Modulation und Funktion der CD40 Expression in intestinalen

Aus der Medizinischen Klinik I
Universitätsklinik Schleswig-Holstein Campus Lübeck
Direktor Prof. Dr. Hendrik Lehnert
Modulation und Funktion der CD40
Expression in intestinalen Epithelzellen in der Pa­
thogenese von chronisch entzündlichen Darmer­
krankungen
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
Aus der Sektion Naturwissenschaften
vorgelegt von
Frauke Rena Borcherding
aus Ankum
Lübeck 2013
http://d-nb.info/1068073292
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
I-II
Abkürzungen
III-IV
1 Einleitung
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
Aufbau der Darmwand
Physiologische Funktion des Darmes
Das intestinale Immunsystem
Orale Toleranz
Immunkompetenz von IECs
Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen
Atiopathogenese
Das CD40-CD40L-System
Hypothese und Arbeitsziele
2 Materialien
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Bakterienstämme & Zelllinien
Antikörper und Stimulanzien
Kits
Medien und Puffer
Chemikalien und andere Reagenzien
Verbrauchsmaterialien
Geräte
Software
3 Methoden
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
Entnahme von Gewebeproben
3.1.1
Anfertigung von Gefrierschnitten und Immunfluoreszenz
3.1.2
Mikroskopische Auswertung
Zellkultur
3.2.1
Bestimmung der Zellviabilität
Stimulations- und Infektionsversuche
3.3.1
Stimulation von IECs
3.3.1.1 Stimulationsansätze der FACS-Analyse für den Nachweis
der CD40 Oberflächenexpression in IECs
3.3.1.2 Stimulationsansätze der quantitativen RT-PCR Analyse
für den Nachweis der CD40 mRNA Expression in IECs
3.3.1.3 Stimulationsansätze der quantitativen RT-PCR Analyse
für den Nachweis der CD40 und IL-8 mRNA Expression
in IECs
3.3.2
Infektion intestinaler Epithelzellen für den Nachweis der CD40
und LL-8 mRNA Expression in IECs
Durchflusszytometrie
RNA-Transkription und cDNA-Synthese
3.5.1 RNA-Transkription
'
3.5.2 Spektrometrische Bestimmung des RNA-Gehalts
3.5.3 cDNA-Synthese
3
3
4
7
9
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13
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17
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19
19
20
20
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24
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29
30
30
30
32
32
33
34
34
35
35
Inhaltsverzeichnis
3.6
3.7
3.5.4 Quantitative Rcal-time (RT)-PCR
Human CXCL / IL-8-Immunoassay
Statistik
4 Ergebnisse
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
Die CD40 Expression in IECs während aktiver CED
IFN-y und TNF-a induzieren die Expression von CD40 in IECs
4.2.1
Die Oberflächenexpression von CD40 in IECs wird durch IFN-y
und TNF-a aufreguliert
4.2.2
Die höchste durch lFN-y induzierte CD40 mRNA Expressionsrate
wird in HT-29, SW480 und T84 Zellen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten detektiert
4.2.3
Die CD40 mRNA Expression in HT-29, SW480 und T84
wird durch IFN-y un^ TNF-ot induziert
Die CD40 mRNA Expression in naiven HT-29 Zellen wird weder durch
die Zugabe von Überständen IFN-y behandelter Zellen noch
durch Verabreichung des sCD40 Liganden erhöht
Bakterielle Stimuli üben keinen Einfluss auf die CD40 Expression
in IECs aus
4.4.1
Die Oberflächenexpression von CD40 in IECs wird durch IFN-y
und LPS nicht erhöht
4.4.2
In HT-29 Zellen wird die CD40 mRNA Expression durch IFN-y
und LPS nicht induziert
4.4.3
IFN-y und Flagellin, exklusiv oder simultan verabreicht, fuhren
zu keiner Induktion der CD40 mRNA Expression in HT-29 Zellen
4.4.4
Ganzzellige, lebende Escherichia colis führen zu keiner
Aufregulierung der CD40 mRNA Expression in HT-29 Zellen
Die Expression von CD40 vermittelt die Sekretion von IL-8
5 Diskussion
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Expression von CD40 auf I ECs
Simulatoren bzw. Regulatoren der CD40 Expression
Bakterielle Stimuli beeinflussen nicht die CD40 Expression in IECs
Die funktionelle Bedeutung der CD40 Expression in IECs
Ausblick
II
35
37
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39
39
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69
70
6 Zusammenfassung
72
Literaturverzeichnis
74
Abbildungsverzeichnis
89
Tabellenverzeichnis
90
Publikationen
91
Erklärung
92