PROLIN-DEHYDROGENASE/l-PYRROLIN-5 - ETH E

Diss.
Nr.
7026
PROLINKATABOL'ISM.US
I
N
AERUGINOSA
PSEUDOMONAS
EIGENSCHAFTEN GEREINIGTER
PROLIN-DEHYDROGENASE/l-PYRROLIN-5-CARBOXYLAT-DEHYDROGENASE
UND REGULATION
IHRER SYNTHESE
ABHANDLUNG
zur
des Titels eines
Erlangung
Doktors der Naturwissenschaften der
EIDGENOESSISCHEN
ZUERICH
HOCHSCHULE
vorgelegt
geboren
von
am
von
MEILE
LEO
dipl.
TECHNISCHE
Natw.
1.
ETH
Dezember 1953
Mosnang (Kt. St.Gallen)
Angenommen auf Antrag
Prof.
Prof.
Dr.
Dr.
Th.
L.
von
Leisinger, Referent
Ettlinger, Korreferent
1982
-106-
5.
Zusammenfassung
vorliegenden Arbeit wurde der Abbau
In der
Prolin
von
bifunktionelles Enzym,
L-Prolin wird durch ein
aeruginosa untersucht.
Pseudomonas
in
die
Prolin-Dehydrogenase/P5C-Dehydrogenase (Pro-DH/P5C-DH),
mat
abgebaut.
PA01
Das
wurde bis
tauscher- und
Enzym
zur
mit Prolin
Affinitätschromatograpie gereinigt
SDS-Gelelektrophorese ergab
mit den Aminosäuren
Ionenaus¬
und
charakterisiert.
ein
Molekulargewicht
wicht
N-Pro-Ala-Asp aufwies. Unter nativen Bedin¬
Polyacrylamidgelelektrophorese
gungen wurde mittels
241'000 und 470'000 Dalton,
von
235'000
tographie
eines
vität ist
spezifisch für L-Prolin und
K -Wert
NAD(P)
bestimmt.
=
0.17mM).
Die Synthese
bolitrepression durch
der
relativen hohen
ist
die
an
Atmungskette gebun¬
L-P5C mit dem Cofak-
nur
(mit
=
0.03mM)
als
Pro-DH/P5C-DH unterliegt den
Prolin als
Induktor),
Citrat und Stickstoffkontrolle.
im Ornithinabbau eine
von
Ausschiuss-Chroma-
weist einen
von
Molekularge¬
FAD-abhängige Pro-DH-Akti-
Die
Sie
ein
und'zeigt höhere Affinität für NAD (K
Kontrollmechanismen der Induktion
auch
und mittels
Pro-DH/P5C-DH setzt spezifisch
um
(K
für NADP
von
45mM für Prolin auf.
von
den in vivo.
tät
mittels
Stamm
von
119'000 Dalton für die kleinste Untereinheit, welche einen N-Ter-
minus
tor
gezüchteten Zellen
elektrophoretischen Homogenität
Eine Analyse mittels
von
aus
Gluta¬
zu
wichtige Rolle,
Das
Kata-
Enzym spielt
indem die P5C-DH-Aktivi-
Acetylornithin-5-Aminotransferase
angeliefertes P5C
zu
Glutamat weitermetabolisiert.
Mutantenstämme
N-Quelle
C- und
der Pro-DH
-
von
Pseudomonas
verwerten
aeruginosa, die Prolin nicht mehr als
konnten
(pru-Mutanten),
und P5C-DH-Aktivität untersucht.
Es
wurden auf den
wurden Stämme mit de¬
fekter Pro-DH-Aktivität und solche mit defekter Pro-DH/P5C-DH
terisiert, hingegen wurden keine Mutanten
funden.
charak¬
Typ Pro-DH /P5C-DH"
ge¬
Die Mutanten mit defekter Pro-DH/P5C-DH konnten Ornithin nicht
verwerten,
Abbau
vom
Besitz
von
was
darauf hinweist, dass eine
einzige P5C-DH-Aktivität
Ornithin und Prolin beteiligt ist.
Durch Konstruktion
am
von
Mehrfachmutanten konnte Prolin als alleiniger Induktor der Pro-DH/P5C-DH
identifiziert werden.
-107-
Summary
Proline
dehydrogenase/l-Pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase
(Pro-DH/P5C-DH),
bifunctional
a
tive reactions of the oxidation of
FAD-dependent
an
converted this
mic acid.
and
intermediate with
The purification
pure).
on
The molecular
mined at 119'000.
dimers
as
the
and tetramers.
N-terminal
cific for the
Its
K
apparent
was
values
activities.
The
in
to
acid and
L-gluta-
It resulted after
homogeneus preparation
a
the
weight of
subunit
Single
was
deteractive
preparation contained catalvtically
degradation revealed N-pro-ala-asp
Edman
proline
were
Pro-DH/P5C-DH
was
highly
45 mM for
spe¬
acid.
l-pyrroline-5-carboxylic
and
0.03 mM for NAD and
L-proline,
l-pyrroline-5-caboxylic
aeruginosa deficient in the utilization of
Pro-DH activity
latter type of mutants
thine, indicating that
a
degradation of Ornithine
in
or
was
both Pro-DH and P5C-DH
unable
Single P5C-DH activity
and
proline.
have been found to
source
Pro-DH
is
to
l-pyrroline-5-carboxylic acid
and the
low level
attributed to the
of the
catabolite
acted
induction
as
an
utilize L-orni-
involved in
was
inducer of the
observed during growth
intracellular formation of proline.
proline degradative
enzyme
was
the
and P5C-DH activities
strongly and coordinatly induced by proline. It
mation
pu-
DEAE-chromatography
Red A.
the only carbon and nitrogen
as
be defective either
enzyme
was
non-hyperbolic.
L-proline
was
glutamic acid
cosubstrates
The Saturation function for
Mutants of Pseudomonas
were
Matrex Gel
amino acid sequence.
of
as
involved
% yield in
Manual
j_-forms
0.17 mM for NADP.
acid
The pure
NAD(P)
procedure
40-fold purification with 11
%
to
consecu-
L-l-pyrroline-5-carboxylic
reaction to
affinity chromatography
(>98
proline
the two
aeruginosa. Pro-DH/P5C-DH oxidized L-proline
rified from Pseudomonas
in
catalyzing
enzyme
shown
to
repression by citräte and nitrogen control.
be
excluded that
bifunctional
on
The
Ornithine
for-
subject to