Genetische Untersuchungen zur Aufklärung der

Aus dem Institut für Humangenetik
des Universitätsklinikums Bonn
Direktor: Prof. Dr. med. Markus M. Nöthen
Genetische Untersuchungen zur Aufklärung der
Heterogenität adenomatöser Polyposis-Syndrome
Kumulative Habilitationsschrift
zur Erlangung der venia legendi
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
für das Lehrgebiet
„Humangenetik“
vorgelegt von
Dr. med. Stefan Aretz
Wissenschaftlicher Angestellter
an der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Bonn 2009
Habilitations-Kolloquium bestanden am 18. November 2009
Nachfolgende Arbeiten bilden die wissenschaftliche Grundlage der vorliegenden
kumulativen Habilitationsschrift:
1. Aretz S, Uhlhaas S, Caspari R, Mangold E, Pagenstecher C, Propping P, Friedl W (2004).
Frequency and parental origin of de novo APC mutations in familial adenomatous polyposis.
European Journal of Human Genetics 12:52-58.
2. Aretz S, Uhlhaas S, Sun Y, Pagenstecher C, Mangold E, Caspari R, Möslein G, Schulmann
K, Propping P, Friedl W (2004). Familial adenomatous polyposis: aberrant splicing due to
missense or silent mutations in the APC gene. Human Mutation 24:370-380.
3. Aretz S, Stienen D, Uhlhaas S, Pagenstecher C, Mangold E, Caspari R, Propping P, Friedl W
(2005). Large submicroscopic genomic APC deletions are a common cause of typical familial
adenomatous polyposis. Journal of Medical Genetics 42:185-192.
4. Aretz S, Koch A, Uhlhaas S, Friedl W, Propping P, Schweinitz DV, Pietsch T (2006). Should
children at risk for familial adenomatous polyposis be screened for hepatoblastoma and
children with apparently sporadic hepatoblastoma be screened for APC germline mutations?
Pediatric Blood & Cancer 47:811-818.
5. Aretz S, Uhlhaas S, Goergens H, Siberg K, Vogel M, Pagenstecher C, Mangold E, Caspari R,
Propping P, Friedl W (2006). MUTYH-associated polyposis (MAP): 70 of 71 patients with
biallelic mutations present with an attenuated or atypical phenotype. International Journal of
Cancer 119: 807-814.
6. Pagenstecher C, Gadzicki D, Stienen D, Uhlhaas S, Mangold E, Rahner N, Arslan-Kirchner
M, Propping P, Friedl W, Aretz S (2007). A complex rearrangement in the APC gene
uncovered by MLPA. The Journal of Molecular Diagnostics 9:122-126.
7. Aretz S, Stienen D, Friedrichs N, Stemmler S, Uhlhaas S, Rahner N, Propping P, Friedl W
(2007). Somatic APC mosaicism: a frequent cause of familial adenomatous polyposis (FAP).
Human Mutation 28:985-992.
8. Kaufmann A, Vogt S, Uhlhaas S, Stienen D, Kurth I, Hameister H, Mangold E, Kötting J,
Kaminsky E, Propping P, Friedl W, Aretz S (2009). Analysis of rare APC variants at mRNA
level: six pathogenic mutations and literature review. The Journal of Molecular Diagnostics
11:131-139.
9. Vogt S, Jones N, Christian D, Engel C, Nielsen M, Kaufmann A, Uhlhaas S, Steinke V,
Propping P, Hes FJ, Sampson JR, Aretz S (2009). Expanded extracolonic tumor spectrum in
MUTYH-associated polyposis. Gastroenterology 137:1976-1985.
i
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG .....................................................................................................1
1.1
Die untersuchten Krankheitsbilder ...................................................................... 2
1.1.1
Historischer Überblick ........................................................................................2
1.1.2
APC-assoziierte familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) .................................4
1.1.3
MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP) ................................................................8
1.1.4
Mutations-negative adenomatöse Polyposis....................................................10
1.2
Material und Methoden .......................................................................................... 10
1.2.1
Patienten..........................................................................................................10
1.2.2
Molekulargenetische Untersuchungsmethoden ...............................................11
2
EIGENE ARBEITEN: ERGEBNISSE UND DISKUSSION ..............................14
2.1
Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP).......................................................... 14
2.1.1
Häufigkeit und parentale Herkunft von de novo APC-Mutationen ....................14
2.1.2
Große genomische Deletionen und Duplikationen im APC-Gen......................16
2.1.3
Charakterisierung einer komplexen Mutation im APC-Gen..............................18
2.1.4
Funktionelle Untersuchung unklarer Varianten des APC-Gens .......................20
2.1.5
Ausmaß und Bedeutung von Mutations-Mosaiken bei der FAP.......................23
2.1.6
APC-assoziertes Hepatoblastom .....................................................................25
2.2
MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP) ................................................................. 26
2.2.1
Mutationsspektrum und kolorektaler Phänotyp der MAP .................................27
2.2.2
Extrakolonisches Tumorspektrum bei MAP-Patienten .....................................30
3
AUSBLICK ......................................................................................................33
4
ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................35
5
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................37
6
DANKSAGUNG...............................................................................................45
ii
1
EINLEITUNG
Der Dickdarmkrebs (kolorektales Karzinom, CRC) zählt zu den häufigsten bösartigen Tumoren in
Westeuropa; allein in Deutschland stellt es mit circa 70.000 Neuerkrankungen pro Jahr die zweithäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Krebstodesursache bei beiden Geschlechtern
dar (www.rki.de). Fortschritte im Bereich der Prävention und Therapie haben deshalb herausragende Bedeutung sowohl für die Betreuung des einzelnen Patienten wie für das Gesundheitswesen allgemein. Es handelt sich beim CRC fast ausschließlich um Adenokarzinome, die Ätiologie ist allerdings ausgesprochen heterogen. Die meisten Fälle treten in höherem Lebensalter und
sporadisch – das heißt als Einzelfall innerhalb einer Familie – auf und sind nicht erblich. Bei etwa
20-25 % der Patienten findet man eine gewisse familiäre Häufung der Erkrankung im mittleren bis
höheren Lebensalter ohne klar erkennbaren Erbgang; hier vermutet man heute meistens ein
multifaktorielles bzw. polygenes Bedingungsgefüge, bei dem neben Umweltfaktoren eine Kombination niedrigpenetranter Risikoallele zur malignen Transformation prädisponiert (Easton and
Eeles 2008; Houlston et al. 2008; Küry et al. 2008). Aufgrund der Verbreitung des CRC muss
eine familiäre Häufung zum Teil aber auch durch zufällige Koinzidenz zustande kommen, deren
Ausmaß bisher aber noch nicht genau bestimmt wurde (Engel et al. 2007). Bei 3-5 % der Patienten liegt eine erbliche Form von Dickdarmkrebs im engeren Sinne vor (monogene Disposition).
Diese erblichen Tumorerkrankungen (hereditäre Tumordispositions-Syndrome) des Magen-DarmTraktes umfassen mehrere klinisch und molekulargenetisch differenzierbare Krankheitsbilder,
insbesondere den erblichen Dickdarmkrebs ohne Polyposis (HNPCC oder Lynch-Syndrom) und
die hereditären Polyposis-Syndrome.
Das Auftreten einzelner Polypen im Dickdarm ist ein häufiges und altersabhängiges Phänomen
(Clark et al. 1985; Ransohoff and Lang 1991; Rex et al. 1993). Die zur Diagnose einer Polyposis
notwendige Mindestzahl von Polypen ist nicht klar definiert und hängt unter anderem vom Polypentyp und dessen Verbreitung in der Allgemeinbevölkerung, der Polypenverteilung im Darm und
dem Alter des Patienten ab. Aufgrund der Adenom-Karzinom-Sequenz kommt adenomatösen
Polypen hier eine besondere klinische Relevanz zu. Gastrointestinale Polyposis-Syndrome
umfassen zahlreiche seltene Entitäten, die zum Teil klinisch und genetisch gut charakterisiert
sind, zum Teil aber noch am Anfang ihrer ursächlichen Aufklärung und phänotypischen Abgrenzung stehen (Friedl et al. 1999; Bronner 2003; Lowichik et al. 2003; Schulmann et al. 2007; Jass
2008). Bei den bisher bekannten hereditären Formen handelt es sich um Präkanzerosen, die für
etwa 1% aller kolorektalen Karzinome (CRC) verantwortlich sind; sie stellen damit nach dem
HNPCC bzw. Lynch-Syndrom die häufigste Ursache des erblichen Dickdarmkrebses dar.
Patienten mit einer Polyposis begegnen dem Arzt in jeder Altersgruppe und zeigen eine mitunter
ausgeprägte inter- und intrafamiliäre Variabilität des klinischen Verlaufs. Der Erkennung und
korrekten Differentialdiagnose kommt klinisch große Bedeutung zu, da die meisten Formen einerseits durch ein hohes Lebenszeitrisiko für frühmanifeste gastrointestinale und zum Teil auch
extraintestinale Karzinome sowie ein hohes Wiederholungsrisiko bei erstgradig verwandten Familienangehörigen gekennzeichnet sind, andererseits mit der regelmäßigen endoskopischen
Vorsorge und Entfernung der Polypen aber ein effizientes Instrument zur Krebsprävention
verfügbar ist (Jarvinen et al. 1995; Aretz and Propping 2004).
Die Aufklärung der genetischen Grundlagen, Charakterisierung der Krankheitsverläufe und
Beschreibung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen stellt eine wichtige wissenschaftliche Aufgabe
dar, die einerseits zu einer direkten Verbesserung der klinischen Betreuung der Familien führen
1
kann, andererseits über die Kenntnis der beteiligten genetischen Faktoren und Signalwege aber
auch das pathogenetische Verständnis nicht nur der seltenen Polyposis, sondern auch des CRC
im Allgemeinen fördert und hierüber langfristig die Möglichkeit zur Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte eröffnet.
Die Familiäre Adenomatöse Polyposis (FAP) ist die häufigste und am längsten bekannte Form
der gastrointestinalen Polyposis-Syndrome. Unsere Arbeitsgruppe am Institut für Humangenetik
des Universitätsklinikums Bonn beschäftigt sich seit 1988 mit der molekulargenetischen Diagnostik, humangenetischen Beratung und wissenschaftlichen Bearbeitung adenomatöser PolyposisSyndrome. Mit Unterstützung der Deutschen Krebshilfe wurden diesbezüglich zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten erstellt, die einen wesentlichen Beitrag zum heutigen Kenntnisstand des
Mutationsspektrums und der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen der FAP geleistet haben (Übersichten in Friedl and Lamberti 2001; Friedl and Aretz 2005).
Aufbauend auf den grundlegenden Untersuchungen zur FAP in den 1990er Jahren betreffen die
hier vorgestellten, in den Jahren 2003 bis 2009 durchgeführten Studien vertiefend und erweiternd
speziellere Fragestellungen zum APC-Mutationsspektrum (große Deletionen, komplexes
Rearrangement), zur Charakterisierung bestimmter APC-Mutationsarten (elterliche Herkunft von
Neumutationen; Relevanz von Mosaiken; Transkriptanalyse von funktionell unklaren Varianten)
und hinsichtlich seltener klinischer Manifestationen (Hepatoblastom). Ein weiterer Schwerpunkt
war die genetische und phänotypische Charakterisierung der erst seit kurzem bekannten
MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP). Es handelt sich um Arbeiten der humangenetischen
Grundlagenforschung, die sich immer auch an klinisch relevanten Aspekten der Krankheitsbilder
orientieren und zum Teil erst durch die Größe des vorhandenen und langjährig erschlossenen
Patientenkollektivs möglich wurden.
1.1 Die untersuchten Krankheitsbilder
1.1.1 Historischer Überblick
Obwohl erste Berichte einer intestinalen Polyposis bereits im frühen 18. Jahrhundert erschienen,
gelang die Abgrenzung der einzelnen Formen gegenüber inflammatorischen Darmerkrankungen
und die ersten gesicherten Beschreibungen der adenomatösen Polyposis in den Jahren 1859
(Chargelaigue 1959) und 1881 (Sklifasowski 1881) erst nach Etablierung der Techniken zur histopathologischen Differenzierung von Darmpolypen (Bussey 1975). Noch im 19. Jahrhundert
wurden mit dem frühen Erkrankungsalter, der familiären Häufung, dem hohen Karzinomrisiko und
der gastroduodenalen Beteiligung die wichtigsten, auch heute noch gültigen klinischen Charakteristika der FAP benannt. Den dominanten Erbgang und präkanzerösen Charakter der Adenome
erkannte Lockhart-Mummery 1925 (Lockhart-Mummery 1925); vom im gleichen Jahr gegründeten
ersten Polyposis-Register am St. Mark´s Hospital in London nahm die systematische Erforschung
der gastrointestinalen Polyposis auch ihren Ausgang, die 1952 in einem ersten umfassenden
klinischen Überblick der familiären intestinalen Polyposis bei 42 Familien durch Dukes breitere
Beachtung fand (Übersichten in Spigelman and Thomson 1994; Bülow et al. 2006).
Neben der früher geläufigsten Bezeichnung Familiäre Polyposis coli existieren zahlreiche
Synonyme (multiple Adenomatosis, Familiäre Adenomatosis coli, Familiäre adenomatöse Polyposis coli). Die insbesondere von der 1985 gegründeten internationalen Experten-Gruppe Leeds
2
Castle Polyposis Group (LCPG) propagierte Bezeichnung Familiäre Adenomatöse Polyposis
(FAP) hat sich inzwischen weitgehend durchgesetzt und beschreibt die dominierende Symptomatik am treffendsten.
Der hereditäre Charakter der FAP fiel früh auf. 1927 beschrieb Cockayne erstmals den dominanten Erbgang (Cockayne 1927). Mit der Kartierung des APC-Gens 1987 und seiner Identifizierung 1991 wurde der Pathomechanismus zum Teil aufgeklärt und die Beschreibung von GenotypPhänotyp-Beziehungen möglich. Neben der Tumorsuppressorfunktion des multifunktionalen
APC-Proteins wurde kürzlich auch dessen Bedeutung für die chromosomale Stabilität erkannt.
Durch die indirekte und später auch direkte prädiktive molekulargenetische Diagnostik konnte die
Anlageträgerschaft von Risikopersonen ab Ende der 1980er Jahre erstmals im präsymptomatischen Stadium sicher nachgewiesen oder ausgeschlossen werden.
Die differentialdiagnostische Abgrenzung der einzelnen Polyposisformen begleitete das gesamte
20. Jahrundert parallel mit einer bis heute anhaltenden Weiterentwicklung der histopathologischen Klassifikation gastrointestinaler Polypen. 1921 und 1949 wurde das Peutz-JeghersSyndrom, 1966 die juvenile Polyposis beschrieben. Die Aufklärung der genetischen Grundlagen
ab den späten 1980er Jahren setzt diese Entwicklung auf molekularer Ebene fort und führte in
jüngster Zeit zur Lösung der autosomal-rezessiv erblichen MUTYH-assoziierten Polyposis aus
der Gruppe APC-negativer Fälle, während die nosologische Stellung anderer, scheinbar eigenständiger Krankheitsbilder revidiert werden musste: sowohl die anfangs als hereditary flat
adenoma syndrome (HFAS) bezeichnete attenuierte Verlaufsform, wie auch die als GardnerSyndrom bekannte Kombination einer adenomatösen Polyposis mit bestimmten extraintestinalen
Manifestationen (Gardner and Richards 1953) und ein Teil der Fälle des Turcot-Syndroms
(primäre Hirntumoren bei multiplen kolorektalen Adenomen/Karzinomen) (Turcot et al. 1959)
erwiesen sich als phänotypische Variante der APC-assoziierten FAP. Bei den übrigen Fällen des
Turcot-Syndroms handelt es sich um Hirntumoren auf dem Boden des HNPCC.
Der im Vordergrund stehende Befall des Kolorektums ließ bereits im frühen 20. Jahrhundert
erfolgreiche therapeutische Interventionen zu, die ebenfalls wesentlich vom St. Mark´s Hospital
vorangetrieben wurden. Die ersten operativen Eingriffe ab 1916 erfolgten noch primär zur
Behandlung eines manifesten CRC; der Einsicht Lockhart-Mummerys folgend, dass nicht der
Krebs selbst, sondern die Disposition hierfür vererbt wird, wurden aber schon bald die präventiven Möglichkeiten der Dickdarmentfernung erkannt und zunehmend auch prophylaktische
Kolektomien durchgeführt. Dominierte lange Zeit die totale Proktokolektomie mit IleostomaAnlage, führte die operationstechnische Weiterentwicklung mit der ersten ileorektalen Anastomose 1948 und der Einführung der restorativen Proktokolektomie mit Pouchanlge 1977 zu einer
deutlichen Steigerung der Akzeptanz der chirurgischen Therapie. Beide Maßnahmen erfordern
allerdings endoskopische Verlaufskontrollen des Rektums bzw. Pouches. Bis heute werden die
Indikationen sowie die Vor- und Nachteile beider Verfahren kontrovers diskutiert. Seit Ende der
1990er Jahre wird auch die laparoskopische Kolektomie erfolgreich eingesetzt.
Demgegenüber beschränken sich Versuche einer Chemoprävention zur Verzögerung des Polypenwachstums auf attenuierte Verläufe oder die Behandlung bzw. Prophylaxe von Adenomen im
Rektum nach Kolektomie mit ileorektaler Anastomose. Hierfür wurde seit 1983 vor allem das
Indomethacinderivat Sulindac aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika erfolgreich
eingesetzt. Es inhibiert als Cyclooxygenase-Hemmer die Prostaglandinsynthese. Die Hoffnung,
die chirurgische Behandlung ähnlich wie beim Magenulcus durch medikamentöse Therapieerfolge abzulösen, ist derzeit allerdings noch nicht in greifbarer Nähe.
3
Eine überragende Bedeutung für die Prognose kommt der endoskopischen Überwachung des
Magendarmtraktes von Risikopersonen zu, die bereits 1928 empfohlen wurde (Jüngling 1928).
Das 1999 von der LCPG erarbeitete und inzwischen fest etablierte Vorsorge-Programm für die
FAP (Vasen et al. 1999; Vasen et al. 2008) hat die Früherkennung und rechtzeitige Behandlung
der Erkrankung entscheidend verbessert und zusammen mit der prophylaktischen Kolektomie
dazu geführt, dass das CRC nicht mehr den bestimmenden prognostischen Faktor darstellt
(Bülow 1986; Jarvinen 1992).
Mit der Beschreibung des APC-Gens und seiner Interaktionspartner gelang in den 1990er Jahren
die Identifizierung eines der zentralen Regulationswege (Wnt-Signalweg) des Zellwachstums,
dessen Fehlsteuerung nicht nur bei der hereditären, sondern auch bei sporadischen Formen zur
Initiation der Adenombildung beiträgt. Schon früh wurde die Bedeutung der FAP als ModellErkrankung für das Verständnis des Dickdarmkrebses im Allgemeinen deutlich und ließ die Erforschung der Pathogenese dieser seltenen Veranlagung in einem größeren Zusammenhang
erscheinen. Seit 1992 existieren auch Mausmodelle der FAP (Su et al. 1992). Insbesondere das
zentrale Paradigma der Adenom-Karzinom-Sequenz konnte durch das synchrone Vorkommen
aller Adenomstadien in Reinform studiert werden, sodass die FAP entscheidende Anstöße zur
Entwicklung des Vogelstein´schen Modells der kolorektalen Karzinogenese gab (Vogelstein et al.
1988; Fearon and Vogelstein 1990). Sachatello bezeichnete die FAP deshalb als das ultimative
Modell der menschlichen Karzinogenese und Smith formulierte schon 1968 hoffnungsvoll, dass
vermutlich jede signifikante Entdeckung bei der FAP Bedeutung für das viel größere Problem des
CRC haben würde (Smith 1968; Sachatello 1971).
1.1.2
APC-assoziierte familiäre adenomatöse Polyposis (FAP)
1.1.2.1 Genetik, Epidemiologie und Pathogenese
Die FAP [MIM *175100] ist ein autosomal-dominant erbliches gastrointestinales Tumordispositions-Syndrom, das durch eine heterozygot vorliegende Keimbahnmutation im APC-Gen verursacht wird. Sie stellt mit einer Inzidenz von etwa 1:10.000 (1:7000-1:24.000) und einer Prävalenz
von 1:30.000-40.000 die häufigste kolorektale Polyposis dar (Bisgaard et al. 1994; Bülow et al.
1996). Die epidemiologischen Daten stammen größtenteils aus dänischen und skandinavischen
Polyposis-Registern; aufgrund der hohen Neumutationsrate ist aber von einer weltweit vergleichbaren Inzidenz auszugehen.
Beim APC-Gen handelt es sich um ein Tumorsuppressor-Gen, das 1987 in der chromosomalen
Region 5q21-q22 kartiert (Bodmer et al. 1987; Leppert et al. 1987) und 1991 identifiziert wurde
(Groden et al. 1991; Kinzler et al. 1991). Die genomische Sequenz umfasst knapp über 108
Kilobasen (kb) (Genbank: NC_000005.8; genomische Region 112.101.483 - 112.209.835) und
kodiert ein 2843 Aminosäuren langes zytoplasmatisches Protein (mRNA-Referenzsequenz
Genbank: NM_000038.4). Das letzte der 15 kodierenden Exons umfasst etwa 77 % der
gesamten kodierenden Sequenz. Es wurden zahlreiche, zum Teil gewebsspezifische Isoformen
beschrieben, insbesondere Exon 9 und 10a werden alternativ gespleißt.
Das APC-Protein ist als komplexes, aus zahlreichen strukturellen und funktionellen Domänen
bestehendes Makromolekül zentraler Bestandteil des Wnt-Signaltransduktionswegs und hier als
„gatekeeper“ an der Kontrolle des Zellwachstums (Proliferation), der interzellulären Adhäsion und
der Regulation des Zellzyklus der Enterozyten beteiligt (Abb. 1.1) (Polakis 1997). In einem Multi4
proteinkomplex ist es durch die Interaktion mit ß-Catenin an der Regulierung von Wnt-vermittelten
Wachstumssignalen beteiligt. Entsprechend der von Knudson 1971 postulierten Second-HitHypothese (Knudson 1971) führen somatische Mutationen in den Enterozyten von heterozygoten
Trägern einer APC-Keimbahnmutation (FAP-Anlageträger) zum (kompletten) Ausfall des APCProteins. Folge hiervon ist eine Stabilisierung von ß-Catenin, das dann eine unkontrollierte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern bedingt (Morin et al. 1997). Die Verteilung der
beiden APC-Mutationen im Tumorgewebe ist dabei nicht zufällig, sondern scheint hinsichtlich
einer für den Tumor optimalen Restfunktion des Proteins selektiert zu werden; nach neuesten
Untersuchungen können während der Tumorprogression auch weitere Mutationen (third-hit) des
APC-Gens auftreten (Segditsas et al. 2009). In jüngster Zeit wurde auch die Bedeutung des APCProteins für die chromosomale Stabilität erkannt (Alberici and Fodde 2006).
Abb. 1.1 Das APC-Protein ist an der Herunterregulierung des intrazellulären ß-Catenins beteiligt. Wnt-vermittelte
Wachstumssignale führen ebenso wie ein mutationsbedingter Funktionsverlust des APC-Proteins zu einem Anstieg des
ß-Catenin-Spiegels und in der Folge zur Aktivierung proliferationsfördernder Transkriptionsfaktoren (Abbildungen
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Oliver Müller, MPI für molekulare Physiologie Dortmund).
Bis heute wurden über 900 verschiedene APC-Keimbahnmutationen bei FAP-Patienten
beschrieben (Human Gene Mutation Database; www.hgmd.cf.ac.uk, www.lovd.nl/APC). Es
handelt sich in der weit überwiegenden Mehrheit um proteintrunkierende Veränderungen (StoppMutationen, Leseraster-Verschiebungen). Diese „Punktmutationen“ liegen meist in der 5´-Hälfte
des APC-Gens ab Exon 3. Bei einem Teil der Patienten mit unauffälliger Familiengeschichte ist
die ursächliche APC-Mutation in der entsprechenden Ei- oder Samenzelle ihrer Eltern neu
aufgetreten (de novo Mutation).
1.1.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Vorsorge
Die klassische (typische) FAP ist durch das Auftreten Hunderter bis Tausender kolorektaler
Adenome im zweiten Lebensjahrzehnt gekennzeichnet, die oft erst im dritten Lebensjahrzehnt
symptomatisch werden (Abb. 1.2). Unbehandelt entwickeln sich bei nahezu allen Betroffenen im
Laufe des Lebens aus einem oder mehreren Adenomen kolorektale Karzinome (Übersicht bei
Friedl and Lamberti 2001; Bülow 2003; Galiatsatos and Foulkes 2006). In etwa 80 % der Familien
lässt sich eine APC-Mutation nachweisen.
Mildere Verläufe der Erkrankung werden meist als attenuierte FAP (AFAP) bezeichnet. Es
handelt sich allerdings um eine klinisch schlecht definierte und genetisch vermutlich heterogene
Patientengruppe, nur bei etwa 20-30% der Indexpatienten lässt sich eine APC-Mutation nachweisen. Als diagnostische Kriterien der AFAP werden typischerweise eine geringere Polypenzahl
(<100) und ein in der Regel 10-15 Jahre späteres Manifestationsalter im Vergleich zur klassi5
schen FAP herangezogen (Knudsen et al. 2003); die Adenome sind im Gegensatz zur klassischen FAP häufig im proximalen Kolon lokalisiert. Letzlich handelt es sich aber bei der Ausprägung der Polyposis um ein biologisches Kontinuum und die dichotome Einteilung markiert eher
die beiden phänotypischen Extreme als klare nosologische Einheiten. Unbehandelt ist das
Lebenszeitrisiko für ein CRC auch bei der AFAP sehr hoch.
Abb. 1.2. Kolektomiepräparat eines Patienten mit klassischer FAP: Der Dickdarm ist mit Polypen übersäht,
die histologisch Adenomen entsprechen (Aufnahmen
von Prof. Dr. K. Jäger, jetzt Chirurgische Abt. Marienhospital Brühl, und von Prof. em. Dr. U. Pfeifer, Institut
für Pathologie, Universitätsklinikum Bonn).
Abb. 1.3. Typische extrakolonische Manifestationen der
FAP: 1 = Drüsenkörperzysten im Magen; 2 = duodenale
Polyposis; 3 = intramurales Desmoid; 4 = retinale Pigmentflecken (CHRPE); 5 = Osteome im Unterkiefer; 6 = Osteome und Zahnfehlstellung (Aufnahmen aus Friedl und
Lamberti 2001 [1]; von PD Dr. R. Caspari, jetzt RehaZentrum Ückeritz, Usedom [2]; Prof. Dr. G. Möslein, jetzt
Chirurgische Abt. St. Josefs-Hospital Bochum [3]; PD Dr. T.
Böker, jetzt Augenklinik Klinikum Dortmund [4] und aus
Herrera 1989 [5,6]).
Polypen des Magens treten bei über 50% (13-84%) der FAP-Patienten auf, es handelt sich allerdings überwiegend um gutartige Drüsenkörperzysten (Abb. 1.3), Magenkarzinome scheinen bei
FAP-Patienten nicht signifikant häufiger zu sein (Inzidenz 0,6%). Duodenaladenome werden
hingegen bei bis zu 90% der Patienten beschrieben, das relative Risiko für die Entstehung eines
Duodenalkarzinoms ist deutlich erhöht (~300), das Lebenszeitrisiko wird mit etwa 5 % angegeben
(Offerhaus et al. 1992; Bülow et al. 2004).
Bei einem Teil der Patienten treten typische, zum Teil unter dem Begriff Gardner-Syndrom zusamengefasste extraintestinale Manifestationen wie Osteome, Fibrome oder Epidermoidzysten auf;
die zum Teil aggressiv wachsenden Desmoide werden in 4-13 % beobachtet (Kadmon et al.
1995; Abb. 1.3). Da Desmoide insbesondere durch ein mechanisches Trauma ausgelöst werden,
können Entscheidungen über invasive therapeutische Eingriffe (Kolektomie) durch eine familiäre
Häufung von Desmoiden unter Umständen beeinflusst werden. Die FAP-typischen gutartigen
Pigmentveränderungen der Netzhaut (CHRPE) haben ihren Stellenwert in der prädiktiven
Diagnostik und in der Entscheidung über das Vorgehen bei der Mutationssuche inzwischen
weitgehend verloren. An extraintestinalen Malignomen wurden insbesondere Hepatoblastome,
Medulloblastome und Schilddrüsenkarzinome beschrieben, aufgrund ihrer geringen Inzidenz (12 %) sind spezifische Vorsorgemaßnahmen allerdings umstritten (Aretz et al. 2006a; Vasen et al.
2008).
Die Effizienz frühzeitiger und engmaschiger Koloskopien zur Prävention des CRC ist für die FAP
gut belegt (Jarvinen 1992) und führte zur Etablierung eines krankheitsspezifischen intensiven
Früherkennungs- bzw. Vorsorge-Programms für Risikopersonen (erstgradig verwandte Personen
6
eines FAP-Patienten) (Schmiegel et al. 2004; Vasen et al. 2008). Die international erhobenen
Befunde konnten durch eigene Untersuchungen bestätigt werden (Aretz et al., unpublizierte
Daten), hierbei zeigte sich allerdings auch, dass die Koloskopie derzeit im Mittel noch etwa zehn
Jahre zu spät begonnen wird.
1.1.2.3 Genotyp-Phänotyp-Beziehungen
Genotyp-Phänotyp-Beziehungen hinsichtlich des Schweregrads der kolorektalen Polyposis und
der Expression extrakolonischer Manifestationen sind seit längerem bekannt und lassen sich zum
Teil überzeugend mit dem Ausfall der entsprechenden funktionellen Domänen im APC-Protein in
Einklang bringen: Mutationen am Beginn (Codons 77-157), in der alternativ gespleißten Region
von Exon 9 (Codons 312-412) und in der distalen Hälfte des APC-Gens (etwa ab Codon 1580)
sind mit einem milderen Verlauf assoziiert, während Mutationen zwischen Codon 1250 und 1330
– insbesondere im Bereich von Codon 1309 – häufig mit einer besonders früh manifesten
Verlaufsform einhergehen (Nagase et al. 1992; Spirio et al. 1993; Caspari et al. 1994; Friedl et al.
2001; Abb 1.4 und 1.5).
Abb. 1.4. Trotz der statistisch nachweisbaren Korrelation zwischen Krankheitsschwere (Alter bei
FAP-Diagnose) und Genotyp besteht eine große
inter- und intrafamiliäre Variabilität (Friedl et al.
2001).
Abb. 1.5. In großen FAP-Kollektiven ließen sich bezüglich
des Schweregrades der Polyposis und des Auftretens extraintestinaler Symptome reproduzierbare Genotyp-PhänotypBeziehungen beschreiben.
Trotz der hohen Korrelation ist die Streuung der klinischen Parameter – selbst intrafamiliär –
allerdings groß. Es handelt sich deshalb immer nur um statistische Genotyp-PhänotypBeziehungen, die Kenntnis der APC-Mutation kann den Krankheitsverlauf bei einem individuellen
Patienten nicht sicher vorhersagen und eignet sich somit kaum als Grundlage für therapeutische
Entscheidungen.
CHRPE treten fast ausschließlich bei Mutationen im zentralen Anteil des Gens auf (Codons 4631387) und finden sich deshalb fast nie bei der AFAP; eine Häufung von Desmoiden und Osteomen wurde bei Mutationen zwischen Codon 1445 und 1578 gefunden (Wallis et al. 1994;
Caspari et al. 1995); Abb. 1.5).
7
1.1.3
MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP)
1.1.3.1 Genetik, Epidemiologie und Pathogenese
Die im Gegensatz zur FAP autosomal-rezessiv erbliche MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP,
[MIM *608456]) wird durch biallele Keimbahn-Mutationen im MUTYH-Gen (anfangs als MYH-Gen
bezeichnet) verursacht. Die MAP wurde im Jahr 2002 erstmals beschrieben und stellt heute die
wichtigste Differentialdiagnose der APC-assoziierten FAP dar (Al-Tassan et al. 2002; Sampson et
al. 2003; Sieber et al. 2003).
Verlässliche Zahlen zur Epidemiologie liegen bisher nicht vor. In Abhängigkeit von den
Einschlusskriterien, den Methoden der Mutationssuche und dem ethnischen Hintergrund machen
biallele Mutationsträger (MAP-Patienten) 3-40 % der APC-mutationsnegativen Patienten mit
adenomatöser Polyposis aus. Entsprechend der Heterozygotenfrequenz von 1-2 % in der kaukasischen Allgemeinbevölkerung dürfte die Inzidenz der Krankheit in westlichen Ländern zwischen
1:10.000-40.000 liegen. Aufgrund des autosomal-rezessiven Erbgangs haben Kinder (und Eltern)
eines MAP-Patienten bei nicht-konsanguinen Partnerschaften im Gegensatz zur FAP ein nur
geringes Wiederholungsrisiko.
Das MUTYH-Gen (humanes MutY-Homolog) liegt in der chromosomalen Region 1p34.1 und
besteht aus 16 Exons. Die genomische Sequenz umfasst über 11 kb (Genbank: NC_000001.9;
genomische Region 45.567.501 - 45.578.729) und kodiert ein 549 Aminosäuren langes Protein.
Es wurden verschiedene Transkripte identifiziert, die in den letzten Jahren mehrmals zu einer
Änderung der Referenzsequenz auf RNA-Ebene und damit der Bezeichnung von MUTYH-Mutationen führten (siehe unten).
Das MUTYH-Protein ist eine DNA-Glykosylase und als „caretaker“ Bestandteil des Basen-Exzisions-Reparatur-Systems (BER) der Zelle, das durch oxidativen Stress entstandene Basenfehlpaarungen (Punktmutationen) der DNA (8-oxo-7,8-dihydroxy-2’-deoxyguanosine = 8-oxoG) korrigiert (Abb 1.6). Der Funktionsverlust des Enzyms durch biallele Keimbahnmutationen führt zu
einer Anhäufung somatischer Mutationen durch 8-oxoG induzierte G:C>T:A Transversionen in
anderen Zielgenen (zum Beispiel dem APC-Gen) und hierüber insbesondere zur Entstehung von
Adenomen im Gastrointestinaltrakt. In den beiden anderen, synergistisch wirkenden Genen
MTH1 (humanes MutT-Homolog) und OGG1 (humanes MutM-Homolog) wurden bisher bei Polyposis-Patienten keine Keimbahnmutationen identifiziert (Al-Tassan et al. 2002; Jones et al. 2002).
Abb. 1.6 Die Basen-Exzisions-Reparatur
(Base excision repair = BER) in E. coli:
die
Glykosylase
MutY
(humanes
Homolog: MUTYH) entfernt A-Basen, die
sich bei der DNA-Replikation gegenüber
8-oxoG (°G), dem stabilsten Produkt von
oxidativen DNA-Schäden, angelagert
haben. MutY erkennt hierbei als einzige
der drei beteiligten Glykosylasen die
intermediäre Basenfehlpaarung °G-A.
Der Ausfall des Enzyms führt deshalb
über die Bildung von °G-A zu G:C > T:AMutationen
(blauer
Kasten)
(aus:
Cheadle and Sampson 2003)
8
MUTYH-Mutationen finden sich bei biallelen Mutationsträgern über das ganze Gen verstreut,
abgesehen von den ersten beiden Exons (MUTYH LOVD [Leiden Open Variation Database;
http://chromium.liacs.nl/LOVD2/colon_cancer/home.php] und HGMD [Human Gene Mutation
Database; www.hgmd.org]). Bei einem nennenswerten Anteil handelt es sich um MissenseMutationen, die vermutlich die katalytischen Eigenschaften des Enzyms reduzieren. Der experimentelle Nachweis der funktionellen Relevanz konnte bisher aber nur für einen Teil der Varianten
erbracht werden.
Bei Patienten europäischen Ursprungs dominieren zwei Missense-Mutationen in Exon 7 und 13,
die nach der ursprünglich von Al-Tassan benutzten und verbreiteten mRNA-Referenzsequenz
(1608 bp; Genbank: U63329.1) als c.494A>G;p.Tyr165Cys (Y165C) und c.1145G>A;
p.Gly382Asp (G382D) bezeichnet werden, nach der aktuellen, 42 Nukleotide längeren Referenzsequenz (1650 bp; Genbank: NM_001128425) hingegen als c.536A>G;p.Tyr179Cys (Y179C) und
c.1187G>A;p.Gly396Asp (G396D). Die kombinierte Allelfrequenz beider Mutationen liegt bei
europäischen Patienten zwischen 50 und 82 %, während beide Mutationen in asiatischen Populationen kaum oder gar nicht vorzukommen scheinen (Miyaki et al. 2005; Kim et al. 2007; YanaruFujisawa et al. 2008); dies lässt an für autosomal-rezessive Erkrankungen nicht ungewöhnliche
Founder-Effekte denken. Passend hierzu wurden auch in anderen Ländern populationsspezifische Gründermutationen beschrieben (Sampson et al. 2003; Kanter-Smoler et al. 2006; Dolwani
et al. 2007; Ajith Kumar et al. 2008). In einem Kooperationsprojekt mit Roberto Colombo, Professor für Klinische Genetik an der Catholic University of the Sacred Heart in Mailand, konnten wir
gerade bei 32 biallelen Trägern der beiden häufigen MUTYH-Mutationen aus Deutschland einen
ancestralen Haplotyp identifizieren und das Alter der beiden Mutationen mittels populationsgenetischer Algorithmen auf die Zeit zwischen dem 3. Jahrtausend und 16. Jahrhundert v. Chr. für
G382D bzw. 6. Jahrhundert v. Chr. bis 3. Jahrhundert n. Chr. für Y165C eingrenzen (Aretz et al.,
zur Publikation eingereicht).
1.1.3.2 Klinisches Erscheinungsbild und Vorsorge
Die MAP ist klinisch im Wesentlichen mit der durch APC-Mutationen verursachten attenuierten
bzw. atypischen FAP vergleichbar (Phänotyp-Klassifikation siehe Kapitel 1.2.1): meist treten
zwischen 20 und einigen hundert Adenomen auf, das Alter bei Diagnose liegt im Mittel bei 45
Jahren (Streuung 12-68 Jahre), unbehandelt beträgt das Lebenszeitrisiko für ein CRC vermutlich
wie bei der AFAP bis zu 100 % (Farrington et al. 2005). Nach neuesten Daten bestehen aber bei
bis zu einem Drittel der MAP-Patienten mit einem CRC keine kolorektalen Polypen (Cleary et al.
2009).
Entsprechend dem autosomal-rezessiven Erbgang tritt die MAP häufig sporadisch oder mehrmals
in Geschwisterschaften auf. Wegen des hohen CRC-Risikos wird Betroffenen, biallelen asymptomatischen Anlageträgern und Geschwistern, die nicht prädiktiv getestet wurden, derzeit das
gleiche gastrointestinale Früherkennungsprogramm wie bei der attenuierten FAP empfohlen. Im
Rahmen der unten erwähnten internationalen Studie (Kapitel 2.2.2) konnten erstmals signifikante
Genotyp-Phänotyp-Korrelationen hinsichtlich der kolorektalen Manifestion nachgewiesen werden
(Nielsen et al. 2009).
Das CRC-Risiko von heterozygoten Anlageträgern wurde anfangs kontrovers diskutiert (Croitoru
et al. 2004; Peterlongo et al. 2006; Webb et al. 2006; Balaguer et al. 2007). Zwei große populationsbasierte Assoziations-Untersuchungen an über 2000 und 3800 CRC-Patienten schätzten
9
das relative Risiko dann auf etwa 1,7 (95% CI 1,07-2,95) bei über 55-Jährigen (Farrington et al.
2005) bzw. auf insgesamt 1,5 (95% CI 1,02-2,16) (Cleary et al. 2009). Wir haben im Rahmen der
erwähnten internationalen Studie bei 273 heterozygoten Anlageträgern ein mit 2,12 (95% CI 1,303,28; p<0.01) in etwa verdoppeltes relatives Risiko festgestellt und kamen so mit einem anderen
methodischen Ansatz zu einem ähnlichen Ergebnis (Jones et al., zur Publikation eingereicht).
1.1.4
Mutations-negative adenomatöse Polyposis
Bei einem nennenswerten Teil der Indexpatienten (44-52 %) kann die genetische Ursache der
adenomatösen Polyposis nicht geklärt werden. Durch die immer bessere klinische Erfassung und
molekulargenetische Diagnostik bei milderen Formen wird der Anteil zukünftig noch weiter
ansteigen. Aufgrund der hohen Mutationsdetektionsrate bei der klassischen Form finden sich bei
den APC- und MUTYH-mutationsnegativen Patienten vermehrt mildere Ausprägungen (AFAP,
multiple kolorektale Adenome = MCA), ein sporadisches Auftreten und seltener extrakolonische
Manifestationen. Es handelt sich vermutlich um einen genetisch und klinisch heterogenen
Phänotyp. Trotz zahlreicher wissenschaftlicher Bemühungen mit verschiedenen methodischen
Ansätzen (Kandidatengene, LOH-Studien, Expressions- und Kopienzahl-Untersuchungen) wurde
bei der Aufklärung der genetischen Grundlagen allerdings bisher – abgesehen von der Identifizierung der MAP – kein substantieller Durchbruch erzielt.
Bei einigen Patienten lässt sich die ergebnislose Mutationssuche mit diagnostischen Schwierigkeiten bzw. Fehldiagnosen erklären. Bei wenigen (5-30) kolorektalen Adenomen muss differentialdiagnostisch insbesondere an den erblichen Dickdarmkrebs ohne Polyposis (HNPCC, LynchSyndrom) gedacht werden. In HNPCC-assoziierten Karzinomen lässt sich das Phänomen der
Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) sowie immunhistochemisch der Ausfall eines MMR-Proteins
nachweisen. Daneben werden aber auch bei anderen intestinalen Polyposis-Syndromen (familiäre juvenile Polyposis; Peutz-Jeghers-Syndrom; hereditäres gemischtes Polyposis-Syndrom)
neben dem jeweiligen dominierenden Polypentyp Adenome beobachtet. Den übrigen Fällen
liegen wahrscheinlich entweder APC-Mutationen zugrunde, die im Rahmen der Routinediagnostik
nicht identifiziert bzw. interpretiert werden können, oder Veränderungen anderer, noch unbekannter Gene, wobei hier sowohl eine monogene, wie auch komplexere, multifaktorielle Ätiologie
denkbar ist.
1.2
Material und Methoden
1.2.1
Patienten
Kollektiv / Rekrutierung
Bis Januar 2009 wurde am Institut für Humangenetik des Universitätsklinikums Bonn bei 1452
Familien mit adenomatöser Polyposis eine molekulargenetische Diagnostik durchgeführt. Bei
allen in die verschiedenen Studien eingeschlossenen Patienten wurde eine APC-Mutationsanalyse aufgrund einer adenomatösen Polyposis veranlasst. Die klinischen Informationen wurden
zum Teil bei der Einsendung der Blutproben mitgeliefert oder im Rahmen der genetischen Beratung in unserem Institut erhoben, zum größten Teil allerdings anlässlich verschiedener wissen10
schaftlicher Studien aktiv und systematisch bei den betreuenden Ärzten und Krankenhäusern
angefordert.
Phänotyp-Klassifikation
Die zur Diagnose einer gastrointestinalen adenomatösen Polyposis notwendige Mindestzahl von
Polypen ist nicht klar definiert, sicher sollten aber bei Erstdiagnose und leerer Familienanamnese
mehr als zehn synchrone kolorektale Adenome vorliegen. Die von unserer Arbeitsgruppe
verwendete Klassifikation der verschiedenen Schweregrade des Krankheitsverlaufs orientiert sich
an den international üblichen Standards und basiert auf der Adenomzahl, dem Diagnosealter und
dem Auftreten eines CRC: i) klassische oder typische FAP: über 100 Adenome vor dem 35.
Lebensjahr oder klinische Symptome vor dem 35. Lebensjahr (wenn Koloskopiebefunde nicht
verfügbar oder unklar); ii) attenuierte FAP (AFAP): 10-100 Adenome nach dem 25. Lebensjahr
oder über 100 Adenome bei Erstdiagnose nach dem 45. Lebensjahr bzw. klinische Symptome
erstmals nach 45. Lebensjahr; iii) atypische Polyposis: die Kriterien für eine typische oder attenuierte FAP sind nicht erfüllt, sodass eine eindeutige Zuordnung nicht möglich ist, meist handelt
es sich um intermediäre Verläufe mit über 100 Adenomen bei einem Diagnosealter zwischen 35
und 40 Jahren oder um eine starke Diskrepanz zwischen dem Beginn von Symptomen und der
Polypenzahl.
1.2.2
Molekulargenetische Untersuchungsmethoden
Suche nach Punktmutationen im APC- und MUTYH-Gen
Die genomische DNA der Patienten wurde aus peripherem Blut (Leukozyten) entsprechend dem
Aussalzverfahren extrahiert (Miller et al. 1988). Das Screening nach APC-Punktmutationen
erfolgte anfangs (seit 1991) mittels Heteroduplexanalyse (HD) und single-strand conformational
polymorphism analysis (SSCP) und später mit dem Protein-Trunkationstest (PTT) für Exon 15
und der denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) (WAVE, Transgenomics)
für die Exons 1-14 und die ersten 500 Basenpaare (bp) von Exon 15 (Abschnitte 15A und 15B).
Auffällige PCR-Fragmente wurden anschließend mit einem Gel- oder Kapillar-Sequenzer (ABI
prism 377, ABI 3100; Applied Biosystems) mittels Cycle-Sequencing und BigDye-Terminatoren
(Kit Versionen 1.1 und 2.0) sequenziert. Die Suche nach MUTYH-Mutationen in allen 16 kodierenden Exons und den angrenzenden Intronsequenzen erfolgte durch direkte Sequenzierung von
11 PCR-Produkten ohne vorherige Screeningverfahren. Zur Beschreibung der Mutationen
wurden die kodierenden Nukleotide entsprechend der mRNA-Referenz-Sequenz des APC-Gens
(GenBank NM_000038) und MUTYH-Gens (Genbank U63329.1 bzw. NM_001128425) nummeriert. Das erste Nukleotid entspricht dabei dem A des ATG-Translations-Initiations-Codons.
Screening auf große genomische Deletionen und Duplikationen des APC-Gens
Das Screening auf große genomische Deletionen und Duplikationen des APC-Gens erfolgte mit
der MLPA-Methode (multiplex ligation-dependent probe amplification). Das MLPA-Test-Kit
(SALSA P043 APC exon deletion test kit, MRC Holland) enthält 20 gepaarte Proben des APCGens zur semiquantitativen Untersuchung der ersten 14 Exons, von drei Abschnitten aus der
11
Promotorregion, von drei am Anfang, in der Mitte und am Ende von Exon 15 gelegenen Fragmenten sowie 11 Kontrollproben anderer chromosomaler Regionen.
Je ein Probenpaar für jedes einzelne Fragment (Exon) wird dabei mit der zu untersuchenden
DNA nach Hitzedenaturierung hybridisiert, die angelagerten Proben werden durch Ligation
verbunden, mit dem gleichen Primerpaar für alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und auf
einem ABI 3100 Kapillar-Sequenzierer aufgetrennt. Als Positiv- und Negativ-Kontrollen wird
parallel DNA gesunder Personen und von Trägern bekannter APC-Deletionen untersucht.
Der Datenexport erfolgte mittels GeneMapper-Software. Die Elektropherogramme wurden
anfangs durch visuelle Beurteilung der Peak-Höhen der einzelnen APC-Fragmente im Vergleich
mit den benachbarten Kontrollfragmenten ausgewertet, später auch durch die Berechnung der
Dosisquotienten mittels der Coffalyzer-Software. Hierzu wird das Verhältnis der Peak-Area eines
APC-Exons und der angrenzenden internen Kontroll-Fragmente berechnet und durch den medianen Wert des entsprechenden Verhältnisses bei allen Proben desselben Laufs normalisiert. Die
erwarteten Werte für große heterozygote Deletionen liegen bei etwa 0,5. Alle Deletionen und
unklaren Befunde wurden durch eine zweite unabhängige Wiederholung bestätigt.
RNA-Untersuchungen (Transkriptanalyse)
Hierzu wurden den Patienten von den betreuenden Ärzten frische venöse Blutproben in speziellen, mit einem RNA stabilisierenden Zusatz versehenen Röhrchen (PAXgene RNA Blutröhrchen,
PreAnalytiX, Qiagen, Hilden) abgenommen. Hieraus wurde die gesamte RNA extrahiert (PAXgene Blood RNA Kit, Qiagen, Hilden). 2-3 µg der RNA wurden anschließend durch random
hexamer-primed reverse Transkription mit dem Superscript-1st-strand-System für RT-PCR
(Invitrogen GmbH, Karlsruhe) in cDNA umgeschrieben. Mittels Standard-PCR-Protokollen wurden
die gewünschten RT-PCR Fragmente unter Verwendung entsprechender Primer generiert, auf
einem 2%igen Agarose-Gel aufgetragen und mittels eines UV Imaging Systems (BIORAD) analysiert. Aberrante und normale Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, gereinigt (High Pure
PCR Product Purification Kit, Roche), mit denselben Primern reamplifiziert und sequenziert.
SNaPshot-Analyse
Die SNaPshot-Analyse (ABI Prism® SNaPshotTM Multiplex Kit, Applied Biosystems) wurde
insbesondere zur Verifizierung der Mutationen und Quantifizierung des Mosaikgrades bei Patienten mit vermutetem APC-Mosaik eingesetzt. Es handelt sich um eine Primer-ExtensionsMethode, die auf der Anlagerung eines einzelnen fluoreszensmarkierten Dideoxy-Nukleotids
(entweder des Wildtyp- oder des Mutations-Nukleotids) an speziell gelegte Primer beruht. Die
Primer reichen bis unmittelbar an die zu untersuchende Variante heran (Uhlmann et al. 2002;
Kaminsky et al. 2005).
Hierzu wird das die APC-Mutation tragende Exon mit den üblichen Primern amplifiziert und dann
ein Aliquot des PCR-Produktes für die SNaPshot-Analyse entsprechend dem Protokoll des
Herstellers verwendet. Parallel wurden auch normale Kontrollen und – soweit verfügbar –DNAProben mit einer Vollmutation untersucht. Die Produkte der Primer-Extensions-Reaktion wurden
anschließend auf einem ABI 3100 Kapillarsequenzer analysiert und das Verhältnis der Peakflächen von normaler und mutierter DNA mit der GeneMapper-Software Version 3.0 (Applied
Biosystems) quantifiziert.
12
Loss of heterozygozity (LOH)
Mithilfe von polymorphen Mikrosatelliten-Markern können segmentale Allelverluste (= Deletionen)
im Tumorgewebe als „loss of heterozygosity“ (LOH) dargestellt werden. Entsprechend der ZweiTreffer-Theorie von Knudson stellt eine somatische Deletion häufig den zweiten Treffer („second
hit“) dar, der im Tumorgewebe zur Inaktivierung des Tumorsuppressorgens (hier APC-Gens) führt
und das Tumorwachstum initiiert.
Zum Nachweis von LOH wurde aus Leukozyten und kolorektalem Adenomgewebe extrahierte
DNA mit den drei nahe am APC-Gen lokalisierten Mikrosatellitenmarkern D5S346, D5S82 and
D5S1965 untersucht. Die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte wurden auf einem ABI 3100
Sequenzierer aufgetrennt und mit der GeneMapper-Software Version 3.0 (Applied Biosystems)
evaluiert. Von einem LOH wurde ausgegangen, wenn eines der beiden in Leukozyten-DNA
nachweisbaren Allele eines informativen Markers in der Tumor-DNA fehlte bzw. deutlich reduziert
war.
Kopplungsuntersuchungen / Haplotyp-Analyse
Die Haplotypanalyse im Bereich des APC-Locus erfolgte unter Verwendung des intragenischen
Polymorphismus rs465899 (c.5880G>A;p.Pro1960 in Exon 15 des APC-Gens) sowie von sieben
die APC-Region flankierenden Mikrosatelliten-Markern (D5S299 - D5S82 - D5S134 – APC –
D5S346 – D5S2001 – D5S1385 – D5S138), die einen genomischen Bereich von 14 cM umfassen.
In-silico-Analysen
Zur in-silico-Analyse der funktionellen Konsequenzen unklarer Varianten in Exon- und Intronbereichen des APC-Gens wurden drei verschiedene Programme benutzt. Zur Prädiktion der
Spleißeffizienz von Wildtyp- und mutierten Sequenzen wurden die Programme Berkeley
Drosophila Genome Project (BDGP) (www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) und SpliceSiteFinder
(www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html) eingesetzt. Der Einfluss von exonischen
Basensubstitutionen auf mutmaßliche exonic splice enhancer (ESE) Motive wurde mittels des
ESEfinder Programms (http://rulai.cshl.edu/tools/ESE2/) eingeschätzt (Cartegni et al. 2003).
13
2
EIGENE ARBEITEN: ERGEBNISSE UND DISKUSSION
2.1
Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP)
2.1.1
Häufigkeit und parentale Herkunft von de novo APC-Mutationen
(Aretz et al., Eur J Hum Genet 2004)
In der Literatur wird der Anteil von APC-Neumutationen (de novo Mutationen) bei FAP-Patienten
mit bis zu 25 %, die APC-Mutationsrate mit 5-9 x 10-6 Mutationen pro Gamet und Generation
angegeben (Rustin et al. 1990; Bisgaard et al. 1994). Alters- und geschlechtsspezifische Muster
der parentalen Herkunft von de novo Mutationen wurden für zahlreiche monogene Syndrome mit
hoher Neumutationsrate beschrieben (Chandley 1991; Crow 2000); im Jahr 2002 lagen aber
noch keine entsprechenden Untersuchungen bei der FAP vor. Die Kenntnis der elterlichen
Herkunft von Neumutationen erlaubt Rückschlüsse auf den zugrunde liegenden Entstehungsmechanismus genetischer Veränderungen während der Gametogenese, die systematische
Analyse wird allerdings vor allem durch die Notwendigkeit erschwert, zur Bestimmung der
Haplotypen Blutproben von drei Generationen der betroffenen Familien zu erhalten. Wir
beschlossen, einen Beitrag zur Frage der Häufigkeit, des Mutationsspektrums und der parentalen
Herkunft von de novo Mutationen im APC-Gen zu leisten. Hierzu wurden die Familienanamnesen
zahlreicher FAP-Patienten komplettiert und neue Blutproben von betroffenen und nicht betroffenen Familienangehörigen angefordert.
Bei der überwiegenden Mehrheit der APC-Keimbahn-Mutationen handelt es sich um über das
Gen verstreute seltene („private“) Ereignisse. Eine Ausnahme bilden die 5-Basen-Deletionen
c.3927_3931delAAAGA in Codon 1309 und c.3183_3187delACAAA in Codon 1061, die wesentlich häufiger auftreten und mit einem schwereren Krankheitsverlauf einhergehen (Caspari et al.
1994; Friedl et al. 2001). Es ist naheliegend zu vermuten, dass die genomische Sequenz im
Bereich von Codon 1061 (…ATGAAATAAAACAAAGT…) und 1309 (…GCAGAAATAAAAGAAA
AGAT…) durch ungleiches Crossing over bzw. Replikationsfehler während der Keimzellbildung
zu diesen Mutationen prädisponiert. Im Widerspruch hierzu scheinen allerdings Berichte über
eine sehr unterschiedliche Frequenz der Mutationen in verschiedenen Ländern zu stehen, die
eher an Gründer-Ereignisse („Founder-Mutationen“) als an Mutations-Hotspots mit einer hohen
Neumutationsrate denken lassen.
Unter 563 nicht-verwandten FAP-Familien mit bekannter Familienanamnese fanden wir 58 Patienten mit wahrscheinlicher Neumutation (10 %). Bei 52 der 58 Fälle lag eine APC-Mutation vor
(49 Punktmutationen, 3 große Deletionen). Bei 38 dieser Patienten konnte die APC-Mutation bei
beiden Eltern ausgeschlossen und damit eine Neumutation bewiesen werden. Die Mutation
c.3927_3931delAAAGA wurde in der Gruppe der Patienten mit Neumutation weitaus häufiger
nachgewiesen (17/58 = 29 % bzw. 17/38 = 45 %) als in der Gruppe der familiären Fälle (26/505 =
5 %) (Abb. 2.1). Sie segregierte mit unterschiedlichen Haplotypen. Die hohe Frequenz der Mutation in Codon 1309 ist somit nicht durch das Vorliegen einer Gründer-Mutation („founder effect“)
sondern durch eine erhöhte Mutationsrate in dieser Gensequenz zu erklären. Die unterschiedliche Häufigkeit der Mutation zwischen familiären und de novo Fällen ist am wahrscheinlichsten
Folge des höheren Selektionsdruckes auf den schwereren Phänotyp der Mutation (Gayther et al.
1994). Die berichtete hohe Variation in der Häufigkeit der Mutation in Codon 1309 ist vermutlich
14
darauf zurückzuführen, dass familiäre Fälle eine höhere Wahrscheinlichkeit der Erfassung haben
als singuläre Fälle.
I:1
I:2
D5S82 6
APC-Mut n
D5S346 4
5
n
7
II:1
D5S82 6
APC-Mut M
D5S346 4
D5S82 5
APC-Mut n
D5S346 8
Abb. 2.1 Verteilung von APC-Keimbahn-Mutationen (ohne
große Deletionen) über das Gen in 441 der 917 nicht-verwandten FAP-Familien (obere Bildhälfte) im Vergleich zur
Verteilung von de novo Mutationen bei 49 nicht verwandten
FAP-Patienten.
II:2
6
n
8
2
n
4
III:2
6
n
8
6
M
4
5
n
8
II:3
5
n
8
III:1
5
n
8
6
n
4
5
n
8
III:3
6
n
8
5
n
8
2
n
4
Abb. 2.2 Haplotyp-Analyse einer FAP-Familie mit
bestätigter de novo-Punktmutation im APC-Gen,
die auf dem väterlichen Allel entstanden ist. Es
sind nur informative Marker dargestellt; der mutationstragende Haplotyp is rot gefärbt.
Wir konnten die elterliche Herkunft der Neumutationen in 16 der oben erwähnten 38 Familien
ermitteln. Hierfür wurden Drei-Generationen-Familien mittels Kopplungsmarkern aus dem Bereich
des APC-Gens untersucht (Abb. 2.2). Es fand sich insgesamt eine höhere Anzahl von Neumutationen in der väterlichen Keimbahn: In 12 Fällen wurde eine paternale und in 4 Fällen eine maternale Herkunft der Neumutation gefunden. Wir konnten hierbei bei der FAP erstmals geschlechtsabhängige Unterschiede bezüglich der Mutationsart nachweisen: große (zytogenetisch sichtbare)
Deletionen sowie Einzelbasen-Substitutionen fanden sich ausschließlich in der väterlichen Keimbahn, während kleine Deletionen und Insertionen ein gleiches Verhältnis zwischen maternaler
und paternaler Herkunft der Neumutation (4:4) aufwiesen.
Die Befunde stehen in Einklang mit der Erwartung des bevorzugten Auftretens von Punktmutationen während der Spermatogenese und den Beobachtungen bei anderen Erkrankungen wie der
Achondroplasie oder syndromalen Kraniosynostosen, bei denen die krankheitsauslösenden
Punktmutationen ausschließlich paternalen Ursprungs sind. Die erhöhte Sensitivität postmeiotischer Stadien der Spermatogenese für Deletionen und Translokationen ist von Mikrodeletionssyndromen und Tiermodellen bekannt. Im Gegensatz hierzu scheinen kleine Deletionen wie die
5-Basenpaar-Deletion in Codon 1309 und kleine Duplikationen als häufigste Mutationstypen bei
der FAP meiotischen Ursprungs und damit geschlechtsunabhängig zu sein. In der bis 2004 einzigen diesbezüglichen Publikation bei der FAP wurden keine parentalen Unterschiede festgestellt,
da das untersuchte Kollektiv hauptsächlich kleine Frameshift-Mutationen aufwies (Ripa et al.
2002). Ripa et al. zogen aus diesem Befund den (voreiligen) Schluss, dass APC-KeimbahnMutationen (ausschließlich) während der meiotischen Zellteilung entstünden.
Die publizierten Daten zum Anteil der Neumutationen bei der FAP und die daraus mit der direkten
Methode (Vogel and Motulsky 1997) berechnete APC-Mutationsrate stammen aus den frühen
1990er Jahren und basieren auf der klinischen Einschätzung von betroffenen und nicht-erkrank15
ten Personen. Die von Bisgaard et al. (1994) und Rustin et al. (1990) errechnete Neumutationsrate ist deshalb sicher überschätzt. Die Häufigkeit unbekannter Nicht-Vaterschaften liegt in der
Allgemeinbevölkerung westlicher Länder vermutlich in der Größenordnung von etwa 4 % (Bellis
et al. 2005) und beeinflusst die Zahlen dann zwar nicht substantiell, relevant dürften aber
unvollständig erhobene Familiengeschichten (keine Koloskopiebefunde der Eltern) und Phänokopien sein: ein Teil der sporadischen Fälle ist auf andere genetische Ursachen wie die autosomal-rezessive MAP sowie noch nicht identifizierte autosomal-rezessive oder multifaktorielle
Dispositionen zurückzuführen. Darüber hinaus wurde in den früheren Untersuchungen überwiegend nur die klassische FAP (>100 Adenome) berücksichtigt, bei der aufgrund des schwereren
Phänotyps von einem höheren Anteil an Neumutationen im Vergleich zur attenuierten FAP auszugehen ist. Umgekehrt wurde die auf der indirekten Methode (Vogel and Motulsky 1997) basierende APC-Mutationsrate vermutlich unterschätzt, da sich die reproduktive Fitness der FAP durch
die verbesserte Prognose seit der verbreiteten Anwendung der Kolektomie in den skandinavischen Ländern in den 1940er Jahren erhöhte.
Der in unserem Kollektiv ermittelte Anteil von Neumutationen könnte leicht unterschätzt sein, da
Familien mit einer Neumutation leichter einer negativen Auslese unterliegen, d. h. nicht als hereditäre Fälle erkannt und damit nicht in entsprechenden Registern erfasst werden. Weder die Häufigkeit der FAP, noch die APC-Mutationsrate lassen sich anhand der uns vorliegenden Daten
berechnen, da in Deutschland keine vollständige populationsbasierte Erfassung von FAP-Familien erfolgt. In Zusammenschau der Daten erscheint ein Anteil von APC-Neumutationen in der
Größenordnung von 10-15 % realistisch. Aufgrund unserer Befunde sind trunkierende Einzelbasen-Substitutionen (Stopp-, Spleißmutationen) hierbei überwiegend paternaler Herkunft, sie
machen allerdings insgesamt nur etwa 25 % der APC-Keimbahn-Mutationen aus. Der durch
Einzelbasen-Substitutionen hervorgerufene geschlechtsspezifische Effekt macht sich aufgrund
des hohen Anteils kleiner Deletionen (insbesondere hervorgerufen durch die 5-Basenpaar-Deletion in Codon 1309) somit bei den Neumutationen insgesamt nicht deutlich bemerkbar: kombiniert
mit den Fällen von Ripa et al. betrug das Verhältnis 10:16 zugunsten der väterlichen Herkunft.
2.1.2
Große genomische Deletionen und Duplikationen im APC-Gen
(Aretz et al., J Med Genet 2005; Kaufmann et al., J Mol Diag 2009)
Bis vor kurzem war der Nachweis großer submikroskopischer genomischer Deletionen und Duplikationen methodisch schwierig, da dieser Mutationstyp mit den in der Routinediagnostik angewendeten PCR-basierten molekulargenetischen Untersuchungstechniken bei autosomalen
Genen nicht sicher festzustellen war. Bis 2005 wurden bei der FAP und anderen monogenen
Erkrankungen mittels Haplotyp-Analyse, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisation (FISH), Southern-Blot,
quantitativer PCR, comparativer genomischer Hybridisierung (CGH) oder durch RNA-Untersuchungen einzelne große Deletionen beschrieben; Ausmaß, quantitative Bedeutung und phänotypische Konsequenzen der Mutationen blieben aber weitgehend unbekannt.
Mit der Entwicklung neuer Techniken zur Semiquantifizierung von multiplex-PCR-Produkten
(Wang et al. 2002) und der methodischen Weiterentwicklung in der multiplex amplification and
probe hybridization (MAPH) (Armour et al. 2000) wurde es erstmals möglich, Gene exonweise
und systematisch hinsichtlich Kopienzahlvarianten (große Deletionen und Duplikationen) zu
untersuchen. Den Durchbruch erfuhr das Deletions-Screening dann mit der Etablierung der
multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA)-Methode durch die Firma MRC Holland
16
(Schouten et al. 2002), die sich als einfache, zuverlässige und schnelle Methode für den Einsatz
in der Routinediagnostik anbot.
Bis 2005 publizierte Untersuchungen zahlreicher monogener Krankheiten zeigten, dass große
Deletionen ganzer Gene oder einzelner Exons einen quantitativ bedeutsamen Mutationstyp
darstellen; bei hereditären Tumorsyndromen wie dem erblichen Brust- und Eierstockkrebs oder
HNPCC trugen diese Veränderungen mit 10-15 %, beim Peutz-Jeghers-Syndrom sogar mit etwa
30 % zur Mutationslast bei (Petrij-Bosch et al. 1997; Wijnen et al. 1998; Taylor et al. 2003; Wang
et al. 2003; Aretz et al. 2005). Durch unsere 2004 durchgeführte Untersuchung an 174 mutationsnegativen, nicht selektierten FAP-Patienten konnten wir die bis dahin umfangreichsten systematisch erhobenen Daten über die Häufigkeit großer Deletionen im APC-Gen publizieren und klare
Genotyp-Phänotyp-Beziehungen herausarbeiten.
Im Rahmen von Kopplungsanalysen zur prädiktiven Diagnostik bei FAP-Familien fand unsere
Arbeitsgruppe schon früher als Zufallsbefund bei vier Familien Hinweise auf das Vorliegen einer
großen submikroskopischen APC-Deletion (Mandl et al. 1996), bei drei weiteren Patienten
bestand eine zytogenetisch sichtbare Deletion. Zur Untersuchung der Häufigkeit von großen
Deletionen war zunächst geplant, die Southern-Hybridisierung einzusetzen und eine halbquantitative Multiplex-PCR zu etablieren. Während der Laufzeit des Forschungsprojekts wurde dann die
MLPA-Methode eingeführt und wenig später von MRC Holland auch ein Kit für das APC-Gen
entwickelt.
Der MLPA-Test zum Nachweis von Deletionen im APC-Gen wurde in unserem Labor etabliert
und anhand der o. g. sieben Patienten mit bereits bekannter Deletion verifiziert. Das Ausmaß der
mittels Kopplungsanalyse detektierten Deletion in drei Familien konnte mittels MLPA näher
charakterisiert werden. Abb. 2.3. zeigt ein Beispiel für ein normales Chromatogramm und ein
Chromatogramm bei einem Patienten mit einer Deletion des ganzen APC-Gens einschließlich der
Promotorregion.
Abb. 2.4 Mittels MLPA charakterisierte Deletionen im
APC-Gen bei 26 FAP-Patienten. Bei 12 Patienten ist das
ganze Gen deletiert, bei 2 Patienten nur die Exons 1-15
(ohne Promotor-Region). Die Pfeile markieren die Hybridisierungsstellen der MLPA-Sonden.
Abb. 2.3. Identifizierung einer Deletion des kompletten
APC-Gens. a) Kontrollprobe, b) FAP-Patient: Die Referenz-Peaks sind rosa unterlegt, alle übrigen Fragmente
sind im Vergleich zu den Referenz-Peaks deletiert.
Anschließend wurden alle 2004 verfügbaren 170 Indexpatienten, bei denen keine Punktmutation
im APC-Gen identifiziert worden war, mittels MLPA untersucht. Hierdurch fand sich bei weiteren
22 Patienten eine Deletion einzelner Exons oder des ganzen Gens einschließlich der PromoterRegion. Insgesamt bestanden so bei 15 % der nicht-verwandten FAP-Patienten (26/174) 14
unterschiedliche submikroskopische Deletionen (Abb. 2.4).
17
Bei einer mittels MLPA festgestellten Deletion eines einzelnen Exons kann es sich um ein falsch
positives Ergebnis handeln, hervorgerufen durch z. B. eine Sequenzvariante in der Hybridisierungssequenz der entsprechenden MLPA-Probe. Derartige Befunde sollten deshalb immer durch
eine Sequenzierung des Exons und eine zweite unabhängige Methode überprüft werden (Wehner
et al. 2005). Bei einem unserer Patienten fand sich eine isolierte Deletion von Exon 14 bei einer
unauffälligen Sequenz des Exons; die Deletion wurde anschließend durch eine Long-Range-PCR
bestätigt, sie passt zu den Segregations- und Haplotypdaten der Familie.
Die Analyse des kolorektalen Phänotyps bei Indexpatienten und betroffenen Verwandten ergab
eine klare und von Größe und Lokalisation der Deletion weitgehend unabhängige Korrelation
dieses Mutationstyps mit einer klassischen FAP: eine Deletion fand sich bei knapp der Hälfte
(48 %) der untersuchten Fälle mit zahlreichen (> 100) frühmanifesten Polypen, aber bei keinem
der Patienten mit einem attenuierten Verlauf. Ähnliche Befunde wurden von anderen Gruppen
publiziert (Bunyan et al. 2004; Michils et al. 2005). Der Nachweis großer Deletionen führte somit
zu einem deutlichen Anstieg der Mutationsdetektionsrate bei der klassischen FAP.
Der bei großen Deletionen dominierende klassische kolorektale Phänotyp stimmt mit dem von
Punktmutationen in vergleichbarer Position erwarteten Krankheitsverlauf überein; die klinischen
Daten beeinflussen deshalb auch die Hypothesenbildung bezüglich des zum Teil immer noch
unverstandenene Pathomechanismus von APC-Mutationen: weder können die phänotypischen
Konsequenzen trunkierender Punktmutationen mit dominant-negativen Mechanismen, noch der
milde Verlauf bei Mutationen am 5´Ende des APC-Gens mit Null-Allelen erklärt werden.
Im Gegensatz hierzu wurde bisher erst eine einzige Duplikation des APC-Gens beschrieben
(McCart et al. 2006). Mittels MLPA fanden wir bei zwei anscheinend nicht verwandten Familien
mit klassischer FAP eine Verdoppelung der Exons 10-11. Anders als bei Deletionen, die mehrere
Exons umfassen, kann die Pathogenität einer Duplikation nicht per se angenommen werden, da
die Vervielfältigung kodierender Bereiche nicht mit einer Funktionsbeeinträchtigung des Proteins
einhergehen muss und die MLPA-Untersuchung keine Rückschlüsse auf die genomische Position
der Duplikation erlaubt. Durch RNA-Analyse konnte die Mutation dann jedoch als korrekt
gespleißte Exon-Abfolge 9–10–11–10–11–12 charakterisiert werden, die zu einem vorzeitigen
Stopp-Codon führt (Kaufmann et al. 2009).
2.1.3
Charakterisierung einer komplexen Mutation im APC-Gen
(Pagenstecher et al., J Mol Diagn 2007)
Auch mit allen heute verfügbaren Methoden lässt sich bei etwa 20 % der Indexpatienten mit einer
klassischen FAP und 50-70 % der Patienten mit einer attenuierten Verlaufsform keine pathogene
Keimbahn-Mutation im APC- oder MUTYH-Gen identifizieren. Neben Fehl- bzw. DifferentialDiagnosen (HNPCC, andere Polyposis-Syndrome), noch unbekannten Genen und pathogenetisch unklaren APC-Varianten tragen hierzu auch kryptische APC-Mutationen bei, die mit den
üblichen Untersuchungsmethoden nicht entdeckt werden bzw. außerhalb der untersuchten Regionen liegen (z. B. in Intron- oder Promoter-Bereichen). Hierauf deuten sowohl einzelne publizierte
Familien mit positiven Kopplungsbefunden in der APC-Region wie auch eine verminderte
allelspezifische RNA- bzw. Protein-Expression des APC-Gens in bis zu einem Drittel der mutationsnegativen Familien hin (Laken et al. 1999; Renkonen et al. 2005).
18
Auch größere genomische Umbauten in der APC-Region stellen eine mögliche Ursache unentdeckter pathogener APC-Mutationen dar. Im Jahr 2006 konnten wir eine bei der MLPA-Untersuchung als Zufallsbefund entdeckte Veränderung des APC-Gens durch zusätzliche molekulargenetische Untersuchungen einschließlich RNA-Analyse als komplexes genomisches Rearrangement charakterisieren:
Bei der Routine-Untersuchung auf große Deletionen mittels MLPA fand sich bei einer Patientin
mit einer attenuierten FAP ein Hinweis auf eine heterozygote Deletion von Exon 4 des APCGens. Um festzustellen, ob es sich hierbei um eine echte Deletion eines einzelnen Exons oder
möglicherweise um eine Punktmutation bzw. genetische Variante im Hybridisierungsbereich der
MLPA-Proben handelte, wurden weitere Untersuchungen angeschlossen:
• Die Sequenzierung von Exon 4 ergab nur die normale Wildtyp-Sequenz.
• Mittels Long-range-PCR (Primer in Exon 3 und in Exon 5 gelegen) fand sich ein Hinweis auf
eine relativ kleine Deletion. Durch weitere Eingrenzung wurde eine Deletion von 604 Basenpaaren (bp) festgestellt, die allerdings nur in Intron 4 des APC-Gens lag und die mittels MLPA
identifizierte Exon-„Deletion“ nicht erklären konnte.
• Der Bruchpunkt für die Intron-Deletion lag genau im Bereich des Rückwärtsprimers für Exon 4.
Sequenzierungen mit einem neuen Rückwärtsprimer für Exon 4 ergaben eine Insertion von
119 bp in Exon 4, welche genau im Bereich der Hybridisierung der MLPA-Sonde für Exon 4
lag und damit die „Deletion“ dieses Exons vortäuschte. Diese Insertion führt bereits im zweiten
Triplett zu einem vorzeitigen Stopp-Codon.
• Die Sequenzierung der cDNA zeigte eine heterozygote Deletion des kompletten vierten Exons.
Die Untersuchungsergebnisse der genomischen DNA und der mRNA beschrieben somit eine
komplexe Mutation (Abb. 2.5), die letztlich zu einem aberranten Spleißen und damit zu einem
Verlust von Exon 4 des APC-Gens führte. Die Mutation wurde stabil vererbt: sie lag bei Polyposis-Patienten aus drei Generationen der Familie vor. Der milde kolorektale Verlauf und das
Fehlen FAP-typischer Netzhautveränderungen (CHRPE) bei der Index-Patientin stimmen mit der
etablierten Genotyp-Phänotyp-Beziehung überein.
Abb. 2.5 Schematische Darstellung des komplexen genomischen Umbaus im
Bereich von Exon 4 des APC-Gens. Die Insertion enthält Teile von Exon 4, Intron 3
und Intron 4 jeweils in entgegengesetzter Richtung.
Komplexe genomische Umbauten entstehen vermutlich durch vielfältige Mechanismen, diese
sind aber häufig rein hypothetisch und lassen sich wie auch in unserem Fall nur schwer nachweisen. Sowohl ungleiches Crossing-over durch Retrotransposon-vermittelte homologe Rekombina19
tion als auch replication slippage werden vermutet, können aber komplexere Rearrangements
nicht immer überzeugend erklären. Ein Alu-vermittelter Mechanismus war in unserem Fall
unwahrscheinlich, da alle Bruchpunkte außerhalb repetitiver Sequenzen lagen. Auffällig waren
allerdings kurze homologe Sequenz-Wiederholungen an den Enden der inserierten Fragmente,
die eventuell die Formation komplexer sekundärer genomischer Strukturen wie Schleifenbildungen begünstigten.
Die Mutation war in der Routine-Diagnostik (exonweise PCR-basierte Untersuchung auf Mutationen) nicht aufgefallen, da die Deletion in Intron 4 der Sequenz des Rückwärtsprimers liegt und
das mutierte Allel daher nicht amplifiziert werden konnte. Auch mittels MLPA wurde die Veränderung nur durch Zufall entdeckt, da die zusätzliche Insertion im Bereich der Hybridisierungssequenz der MLPA-Sonden für Exon 4 liegt. Dieses Beispiel ist ein weiterer Hinweis dafür, dass
bei einem Teil der FAP-Patienten Mutationen im APC-Gen vorliegen dürften, die nur durch den
Einsatz eines erweiterten Methodenspektrums erfasst werden können und damit derzeit meist
wissenschaftlichen Projekten vorbehalten sind.
2.1.4
Funktionelle Untersuchung unklarer Varanten des APC-Gens
(Aretz et al., Hum Mutat 2004; Kaufmann et al., J Mol Diagn 2009)
Die Einschätzung der pathogenen Relevanz einer Keimbahn-Variante ist sowohl für die ursächliche Klärung einer monogen erblichen Krankheit wie auch für die genetische Beratung der Familienangehörigen und insbesondere für die verantwortungsbewusste Durchführung einer prädiktiven
Diagnostik bei asymptomatischen Verwandten einer betroffenen Person entscheidend. Bestimmte Mutationstypen wie Stopp- und Frameshift-Mutationen, große genomische Deletionen oder
Mutationen der hochkonservierten intronischen Spleiß-Sequenzen werden per se als krankheitsverursachend eingestuft, da sie über die vermutete Trunkation eine Verkürzung bzw. einen
Ausfall des entsprechenden Proteins bedingen.
Im Gegensatz dazu ist die funktionelle Bedeutung seltener Basensubstitutionen, die (scheinbar)
zu Missense- oder stummen Mutationen führen, von Varianten in gering konservierten Intronsequenzen und von kleinen in-frame-Deletionen meist unklar. Zwar wurden Kriterien für die zu
vermutende Pathogenität einer Sequenzvariante entwickelt (de novo Mutation, Änderung der
Aminosäure-Polarität, Auftreten in einer evolutionär konservierten Sequenz, Fehlen in normalen
Kontrollpersonen, Ko-Segregation mit dem Phänotyp, LOH im Tumorgewebe) (Cotton and Scriver
1998); diese Parameter erlauben allerdings keine sichere Beurteilung, wie sie für die Anwendung
in der Patientenversorgung zu fordern ist.
Aufgrund des rasch zunehmenden Umfangs der molekulargenetischen Diagnostik wird eine
immer größere Zahl dieser funktionell unklaren Varianten (unclassified variants, UV) in der Literatur bzw. in zentralen und locus-spezifischen Mutationsdatenbanken beschrieben (Übersicht
unter www.hgvs.org). Durch die sich etablierenden Hochdurchsatz-Sequenziertechniken („second
generation sequencing“) wird diese Zahl in naher Zukunft sicher weiter stark ansteigen. Die
Erfassung und funktionelle Klärung von UVs stellt somit eine große wissenschaftliche Herausforderung dar, die inzwischen erkannt wurde und bereits zu ambitionierten internationalen Initiativen
wie dem Human Variome Project (HVP) führte (www.humanvariomeproject.org).
Bisher wurden bei FAP-Patienten nur wenige Missense- und stumme Mutationen im APC-Gen
beschrieben und nur einzelne dieser Varianten funktionell untersucht (HGMD; www.hgmd.org).
20
Aufgrund der großen Zahl uns bekannter FAP-Familien und einer intensiven Rekrutierungsarbeit
gelang es unserer Arbeitsgruppe während der letzten fünf Jahre, die Konsequenzen von 15
verschiedenen seltenen heterozygoten Basensubstitutionen im kodierenden Bereich des APCGens oder in wenig konservierten intronischen Spleißpositionen sowie eine große genomische
Duplikation mittels Transkriptanalyse funktionell zu charakterisieren (Tab. 2.1). Wir verglichen
hierbei die mRNA dieser Patienten mit der von Patienten mit Mutationen in hochkonservierten
Spleißsequenzen. Hierfür mussten neue Blutproben angefordert werden, die in speziellen, RNAStabilisator enthaltenden Röhrchen verschickt wurden.
Abb. 2.6 Schematische Darstellung des APC-Gens. Die Pfeile markieren die Lage der identifizierten scheinbaren
Missense- oder stummen Mutationen in Exon 4, 11, 13, 14 und 15A.
Wir führten 2003 die erste systematische Untersuchung der Konsequenz von Missense- und
stummen Mutationen sowie von Spleißmutationen im APC-Gen auf Transkript-Ebene durch. Bei
12 Patienten fanden wir insgesamt sieben verschiedene seltene Einzelbasen-Substitutionen in
der kodierenden Sequenz, die alle in der Nähe der Exongrenzen lagen (Abb. 2.6). Mittels RTPCR konnte nachgewiesen werden, dass 6 der 7 Basensubstitutionen zum vollständigen Herausspleißen eines Exons führten; der Effekt war mit dem von Mutationen in den hochkonservierten
intronischen AG/GT-Spleißsequenzen vergleichbar (Abb. 2.7). Die Mutationen führen somit nicht
zu der prognostizierten veränderten Aminosäuresequenz, sondern zu einem veränderten Spleißen mit nachfolgender Bildung eines vorzeitigen Stopp-Codons.
b)
c)
Abb. 2.7 Untersuchung der cDNA von Patienten mit verschiedenen Mutationen in Spleißsequenzen und am Ende
von Exon 14 oder am Anfang von Exon 15 des APC-Gens. a) Auftrennung von RT-PCR-Produkten auf Agarosegel. b) Sequenzierung des 205 bp Produkts, in dem Exon 14 deletiert ist. c) In dem normalen Fragment ist nur das
Allel mit der Wildtyp-Sequenz (c.1957A) bzw. nur ein geringfügiger Anteil des mutierten Alleles (c.1956T) enthalten.
21
Die Befunde wichen zum Teil deutlich von dem Spleißverhalten ab, welches von dem auf traditionellen Spleißsequenzen beruhenden Programm BDGP vorhergesagt wurde. Dies lässt sich auf
die intronnahe Position der involvierten Nukleotide zurückführen, die in Bindungsstellen für wichtige exonische Spleißfaktoren (exonic splicing enhancers, ESE) liegen. Durch Veränderung der
Bindungsstellen wird der Spleißvorgang erheblich beeinträchtigt. Auch die Basensubstitutionen
an wenig konservierten intronischen Spleißpositionen führten zum Verlust eines Exons oder zu
aberranten Transkripten mit vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese. Der klinische Verlauf der
Erkrankung bei Patienten mit den in Tab. 2.1 charakterisierten Varianten ist vergleichbar mit dem
von Patienten mit „echten“ Spleißmutationen in den entsprechenden Exons.
Tabelle 2.1
Position
Charakterisierung seltener APC-Varianten durch Transkript-Analyse
Mutation
vorhergesagte
Konsequenz
Einfluß auf normale
Spleißeffizienz*
tatsächlicher Effekt
(RNA)
kolorektaler
Phänotyp
Exon 4
c.423G>T
p.Arg141Ser
nicht erkannt
Deletion Exon 4
attenuiert
Exon 11
c.1548G>A
p.Lys516
1,00 → 0,84
Deletion Exon 11
klassisch
Exon 13
c.1742A>G
p.Lys581Arg
0,92 → 0,78
Deletion Exon 13 (partiell)
attenuiert
Exon 14
c.1956C>T
p.His652
0,91 → 0,90
Deletion Exon 14 (partiell)
klassisch
Exon 14
c.1957A>G
p.Arg653Gly
0,91 → 0,38
Deletion Exon 14
klassisch
Exon 14
c.1957A>C
p.Arg653
0,91 → 0,42
Deletion Exon 14
variabel
Exon 15A
c.1959G>A
p.Arg653
0,81 → 0,72
Kein Effekt
variabel
Intron 3
c.423-5A>G
aberrantes Spleißen
nicht erkannt
Deletion Exon 4
variabel
Intron 4
c.531+5G>C
aberrantes Spleißen
0,98 → 0,25
Deletion Exon 4
attenuiert
Intron 4
c.531+5_531+8
aberrantes Spleißen
delGTAA
0,98 → 0,15
Deletion Exon 4
attenuiert
Intron 4
c.532-8G>A
aberrantes Spleißen
0,45 → <0,01
vorzeitiger Stopp
klassisch
Intron 9
c.1312+3A>G
aberrantes Spleißen
0,94 → 0,40
Deletion Exon 9
attenuiert
Intron 9
c.1312+5G>A
aberrantes Spleißen
0,94 → 0,07
Deletion Exon 9
klassisch
Intron 10
c.1409-2_1409
delAGG
aberrantes Spleißen
Spleißakzeptorstelle
zerstört
Aktivierung von zwei
kryptischen Spleißstellen
attenuiert
Intron 14
c.1958+3A>G
aberrantes Spleißen
0,91 → 0,47
Deletion Exon 14
klassisch
* Die Spleißeffizienz der normalen und der mutierten Sequenzen wurde mit dem Programm BDGP geschätzt
Die Ergebnisse unserer Transkript-Analyse legen in Zusammenschau mit anderen publizierten
Daten (Azzopardi et al. 2008) die Vermutung nahe, dass der überwiegenden Mehrheit seltener,
bei Polyposis-Patienten identifizierter Basensubstitutionen im APC-Gen pathogene Relevanz
zukommt. Auch wenn eine Erfassungs- und Publikations-Auslese nicht vollständig auszuschließen ist, stimmt diese Tendenz mit kürzlich vorgestellten Analysen systematischer Daten zur
genetischen Variation des Menschen überein (Kryukov et al. 2007; Boyko et al. 2008). Der
Nachweis von auch auf Transkriptebene stummen Varianten sowie die Diskrepanzen zu der Insilico-Analyse verdeutlichen allerdings die Notwendigkeit einer funktionellen Klärung jeder
unklaren Variante, insbesondere wenn diese für eine prädiktive Diagnostik herangezogen werden
soll.
22
2.1.5
Ausmaß und Bedeutung von Mutations-Mosaiken bei der FAP
(Aretz et al., Hum Mutat 2007)
Die Identifizierung und Beurteilung somatischer Mutations-Mosaike (mit und ohne Beteiligung der
Keimbahn) stellt eine Herausforderung sowohl für die genetische wie klinische Diagnostik dar.
Somatische Mosaike wurden insbesondere bei sporadischen Fällen monogener Krankheiten mit
einer hohen Neumutationsrate wie der Hämophilie, der Duchenne´schen Muskeldystrohphie und
auch verschiedenen hereditären Tumordispositions-Syndromen in quantitativ relevantem Ausmaß
beschrieben, was ihre praktische Bedeutung zunehmend erkennen läßt (Hall 1988; Youssoufian
and Pyeritz 2002; Erickson 2003). Obwohl die geschätzte Neumutationsrate des APC-Gens mit
5-9 x 10-6 Mutationen pro Gamet pro Generation das häufige Vorkommen postzygotischer
de novo-Mutationen wahrscheinlich macht, wurden bei der FAP bis 2007 keine diesbezüglichen
systematischen Untersuchungen publiziert.
Bei 8 unserer insgesamt 1248 auf APC-Mutationen untersuchten, nicht-verwandten FAP-Patienten (Stand Oktober 2006) deuteten die Befunde der Screening-Untersuchungen (DHPLC, PTT)
auf das Vorliegen einer Mutation in Form eines somatischen Mosaiks. Die Sequenzierung der
entsprechenden APC-Fragmente zeigte sehr geringe Anteile eines mutierten Allels, die ohne die
Screeningbefunde leicht übersehen worden wären. Vermutete APC-Mosaike wurden deshalb mit
verschiedenen Methoden gezielt untersucht.
Hierfür nahmen wir zu allen Patienten mit Verdacht auf ein Mosaik Kontakt auf und forderten eine
zweite EDTA-Blutprobe an. Von 6 Patienten konnte paraffineingebettetes kolorektales
Adenomgewebe, von 3 dieser Patienten auch normale Kolon-Schleimhaut und von einem
weiteren Patienten Mundschleimhaut akquiriert werden. Alle 8 Mutationen konnten in der zweiten
Blutprobe bestätigt werden. Eine ungleiche Allel-Amplifikation aufgrund z. B. einer Variante in der
Primer-Sequenz konnte durch Sequenzierung eines zweiten PCR-Produktes mit anderen Primern
ausgeschlossen werden. Darüber hinaus ließen sich die Mutationen bei allen untersuchten
Patienten in der DNA aus Adenomen und normaler Kolonschleimhaut nachweisen. Bei einem
Patienten fanden wir das schwache Mosaik auch in der Wangenschleimhaut, erwartungsgemäß
aber nicht bei beiden Eltern. Bei zwei Patienten waren früher bereits zusätzliche Methoden (allelspezifische PCR, Untersuchung neuer Restriktionsstellen) zur Verifizierung der Mutationsbefunde
eingesetzt worden.
Wir etablierten in unserem Labor die SNaPshot-Methode (ABI Prism® SNaPshotTM Multiplex Kit,
Applied Biosystems), welche herkömmlichen Verfahren zur Quantifizierung des Mosaikgrades
wie der zeitaufwändigen und teuren Sequenzierung großer Mengen von klonierten PCRProdukten überlegen ist. Es handelt sich um eine Primer-Extensions-Technik, bei der die Menge
der mutierten und der Wildtyp-DNA sowohl graphisch in einem Chromatogramm als auch über
Höhe oder Fläche der Amplituden berechnet werden kann. Der Grad des Mosaiks wurde als
Prozentsatz mutierter DNA eines Allels ausgedrückt.
Um die Präzision der SNaPshot-Methode zu überprüfen, wurde ein Verdünnungs-Experiment mit
absteigenden Konzentrationen von Leukozyten-DNA mit einer Vollmutation durchgeführt. Die
berechneten Werte des mutierten Allels (T) stimmten bis zu einer Menge von 5 % der GesamtDNA gut mit den erwarteten Werten überein und waren bis zum 1 %-Niveau noch in den
Chromatogrammen sichtbar. Bei der SNaPshot-Quantifizierung der somatischen Mosaike in Blut
und Adenomgewebe im Vergleich zu Normalkontrollen und der gleichen Mutation als NichtMosaik wurde insgesamt eine gute Übereinstimmung der Amplitudenhöhe mit dem
Sequenziermuster festgestellt (Abb. 2.8).
23
Abb. 2.9 SNaPshot-Chromatogramme von DNAProben verschiedener Gewebe bei drei der acht
Patienten mit einem somatischen APC-Mosaik. Die
Prozentzahlen in den Diagrammen geben den Grad
des Mosaiks bezogen auf das mutierte Allel an.
Abb. 2.8 SNaPshot- und Sequenzier-Ergebnisse der
DNA aus Leukozyten und Adenomgewebe von Patient
1374, verglichen mit einer normalen Kontrolle und mit
einem Partienten, der die gleiche APC-Mutation als
Vollmutation trägt. Die eingerahmten Zahlen entsprechen den Flächen unter den Peaks.
Die Quantifizierung der Mutationen in verschiedenen Geweben mittels SNaPshot-Analyse ergab
eine große Variation des Mosaikgrades in Leukozyten-DNA zwischen den 8 Patienten (6-75 %)
und als konsistenten Befund einen deutlich höheren Anteil der mutierten DNA in Adenomen
verglichen mit dem Anteil in Blut und normaler Kolonschleimhaut (Abb. 2.9). Bei Patient 575 ließ
sich kein mutiertes Allel in normaler Kolonschleimhaut nachweisen. Es bestand keine Korrelation
zwischen dem Mosaikgrad in Blut und anderen Geweben.
Die Mehrheit der 8 Patienten hatte einen attenuierten (4/8) oder atypischen (2/8) kolorektalen
Phänotyp (Definitionen siehe Kapitel 1.2.1) (Tab. 2.2), obwohl aufgrund der Lage der Mutation im
APC-Gen ein klassischer oder sogar schwerer Verlauf zu erwarten gewesen wäre. Bei einigen
Patienten war auch der obere Gastrointestinaltrakt involviert; extraintestinale Manifestationen
wurden bei keinem der Patienten berichtet. Erwartungsgemäß bestand keine Korrelation
zwischen dem Mosaikgrad in Leukozyten-DNA und der Schwere der kolorektalen Polyposis.
Tabelle 2.2 Klinische Befunde der 8 Polyposis-Patienten mit einem somatischen APC-Mosaik
Mutation
(Exon)
Alter bei
Diagnose
kolorektale
Adenome
CRC bei
Diagnose
Duodenale
Adenome
Phänotyp
6
8
15A
15E
15F
15G
15G
15H
50
37
26
49
37
41
14
21
>50
<100
50
<100
>100
viele
>100
>200
nein
nein
nein
nein
nein
nein
nein
ja
nein
multiple
4
multiple
nein
1
nein
unbekannt
attenuiert
attenuiert
attenuiert
attenuiert
atypisch
atypisch
klassisch
klassisch
Alle 8 Fälle mit nachgewiesenem somatischem APC-Mosaik gehörten zu den 75 PolyposisPatienten mit nachgewiesener oder vermuteter Neumutation. Die Häufigkeit eines APC-Mosaiks
bei unseren FAP-Neumutationen liegt somit bei etwa 11 %. Ähnliche Zahlen wurden bei anderen
24
monogen erblichen Erkrankungen und kürzlich auch von einer niederländischen Arbeitsgruppe
bei der FAP berichtet (Hes et al. 2008).
Es handelt sich um die erste publizierte systematische Untersuchung zur Häufigkeit und zum
Phänotyp von somatischen APC-Mosaiken bei Polyposis-Patienten. Zusammenfassend konnte
unsere Studie zeigen, dass somatische APC-Mosaike eine für die Routinediagnostik relevante
Gruppe darstellen. Ein niedriggradiges somatisches Mosaik kann leicht übersehen oder falsch
interpretiert werden. Auffällige Ergebnisse sollten immer kritisch überprüft bzw. mit anderen
Methoden bestätigt werden. Screening-Methoden wie DHPLC und PTT sind sensitiver in der
Identifizierung von somatischen Mosaiken als die direkte Sequenzierung. Die SNaPshot-Analyse
eignet sich als günstiges, einfaches und zuverlässiges Verfahren zur Bestätigung und
Quantifizierung fraglicher Mosaike. Bei einigen mutationsnegativen Patienten könnte ein auf das
Entoderm beschränktes und deshalb durch eine Blutuntersuchung nicht zu entdeckendes Mosaik
vorliegen.
Somatische Mosaike tragen zur phänotypischen Variabilität der FAP bei und erklären insbesondere einen Teil unerwartet milder Verläufe. Die Identifizierung eines somatischen Mosaiks hat
Bedeutung für die klinische Betreuung der Familien: Kinder eines Mosaik-Patienten können einen
schwereren klinischen Verlauf mit früherer Manifestation entwickeln, was Einfluss auf den Beginn
der Vorsorge-Untersuchungen hat; andererseits sollten die Eltern eines Patienten mit vermeintlicher Neumutation klinisch gründlich untersucht werden, da ein milder Phänotyp aufgrund eines
somatischen Mosaiks andernfalls möglicherweise übersehen wird.
2.1.6
APC-assoziertes Hepatoblastom
(Aretz et al., Pediatr Blood Cancer 2006)
Neben der Dickdarmspiegelung sind die endoskopische Überwachung des oberen Magendarmtraktes und die adäquate Behandlung von Desmoiden für die Prognose von FAP-Patienten
entscheidend und unumstritten. Bei den FAP-assoziierten extraintestinalen Malignomen wie
Hepatoblastom, Medulloblastom und Schilddrüsenkarzinom werden Früherkennungs-Untersuchungen aufgrund der geringen Inzidenz (1-2%) hingegen kontrovers diskutiert.
Das Hepatoblastom (HB) ist ein frühmanifester bösartiger embryonaler Lebertumor, der bei
Kindern von FAP-Patienten wesentlich häufiger als in der Allgemeinbevölkerung auftritt und trotz
einer inzwischen deutlich verbesserten Therapie immer noch von etwa einem Viertel der
Patienten nicht überlebt wird. Da das Thema in der Literatur nicht adäquat diskutiert wurde,
nahmen wir die Kenntnis von mehreren fortgeschrittenen HB-Fällen im eigenen Patientenkollektiv
zum Anlass, unsere diesbezüglichen Daten zusammenzufassen und die wenigen Publikationen
um eine abwägende ausführliche Gegenüberstellung der Vor- und Nachteile eines frühkindlichen
HB-Screenings zu ergänzen, wie sie sich paradigmatisch auch beim Screening-Programm für
embryonale Tumoren des Beckwith-Wiedemann-Syndroms (BWS) zeigen.
In Anlehnung an die bisherigen Erfahrungen mit dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom kann eine
effiziente Früherkennung des HB nur durch unmittelbar postnatal beginnende regelmäßige Ultraschall-Untersuchungen in Kombination mit einem Monitoring der α-Fetoprotein-Spiegel in etwa 23-monatigen Abständen erwartet werden. Den Vorteilen einer früheren Diagnose mit potentiell
verbesserter Prognose und geringeren therapiebedingten Nebenwirkungen stehen allerdings die
Gefahren der Überdiagnose, der psychischen und körperlichen Belastung durch häufige bildgebende und invasive Untersuchungen im Kleinkindesalter, die größtenteils unnötige Verunsiche25
rung der Eltern und die Vorverlegung der prädiktiven genetischen Testung in das Neugeborenenalter gegenüber.
Durch die Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Professor Torsten Pietsch, dem Direktor
des Instituts für Neuropathologie des Universitätsklinikums Bonn, gelang es uns, die initiale
Fragestellung um einen interessanten Aspekt zu ergänzen:
Die Arbeitsgruppe hat Zugriff auf ein großes Kollektiv sporadischer HB-Fälle. In gesundem
Gewebe (Blut, normales Lebergewebe) von 50 klinisch und familienanamnestisch ausreichend
charakterisierten Fällen führten wir ein komplettes Mutations-Screening im APC-Gen durch und
konnten bei 5 Patienten (10 %) eine pathogene Keimbahnmutation identifizieren. Diese erstmals
systematisch an einer großen Fallzahl erhobenen Daten ließen vermuten, dass es sich bei einem
nennenswerten Anteil scheinbar sporadischer HB tatsächlich um die frühe Manifestation einer
FAP auf dem Boden einer APC-Neumutation handelt. Unerkannt werden diese Patienten nach
erfolgreich therapiertem HB später wahrscheinlich erst im symptomatischen Stadium der FAP mit
fortgeschrittener Polyposis oder sogar einem manifestem CRC auffällig. Ein Routine-APCScreening jedes sporadischen HB-Falles könnte hier Abhilfe schaffen; durch die bei unseren
FAP-assoziierten HB festgestellte sehr hohe Mutationsdetektionsrate sollten hierdurch die
meisten hereditären Fälle sicher identifiziert werden, um sie einer späteren gastrointestinalen
Vorsorge zuzuführen. Eine neulich publizierte Studie an 29 ebenfalls sporadischen HB konnte
unsere Ergebnisse nicht bestätigen (Harvey et al. 2008), allerdings war der Unterschied bei der
Größe der untersuchten Kollektive nicht signifikant. Die klinische Relevanz von APC-Keimbahnmutationen bei sporadischen HB ist somit bisher nicht abschließend geklärt, aufgrund der recht
hohen APC-Neumutationsrate muss aber unter sporadischen HB ein gewisser Anteil von APCassoziierten Tumoren erwartet werden.
2.2
MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP)
Inzidenz, Mutationsspektrum und kolorektaler Phänotyp der MAP wurden in den vergangenen
sieben Jahren in verschiedenen Patientengruppen (FAP, HNPCC, sporadisches CRC)
umfassend charakterisiert (Sampson et al. 2003; Fleischmann et al. 2004; Gismondi et al. 2004;
Isidro et al. 2004; Venesio et al. 2004; Wang et al. 2004; Eliason et al. 2005; Nielsen et al. 2005;
Kanter-Smoler et al. 2006). Hierzu leistete auch unsere Untersuchung am international bisher
größten Kollektiv einen wichtigen Beitrag (Aretz et al. 2006b, siehe Kapitel 2.2.1).
Einige klinisch relevante Aspekte des Tumordispositions-Syndroms wurden bis zum Jahr 2009
jedoch nicht hinreichend untersucht bzw. nicht abschließend geklärt: So existierten keine
systematischen Untersuchungen zu Spektrum und Inzidenz extrakolonischer Tumoren bei MAPPatienten und zum Darmkrebsrisiko von heterozygoten MUTYH-Anlageträgern („Heterozygotenrisiko“). Auch die biologischen Eigenschaften des MAP-assoziierten CRC sind erst ansatzweise
erforscht.
Die verlässliche Beantwortung der oben genannten Fragen ist nur durch Untersuchung vieler
MAP-Patienten bzw. heterozygoter Anlageträger möglich. Zur Gewinnung belastbarer Daten
wurde deshalb eine Kooperation mit den Arbeitsgruppen von Professor Julian Sampson (Institute
of Medical Genetics, Cardiff, England) und Dr. Frederik Hes (Center for Human and Clinical
Genetics, Leiden, Niederlande) initiiert, die zu den führenden Gruppen auf diesem Gebiet
gehören und ebenfalls Zugriff auf größere Patientengruppen haben.
26
Das europäische Kooperationsprojekt sollte folgende Fragen beantworten:
ƒ
Extrakolonisches Tumorspektrum bei der MAP
(Federführung Aretz, Bonn)
ƒ
CRC-Risiko bei heterozygoten MUTYH-Mutationsträgern
(Federführung Sampson, Cardiff)
ƒ
Überleben von Patienten nach einem MUTYH-assoziierten CRC
(Federführung Hes, Leiden)
ƒ
Genotyp-Phänotyp-Beziehungen
Entsprechend dem gemeinsam erarbeiteten Studienprotokoll wurden nach Erstellung entsprechender Formulare alle den drei Zentren bekannten MAP-Indexpatienten und betroffenen
Geschwister direkt oder über die einsendenden Ärzte kontaktiert. Die möglichst umfassende
Rekrutierung erforderte zeitaufwändige Erinnerungsschreiben und das Recherchieren aktueller
Adressen. Nach Erhalt des schriftlichen Einverständnisses wurden alle teilnehmenden Patienten
aus Deutschland und ein großer Teil der niederländischen Patienten in einem längeren persönlichen Telefongespräch anhand eines strukturierten Fragebogens ausführlich zu Krankheitsverlauf, möglichen extrakolonischen Tumormanifestationen und dem Gesundheitszustand der
Eltern befragt. Die relevanten klinischen Befunde wurden anschließend bei den betreuenden
Ärzten bzw. Krankenhäusern und Pathologischen Instituten angefordert und ausgewertet. Bedingt
durch unterschiedliche Gesundheitssysteme und unterschiedliche Zugriffsmöglichkeiten auf Patientendaten bzw. Möglichkeiten der direkten Kontaktaufnahme unterschied sich das Vorgehen
zwischen den Zentren in einigen Punkten.
Die Datensammlung wurde im Frühjahr 2008 abgeschlossen. In die Studie konnten insgesamt
276 MAP-Fälle (biallele Mutationsträger) und 350 Eltern (obligat heterozygote Anlageträger)
aufgenommen werden. Es handelt sich damit um die mit Abstand größte bisher untersuchte
Gruppe von Patienten und heterozygoten Anlageträgern; das Bonner Teilkollektiv ist dabei das
hinsichtlich Umfang (98 MAP-Patienten) und klinischen Befunden qualitativ hochwertigste. Der
Nachweis einer signifikanten Genotyp-Phänotyp-Korrelation bezüglich der Erstmanifestation der
Erkrankung und die Ergebnisse des Heterozygotenrisikos wurden inzwischen publiziert (Nielsen
et al. 2009, Jones et al. 2009; siehe Einleitung). Auch die Auswertung der Inzidenz extrakolonischer Tumore konnte kürzlich hochrangig veröffentlicht werden (Vogt et al. 2009; siehe Kapitel
2.2.2).
2.2.1
Mutationsspektrum und kolorektaler Phänotyp der MAP
(Aretz et al.; Int J Cancer 2006)
Nach der 2002 erfolgten Identifizierung der MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP) als eigenständiges, autosomal-rezessives Krankheitsbild (Al-Tassan et al. 2002) lag es nahe, an unserem
großen Polyposiskollektiv retrospektiv eine systematische Untersuchung durchzuführen, um die
Häufigkeit der MAP bei Patienten mit adenomatöser Polyposis, das Mutationsspektrum und den
dominierenden Phänotyp zu ermitteln. Hierzu etablierten wir die molekulargenetische Diagnostik
des MUTYH-Gens mittels direkter Sequenzierung aller 16 Exons in unserem Labor.
Bis zum Zeitpunkt der Auswertung der Daten für die oben genannte Publikation (Oktober 2005)
konnten wir 660 von insgesamt 1170 nicht verwandten FAP-Indexpatienten komplett mittels PTT
und DHPLC auf Punktmutationen im APC-Gen und mittels MLPA hinsichtlich großer genomischer
Deletionen/Duplikationen im APC-Gen untersuchen. Eine pathogene APC-Keimbahnmutation ließ
27
sich bei 331 der 660 Patienten nachweisen. Die Mutationsdetektionsrate im APC-Gen betrug
somit im Gesamtkollektiv 50 %, zeigte aber erwartungsgemäß große Unterschiede hinsichtlich
des kolorektalen Phänotyps: bei Patienten mit klassischer FAP betrug sie 83 %, bei der attenuierten FAP nur 22 % (Abb. 2.10).
Abb. 2.10 Mutationsdetektionsrate in den Genen APC und MUTYH bei 660 nicht
verwandten Polyposis-Patienten bezogen auf den kolorektalen Phänotyp.
Um die Häufigkeit der MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP) zu ermitteln, wurden die verbliebenen unselektierten 329 APC-mutationsnegativen FAP-Indexpatienten anschließend auf MUTYHKeimbahnmutationen untersucht. Die wesentlichen Befunde lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Bei 17 % (55/329) der nicht nach Familienanamnese oder Phänotyp selektierten Indexpatienten
fanden sich biallele MUTYH-Mutationen. Das Mutationsspektrum in unserem Kollektiv war breit
und umfasste 21 verschiedene MUTYH-Mutationen, sieben davon wurden von uns erstmalig
beschrieben.
Es ließ sich eine klare Abhängigkeit der Mutationsdetektionsrate vom kolorektalen Phänotyp
nachweisen: eine MAP bestand bei 18 % (40/227) der attenuierten Fälle und bei 27 % (7/26) der
atypischen Fälle, aber bei keinem der 41 Patienten mit eindeutig klassischer Polyposis (frühmanifest, >100 Adenome). Durch ein MUTYH-Mutations-Screening wird die Mutationsdetektionsrate
bei Patienten mit attenuierter oder atypischer adenomatöser Polyposis somit deutlich gesteigert
(Abb. 2.10).
Monoallele MUTYH-Mutationen mit zu vermutender pathogener Relevanz wurden nur bei 0,9 %
(3/329) der Patienten identifiziert. Die Heterozygoten-Frequenz bei unseren Polyposis-Patienten
entsprach somit der in der Allgemeinbevölkerung. Dies unterstützt die Hypothese, dass heterozygote MUTYH-Mutationen keinen nennenswerten Krankheitswert haben und lässt außerdem
vermuten, dass die Mutationsdetektionsrate bei der kompletten Sequenzierung des Gens sehr
hoch ist. Große Deletionen scheinen demnach im Gegensatz zum Tumorsuppressor-Gen APC
keine nennenswerte Rolle zu spielen.
Bei 48 % der MAP-Patienten fanden sich die Mutationen Y165C und G382D in homozygotem
oder compound-heterozygotem Zustand, bei 31 % der Patienten mit bialleler Mutation bestand
hingegen nur eine und bei 20 % keine der beiden in der kaukasischen Bevölkerung häufigen
Mutationen. Durch ein Mutations-Screening, das sich primär auf den Nachweis von Y165C und
G382D beschränkt und eine komplette Sequenzierung des MUTYH-Gens nur beim Vorliegen
28
einer der beiden häufigen Mutationen in heterozygotem Zustand anschließt, wäre somit bei etwa
1/5 der Patienten keine MAP diagnostiziert worden.
Zur Beschreibung des Mutationsspektrums wurden noch 9 weitere selektierte Indexpatienten und
zur klinischen Charakterisierung der MAP weitere 7 erkrankte Verwandte von Indexpatienten in
die Analyse einschlossen (insgesamt dann 71 Patienten). Fast alle Patienten zeigten einen attenuierten (80 %) oder atypischen (18 %) kolorektalen Phänotyp (Abb. 2.10).
Der Phänotyp der Patienten ist in Tab. 2.3 zusammengefasst. Aufgrund des häufig sporadischen
Auftretens wurde die Diagnose bei der überwiegenden Mehrheit unserer Patienten in symptomatischem Zustand gestellt. Die hohe Inzidenz des CRC bei Diagnose ist vergleichbar der in
symptomatischem Stadium diagnostizierten APC-assoziierten FAP.
Tabelle 2.3 Phänotyp von 64 MAP-Indexpatienten und 7 betroffenen Verwandten
Phänotyp
Häufigkeit
bei Diagnose symptomatisch
87 %
kolorektaler Phänotyp
attenuiert oder atypisch
mittleres Alter bei Diagnose in Jahren (Spannbreite)
45 (24 – 72)
kolorektale Adenomzahl
20 bis mehrere Hundert
proximale Adenom-Verteilung
40 %
CRC bei Diagnose
50 %
jüngstes Alter bei Diagnose eines CRC (Jahre)
29
fortgeschrittenes CRC-Stadium (T3, T4)
81 %
duodenale Adenome
24 %
extraintestinale Manifestation
6%
Familienanamnese
31 x aut-rez, 7 x pseudo-dominant
Bezogen auf die Anzahl kolorektaler Adenome (15-100 versus ≥100) ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Inzidenz bialleler Mutationen (Tab. 2.4). Bei Patienten mit weniger als
15 Adenomen traten hingegen in Übereinstimmung mit der Literatur keine biallelen Mutationen
auf. Auffällig ist, dass auch bei Patienten mit ≥100 Adenomen ein deutlich fortgeschrittenes Alter
bei Diagnosestellung bestand. Auf der Basis dieser Daten sollte deshalb die häufig publizierte
hohe Inzidenz klassischer bzw. typischer Verläufe bei MAP-Patienten, der meist lediglich die
Polypenzahl (≥100) als klassifizierendes Kriterium zugrunde liegt, revidiert werden: wie bei der
attenuierten FAP findet sich bei MAP-Patienten mit einer hohen Adenomzahl ein im Vergleich zur
klassischen FAP deutlich späteres Alter bei Diagnose und eine häufig proximal betonte Adenomverteilung. Das charakteristischste Zeichen der MAP scheint somit der eher spät einsetzende
Krankheitsverlauf und weniger die Zahl kolorektaler Adenome zu sein.
Tabelle 2.4 Häufigkeit bialleler MUTYH-Mutationen bezogen auf die Anzahl kolorektaler Adenome bei 329 nicht
verwandten Patienten
Polypenzahl
1-15
>15-100
untersuchte Patienten
Zahl der
mittleres Alter bei Diagnose
Patienten
(Jahre)
30
46 (17-66)
85
45 (5-76)
55
>100
multiple
75
unbekannt
84
45 (11-71)
identifizierte MAP-Patienten
Zahl der
mittleres Alter bei
Patienten
Diagnose (Jahre)
0
43 (30-60)
17 (20 %)
50 (35-68)
44 (12-65)
8 (15 %)
13 (17 %)
43 (14-55)
17 (20 %)
48 (39-55)
29
45 (24-63)
Das Erkrankungsrisiko der Kinder von MAP-Patienten ist im Gegensatz zur FAP gering (etwa 0,51 %), soweit keine konsanguinen Partnerschaften bestehen. Intensivierte Früherkennungs-Untersuchungen sollten deshalb bei klinisch Betroffenen, asymptomatischen biallelen Mutationsträgern
und bei Geschwistern von Indexpatienten, die sich nicht prädiktiv testen lassen wollen, durchgeführt werden. Auf der Basis unserer Daten können sich Beginn und Umfang der Vorsorge
sowie der Zeitpunkt einer prädiktiven Testung an der attenuierten FAP orientieren.
Zusammenfassend leistete unsere molekulargenetische und klinische Untersuchung am größten
publizierten MAP-Kollektiv einen Beitrag sowohl zur Klärung der Inzidenz bialleler MUTYH-Mutationsträger bei verschiedenen kolorektalen Phänotypen, des Mutationsspektrums und der Relevanz heterozygoter MUTYH-Mutationen, wie auch zur detaillierten Beschreibung der klinischen
Ausprägung und den daraus resultierenden Früherkennungs-Empfehlungen.
2.2.2
Extrakolonisches Tumorspektrum bei MAP-Patienten
(Vogt et al., Gastroenterology 2009)
Die Kenntnis des extrakolonischen Tumorspektrums der MAP ist wichtig, um adäquate Vorsorgeempfehlungen für MAP-Patienten zu erarbeiten und die Kenntnisse der Funktion des MUTYHProteins zu erweitern. Die Fragestellung wurde als Teilprojekt der oben erwähnten europäischen
Kooperation unter Federführung des Bonner Zentrums an dem gemeinsam rekrutierten Patientenkollektiv bearbeitet. Die Auswertung der Daten bezüglich des Spektrums und der Häufigkeit
extrakolonischer Tumoren bei 276 MAP-Patienten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für
Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie (IMISE) der Universität Leipzig. Hierfür
wurden die kumulativen Lebenszeitrisiken im Alter von 75 Jahren für die mehr als einmal im Patienten-Kollektiv gefundenen Malignome berechnet; im Vergleich mit der altersspezifischen
Tumorinzidenz der Allgemeinbevölkerung (Saarländisches Krebsregister) wurden außerdem die
standardisierten Inzidenz-Ratios (SIR) bestimmt (Tab. 2.5). Die Auswertung der Daten führte zu
den folgenden Ergebnissen:
Die Beteiligung des oberen Gastrointestinaltraktes ist bei der MAP hinsichtlich Häufigkeit und
Konsequenzen klinisch relevant: 17 % der Patienten entwickelten duodenale Adenome, 12 %
eine Magenpolyposis. Ähnlich wie bei der FAP ist das relative Risiko für Duodenalkarzinome
deutlich erhöht (SIR 130; 95%CI 16-470). Auch wenn das kumulative Lebenszeitrisiko mit 3,6 %
vergleichsweise gering ist, stellen Duodenalkarzinome eine prognostisch ungünstige Komplikation dar, was auch durch die Publikation weiterer Kasuisten unterstrichen wird. Deshalb werden
präventive Gastroduodenoskopien in einem Umfang wie bei der FAP empfohlen.
Hinsichtlich der extraintestinalen Tumoren ergibt sich ein vielschichtigeres Bild. Bei 13 % der
Patienten fand sich mindestens ein extraintestinales Karzinom. Das Risiko für die Entwicklung
eines extraintestinalen Karzinoms ist im Vergleich zur alterstandardisierten Normalbevölkerung
fast verdoppelt (SIR 1,8), das Lebenszeitrisiko beträgt 40%. Allerdings handelt es sich – passend
zum kolorektalen Phänotyp und zum Pathomechanismus – überwiegend um spätmanifeste Malignome. Das breite Tumorspektrum und die meist niedrige Inzidenz jeder einzelnen Entität sprechen eher für zufällige Ereignisse auf dem Boden der bestehenden genetischen Disposition, ein
klar dominierender extraintestinaler Tumor ließ sich nicht nachweisen.
Eine leichte bis moderate, aber signifikante relative Risikoerhöhung fand sich für Haut- und
Blasenkrebs sowie für Eierstockkrebs und für Brustkrebs, sofern nicht die Zahl der von Brustkrebs betroffenen Frauen, sondern die Zahl unabhängig aufgetretener Primärkarzinome berück30
sichtigt wurde. Während ein erhöhtes Risiko für Blasen- und Hautkrebs bisher bei der MAP nicht
berichtet wurde, gab es bereits Hinweise für ein erhöhtes Brustkrebsrisiko (Nielsen et al. 2005).
Drei Ovarial- und zwei Endometriumkarzinome im Kollektiv sind auffällig. Der Befund stimmt mit
Ergebnissen einer systematischen MUTYH-Suche bei Endometriumkarzinomen (Barnetson et al.
2007) und mehreren kasuistischen Berichten überein und spricht zusammen mit den Brustkrebsfällen für eine geringe, aber wahrnehmbare Erhöhung gynäkologischer Malignome; allerdings
hatte die Studie nicht genug statistische Power, um die Relevanz aller dieser Tumoren eindeutig
zu klären (Tab. 2.5).
Tabelle 2.5 Inzidenz extrakolonischer Karzinome, die mindestens bei zwei der 276 MAP-Patienten (118 weiblich, 158
männlich) aufgetreten sind.
Lokalisation des Karzinoms
n
SIR (95%CI)
Obs%-Risiko
75 J (95%CI)
Alter bei Diagnose b)
alle extraintestinalen Malignome a)
45
1,9 (1,4 – 2,5)
38 (23 – 52)
54 (27 – 78)
Ösophagus
2
5,5 (0,7 – 19,9)
2 (0 – 4)
53 (46, 59)
Magen
3
4,2 (0,9 – 12,4)
1 (0 – 3)
38 (17 - 48)
Duodenum
2
130,1 (15,8 – 470,0)
4 (0 – 9)
61 (56, 65)
Harnblase
4
7,2 (2,0 – 18,5)
6 (0 – 12)
61 (45 – 67
13
2,8 (1,5 – 4,8)
22 (7 – 37)
58 (30 – 71)
2
0,7 (0,1 – 2,3)
3 (0 – 9)
60 (51, 69)
8
11 e)
2,1 (0,9 – 4,2)
3,0 (1,5 – 5,4)
26 (0 – 51)
..……….
55 (45 – 78)
3 f)
5,7 (1,2 – 16,7)
10 (0 – 22)
51 (45, 56)
2
4,7 (0,6 – 16,9)
3 (0-7)
51 (47, 54)
Haut
c)
Lunge
Mamma d)
Ovar d)
Endometrium
d)
a)
hier wurden alle bei den 276 Patienten dokumentierten extraintestinalen Malignome berücksichtigt; b) Medianes Alter
c)
d)
e)
in Jahren (Spanne); Melanome, Spinaliome, Basaliome; Daten bezogen auf die 118 MAP-Patientinnen; bezogen
f)
auf die Zahl an einem Mammakarzinom erkrankter Frauen (n = 8) bzw. die Zahl der Mammakarzinome (n = 11); von
einem Patienten war das Diagnosealter des Ovarialkarzinoms nicht bekannt; zur Berechnung wurde bei diesem Fall
das mittlere Erkrankungsalter der weiblichen Allgemeinbevölkerung (67 Jahre) verwendet. SIR = standardisierte
Inzidenz-Ratio; J = Jahre; CI = Konfidenz-Intervall.
Hinweise für eine Häufung typischer FAP-assoziierter extraintestinaler gutartiger Tumoren
(Desmoide, Osteome, CHRPE) fanden sich nicht. Als Bestätigung einiger kasuistischer Berichte
beobachteten wir jedoch eine auffällige Häufung von Talgdrüsentumoren (n = 5), die bisher nur
mit dem Muir-Torre-Syndrom, einer phänotypischen Variante des HNPCC, in Verbindung
gebracht wurden, in der Allgemeinbevölkerung aber nur sehr selten beobachtet werden. Auch
wenn die Zahlen aufgrund fehlender populationsbasierter Daten nicht immer klar zu interpretieren
sind, ergibt sich zusammen mit dem möglicherweise leicht erhöhten Risiko für gynäkologische
Tumoren das Bild einer phänotypischen Überlappung zwischen der MAP und HNPCC, die sich
mit einer ähnlichen bzw. funktionell ineinandergreifenden Funktionsweise der beteiligten Gene
bzw. Reparatur-Mechanismen (Base-excison-repair versus mismatch-repair) erklären lässt.
Hierzu passt auch die aktuelle Beobachtung, dass bei einem Teil der MAP-Patienten mit einem
CRC keine kolorektale Polyposis besteht und sich bei MUTYH-Mutationsträgern signifikant häufiger als beim sporadischen CRC eine niedrige Mikrosatelliten-Instabilität (MSI-L) des Karzinoms
nachweisen lässt (Cleary et al. 2009). Diese Beobachtungen ermöglichen somit einen interessanten neuen Blickpunkt auf die zugrunde liegende Pathophysiologie und könnten zukünftige
Forschungsprojekte anregen.
31
Retrospektive klinische Datenerhebungen und eine Rekrutierung von Patienten aus spezialisierten Zentren heraus können leicht zu verzerrten Ergebnissen führen und müssen deshalb kritisch
gewertet werden. Hierzu zählen die Patientenselektion zugunsten eines schwereren und damit
auffälligeren Krankheitsverlaufs sowie eine unvollständige Datenerhebung, insbesondere bei
verstorbenen Patienten. Hinsichtlich des extraintestinalen Tumorspektrums ist hier grundsätzlich
nicht von einer selektiven Rekrutierung auszugehen, da in der Regel die gastrointestinale
Symptomatik den Grund zur Veranlassung der Diagnostik darstellte. Da sich andererseits aber
fast die Hälfte der extrakolonischen Malignome vor der Diagnose der MAP manifestierten, ist zu
vermuten, dass einige, an solchen Malignomen früh verstorbene Patienten nicht erfasst wurden
und damit eine Unterrepräsentation von Karzinomen mit schlechter Prognose besteht. Die unterschiedliche Frequenz extrakolonischer Tumoren in den drei nationalen Gruppen legt nahe, dass
bestimmte Rekrutierungsstrategien bzw. Einschränkungen der Rekrutierungsmöglichkeiten in
gewissem Ausmaß zur Unterschätzung geführt haben.
Andererseits kann auch vermutet werden, dass das Patientenkollektiv gründlicher als die
Allgemeinbevölkerung untersucht wurde und daraus beim Vergleich mit Inzidenzen aus
populationsbasierten Krebsregistern (in denen bestimmte Tumoren dann unterrepräsentiert
wären) eine gewisse Überschätzung der Riskoerhöhung resultiert. Verzerrungen dieser Art
lassen sich bei dem gewählten Studiendesign nicht gänzlich vermeiden und müssen in Kauf
genommen werden, da eine Klärung der Fragen durch sehr aufwändige und langfristig angelegte
prospektive Studien unrealistisch ist und sich auf absehbare Zeit vermutlich kein größeres und
besser untersuchtes Kollektiv zusammenstellen lässt.
Zusammenfassend sprechen die Daten somit für ein insgesamt leicht bis moderat erhöhtes
extraintestinales Krebsrisiko von MAP-Patienten. Über die gerade publizierten Genotyp-Phänotyp-Beziehungen (Nielsen et al. 2009) hinaus ließen sich keine neuen Korrelationen nachweisen. Aufgrund unserer Ergebnisse (Tumorspektrum, moderate Risikoerhöhung, überwiegend
späte Manifestation) erscheint eine spezifische Erweiterung der bestehenen VorsorgeEmpfehlungen nicht notwendig, insbesondere da Mammakarzinome weitestgehend durch die
bestehenden Früherkennungs-Untersuchungen der weiblichen Allgemeinbevölkerung in
westlichen Ländern erfasst werden sollten und das Screening bezüglich des vergleichbar
häufigen Urothelkarzinoms bei HNPCC mittels Urin-Zytologie wegen der geringen Sensitivität und
hohen Zahl falsch positiver Befunde nicht mehr empfohlen wird. Ratsam erscheint allenfalls eine
allgemein erhöhte Sensibilität von MAP-Patienten gegenüber extraintestinalen Tumoren
einschließlich dermatologischer Veränderungen.
32
3
Ausblick
Trotz großer Fortschritte bei der klinischen und genetischen Charakterisierung hereditärer kolorektaler Tumordispositions-Syndrome in den letzten beiden Jahrzehnten bleiben nach wie vor
etwa 40-50 % aller Fälle einer adenomatösen Polyposis ursächlich ungeklärt. Dieses Faktum
stellt eine Herausforderung und wichtige Aufgabe der humangenetischen Grundlagenforschung
dar, denn die ätiologische Klärung einer kolorektalen Polypsis hat große Bedeutung sowohl für
das pathogenetische Verständnis der Erkrankung und damit für die Möglichkeit der Entwicklung
therapeutischer Ansätze, als auch für die klinische Betreuung der Familien (Wiederholungsrisiko,
prädiktive Diagnostik, genetische Beratung, Vorsorge-Untersuchungen). Schätzungsweise 1520 % der nicht-monogenen CRC-Fälle sind durch disponierende genetische Faktoren mitverursacht (de la Chapelle 2004); die Identifizierung weiterer ursächlich beteiligter Gene bzw. Risikoallele bei kolorektalen Tumorsyndromen hat deshalb auch Modellcharakter für das kausale
Verständnis des CRC im Allgemeinen.
Eine hereditäre Ursache der derzeit noch ungeklärten Polyposis-Formen ist wahrscheinlich, da
sich das Auftreten zahlreicher synchroner und metachroner intestinaler Adenome nicht überzeugend durch exogene Faktoren erklären lässt. Insbesondere bei leerer oder unklarer Familienanamnese könnte es sich um multifaktorielle bzw. poly-/oligogene, aber auch autosomal-rezessive Formen handeln. Eine hohe Zahl von autosomal-dominanten Neumutationen ist bei attenuiertem klinischem Verlauf aus formalgenetischen Überlegungen (niedriger Selektionsdruck)
hingegen wenig wahrscheinlich.
Mutationsanalysen in Kandidatengenen, aber auch LOH-Untersuchungen oder array-basierte
Expressionsstudien an Tumorgewebe führten bisher abgesehen von der Identifizierung der MAP
zu keinem substantiellen wissenschaftlichen Durchbruch. Die Situation ändert sich derzeit allerdings rasch durch die zunehmende Verfügbarkeit und Weiterentwicklung neuer methodischer
Ansätze, insbesondere der Hochdurchsatz-Sequenzierung („next generation sequencing“) und
der hochauflösenden SNP-Array-Analyse. Diese Methoden wurden in den letzten Jahren zur
Durchführung genomweiter Assoziationsstudien fest etabliert (Zanke et al. 2007), sie haben sich
durch den genomweiten Nachweis von Kopienzahl-Veränderungen (copy number variation =
CNV) aber auch als leistungsfähiges Verfahren zur Identifizierung ursächlich relevanter Gene bei
monogenen Krankheitsbildern erwiesen (Peiffer et al. 2006; Rivera et al. 2007, Übersicht bei
Vissers et al. 2005).
Der wissenschaftliche Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe in den nächsten Jahren wird deshalb
in der genetischen Charakterisierung der derzeit ätiologisch unklaren adenomatösen PolyposisFormen liegen. Im Hinblick auf die Charakteristika des Patientenkollektivs erscheint eine genomweite SNP-Array-Analyse als die vielversprechendste und derzeit effektivste Methode zur Identifizierung neuer Risikoallele bzw. Kandidatenregionen. Die materielle Voraussetzung wurde gerade
durch ein von der Deutschen Krebshilfe gefördertes dreijähriges Drittmittelprojekt geschaffen.
Hierfür erfolgt derzeit eine kontinuierlichen Rekrutierung, klinische Charakterisierung und Sammlung von Blut- und Gewebeproben aller uns bekannten Probanden. Der SNP-Array-Untersuchung
geht eine umfassende Suche nach bisher unentdeckten („kryptischen“) APC-Mutationen mittels
kompletter Sequenzierung des Gens, Transkriptanalyse und Untersuchung der allelspezifischen
Expression voraus.
Aufbauend auf der Rekrutierung und umfassenden klinischen Aufarbeitung unseres Kollektivs
werden alle Studienpatienten dann mittels quantitativer SNP-Array-Analyse systematisch auf
33
genomische Keimbahn-Deletionen hin untersucht. Im gleichen Experiment sollen parallel
genomweite Assoziationsdaten erhoben und zusammen mit einem unabhängigen, ähnlich großen
und ethnisch vergleichbaren Patientenkollektiv verglichen werden (Abb. 3.1); hierzu bestehen
Kooperationen mit europäischen Arbeitsgruppen.
Durch dieses Vorgehen wird sowohl einem monogenen, auf bisher unentdeckten (Tumorsuppressor-)Genen beruhenden, wie auch einem polygenen bzw. multifaktoriellen ätiologischen
Modell Rechnung getragen. Es ist zu erwarten, dass die array-basierte Untersuchung große
Datenmengen generieren wird, die anschließend in unterschiedliche Richtungen und mit
verschiedenen methodischen Ansätzen (quantitative PCR, LOH-Untersuchungen, Charakterisierung krankheitsassoziierter Haplotypen) weiter bearbeitet werden können. Zur Dateninterpretation
und Eingrenzung vielversprechender Kandidatenregionen sollen auch die in immer größerer
Menge in zentralen Datenbanken verfügbaren genomweiten Informationen hinsichtlich Expressionsprofilen, Methylierungsmustern sowie Assoziations- und Kopplungsbefunden herangezogen
werden.
Abb. 3.1
Geplante Strategie der Identifizierung ursächlicher Gene bzw.
Risikoallele mittels SNP-Array bei Patienten mit adenomatöser Polyposis ohne
nachweisbare APC- oder MUTYH-Mutation.
Neben der Identifizierung neuer genetischer Dispositionen stellt die funktionelle Klärung seltener
Basensubstitutionen in kodierenden und nicht-kodierenden Bereichen bekannter Gene eine wichtige wissenschaftliche Aufgabe dar, die durch die kontinuierliche Ausweitung der Sequenzierkapazitäten zunehmend an Bedeutung gewinnt. Kürzlich erfolgte Analysen systematisch erhobener genomweiter Daten zur humanen genetischen Variation lassen vermuten, dass ein beträchtlicher Anteil von (de novo aufgetretenen) seltenen Missense-Varianten pathogene Effekte verursacht (Kryukov et al. 2007; Boyko et al. 2008). Entsprechend der rare-variant-Hypothese trägt
eine Häufung seltener und mäßig penetranter Missense-Mutationen in bekannten und noch nicht
identifizierten Genen in ihrer Gesamtheit substantiell auch zur Entstehung multipler Adenome bei
(Fearnhead et al. 2004). Genomweite Sequenzieransätze werden es zukünftig realistisch erscheinen lassen, die postulierte Bedeutung seltener Varianten für die Krankheitsentstehung besser
einzuschätzen, allerdings werden die hierfür benötigten finanziellen und personellen Resourcen
vermutlich beträchtlich sein.
34
4
Zusammenfassung
Ausgehend von der molekulargenetischen Diagnostik und humangenetischen Beratung beschäftigt sich unsere Arbeitsgruppe seit 20 Jahren wissenschaftlich mit gastrointestinalen PolyposisSyndromen. Die hier beschriebenen und in den Jahren 2003 bis 2009 durchgeführten Untersuchungen haben die genetische und phänotypische Charakterisierung von adenomatösen Polyposis-Syndromen zum Gegenstand. Nach den grundlegenden Arbeiten zu Mutationsspektrum
und Genotyp-Phänotyp-Korrelationen der autosomal-dominanten Familiären Adenomatösen
Polyposis (FAP) in den 1990er Jahren wurde mit der MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP) im
Jahre 2002 erstmals eine weitere und autosomal-rezessiv vererbte adenomatöse Polyposis
beschrieben, die oft nur molekulargenetisch von der FAP abgegrenzt werden kann.
Die Verfügbarkeit eines der weltweit größten Polyposiskollektive ermöglichte uns die systematische Untersuchung von Fragestellungen, die an kleinen Patientengruppen nicht zu bearbeiten
sind. Methodisch kamen einerseits Techniken der Routinediagnostik wie die Sequenzierung,
Kopplungsanalyse und das Deletions-Screening mittels MLPA sowie die umfassende Anforderung und Auswertung klinischer Daten zum Einsatz, andererseits wurden bei speziellen Fragen
mit SNaPshot-Analyse, Transkriptanalyse und LOH-Untersuchungen auch aufwändigere Verfahren angewendet.
Wir konnten zeigen, dass die hohe Frequenz der 5-Basen-Deletion in Codon 1309 des APCGens nicht durch einen „Founder-Effekt“, sondern durch eine erhöhte Mutationsrate in dieser
Gensequenz erklärt werden kann. Es gelang uns, das Spektrum von APC-Neumutationen zu
beschreiben und erstmals bei der FAP geschlechtsspezifische Unterschiede bezüglich der Art der
Neumutation herauszuarbeiten, die in Einklang mit Befunden bei anderen dominanten Erkrankungen und theoretischen Überlegungen stehen.
Durch ein Deletions-Screening bei 170 nicht verwandten FAP-Patienten ohne APC-Punktmutation charakterisierten wir Häufigkeit und Spektrum von großen genomischen APC-Deletionen und
beschrieben eine klare Korrelation zwischen dem Vorliegen einer großen Deletion und der
Entwicklung einer klassischen FAP.
Im Rahmen eines längerfristig angelegten Projektes gelang uns die funktionelle Charakterisierung
der mit Abstand größten publizierten Zahl seltener unklarer APC-Varianten: die bisher insgesamt
von uns auf Transkriptebene untersuchten sieben verschiedenen exonischen und acht intronischen Einzelbasen-Substitutionen sowie eine große genomische Duplikation zeigten interessanterweise, dass der Mehrheit seltener Varianten im APC-Gen, die bei Polyposis-Patienten identifiziert werden, offensichtlich pathogene Relevanz zukommt.
Die mittels mehrerer Methoden auf genomischer und cDNA-Ebene erfolgte Charakterisierung
eines komplexen APC-Rearrangements in einer FAP-Familie erlaubte Spekulationen über die
Entstehung größerer genomischer Umbauten und veranschaulichte, dass sich bestimmte Mutationstypen den Detektionsmethoden der Routinediagnostik entziehen und daher in bisherigen
Untersuchungen und Datenbanken vermutlich unterrepräsentiert sind.
Erstmals konnten wir umfassende Daten zu Ausmaß und klinischen Konsequenzen somatischer
Mutations-Mosaike im APC-Gen bei Polyposis-Patienten generieren: in einer methodisch aufwändigen Studie demonstrierten wir, dass somatische APC-Mosaike bei Patienten mit einer
Neumutation häufig auftreten, beim üblichen Mutations-Screening aber leicht übersehen werden
und mit der SNaPshot-Methode gut zu quantifizieren sind. Der ermittelte Mosaikgrad in verschie35
denen Geweben ließ sich mit Hypothesen der Mosaikentstehung in Einklang bringen. Somatische
APC-Mosaike können einen Teil der Abweichungen von etablierten Genotyp-Phänotyp-Beziehungen bei FAP-Patienten erklären und haben Bedeutung für die adäquate Einschätzung des
Umfangs von Früherkennungs-Untersuchungen.
Eine andere Studie beschäftigte sich mit dem FAP-assoziierten Hepatoblastom. Ein APC-Mutationsscreening bei 50 Patienten mit (scheinbar) sporadischem Hepatoblastom ließ vermuten,
dass es sich bei einem nennenswerten Teil der Fälle (8-10 %) tatsächlich um die frühe Manifestation einer FAP auf dem Boden einer APC-Neumutation handelt, was Konsequenzen für die
klinische Betreuung der Patienten hätte. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Vor- und Nachteile
eines frühkindlichen Hepatoblastom-Screenings bei Kindern von FAP-Patienten unter Einbeziehung eigener Daten und von Ergebnissen bei anderen embryonalen Tumorsyndromen umfassend diskutiert.
Ein parallel durchgeführtes Projekt beschäftigt sich mit der MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP).
Durch die retrospektive molekulargenetische Untersuchung und Auswertung klinischer Befunde
von 71 MAP-Patienten konnten wir einen wesentlichen Beitrag zur Beschreibung des Mutationsspektrums und zur Charakterisierung des kolorektalen Phänotyps der MAP leisten. Hierbei zeigte
sich insbesondere, dass die MAP praktisch nie der klassischen FAP entspricht, sondern eine
atypische oder attenuierte klinische Ausprägung hat.
In einer Kooperation mit zwei europäischen Arbeitsgruppen werteten wir federführend die
gemeinsam zusammengetragenen klinischen Daten zum extrakolonischen Tumorspektrum bei
276 MAP-Patienten aus. Hierbei ergab sich neben einer pathophysiologisch interessanten
phänotypischen Überlappung zum HNPCC eine signifikant erhöhte Rate extrakolonischer Malignome. Es ließ sich allerdings kein dominierendes extraintestinales Karzinom nachweisen,
sodass die bisher empfohlenen Früherkennungs-Untersuchungen für MAP-Patienten nicht spezifisch erweitert werden müssen. Im Rahmen des Kooperationsprojektes beteiligten wird uns
außerdem an der Analyse des Heterozygotenrisikos und von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen.
Durch die genannten Arbeiten gelang uns eine vertiefende Charakterisierung der FAP und der
MAP. Nach wie vor ist allerdings ein nennenswerter Teil der Polyposis-Fälle ätiologisch ungeklärt.
Das aktuelle Projekt der genetischen Grundlagenforschung unserer Gruppe hat deshalb insbesondere die Identifizierung weiterer Risikoallele zum Ziel. Hierfür wurde durch die Verfügbarkeit
neuer genomweiter Hochdurchsatz-Techniken wie der hochauflösenden SNP-Array-Analyse und
dem Next-Generation-Sequencing die methodische Grundlage geschaffen. Bezüglich der MAP
sind prospektive Untersuchungen zur altersabhängigen Penetranz kolorektaler Tumoren bei
prädiktiv getesteten MAP-Anlageträgern und eine Feststellung der Häufigkeit bialleler MUTYHKeimbahn-Mutationen bei unselektierten Trägern von Talgdrüsen-Neoplasien geplant.
36
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6
Danksagung
Ganz besonders und an erster Stelle möchte ich Frau Dr. Waltraut Friedl danken, ohne deren
geduldige und intensive fachliche Unterstützung sowie herausragende methodische Kenntnisse
viele Arbeiten nicht so hätten durchgeführt werden können. Ihre zahlreichen Anregungen und
sorgfältigen Manuskript-Korrekturen (inklusive der Durchsicht dieses Textes), die aktive Mitarbeit
bei allen Projekten und die zahlreichen interessanten und konstruktiven Diskussionen trugen
wesentlich zur Qualität und zum Vorankommen der hier beschriebenen Studien bei. Durch ihre
langjährige Aufbauarbeit und das große Engagement im Umgang mit Mitarbeitern und Patienten
wurden die Grundlagen für die koninuierlich erfolgreiche wissenschaftliche Arbeit der Gruppe
geschaffen. Ihr altersbedingtes Ausscheiden aus dem Institut stellt deshalb einen großen
fachlichen und persönlichen Verlust dar.
Sehr zu Dank verpflichtet bin ich ebenfalls Herrn Prof. Dr. Peter Propping für die großzügie und
langjährige Unterstützung, die anregenden wissenschaftlichen Diskussionen und die kritische
Durchsicht aller Manuskripte und Anträge mit vielen wertvollen Verbesserungsvorschlägen.
Hierzu zählen auch die immer freundliche und vorbildliche Art im Führen des Instituts und seiner
Mitarbeiter, das motivierende Umfeld und das Schaffen einer harmonischen Arbeitsatmosphäre,
ohne die eine erfolgreiche wissenschaftliche Arbeit kaum möglich ist. Danken möchte ich dabei
auch ganz besonders für das mir jederzeit und uneingeschränkt entgegengebrachte Vertrauen,
das sich auch in der Übertragung wichtiger Aufgabenbereiche und eigenverantwortlicher Tätigkeiten im Institut wiederspiegelte.
Mein besonderer Dank gilt darüber hinaus Herrn Prof. Dr. Markus M. Nöthen für das Interesse an
der Arbeit unserer Gruppe, die konstruktive Unterstützung bei Anträgen und Publikationen und
das große persönliche Engagment zur erfolgreichen Fortsetzung neuer wissenschaftlicher
Projekte.
Die Arbeit wäre nicht ohne den Beitrag der anderen Mitglieder unserer Arbeitsgruppe „Erblicher
Darmkrebs“ möglich gewesen. Daher danke ich insbesondere Dietlinde Stienen und Siegfried
Uhlhaas für die stets sorgfältig und zuverlässig durchgeführten Laborarbeiten und das Einbringen
ihrer großen Erfahrung im Bereich der molekulargenetischen Methodik, den Doktoranden Kirsten
Sieberg und Daria Christian für die Unterstützung bei der Anforderung, Dokumentation und
Auswertung klinischer Befunde sowie meinen Mitarbeiterinnen Astrid Kaufmann und Stefanie
Vogt für die gute Zusammenarbeit und zeitintensive Patientenrekrutierung.
Danken möchte ich auch den vielen übrigen Mitarbeitern des Instituts, die durch ihre Kollegialität
und Unterstützung mit Ratschlägen und Kommentaren für die gute Arbeitsatmosphäre
verantwortlich sind, sowie für die geduldige Unterstützung bei kleineren und größeren technischen Problemen durch Andreas Stein.
Weiterhin danke ich in- und ausländischen Kooperationspartnern, insbesondere Julian Sampson
(Cardiff, England), Frederik Hes (Leiden, Niederlande) und Roberto Colombo (Mailand, Italien),
die durch ihre Zusammenarbeit wichtige Impulse und Anregungen geliefert haben und einige
Projekte erst ermöglichten, sowie Christoph Engel vom IMSIE Leipzig für die statistische Auswertung einiger Daten.
Ganz besonders möchte ich auch der Deutschen Krebshilfe danken, die mit ihrem Vertrauen und
der langjährigen finanziellen Unterstützung eine Voraussetzung für die erfolgreiche Arbeit unserer
Gruppe geschaffen hat und uns auch gegenwärtig wieder in großem Umfang fördert.
Den FAP-Patienten und der Selbsthilfegruppe Familienhilfe Polyposis e.V. danke ich für die
bereitwillige Teilnahme an wissenschaftlichen Studien und die vielen persönlichen Kontakte.
Besonders herzlich danken möchte ich meiner Frau und meinen Kindern, die meine häufige
Abwesenheit mit Fassung tragen und mich trotzdem noch als vollwertiges Familienmitglied
betrachten.
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