aadorf (TG)
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Michael Detmar, co-examiner
2010
1. Summary
One of the most promising avenues towards the development of better drugs consists
in the antibody-mediated delivery of therapeutic agents (e.g. cytokines, drugs or
radionuclides) to the site of the disease, while sparing normal tissue. Targeting the
neovasculature of tumors or inflammation seems to be a particularly promising
avenue, considering the fact that the formation of new blood vessels is a crucial step
for disease progression. Furthermore, antigens in the modified neovasculature of
diseases are ideal for antibody-based pharmacodelivery applications, in view of their
abundance, stability and specificity.
In this thesis we show that spliced isoforms of fibronectin and tenascin C, markers of
angiogenesis, are expressed in synovial tissue of rheumatoid arthritis specimens and in
endometriosis lesions of patients. The antibody F8, specific to the EDA domain of
fibronectin, showed the strongest staining in comparative immunohistochemistry
performed on tissue samples of various inflammatory diseases and was thus selected
for the development of a fully human fusion protein with IL-10.
IL-10 is a particularly attractive anti-inflammatory cytokine for treatment of chronic
inflammation, which has exhibited an excellent tolerability profile in rodents, monkeys,
and patients, and which has been investigated in clinical trials for the treatment of
patients with inflammatory diseases (e.g. rheumatoid arthritis). The clinical
development of IL-10 was discontinued because of insufficient efficacy of the
compound in humans. However, in a placebo controlled phase I/II study for the
treatment of rheumatoid arthritis ACR20 responses were 63% for the IL-10 groups,
compared to 10% for placebo. Similar results were observed with TNF blockers.
The fusion protein F8-IL10 was produced and purified to homogeneity in CHO cells and
shown to comprise biological active antibody and cytokine moieties by binding assays
on recombinant antigen and by MC/9 cell proliferation assays. Following
radioiodination, F8-IL10 was able to selectively target arthritic lesions and tumor neovascular structures in mice, as evidenced by autoradiographic analysis and quantitative
biodistribution studies. The subcutaneous administration route led to equivalent
targeting results when compared with intravenous administration and was thus
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selected for the clinical development of the product. F8-IL10 potently inhibited
progression of established arthritis in the collagen-induced mouse model when tested
alone and in combination with methotrexate. In preparation for clinical trials in
patients with rheumatoid arthritis, F8-IL10 was studied in rodents and in cynomolgus
monkeys, revealing an excellent safety profile at doses tenfold higher than the planned
starting dose for clinical phase I trials.
In a second part of this thesis the targeting potential of F8 was studied in a mouse
model of endometriosis. A selective uptake of fluorescently labeled F8 in endometriosis
lesions was demonstrated using near infrared imaging.
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Zusammenfassung
Einer der vielversprechendsten Wege in der Entwicklung von besseren und selektiveren
Medikamenten besteht darin, Therapeutika (z.B. Zytokine, Chemotherapeutika oder
Radionuklide) mit Hilfe von Antikörpern zielgerichtet an den Ort der Erkrankung zu
bringen, wodurch gesundes Gewebe geschont wird. Die Neubildung von Blutgefässen
ist ein wichtiger Prozess im Fortschreiten von verschiedenen Erkrankungen, wie zum
Beispiel Krebs oder entzündlichen Erkrankungen. Antigene, die selektiv auf und um
neuen Blutgefässen herum vorkommen, sind besonders attraktive Ziele für Antikörperbasierte Therapeutika aufgrund ihres häufigen Vorkommens, ihrer Stabilität und ihrer
Spezifität.
Wir konnten zeigen, dass gespleisste Isoformen von Fibronektin und Tenascin C,
sowohl im Synovium von Patienten mit Rheumatoider Arthritis, als auch in
Endometriosegewebe vorkommen. Der Antikörper F8, der spezifisch an die alternativ
gespleisste EDA Domäne von Fibronektin bindet, zeigte in diesen Geweben die stärkste
Färbung und wurde daher ausgewählt um ein humanes Fusionsprotein mit Interleukin10 (IL-10) zu entwickeln.
IL-10 ist ein sehr vielversprechendes anti-inflammatorisches Zytokin, das bereits in
verschiedenen klinischen Studien für die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen
getestet wurde. Es zeigte im Allgemeinen eine sehr gute Verträglichkeit in Studien mit
Nagetieren, Primaten und im Menschen. Die klinische Entwicklung von IL-10 wurde
jedoch aufgrund einer eher mässigen Wirksamkeit gestoppt. Allerdings wurde in einer
Plazebo kontrollierten Phase I/II Studie an Patienten mit Rheumatoider Arthritis in 63%
eine Reduktion der Symptome um 20% festgestellt. Diese Resulate sind vergleichbar
mit denen von TNF Blockern.
Das Fusionsprotein F8-IL10 wurde in CHO Zellen produziert. Um zu überprüfen, ob
sowohl Antikörper als auch Zytokine ihre biologische Aktivität beibehielten, wurden
Zellproliferations-
und
Bindungsversuche
durchgeführt.
Anhand
von
Biodistributionsexperimenten und Autoradiographie konnte gezeigt werden, dass sich
radioaktiv markiertes F8-IL10 nach intravenöser Injektion selektiv sowohl in
entzündeten Gelenken als auch in Tumoren von Mäusen anreichert. Eine subkutane
Verabreichung des Fusionsproteins führte zu einem vergleichbaren Targeting und
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wurde deshalb für die klinische Entwicklung ausgewählt. In einem ArthritisMausmodell resultierte die subkutane Verabreichung von F8-IL10 zu einer deutlichen
Verlangsamung des Fortschreiten der Krankheit. In Kombination mit Methotrexat
konnten die Therapieergebnisse sogar noch weiter verbessert werden.
Als Vorbereitung auf klinische Studien an Patienten mit Rheumatoider Arthritis wurden
Toxikologiestudien an Primaten und Mäusen durchgeführt. Hierbei zeigte sich F8-IL10
ein sehr gutes Toxizitätsprofil, auch bei bis zu 10-fach höherer Dosis als die geplante
Startdosis in den klinischen Studien.
Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde das Targeting-Potential von F8 in einem
Endometriose-Mausmodell getestet. Mittels Nahinfrarot-Bildgebung konnte gezeigt
werden, dass sich der Antikörper F8 selektiv im Endometriosegewebe anreichert.
anreichert.
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