Aus dem Zentrum Anatomie der Universität zu Köln
Werbung
Aus dem Zentrum Anatomie der Universität zu Köln Geschäftsführender Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. W. F. Neiss Institut für Anatomie I Direktor: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. A. Wodarz Der Einfluss einer Inhibition von Tumor-Nekrose-Faktor alpha auf die antigenspezifische T-Helfer-1-Zellantwort und die Myelinpathologie im zentralen Nervensystem bei Experimenteller Autoimmuner Enzephalomyelitis Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Fee Oda Holland aus Bielefeld promoviert am 16. Dezember 2015 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln Druckjahr 2015 Druckerei: COPY CENTER Bielefeld, Inh. Ewald Heilemeier, Gadderbaumer Str. 3, 33602 Bielefeld Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. S. Kürten 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. M. Schroeter Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne die Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 10.06.2015 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung von Frau Universitätprofessor Dr. med. S. Kürten (Erstbetreuerin) von mir selbst ausgeführt worden. Bei den folgenden Punkten habe ich Unterstützung erhalten von den folgenden Personen: Dr. med. Stefanie Kürten: Entwicklung des Konzepts, Supervision Experimente und Färbungen, Pflege der Mäuse, Evaluation klinischer Scores der Mäuse. Dr. med. vet. Mascha Recks, Pflege der Mäuse, Evaluation klinischer Scores der Mäuse. Anfertigung der Semidünnschnitte und Methylenblaufärbung, Färbung EMSchnitte und Anfertigung EM-Fotos. Helena Batoulis Pflege der Mäuse, Evaluation klinischer Scores der Mäuse, Einführung ELISPOT. Evelin Janßen Epon-Einbettung für EM. Jolanta Kozlowski, Anleitung Immunhistochemie, Etablierung IHC-Doppelfärbung. Danksagung Allen voran ein Dank an Prof. Dr. med. Stefanie Kürten, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre und die mir immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich an jedem Punkt unterstützt hat. Eine bessere Betreuung hätte man sich nicht wünschen können. Außerdem Dank an die Arbeitsgruppe unserer Studie und der Anatomie, ohne die die Grundlagen für diese Arbeit nicht vorhanden gewesen wären. Danke an Mascha Recks und Helena Batoulis, Jolanta Kozlowski, Frau Janßen. Besonderen Dank auch an Felizitas Thomalla für den Zusammenhalt in guten und besseren Zeiten. Außerdem dem gilt mein Dank allen, die mich während der Phase des Schreibens ausgehalten haben und halfen, wenn Ablenkung gebraucht wurde, insbesondere Bernhard Schlüter, Annika Benölken und Gertrud Imorde-Holland. Weiterhin danke ich Leif Van Holland, der jedes technische Problem lösen konnte und sich durch Inhalt und Rechtschreibduden gekämpft hat. Zuletzt Dank an Karl-Patrick Wessel für die Unterstützung. Widmung MeinemVater Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis IX 1. Einleitung 1 1.1 Multiple Sklerose ............................................................................................................................1 1.2 Das Tiermodell der Multiplen Sklerose: EAE .................................................................................3 1.3 Rolle der Immunzellen ...................................................................................................................7 + 1.3.1 Die Rolle der CD4 -T-Zellen ...................................................................................................9 + 9 + 12 1.3.1.1CD4 -Zellen in EAE 1.3.1.2CD4 -T-Zellen in der MS 1.3.2 Die Rolle antigenpräsentierender Zellen ..............................................................................14 1.3.2.1Makrophagen und Mikroglia bei EAE 14 1.3.2.2Makrophagen und Mikroglia bei MS 17 1.3.2.3Dendritische Zellen bei EAE und MS 17 1.3.3 Weitere beteiligte Zelllinien ...................................................................................................18 + 1.3.3.1CD8 -T-Zellen bei EAE und MS 18 1.3.3.2B-Zellen in EAE und MS 19 1.4 Histopathologie bei MS und EAE .................................................................................................21 1.5 Tumor-Nekrosefaktor alpha (TNF-α) ............................................................................................24 1.5.1 Funktion und Rezeptorprofil .................................................................................................24 1.5.2 TNF-α in Autoimmunkrankheiten ..........................................................................................28 1.5.3 TNF-α-Inhibition ....................................................................................................................30 1.6 Zielsetzung der Arbeit ..................................................................................................................32 2. Material und Methoden 34 2.1 Mäuse ...........................................................................................................................................34 2.2 Histologie......................................................................................................................................35 2.2.1 Ultradünnschnitte und elektronenmikroskopische Unter-suchung .......................................35 2.2.2 Semidünnschnitte gefärbt mit Methylenblau, lichtmikros-kopische Analyse ........................37 2.2.3 Hämatoxylin/Eosin-Färbung, lichtmikroskopische Analyse ..................................................38 2.3 Immunhistochemien .....................................................................................................................39 VI Inhaltsverzeichnis 2.3.1 TNF-α-Monofärbung .............................................................................................................39 2.3.2 TNF-α- und F4/80-Doppelfärbung ........................................................................................40 2.3.3 TNF-α- und SMI 32-Doppelfärbung ......................................................................................41 2.3.4 Fluoreszenzmikroskopie .......................................................................................................42 2.4 ELISPOT ......................................................................................................................................42 2.4.1 Zellpräparation Milz und ZNS ...............................................................................................42 2.4.2 Zellpräparation Blut ...............................................................................................................43 2.4.3 ELISPOT Assay ....................................................................................................................44 2.5 Statistische Analysen ...................................................................................................................45 3. Ergebnisse 47 3.1 Die Anzahl der Th1-Zellen im Blut korreliert während des Krankheitsverlaufs nicht mit dem klinischen Score ...........................................................................................................................47 3.2 TNF-α ist in entzündlichen Läsionen des Rückenmarks nachweisbar und korreliert signifikant mit dem klinischen Score .............................................................................................................49 3.3 Makrophagen/Mikroglia setzen TNF-α frei und TNF-α trägt zur Schädigung des Myelins bei ....51 3.4 Eine TNF-α Blockade vermindert die Inzidenz und verzögert das Einsetzen der EAE ...............53 3.5 Eine TNF-α-Inhibition erhöht die antigenspezifische Antwort von Th1-Zellen in der Milz und dem Blut, hat jedoch keinen Einfluss auf die antigenspezifische Th1-Antwort im ZNS .......................55 3.6 Die Anzahl der Th1-Zellen in der Milz korreliert nicht mit dem klinischen Score; die Anzahl der Th1-Zellen im ZNS hingegen weist eine Korrelation auf ..............................................................56 3.7 Eine TNF-α-Inhibition hat keinen protektiven Effekt auf die entzündliche Aktivität, den Myelinschaden und feine Axonpathologien ..................................................................................57 3.8 Nach Absetzen des TNF-α-Inhibitors verschlimmert sich der klinische Score der Mäuse ..........62 4. Diskussion 65 4.1 Die Th1-Zellzahlen im Blut korrelieren weder zu Beginn noch im Verlauf der EAE mit dem klinischen Score ...........................................................................................................................65 4.2 TNF-α ist in entzündlichen Läsionen zu finden und korreliert signifikant mit dem klinischen Score ............................................................................................................................................66 4.3 TNF-α wird von Makrophagen/Mikroglia freigesetzt und ist mit einer Beschädigung des Myelins assoziiert ......................................................................................................................................67 VII Inhaltsverzeichnis 4.4 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf den klinischen Verlauf und den Krankheitsbeginn ........67 4.5 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf IFN-γ-freisetzende Th1-Zellen .......................................73 4.6 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf die Histopathologie ........................................................78 4.7 Ergänzung durch parallel erhobene Ergebnisse ..........................................................................83 + 4.7.1 CD4 -Zellen und Makrophagen ............................................................................................83 4.7.2 Immunhistochemische Untersuchungen mit SMI 99 und 312 ..............................................84 4.7.3 Klinischer Verlauf bei einer mit Humira® behandelten Kontrollgruppe ................................84 4.7.4 Auswirkungen der TNF-α-Inhibition auf IL-17-freisetzende Th17-Zellen ..............................85 4.7.5 Auswirkungen der TNF-α-Inhibition auf axolytische Vorgänge .............................................91 4.7.6 Auswirkungen der TNF-α-Inhibition auf apoptotische Vorgänge ..........................................93 4.8 Ausblick ........................................................................................................................................96 5. Zusammenfassung 97 6. Literaturverzeichnis 100 7. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen 133 8. Lebenslauf 134 VII Abkürzungsverzeichnis ATP Adenosintriphosphat BHS Blut-Hirn-Schranke CD Cluster of Differentiation CCR CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor CFA Complete Freund’s Adjuvant CTL Cytotoxic T-Lymphocyte DAPI 4,6-Diamidino-2-Phenylindol DMEM Dulbecco's Modifizierte Medien EAE Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis EBV Epstein-Barr-Virus EDSS Expanded Disability Status Scale FADD Fas-assoziierte Todesdomäne Fc Fragment crystallizable FITC Fluoresceinisothiocyanat Foxp3 Forkhead Box P3 (Protein und Gen) GM-CSF Granulocyte macrophage-colony stimulating factor HLA Humanes Leukozytenantigen ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 IFN Interferon IgG Immunglobulin G IL Interleukin VI Abkürzungsverzeichnis iNOS Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase LPS Lipopolysaccharid MAG Myelin-Assoziiertes-Glykoprotein MBP Myelin-Basisches-Protein (Myelin Basic Protein) MHC Hauphistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex) MMP Matrix-Metalloprotease MOBP Myelin-Assoziiertes-Basisches-Oligodendrozyten-Protein MOG Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein MRT Magnetresonanztomographie MS Multiple Sklerose mTNF Transmembraner Tumornekrosefaktor NAA N-Acetyl-Aspartat NF-κB Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells NNND Nearest Neighbour Neurofilament Distance NO Stickstoffmonoxid OSP Oligodendrozyten-Spezifisches-Glykoprotein PBS Phosphat-Puffer (Phosphate Buffered Saline) PLP Proteolipidprotein PP-MS Primär Progressive Multiple Sklerose RANTES Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted ROR Retinoic acid-receptor-related orphan receptor ROS Reaktive Sauerstoff-Spezies RR-MS Schubförmig remittierende Multiple Sklerose (relapsing-remitting MS) RunX Runt-related transcription factor X X Abkürzungsverzeichnis STAT1 Signal Transducers and Activators of Transcription 1 sTNF Löslicher Tumornekrosefaktor (soluble) TACE TNF-α Converting Enzyme Teff T-Effektorzelle TGF-β Transforming growth factor beta Th-Zelle T-Helfer-Zelle TMEV Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus TNF-α Tumornekrosefaktor Alpha TNF-R Tumornekrosefaktorrezeptor Treg Regulatorische T-Zellen TRADD Tumor necrosis factor Receptor type 1 Associated Death Domain protein TRAF TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 VLA-4 Very late antigen 4 ZNS Zentrales Nervensystem XI 1. Einleitung 1.1 Multiple Sklerose Die multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS: Gehirn und Rückenmark), die mit einer Demarkation der Myelinscheiden und der Schädigung von Axonen einhergeht. Es kommt vorwiegend in der weißen Substanz zur Ausbildung von Entmarkungsherden, die auch als Plaques oder Läsionen bezeichnet werden. Bedingt wird sie wahrscheinlich durch autoreaktive T-Lymphozyten, die sich gegen verschiedene Bestandteile des Myelins richten, über die Blut-HirnSchranke (BHS) in das ZNS gelangen und dann eine Kaskade von Immunreaktionen auslösen, die zum jeweiligen Schädigungsmuster führen. Obwohl die MS erstmals 1838 von Carswell beschrieben und 1868 von Charcot als eigenständige Krankheit Krankheitsmechanismus bis identifiziert heute unklar wurde und [40], ist der Gegenstand genaue intensiver Forschung. MS tritt vorwiegend im jungen Erwachsenenalter auf und ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu bleibender Behinderung und vorzeitiger Berentung führt [61]. Dabei ist die Lebenszeit um etwa sieben bis zehn Jahre verkürzt [91]. Die Prävalenz liegt in Deutschland bei über 100/100 000 Einwohner pro Jahr und weltweit sind ca. 2,3 Millionen Menschen an MS erkrankt [52]. Man kann zwei verschiedene Verlaufsformen unterscheiden: die schubförmig remittierende (relapsing-remitting RR-MS) und die primär progressive (PP-MS) MS. Etwa 80-85 % der Patienten entwickeln eine RR-MS, wobei Frauen etwa doppelt so häufig betroffen sind wie Männer. Die Erkrankung äußert sich durch verschiedenste neurologische Ausfälle, die abhängig von der Läsionslokalisation sind (z.B. Ataxie, Tremor, Optikusneuritis, Sprach- und Schluckstörungen, Gefühlsstörungen, Paresen etc.). Als Schub bezeichnet man ein neu aufgetretenes 1 oder akut verschlechtertes 1. Einleitung neurologisches Defizit, das mindestens 24 Stunden anhält und nicht im Rahmen einer Infektion oder Fieber auftritt. Dabei muss der Abstand zum vorherigen Schub mindestens 30 Tage betragen. Die Symptome bilden sich anfangs meist nahezu vollständig wieder zurück. In etwa der Hälfte der Fälle geht die RR-MS innerhalb von zehn Jahren in eine sekundär progrediente Form über [282], die durch progrediente neurologische Ausfälle sowie zunehmende Demyelinisierung und axonalen Schaden bis hin zum Verlust von Axonen gekennzeichnet ist. In etwa 10-15% der Fälle setzt die progrediente Form direkt ein (PP-MS), wobei das Erkrankungsalter in diesem Fall im Durchschnitt zehn Jahre höher liegt und kein Unterschied zwischen den Geschlechtern besteht [256]. Dabei ist unklar, welche Faktoren die unterschiedlichen Verlaufsformen bedingen. Ebenfalls unklar sind die Auslöser der Erkrankung. Es werden mehrere Hypothesen diskutiert und man geht derzeit davon aus, dass sowohl genetische Komponenten als auch Umweltfaktoren eine Rolle spielen. Die Konkordanzraten eineiiger Zwillinge liegen bei 20-30%, die von Geschwistern hingegen nur bei 5% [61]. Mögliche relevante Gene sind z.B. die des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA-Gene). Als bedeutsamster genetischer Risikofaktor (10-60%) gelten die HLA Klasse II Moleküle, vor allem HLA-DR und HLA-DQ [103]. Aber auch die Gene für HLA Klasse I Moleküle spielen eine Rolle. Sie können je nachdem sowohl zu einem verminderten Risiko (z.B. HLA-A2 Allel) als auch zu einer erhöhten Anfälligkeit (z.B. HLA-A3) für MS führen [76]. Die Relevanz von Umweltfaktoren wird dadurch unterstrichen, dass die Krankheitsprävalenz zum Äquator hin abnimmt und Kinder, die vor ihrem 15. Lebensjahr in eine andere Gegend ziehen, das Risiko des jeweils neuen Landes annehmen. Wenn hingegen der Umzug in ein Land mit vom Geburtsland abweichender Prävalenz später erfolgt, bleibt das Risiko des Geburtslandes bestehen [139]. Es scheinen demnach die in der Kindheit vorhandenen Umwelteinflüsse entscheidend zu sein. Als mögliche Faktoren werden unter anderem Industrialisierung, Umweltverschmutzung, Ernährungsgewohnheiten, UV-Strahlung (das Fehlen von Melatonin verstärkt 2 1. Einleitung beispielsweise die Th1-Zellantwort), Vitamin D-Mangel und Virusinfektionen diskutiert (zusammengefasst in [120+241]). So heterogen wie die möglichen Ursachen sind auch Neuropathologie, Pathogenese und der Verlauf einer MS. Im Jahr 2000 entwickelten Luchinetti et al. [155] eine Einteilung der Läsionen anhand der unterschiedlichen pathogenen Zellen und Faktoren. Diese histopathologischen Muster sind zwar interindividuell unterschiedlich, erwiesen sich intraindividuell jedoch als konstant. Muster I ist gekennzeichnet durch eine Dominanz von T-Zellen und Makrophagen, die proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IFN-γ und Radikale ausschütten. Bei Muster II dominieren Antikörper (gegen MOG und MBP) und Komplementfaktoren, wobei die Mechanismen denen des Guillain-BarréSyndroms ähneln. Muster III weist vor allem einen Verlust von myelinassoziiertem Glykoprotein (MAG) und oligodendrozytäre Schäden auf. Muster IV wird dominiert durch nichtapoptotische Oligodendrozytendegeneration. Auch wenn immer pathophysiologischen neue Erkenntnisse Zusammenhänge hinzukommen, der MS noch sind die weitgehend unverstanden. Da die Untersuchungsmöglichkeiten zum Verständnis dieser Zusammenhänge am lebenden Menschen sehr begrenzt sind, ist ein geeignetes Tiermodell von Nöten, um detailliertere Erkenntnisse gewinnen zu können. 1.2 Das Tiermodell der Multiplen Sklerose: EAE Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist eines der am häufigsten verwendeten Tiermodelle mit einem Erkrankungsmuster, das dem der MS sehr ähnelt und somit zur Erkenntnisgewinnung herangezogen wird [87]. Erstmals wurde die EAE von Thomas Rivers 1933 bei Primaten mit Kaninchen-Hirn-Emulsion ausgelöst [219] und später auch bei anderen Spezies etabliert, wobei heutzutage vor allem Mäuse eingesetzt werden. Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur Induktion 3 einer EAE: dazu gehören 1. Einleitung beispielsweise die Injektion von Myelin-Antigenen (aktive EAE) [247], der Transfer von enzephalitogenen T-Zellen (passive EAE) [247] oder auch spontan auftretende Verläufe, die auf genetischen Modifikationen des T-Zell-Rezeptors beruhen [88]. Die Krankheitsverläufe und Schädigungsmuster unterscheiden sich je nach verwendetem Myelinbestandteil, Mausstamm und Induktionsmethode. Mit dem adoptiven Transfer von T-Zellen lässt sich beispielsweise eine Symptomatik auslösen, die sich innerhalb von kurzer Zeit vollständig wieder zurückbildet [199]. Bei den aktiv induzierten EAE-Modellen zeigen sich unterschiedliche Verläufe, die von dem Ratten-/ Mausstamm und dem zur Immunisierung verwendeten Antigen abhängig sind. Dabei können akute, chronische oder auch schubförmige Verläufe beobachtet werden [266]. Zur effektiven Auslösung einer aktiven EAE werden CFA und Pertussis Toxin benötigt. CFA enthält abgetötetes Mycobakterium tuberculosis und bewirkt eine Aktivierung des Immunsystems [72+79]. Pertussis Toxin wird als weiteres Adjuvans zur Verstärkung der Auslösung der EAE eingesetzt [20] und trägt zur Erhöhung der Durchlässigkeit der BHS bei [34]. Mögliche Zielantigene sind das Myelin-Basische-Protein (MBP) [162], das Proteolipidprotein (PLP) [190], das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) [149], MAG [205], das Myelin-Oligodendrozyten-Basische-Protein (MOBP), das Oligodendrozyten-Spezifische-Glykoprotein (OSP), Galactocerebroside und einige weitere neuronale Strukturen [123]. PLP ist mit 50% das am häufigsten vorkommende Myelinprotein, gefolgt von MBP (3040%) und OSP (7%) [145+181]. MOG hingegen macht mit nur 0,01-0,05% einen deutlich geringeren Anteil aus und ist im Gegensatz zu den anderen nicht im kompakten Myelin, sondern auf der äußeren Oberfläche der Oligodendrozytenmembran lokalisiert und damit erreichbar für humorale Faktoren wie z.B. Antikörper und Komplementfaktoren [149+191]. Mit einer entsprechenden genetischen Anpassung der Mäuse können enzephalitogene TZellen zu nahezu allen im ZNS anwesenden Antigenen generiert werden (zusammengefasst von [210]). Des Weiteren lassen sich klassische und atypische EAE-Modelle unterscheiden. Häufig verwendete klassische EAE Modelle sind: eine bei B10.PL- oder PL/J-Mausstämmen mit MBP ausgelöste 4 1. Einleitung monophasische EAE, eine RR-EAE ausgelöst z.B. mit PLP 139-151 im SJL/JStamm sowie eine chronisch verlaufende EAE induziert durch MOG 35-55 in C57BL/6-Mäusen [16]. Sie zeichnen sich durch progrediente schlaffe Paresen aus, die die Grundlage für das gängige Scoring-System sind (0-5: 0=gesund; 1=Schwanzparese; 2=Hinterlaufschwäche; 3=Hinterlaufparese; 4=Quadriplegie, 5=Tod). Die Krankheit manifestiert sich bei diesem, auch als typisch bezeichneten Verlauf, vor allem im Rückenmark, wohingegen die Läsionen beim atypischen Verlauf anderorts lokalisiert sind. Sie befinden sich beispielsweise im Kleinhirn, was zu entsprechenden Ausfallsmustern wie Ataxie und Tremor führt [57], auch Optikusneuritiden sind in diesen atypischen Modellen zu beobachten. Mittlerweile wurden weitere Modelle entwickelt, die z.B. eine B-Zellbeteiligung aufweisen (MP4-induzierte EAE in C57BL/6-Mäusen [136]). Obwohl es schwierig ist, die Heterogenität der MS im Tiermodell vollständig abzubilden, bietet sich die Möglichkeit, die Krankheitspathogenese mit verschiedenen Modellen gezielt zu untersuchen. Es ist möglich transgene Mauspopulationen zu züchten, in denen Gene gezielt verändert worden sind, wie z.B. die des T-Zell-Rezeptors [88]. Außerdem können sogenannte Knockout-Mäuse generiert werden, in welchen Gene gezielt ausgeschaltet werden und so eine Untersuchung der jeweiligen Auswirkungen möglich ist [194]. Eine weitere Möglichkeit De- und Remyelinisierung zu untersuchen ist das Cuprizon-Modell. Mischt man C57BL/6-Mäusen Cuprizon unter das Futter, zeigen diese nach einigen Wochen Anzeichen einer Demyelinisierung. Nach Absetzen des Giftes kommt es wiederum nach einigen Wochen zur Remyelinisierung [164]. So können diese Vorgänge zuverlässig untersucht werden. Die demyelinisierten Läsionen dieses Modells entsprechen vom Muster am ehesten denen vom Typ III nach Luchinetti, da vielmehr eine Beteiligung von Makrophagen und Mikroglia als von T-Zellen, sowie Zeichen für oxidativen Stress und mitochondriale Schädigung zu beobachten sind (zusammengefasst in [208]). Dieses Modell kann genutzt werden, um die Prozesse, die während einer De- sowie einer Remyelinisierung stattfinden, zu untersuchen. Es wird 5 1. Einleitung den verschiedenen Verläufen und den vielschichtigen pathogenen Mechanismen der MS aber nicht gerecht. Ein weiteres Modell, mit dem man versucht die Prozesse der MS darzustellen ist das TMEV (Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus)-Modell. Dabei soll untersucht werden, inwiefern Virusinfektionen zu Autoimmunprozessen im ZNS beitragen können [177]. Es zeigt sich je nach Virus-Subtyp beispielsweise ein akuter Verlauf, der relativ schnell zum Tod der Mäuse führt (GDVII-Typ), oder ein zweiphasiger chronischer Verlauf mit akuter Polioenzephalomyelitis und einer chronischen Demyelinisierung nach einigen Wochen, wobei dafür eine Persistenz des Virus nötig ist (DA-Subtyp) [264]. Es sind außerdem axonaler Schaden und der Verlust von Axonen zu beobachten [50+268]. Der klinische Verlauf der Infektion mit TMEV entspricht am ehesten dem einer chronisch progredienten MS und es zeigt sich eine Beteiligung von Antikörpern, CD4+Zellen und CD8+-Zellen (zusammengefasst in [263]). Im Gegensatz zur EAE ist aber keine Auslösung einer Demyelinisierung durch den adoptiven Transfer von T-Zellen möglich [14]. Insgesamt ist es schwierig die Komplexität der MS mit einem einzigen Modell abzubilden, sowohl was die Ätiologie als auch die Verläufe und die Pathogenese anbelangt. Eine MS tritt beispielsweise spontan auf und die Erkrankten stammen aus einer genetisch heterogenen Population. Möchte man eine spontane Form der EAE auslösen, werden dafür aber transgene Mäuse benötigt, was gleichzeitig eine Einschränkung eben dieser Heterogenität bedingt [279]. Die gleiche Problematik ergibt sich bei Knockout-Mäusen. Eine Darstellung der unterschiedlichen Verlaufsformen der MS (RR-MS, SP-MS, PPMS) ist nicht mit einem einzelnen Modell möglich, dazu sind mehrere verschiedene Modelle nötig. Gleiches gilt für die beteiligten Zelllinien, so ist z.B. ein chronischer Verlauf mit einer Demyelinisierung mediiert durch T-Zellen und Makrophagen bei einer EAE bei mit MOG:35-55 immunisierten C57/BL6Mäusen [175] oder ein spontaner schubförmiger Verlauf bei einer Immunisierung mit MOG:92-106 bei SJL/J-Mäusen mit transgenem TZellrezeptor und B-Zell-Beteiligung zu beobachten [206]. Auch ist bekannt, dass bei der MS, im Gegensatz zu der EAE, eher eine Dominanz der CD8+-Zellen 6 1. Einleitung statt der CD4+-Zellen vorhanden ist [9]. Außerdem werden zur Auslösung einer aktiven EAE Adjuvantien benötigt, um die Immunreaktionen zu verstärken [20], was den Pathomechanismen einer MS nicht entspricht. Auch wenn der Einsatz von Tiermodellen wichtig ist, um die Vorgänge im Immunsystem zu untersuchen, muss man mit der Interpretation der so gewonnenen Ergebnisse vorsichtig sein, insbesondere in Bezug auf die Entwicklung neuer Therapieansätze. Obwohl sich einige Therapeutika wie z.B. TNF-α-Inhibitoren in EAE-Studien zunächst als wirksam erwiesen [230], bestätigte sich dies bei MS-Patienten nicht [255]. Der Einsatz von Kortikosteroiden hingegen erwies sich sowohl im Tiermodell als auch beim Menschen als wirksam [38+227] und ist Bestandteil der Standardtherapie der MS. Da die Mechanismen der histopathologischen Schädigung bei MS und EAE ähnlich sind, scheint es möglich zu sein anti-inflammatorische Therapeutika im Tiermodell zu testen und die Ergebnisse auf den Menschen zu übertragen [86]. Die Kombination verschiedener Tiermodelle ermöglicht es verschiedene Aspekte der MS und ihrer immunologischen Grundlagen zu erforschen. Insbesondere bei der Entwicklung von spezifischen Therapien müssen die Ergebnisse jedoch immer mit Bedacht interpretiert und von einer voreiligen Generalisierung auf den Menschen sollte Abstand genommen werden. 1.3 Rolle der Immunzellen Die Pathogenese der Läsionen in MS und EAE stellt ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Komponenten des angeborenen und erworbenen Immunsystems dar, das längst nicht vollständig verstanden ist. Man geht davon aus, dass potentiell gegen Myelinbestandteile gerichtete, reaktive CD4+-T-Zellen in der Periphere aktiviert werden und dann über Adhäsionsmoleküle (z.B. VLA-4) an der BHS anheften und ihnen so ermöglicht wird, in das ZNS zu gelangen. Reboldi et al. konnten zeigen, dass die Invasion von Th-Zellen bei einer mit MOG:35-55 induzierten EAE bei C57BL/6-Mäusen 7 1. Einleitung zweiphasig verläuft. Zunächst kommt es zu einer initialen Invasion über den Plexus choroideus, bei der in erster Linie CCR-6 beteiligt ist, welches von ThZellen exprimiert wird. Im Verlauf aktivieren die so eingewanderten Zellen dann postkapilläre Venolen im ZNS-Parenchym und ermöglichen aktivierten TLymphozyten die Migration in das ZNS. Wenn CCR-6 fehlte, war keine Auslösung einer EAE möglich [211]. Im ZNS angelangt, werden die Lymphozyten von antigenpräsentierenden Zellen reaktiviert. Daraufhin werden proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, INF-γ, IL-12, IL-17 und Chemokine wie IL-8 und RANTES ausgeschüttet. So kommt es zur Aktivierung von ortsansässigen Mikrogliazellen und Makrophagen sowie zur weiteren + Rekrutierung von anderen Immunzellen, wie CD8 -T-Zellen und weiteren antigenpräsentierenden Zellen aus der Peripherie. Durch diverse Mechanismen (proinflammatorische Zytokine, Radikalbildung, Komplementaktivierung, MyelinPhagozytose, Apoptoseinduktion etc.) kommt es zu Demyelinisierung und axonaler Schädigung bis hin zum Verlust von Axonen. Dabei werden weitere Myelinbestandteile freigesetzt, die ebenfalls präsentiert werden, was die Immunantwort weiter verstärkt. Das Repertoire der autoreaktiven Zellen erweitert sich und sie reagieren auf Antigene, die unabhängig von dem ursprünglichen präsentierten Antigen sind. Diesen Mechanismus bezeichnet man als Epitope Spreading [144+173+276]. Es entwickelt sich so ein Teufelskreis. Von überlebenden Oligodendrozyten aus kann es dann teilweise zur Remyelinisierung kommen, wobei die ursprüngliche Qualität der Myelinstruktur aber nicht mehr erreicht werden kann [288]. 8 1. Einleitung 1.3.1 Die Rolle der CD4+-T-Zellen 1.3.1.1 CD4+-Zellen in EAE Seit Ben-Nun et al. [19] 1981 zeigen konnten, dass EAE durch adoptiven Transfer von CD4+-T-Lymphozyten ausgelöst werden kann, stehen diese im Zentrum der Forschung. Es lassen sich verschiedene Subtypen von CD4+-T-Zellen unterscheiden: Th1(T-Helferzellen), Th2-, Th9-, Th17-, Th22- und regulatorische CD25+/Foxp3+Zellen, wobei eine gewisse Plastizität zwischen den einzelnen T- Zellpopulationen vorhanden ist [32]. Th1-Zellen mediieren die zellabhängige Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene über die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen wie beispielsweise IFN-γ und TNF-α. Ihre Differenzierung wird durch IL-12 vorangetrieben. Th2-Zellen reagieren mit einer Stimulation der humoralen Immunantwort auf extrazelluläre Pathogene über die Sekretion von IL-4, -5, 10,13 (anti-inflammatorische Zytokine) und über die Stimulation von B-Zellen [299]. Ihre Differenzierung erfolgt über IL-4. Die Th17-Zellen sind ein relativ neu entdeckter Subtyp der CD4+-T-Zellen. Zunächst wurde angenommen, dass er von einem Vorläufer der Th1-Zellen abstammt [22], dies konnte jedoch widerlegt werden, da unterschiedliche Transkriptionsfaktoren involviert sind [95]. Th17-Zellen setzen IL-17A, IL-17F, IL-6, IL-9, IL-21, IL-22, IL-23, IL-26, TNF-α und GM-CSF frei [140] und sind beteiligt an der Abwehr von extrazellulären Bakterien und Pilzen, z.B. über eine Beeinflussung der Rekrutierung von Neutrophilen [114]. Naive T-Zellen werden unter dem Einfluss von IL-6, IL-21, und TGF-β zu Th17-Zellen. Dieser Vorgang wird stimuliert durch TNF-α und IL1β. Zusätzlich dazu beeinflusst IL-23 die Reifung der Th17-Zellen [62]. Regulatorische T-Zellen exprimieren CD25 - eine Untereinheit des IL-2Rezeptors - Foxp3 und TNF-R2 an ihrer Oberfläche. Sie machen etwa 10% der CD4+-Zellen aus und unterdrücken autoreaktive T-Effektorzellen bei direktem Zellkontakt durch bisher nicht genau verstandene Mechanismen [257]. 9 1. Einleitung Angenommen wird unter anderem eine Hemmung der Proliferation von ThZellen via IL-10 [7+42+178]. Dabei wird diese Hemmung unter anderem über die Bindung von TNF-α an TNF-R2 aktiviert. Eine Suppression regulatorischer T-Zellen ist nach Pasare und Medzhitov [197] durch den Einfluss von IL-6 möglich und es kommt somit zum Wegfall der antiinflammatorischen Wirkung und entsprechender Verstärkung der Entzündung. Es kann außerdem zwischen natürlichen und induzierbaren regulatorischen TZellen unterschieden werden. Während sich erstere im Thymus entwickeln, benötigen letztere eine Stimulation durch T-Effektorzellen in der Peripherie. Dabei sind die natürlichen Tregs auf eine Stimulation über TNF-R2 angewiesen, die induzierbaren hingegen können ihre Funktion auch unabhängig von TNFR2, z.B. über eine Stimulation mit TGF-β, ausüben [108]. Da eine passive EAE mittels Transfer von myelinspezifischen Th1-Zellen ausgelöst werden kann, galt zunächst ihnen die Aufmerksamkeit [295]. Es konnte gezeigt werden, dass STAT4 und T-bet die an der Differenzierung zu Th1-Zellen beteiligten Transkriptionsfaktoren sind, die zur EAE-Auslösung benötigt werden [152]. IFN-γ wird überwiegend als proinflammatorisches Zytokin angesehen. Es löst eine vermehrte Expression von MHC I und II aus, stimuliert antigenpräsentierende Zellen und Makrophagen und nimmt Einfluss auf die Migration von Leukozyten in das ZNS. Des Weiteren verschiebt es das Gleichgewicht der Th1- und Th2-Zellen hin zu den Th1-Zellen und trägt zur BZelldifferenzierung und dem Antikörper-Klassenwechsel zu Immunglobulin G bei. Es supprimiert außerdem regulatorische T-Zellen. Diese proinflammatorischen Eigenschaften beziehen sich in erster Linie auf das IFN-γ, das von CD4+-und CD8+-T-Zellen freigesetzt wird. Dem IFN-γ aus natürlichen Killer- und natürlichen Killer-T-Zellen sowie aus γδ-T-Zellen hingegen werden auch regulatorische Funktionen zugeschrieben.[27]. Es kann T-Zellen inhibieren und trägt zur Stimulation von regulatorischen T-Zellen sowie zur Apoptose von Th1-Zellen bei (zusammengefasst in [225]). Gleichzeitig scheint nicht nur der Typ der Zellen, die IFN-γ freisetzen, sondern auch der Zeitpunkt der Freisetzung wichtig zu sein. Eine frühe Verabreichung von IFN-γ bei einer EAE mit chronischer Verlaufsform konnte zur Verhinderung von Symptomen führen. 10 1. Einleitung Eine Gabe im späteren Krankheitsverlauf wirkte sich hingegen negativ auf die klinische Symptomatik aus [47+89]. Untersucht man nun die Rolle von IFN-γ in der EAE, so lässt sich bei IFN-γ-Knockout-Mäusen beobachten, dass sich eine atypische Form der EAE, mit vorwiegender Beteiligung des Gehirns und einem Fehlen von Läsionen im Rückenmark, entwickelt. IFN-γ scheint dementsprechend eine pathogene Rolle beim Verlauf der sogenannten klassischen EAE zu spielen [285]. Trotzdem fand sich bei den Tieren, denen IFN-γ fehlte, keine Resistenz gegenüber EAE, sondern sogar ein verschlimmerter Verlauf [131]. Damit sich naive CD4+-Zellen zu Th1-Zellen transformieren, wird IL-12 benötigt [81], was die Vermutung nahe legt, dass ein gezieltes Ausschalten von IL-12 zur Besserung, wenn nicht gar Verhinderung von EAE führen kann. Um diese Hypothese zu überprüfen, kreierte man Mäuse, bei denen verschiedene Untereinheiten des IL-12 ausgeschaltet wurden. Dabei zeigte sich, dass Mäuse, denen die p35-Untereinheit fehlte, empfänglicher für eine EAE waren [89], während eine gezielte Ausschaltung der p40-Untereinheit zu einer Resistenz gegenüber der Krankheit führte [49]. Die p40-Untereinheit des IL-12 ist ebenfalls Bestandteil des IL-23, welches essentiell für die Vermehrung, das Überleben und die Reifung von Th17-Zellen ist [172]. Insofern könnte nicht nur IL-12 sondern auch IL-23 für den beobachteten positiven Effekt verantwortlich sein. Diese Ergebnisse stellten die Dominanz der Th1-Zellen in Frage und rückten Th17-Zellen in den Fokus. Die Zytokine der Th17-Zellen tragen zur Formation von entzündlichen Läsionen bei: IL-17 als proinflammatorisches Zytokin [95+244], IL-6 als Suppressor von regulatorischen T-Zellen [197], TNF-α unter anderem als Induktor von Apoptose [99] sowie GM-CSF als Wachstumsfaktor für Granulozyten und Makrophagen [94]. Jäger et al. demonstrierten 2009, dass eine Auslösung von EAE mit dem Transfer von Th17-Zellen möglich ist [117] . Diese benötigen nach O'Connor et al. dafür jedoch die Anwesenheit von IFN-γ [186]. Es scheint also ein Wechselspiel zwischen Th1-und Th17-Zellen stattzufinden. Auch das Infiltrationsmuster scheint abhängig vom vorherrschenden Zelltyp zu sein. Sind vor allem Th17-Zellen vertreten, kommt 11 es zur Einwanderung von 1. Einleitung Entzündungszellen in das Hirnparenchym und zur Auslösung einer atypischen Form der EAE. Wenn man nun aber IL-17 neutralisierende Antikörper hinzugibt, verringern sich die Symptome der atypischen EAE und es kommt zur Entwicklung einer klassischen Form mit einem Überwiegen der Infiltration des Rückenmarks statt des Hirnparenchyms [246]. Anhand des Chemokinmusters findet man Hinweise, dass bei Th1-induzierter EAE eher Makrophagen und Mikroglia überwiegen. Bei Modellen, in denen Th17-Zellen vorherrschen, ist hingegen eher eine Rekrutierung von Neutrophilen zu verzeichnen und die Zellen wandern in diesem Fall tiefer in die weiße Substanz ein, wohingegen sie im Th1-zelldominanten Modell eher meningeal und subpial verbleiben [132]. 1.3.1.2 CD4+-T-Zellen in der MS Die Erkenntnis, dass CD4+-T-Zellen eine Rolle in der MS spielen, stützt sich unter anderem auf die Ergebnisse und Parallelen aus EAE-Modellen, wobei die Einflüsse der jeweiligen Zellreihen sowohl Unterschiede als auch Parallelen aufweisen. Es konnten Th1-Zellen in den Läsionen im Gehirn [262] sowie im Liquor und im Blut von MS-Patienten [148+192] gefunden werden. Zwar sind auch bei Gesunden myelinspezifische T-Zellen vorhanden, die jedoch, im Gegensatz zu denen der Erkrankten, eine Kostimulation über CD28 benötigten, um aktiviert zu werden. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die T-Zellen der Gesunden, im Gegensatz zu denen der an MS Erkrankten, vorher noch nicht aktiviert worden sind [153]. CD28 befindet sich auf T-Zellen, interagiert mit CD80 oder CD86 auf antigenpräsentierenden Zellen und führt zu einer Aktivierung der T-Zellen. Ist die Aktivierung der jeweiligen T-Zelle erfolgt, wird die Kostimulation nicht mehr zwangsläufig benötigt und die Zellen können unabhängig von anderen Zellen Schaden anrichten [222]. Myelinspezifische TGedächtniszellen ließen sich, im Gegensatz zu MS-Erkrankten, bei Gesunden nicht finden [35]. 12 1. Einleitung Des Weiteren korrelieren MHC-II-Gene und MS-Erkrankungswahrscheinlichkeit [103], was die Beteiligung von CD4+-T-Zellen wahrscheinlich macht, da diese mit MHC-II interagieren. Betrachtet man IFN-γ-freisetzende autoreaktive Th1-Zellen, so scheinen diese nach einer Studie von Crawford et al. höher differenziert zu sein als bei gesunden Probanden [48]. In einer Studie, in der man systemisch IFN-γ verabreichte, konnte außerdem gezeigt werden, dass dies zu einer Verschlechterung der Krankheit führte, was unter anderem auf eine vermehrte Proliferation der Lymphozyten zurückgeführt werden konnte [196]. Nach Frisullo et al. war IFN-γ insbesondere im akuten Schub erhöht, während dies in der chronischen Phase nicht der Fall war [80]. Als man der Frage nachging, wie genau IFN-γ zur Pathogenese beiträgt, konnte herausgefunden werden, dass IFN-γ in vitro die Apoptose von humanen Oligodendrozyten auslöst. Dies wurde dadurch unterstützt, dass IFN-γ in MS-Läsionen in der Nähe von apoptotischen Oligodendrozyten gefunden werden konnte [207]. Auf dieser Grundlage wurde eine Studie zur Wirkung von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern bei MSPatienten durchgeführt, die positive Resultate lieferte [239]. Die Stichprobengröße war allerdings relativ klein und eine Verbesserung zeigte sich lediglich bei einem Teil der Probanden. Außerdem problematisch im Hinblick auf Folgestudien sind die Ergebnisse aus EAE-Studien, die zeigen, dass es in der Abwesenheit von IFN-γ zur Verschlechterung des Krankheitsverlaufs kommt [131]. Allerdings ist eine Abweichung der Funktionen von IFN-γ bei MS und EAE durchaus möglich. Die Rolle von Th17-Zellen bei der MS ist weit weniger gut erforscht. Mit DNAMikroarrays konnte man nachweisen, dass sich IL-17 in aktiven MS-Läsionen sowie am Rand von chronisch-aktiven Läsionen befindet [267]. Es zeigte sich eine Anreicherung von IL-17-mRNA im Blut und im Liquor von MS Patienten, wobei während klinischer Verschlechterungen die Konzentration vor allem im Blut anstieg [166]. Obwohl die Th1-Zellen im Liquor und Blut von MS-Patienten etwa 10-fach höherer Anzahl als die Th17-Zellen vorhanden waren, war die Anzahl von Th17-Zellen im Vergleich zu Gesunden ebenfalls signifikant erhöht [33]. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Zellen, die positiv für IFN-γ und 13 1. Einleitung IL17 sind, die Bluthirnschranke leichter überwinden [124]. Demnach existiert wahrscheinlich ein Zusammenspiel von Th1- und Th17-Zellen, welches zur Formation von entzündlichen Läsionen beiträgt. Eine Studie mit einem neutralisierenden Antikörper gegen die p40-Untereinheit von IL-12 und IL-23 zeigte keine Verbesserung der Krankheit, obwohl so sowohl die Th1Differenzierung als auch die IL-17 Produktion durch Th17-Zellen hätte unterdrückt werden sollen [228]. Die Gründe für das fehlende Ansprechen auf die Therapie bleiben fraglich. So ist beispielsweise unklar, ob der Antikörper überhaupt die Möglichkeit hatte, die BHS zu überwinden. Eines der gängigen Therapieregimes ist die Verabreichung von IFN-β. Es vermindert die Th1-Antwort und führt zu signifikant geringeren Konzentrationen von IFN-γ und dem Transkriptionsfaktor T-bet. Die Konzentration von IL-17 hingegen wird nicht signifikant vermindert [58]. Es sprechen jedoch nicht alle Patienten gut auf eine Therapie mit IFN-β an. Eine Beteiligung von Th17-Zellen ist demnach wahrscheinlich und es ist möglich, dass bei den verschiedenen Verlaufsformen unterschiedliche Entzündungsmediatoren und Zelltypen vorherrschen. 1.3.2 Die Rolle antigenpräsentierender Zellen 1.3.2.1 Makrophagen und Mikroglia bei EAE Makrophagen und Mikroglia sind eng verwandte Zellpopulationen, die im ZNS ähnliche Funktionen ausüben und beide F4/80 exprimieren [202]. Sie gelangen schnell zu entzündlichen Läsionen und mediieren die Immunantwort. Nichtphagozytierende Makrophagen aus der Peripherie können sich im ZNS zu Mikroglia umwandeln [74] und umgekehrt [28]. Sie präsentieren Antigene über MHC-II Moleküle, welche nach Konno et al. [129] in der EAE vermehrt vorhanden sind. Im Gegensatz zu aus dem Blut stammenden perivaskulären Makrophagen, denen eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsinduktion (Aktivierung von enzephalitogenen CD4+-T-Zellen) zugeschrieben wird [102], 14 1. Einleitung trägt eine Expression von MHC-II über Mikroglia eher zu einer Aktivierung von regulatorischen T-Zellen, sprich zu einer Eindämmung der Inflammation, bei [5]. Bei Makrophagen hingegen ist der Anteil an MHC-II- und CD45-Expression im Vergleich zu dem der Mikroglia größer [68+125]. Makrophagen und Mikroglia sind durch die Präsentation von neuen Antigenen am Epitope Spreading beteiligt [173]. Dieses findet z.B. dann statt, wenn Phagozyten Myelinbestandteile von zerstörten/demyelinisierten Axonen ingestieren und diese dann erneut präsentieren. Makrophagen und Mikroglia fungieren jedoch nicht nur als antigenpräsentierende Zellen, sondern schütten auch diverse Zytokine und Chemokine aus, die überwiegend proinflammatorische (IL-1, INF-γ, TNF-α, GMCSF, IL-12, IL-23) aber auch anti-inflammatorische (IL-10, TGF-β) Funktionen ausüben [209] und zur weiteren Rekrutierung von Leukozyten in das ZNS führen. Des Weiteren setzen sie freie Radikale (NO) [127] sowie den exzitatorischen Transmitter Glutamat frei, der in großen Mengen schädlich für Neurone und Oligodendrozyten ist. Nach Ergebnissen von Werner et al. besteht eine positive Korrelation zwischen Glutamatkonzentration und axonalem Schaden [286]. Es lassen sich zwei Phänotypen von Makrophagen unterscheiden, die jeweils unterschiedliche Funktionen ausüben: der M1-Phänotyp (klassisch aktiviert, das heißt via LPS, IFN-γ und IL-12) trägt über die Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine zur ZNS-Destruktion bei und hat Einfluss auf die Aktivierung von TZellen sowie deren Migration in das ZNS. Er ist vor allem in der akuten Phase der EAE präsent. Der M2-Phänotyp (alternativ aktiviert, das heißt via IL-4, IL-10 und IL-13) weist hingegen regulatorische und antiinflammatorische Funktionen auf und ist eher in den späteren EAE-Phasen zu finden. Beim M2-Phänotyp existieren jeweils noch weitere Unterformen (a-c), die zum Teil proinflammatorische Prozesse begünstigen [176+278]. Ein Ungleichgewicht der unterschiedlichen Phänotypen scheint zur Pathogenese der EAE beizutragen (zusammengefasst in [118]). In diversen Studien konnte man herausarbeiten, dass die aus dem Blut stammenden Makrophagen von funktioneller Relevanz in der EAE sind. Wenn 15 1. Einleitung Makrophagen entfernt wurden, konnte keine EAE mittels adoptiven Transfers von T-Zellen ausgelöst werden. Obwohl die Extravasation der Leukozyten aus dem Blut nicht verhindert wurde und eine Zytokinfreisetzung vorhanden war, infiltrierten Lymphozyten das Parenchym nicht. Im Gegensatz zu den Kontrollmäusen kam es nicht zur Demyelinisierung und die Freisetzung von iNOS und TNF-α wurde verhindert [260]. Eine Erklärung dafür bietet eine Studie von Agrawal et al [2]. Zum besseren Verständnis muss aber zunächst der Aufbau der BHS etwas genauer betrachtet werden. Sie beinhaltet zwei Basalmembranen: eine endotheliale und eine parenchymale, die jeweils unterschiedlich zusammengesetzt sind [238]. Die endotheliale wird durch die Zellen des Endothels, die parenchymale durch Astrozyten und assoziierte leptomeningeale Zellen gebildet [214]. Man geht davon aus, dass autoreaktive T-Zellen in der EAE mit den endothelialen Lamininen interagieren (über die Interaktion von α4-Integrin und VCAM-1 [292]) und so die endotheliale Basalmembran, jedoch nicht die parenchymale Basalmembran überwinden können [238]. Symptome treten aber erst dann auf, wenn die Lymphozyten in das ZNS-Parenchym einwandern. Den Ergebnissen von Agrawal et al. zur Folge sind Makrophagen für die Überwindung der parenchymalen Basalmembran verantwortlich. Sie setzen Gelatinase frei (MMP 2 und MMP 9), welche die Laminine an der parenchymalen Basalmembran zerstört und so die Einwanderung von Lymphozyten ermöglicht [2]. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich, wenn in aus dem Blut stammenden Makrophagen MHC-Antigene, kostimulatorische Moleküle (wie CD40) oder TNF-α ausgeschaltet wurden [102+242]. Das klinische Bild ließ sich so verbessern oder sogar die Krankheitsinduktion verhindern. Heppner et al. konnten zeigen, dass die Depletion von Mikroglia ebenfalls zu einem verbesserten klinischen Bild, weniger Infiltraten und einem späteren Beginn der Krankheit führte [101]. Erneut scheint es ein komplexes Zusammenspiel der unterschiedlichen Zelllinien bzw. Untertypen zu sein, die an der Pathogenese von EAE beteiligt sind. 16 1. Einleitung 1.3.2.2 Makrophagen und Mikroglia bei MS In aktiven Plaques von MS-Patienten konnten Makrophagen in den Bereichen gefunden werden, an denen Demyelinisierung stattfindet [31]. Ihre Funktionen in der MS entsprechen denen der EAE: sie produzieren proinflammatorische Zytokine [209], Chemokine [237] und reaktive Stickstoffradikale [224]. Letztere wurden allerdings nur bei akuten, hingegen nicht bei chronischen Verlaufsformen der MS von Makrophagen freigesetzt [189] und tragen folglich zur Formation von akuten Läsionen bei. Wahrscheinlich nehmen Makrophagen neben der schädigenden, auch regulatorische und wiederherstellende Funktionen ein, worauf unter anderem die Ergebnisse von Kotter et al. hinweisen. Wie bereits erwähnt ist beispielsweise die Phagozytose von Myelinresten notwendig, damit es zur Remyelinisierung kommen kann [130]. Auch beim Menschen lassen sich die Makrophagen in M1- und M2-Phänotypen unterteilen, deren Funktionen den in der EAE beteiligten Makrophagen entsprechen. So wurde z.B. durch die Gabe von IFN-β eine Vermehrung der Makrophagen vom M2-Phänotyp beobachtet [5]. 1.3.2.3 Dendritische Zellen bei EAE und MS Dendritische Zellen sind eine weitere Zelllinie, die in der Lage ist, Antigene im ZNS zu präsentieren, so auch myelinspezifische Antigene für CD4 +-T-Zellen bei der EAE. Nach Bailey et al. entwickeln sich die CD4+-T-Zellen nach Stimulation von im ZNS angereicherten dendritischen Zellen vor allem zum Th17-Phänotyp [10]. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass eine EAE durch den Transfer von myelinspezifischen dendritischen Zellen (MOG:35-55) ausgelöst werden kann [283]. In einer neuen Studie, in der die Wirkung eines Phosphatidylinositol-3-Kinase-Inhibitors auf dendritische Zellen getestet wurde, konnten diese gehemmt und somit eine Verbesserung der EAE mit geringeren Spiegeln von IFN-γ und IL-17 erreicht werden [291]. 17 1. Einleitung Bei MS-Patienten stellten Zozulya et al. eine Erhöhung der Anzahl dendritischer Zellen in Blut, Liquor und Läsionen im ZNS fest [300]. Außerdem produzierten die Zellen eine höhere Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IFN-γ und IL-6) [112]. Iwamoto et al. untersuchten 2007 die Einflüsse von TNF-α auf humane Monozyten und fanden heraus, dass sich diese in Anwesenheit von Lipopolysacchariden zu dendritischen Zellen oder Makrophagen entwickeln, die eine hohe Anzahl von Effektormolekülen freisetzen (TNF-α, Matrixmetalloproteasen, IL-23). Reife dendritische Zellen benötigen außerdem die Stimulation über TNF-α, um eine Th1- oder Th17Antwort auszulösen. Folglich wird über dendritische Zellen auf die Immunantwort von Th1- und Th17-Zellen Einfluss genommen [115]. 1.3.3 Weitere beteiligte Zelllinien 1.3.3.1 CD8+-T-Zellen bei EAE und MS Neben CD4+-T-Zellen sind auch die zytotoxischen CD8+-T-Zellen (CTL) mögliche Mitverursacher von Läsionen im ZNS. Es konnte gezeigt werden, dass CTLs in der Lage sind Neuriten anzugreifen [174]. Sie setzen außerdem Perforine frei, die eine Schädigung der Zellen im ZNS hervorrufen können und zu der Desintegrität der BHS beitragen [135+137]. Im Gegensatz zu CD4+-TZellen, interagieren CD8+-T-Zellen nicht mit MHC II sondern mit MHC I, das auf jeder Zelle vorhanden ist und nach Neumann et al. auf Neuronen induziert werden kann [183]. Kreiert man nun Knockout-Mäuse, denen MHC I fehlt, kommt es zwar noch zur Demyelinisierung, der axonale Schaden fällt jedoch deutlich geringer aus und die Nervenleitgeschwindigkeit wird ebenfalls nicht beeinflusst [218]. Auch eine passive EAE-Auslösung mit MOG:35-55 spezifischen CD8+-T-Zellen ist möglich [248]. Bei der Auslösung von EAE mit MOG:37-46, welches kein CD4+-T-Zellepitop darstellt, kam es zur Bildung von IFN-γ-ausschüttenden CD8+-T-Zellen [77]. Man geht mittlerweile davon aus, dass es entsprechend den CD4+-T-Zellen auch bei der CD8+-Zelllinie sowohl 18 1. Einleitung regulatorische als auch zytotoxische Unterformen gibt, die jeweils unterschiedliche Zytokinmuster aufweisen [59]. Bei MS-Patienten konnte man feststellen, dass a) CTLs in das Hirnparenchym einwandern, während CD4+-T-Zellen eher meningeal und perivaskulär bleiben [82], b) in Läsionen mehr CD8+- als CD4+-T-Zellen zu finden sind [97] und c) der Axonschaden, ähnlich wie im Mausmodell, mit der Anzahl der infiltrierten CD8+T-Zellen korreliert [25]. Außerdem setzten mit IL-23 stimulierte CD8+-T-Zellen sogar in größerem Ausmaß IL-17 frei als CD4+-T-Zellen [275]. Wahrscheinlich haben demnach auch CD8+-T-Zellen einen Anteil an der Läsionspathologie, insbesondere in Bezug auf die axonale Pathologie. Die Demyelinisierung hingegen lässt sich nach diesen Ergebnissen eher nicht auf CD8 +-T-Zellen zurückführen. 1.3.3.2 B-Zellen in EAE und MS Eine EAE konnte zwar nicht durch den Transfer myelinspezifischer Antikörper ausgelöst werden [141], B-Zellen scheinen aber trotzdem durch ihre Funktion als antigenpäsentierende Zellen und durch die Ausschüttung von Antikörpern zur Pathogenese beizutragen. Ein Modell der EAE, in dem B-Zellen beteiligt sind, ist das MP4-Modell, mit dem auch bei C57BL/6-Mäusen eine EAE mit BZellbeteiligung ausgelöst werden kann. Dies ist insofern interessant, als dass die meisten genveränderten Mäuse C57BL/6-Maus-Kreuzungen sind [136]. Das MP4 ist ein Fusionsprotein aus MBP und PLP und wurde ursprünglich als mögliches Ziel für MS-Therapeutika entwickelt [64]. B-Zellen sind dabei vor allem bei der chronischen mit MP4-induzierten EAE vorherrschend und organisieren sich in lymphfollikelartigen Aggregaten [135]. Bei Mäusen, denen B-Zellen fehlen, kann keine EAE ausgelöst werden. Wenn man ihnen aber myelinspezifische Antikörper überträgt (hier MOG-spezifisch), wird die Auslösung wieder möglich [157]. Bei Mäusen, bei denen man über genetische Modifikationen die Antikörperproduktion erhöhte, fand man eine ausgeprägtere EAE [150]. Neben dieser direkt pathogenen Rolle der B-Zellen über eine 19 1. Einleitung Antikörperproduktion, wirken sie außerdem als antigenpräsentierende Zellen, die mit T-Zellen interagieren und sie zur Ausschüttung von IL-17 und IFN-γ anregen. Die Rolle der B-Zellen ist sehr komplex. So verfügen sie wahrscheinlich zusätzlich noch über regulatorische Funktionen, die allerdings nur vor der Krankheitsinduktion greifen. Wenn man B-Zellen vor der Immunisierung entfernte, verlief die Krankheit schlimmer. Eine Entfernung nach der Induktion hingegen hatte keine Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf [165]. Bei MS weist z.B. die Erhöhung der oligoklonalen IgG-Banden im Liquor, die man zur Diagnosestellung verwendet, auf eine Beteiligung von Antikörpern und somit der B-Zellen hin. Diese Antikörper sind zum Teil myelinspezifisch gegen MBP, PLP und MOG [281]. In MS-Läsionen konnten außerdem Immunglobuline und Komplementfaktoren in der Nähe von B-Zellen gefunden werden [245], was, wie oben bereits erwähnt, einem Läsionsmuster vom Typ II entspricht. Dies stellt den bei MS-Patienten am weitesten verbreiteten Läsionstyp dar. Mit einem früheren Krankheitsbeginn, einer vermehrten Krankheitsaktivität und dem Tod einhergehende meningeale B-Zell-Aggregate konnten bei 40% der Patienten mit SP-MS gefunden werden. Bei einem primär progredienten Verlauf der MS wurden diese follikelartigen Strukturen hingegen nicht beobachtet, wobei fraglich ist, ob der PPMS eine autoimmune Genese zu Grunde liegt. Möglicherweise sind stärkere Immunreaktionen zur Auslösung der Aggregation der Zellen zu Follikeln notwendig, die gleichzeitig mit einer vermehrten Schädigung des Parenchyms einhergehen. Außerdem könnte es so zu einer chronischen Schädigung kommen, die von den aggregierten B-Zellen ausgeht. Bei Betroffenen, bei denen sich Follikel fanden, waren eine vermehrte Demyelinisierung, mehr aktive kortikale Läsionen, eine vermehrte Aktivierung von Mikroglia und ein vermehrter Verlust von Neuronen zu beobachten. Auch eine vermehrte Freisetzung humoraler Faktoren könnte zu dieser Schädigung beitragen [96+159]. Weitere Studien zeigten, dass die Entstehung von follikelartigen Formationen mit einer Schädigung der parenchymalen Basalmembran einhergeht [110+160]. B-Zellen scheinen also ebenfalls ihren Anteil an der Pathogenese von MS zu haben. 20 1. Einleitung 1.4 Histopathologie bei MS und EAE Das histologische Bild in EAE und MS ist im Allgemeinen gekennzeichnet durch die Trias Entzündung, Demyelinisierung und axonalen/neuronalen Schaden. Dabei ist die Entzündung der Prozess, der bis dato am besten verstanden ist. Wie oben bereits beschrieben, überwinden autoreaktive CD4 +-T- Zellen die BHS, werden reaktiviert und es kommt zu einer Kaskade von Immunreaktionen, die in einer Demyelinisierung und der Bildung von entzündlichen Herden (Plaques) endet. Wandern dann Astrozyten ein und expandieren, können diese sich um die Plaques herum versammeln und eine abschirmende Glia-Narbe (Sklerose) entsteht, die gegen weiteren Schaden schützt [6]. Während demyelinisierte Nervenfasern zwar durch eine geringere Nervenleitgeschwindigkeit auffallen, bleiben die Axone jedoch funktionsfähig und es kann, sofern die Oligodendrozyten noch intakt sind, zur Remyelinisierung kommen. Ist allerdings das Axon selbst geschädigt, führt dies zu irreversiblen neuronalen Schäden. Prinzipiell wurde der axonale Schaden zwar schon im 19. Jahrhundert (1868) von Charcot beschrieben, jedoch lange außer Acht gelassen. Erst 1998 identifizierten Trapp et al. den axonalen Schaden als ein Merkmal, das in zahlreichen Läsionen auftritt [261]. Axone sind aufgrund ihrer Morphologie und Stoffwechsellage potentiell gefährdet: Sie sind sehr lang und stoffwechselinaktiv. Mögliche Ursachen für axonale Schäden können z.B. Transportdefekte, Ischämien oder auch freigesetzte Entzündungsmediatoren sein [45]. In der MS werden als Ursachen für axonalen Schaden der direkte Angriff über Antikörper oder CTLs, die toxische Wirkung von Effektormolekülen wie Glutamat oder Radikale - sowie sekundär schädigende Effekte nach erfolgter Demyelinisierung angenommen [193]. Ist es erst einmal zu einer Beschädigung des Axons gekommen, stirbt, gemäß dem Prozess der Wallerschen Degeneration, zunächst der distale, vom Perikaryon abgetrennte Teil des Axons ab. Fehlen zusätzlich Verbindungen zu anderen Neuronen, kann es dann zum Absterben der proximalen Axonanteile 21 1. Einleitung und des Perikaryons selbst kommen. Ein Prozess, der über neuronale Verbindungen retrograd oder anterograd weiterlaufen und so auch räumlich weiter entfernte Neurone affektieren kann [201]. Mittels magnetresonanzspektroskopischen Analysen mit neuronalen Markern wie N-Acetyl-Aspartat (NAA), kann axonaler Schaden mittlerweile relativ gut detektiert werden, wobei eine Korrelation mit dem Krankheitsausmaß/klinischen Defizit bei MS-Patienten gefunden werden konnte [55+70]. NAA wird in intakten neuronalen Mitochondrien gebildet und spiegelt so deren Metabolismus wieder. In MS-Läsionen ist seine Synthese entsprechend vermindert. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen und immunhistochemischen Färbungen des Gewebes konnten einige Charakteristika von axonalem Schaden definiert werden. Dazu gehörten ein vergrößerter Durchmesser der axonalen Mitochondrien (auch bezeichnet als feine axonale Pathologien), da sie auf das Minderangebot von ATP reagieren [161] und eine Verminderung des Abstands benachbarter axonaler Neurofilamente (NNND, nearest neighbour neurofilament distance) sowie eine Veränderung des Durchmesser der Axone selbst. Dieser ist abhängig von der Anzahl der Neurofilamente und entscheidend für die Nervenleitgeschwindigkeit und korrekte Leitungsübertragung [156]. Ein weiteres histologisches Charakteristikum ist der sogenannte axon end bulb, der dadurch zustande kommt, dass das distale Ende eines durchtrennten Axons versiegelt wird und anschwillt. Als immunhistochemischen Nachweis gibt es die Möglichkeit einer Färbung mit Antikörpern gegen nicht-phosphoryliertes Neurofilament (SMI 32). Unter physiologischen Bedingungen sind Neurofilamente stark phosphoryliert und werden daher nicht durch SMI 32 angefärbt. Verlieren Axone durch Schädigung nun aber ihre Phosphorylierung, kann dies durch eine Färbung mit SMI 32 sichtbar gemacht werden [261]. Lange Zeit wurde angenommen, dass es erst im späten Krankheitsverlauf zu axonalem Schaden kommt. Diverse Studienergebnisse weisen jedoch darauf hin, dass axonaler Schaden ein frühes Merkmal ist, dieser jedoch klinisch nicht in Erscheinung tritt, bis ein kritisches Level erreicht ist und der Ausfall der Neurone nicht mehr kompensiert werden kann. Bei Mäusen entspricht dies 22 1. Einleitung einem Verlust von 15-30% der Neurone [46+290]. Wie genau der axonale Schaden bedingt wird, ist allerdings fraglich. Es fanden sich in EAE-Studien keine oder eine nur geringe Korrelationen zu der Anzahl der T-Zellen im Parenchym [66+105+280]. Wie hängen nun aber Inflammation, Demyelinisierung und Neurodegeneration zusammen? Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass Demyelinisierung axonalen Schaden bedingt (Outside-In-Modell). Tsunoda et al. [265] und Peterson et al. hingegen vermuten, dass axonaler Schaden auch der Demyelinisierung vorausgehen kann (Inside-Out-Modell). Die Annahme beim Outside-In-Modell ist, dass es erst zur Demyelinisierung kommt, die dann zu axonalem Schaden führt. Dies ist z.B. bei EAE der Fall, wenn sie durch adoptiven Transfer ausgelöst wurde. Beim Inside-Out Modell hingegen wird das Axon geschädigt, z.B. durch virale Infektionen, reaktive Toder B-Zellen oder Effektormoleküle wie TNF-α und Glutamat. Im Verlauf breitet sich der Schaden dann über wallerische Degeneration oder die Unterbrechung der Verbindung zwischen Oligodendrozyten und Axonen aus. Durch die Aktivierung von weiteren Immunzellen wie z.B. Mikroglia erstreckt sich der Schaden auf die Oligodendrozyten. Makrophagen und andere phagozytierende Zellen nehmen Anteile des beschädigten Myelins, der Oligodendrozyten und der Axone auf und präsentieren die Antigene den ruhenden autoreaktiven Tund B-Zellen, die daraufhin reaktiviert werden. Es kommt zur Demyelinisierung und weiterem axonalen Schaden. Dieser Kreislauf kann z.B. bei Modellen mit MOG:35-55 induzierter EAE gefunden werden [203]. Auch bei der MS gibt es mehrere Hypothesen in Bezug auf die Interaktion von Entzündung und Neurodegeneration. Steinman nach zu urteilen verläuft MS in zwei Phasen. Die erste Phase ist gekennzeichnet durch entzündliche Prozesse, während zunächst myelinhaltige Makrophagen im Vordergrund stehen und Lymphozyten erst später eine Rolle spielen. Sie weist einen schubförmigremittierenden Verlauf auf. Im Anschluss kommt es dann in der zweiten Phase zur Neurodegeneration mit irreversiblen neurologischen Defiziten (sekundär progrediente Verlaufsform) [243]. Ähnlich besagt eine andere Hypothese, dass die unterschiedlichen Verlaufsformen unterschiedliche pathologische Muster mit 23 1. Einleitung sich bringen, die RR-MS eine charakteristische Entzündung und die PP-MS eine vorherrschende Neurodegeneration. In fortgeschrittenen Krankheitsstadien korreliert die Neurodegeneration dann mit dem Auftreten irreversibler neurologischer Defizite [54]. Das MOG:35-55-abhängige EAE-Modell bildet diese Charakteristika der Histopathologie gut ab, da es eine Korrelation von Läsionsformation und Krankheitsstadien durch Krankheitsschweregrad die An- oder aufweist Abwesenheit von und die Entzündung gekennzeichnet sind. Während in der akuten Phase viele entzündliche Infiltrate und viel Ödem vorhanden sind, nehmen diese im Verlauf ab. In der chronischen Phase dominieren dann Myelin- und Axonpathologien [212]. Um die Ergebnisse der Tierstudien auf die MS übertragen zu können, ist es notwendig Tiermodelle zu etablieren, die den jeweiligen Krankheitsverläufen der MS größtmöglich ähneln und die Untersuchung der beteiligten Faktoren ermöglichen. Einer der in MS, EAE und vielen weiteren Autoimmunkrankheiten vorhandene Mediator ist TNF-α. 1.5 Tumor-Nekrosefaktor alpha (TNF-α) Es gibt diverse Zellen im ZNS, die TNF-α freisetzen und einige Erkenntnisse, die nahe legen, dass TNF-α am Pathomechanismus von Autoimmunkrankheiten beteiligt ist. Um dies besser nachvollziehen zu können, muss man zunächst die Grundlagen zu TNF-α und seinen Rezeptoren näher betrachten. 1.5.1 Funktion und Rezeptorprofil TNF-α wurde bereits vor über 45 Jahren von Carswell et al. identifiziert, mit der Annahme, dass es die Nekrose von Tumorzellen verursacht - daher auch seine Namensgebung [37]. Kurze Zeit später konnte seine DNA-Struktur ermittelt und das Protein geklont werden [200]. Parallel dazu isolierten Beutler et al. einen Faktor aus Makrophagen, den sie Cachexin nannten [23] und es stellte sich 24 1. Einleitung heraus, dass dieser identisch mit TNF-α ist. Makrophagen schütten folglich TNF-α aus. Schnell wurde klar, dass TNF-α noch deutlich mehr Funktionen hat, als die Induktion der Nekrose von Tumorzellen, so z.B. eine erhebliche proinflammatorische Wirkung [53]. Bei einer Überproduktion führt es zu Fieber, Hypotension und septischem Schock [259]. Hinzu kommt, dass TNF-α nicht nur von Makrophagen, sondern von vielen weiteren Zelltypen (T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen, Monozyten, Granulozyten, Mastzellen) und auch von nichthämatopoetischen Zellen ausgeschüttet wird [277]. Im ZNS sezernieren Mikroglia, Astrozyten und einige Neuronenpopulationen TNF-α [170]. Die ursprüngliche Idee, TNF-α als Behandlungsoption in der Krebstherapie zu verwenden, ließ also viele systemische Nebenwirkungen vermuten und wurde daraufhin wieder verworfen. TNF-α verfolgt aber nicht nur proinflammatorische Funktionen, sondern trägt beispielsweise zur Formation von Granulomen in mykobakteriellen Infektionen und somit zur Begrenzung der Infektion bei [75]. Um die Funktionen von TNF-α genauer zu verstehen, müssen seine Rezeptoren betrachtet werden. Mittlerweile sind über 40 Mitglieder der TNF/TNF-Rezeptorfamilie bekannt, die jeweils mit verschiedenen Liganden interagieren und sich durch intrazelluläre cysteinreiche Domänen auszeichnen [24]. Im Folgenden hervorgehoben werden die membranständigen Rezeptoren TNF-Rezeptor Typ 1 (TNF-R1), auch bekannt als p55-, CD120a-TNF-Rezeptor, und TNF-Rezeptor Typ 2 (TNFR2/p75/CD120b). TNF-R1 ist auf nahezu allen Zellen ausgenommen Erythrozyten vorhanden, die Expression von TNF-R2 hingegen ist induzierbar und findet nur auf Endothel-, hämatopoetischen und neuronalen Zellen statt [1]. TNF-α selbst existiert in zwei Formen: als monomeres Transmembranprotein, dem sogenannten Prä-TNF oder auch transmembranen TNF-α (mTNF), von dem mittels TACE (TNF Converting Enzyme) das lösliche TNF-α (sTNF) abgespalten wird, welches die zweite Form darstellt. Um seine Wirkung zu entfalten, müssen die monomeren TNF-Moleküle noch zu Trimeren aggregieren. Während sTNF eine höhere Affinität zum TNF-R1 hat, wird TNFR2 eher durch mTNF aktiviert. Prinzipiell können die Liganden aber jeweils an beide Rezeptoren binden [98] (siehe auch Abbildung 1). 25 1. Einleitung Abbildung 1: Schematische Darstellung der TNF-Rezeptor-Signalwege. Vom transmembranen TNF (mTNF) wird durch das TNF-Converting-Enzyme (TACE) lösliches TNF (sTNF) abgespalten. Dies formt Trimere und aktiviert bevorzugt TNF-R1, mTNF hingegen aktiviert vorzugsweise TNF-R2. Durch TNF-R1 werden vor allem zur Apoptose führende Signalwege ausgelöst, sowohl über TRADD (Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein) und FADD (Fas-associated death domain) als auch über reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aus Mitochondrien. Diese führen zu einer Aktivierung verschiedener Caspasen, über die eine Apoptose der jeweiligen Zelle ausgelöst wird. Über TNF-R2 und über TNF-R1 werden außerdem anti-apoptotische Signalkaskaden in Gang gesetzt. Durch TNFRezeptor-assoziierte Faktoren (TRAF, in diesem Fall TRAF2) wird NF-κB aktiviert, was wiederum zur Aktivierung antiapoptotischer Gene führt. TNF-α-produzierende Zellen sind unter anderem Makrophagen und T-Zellen. (Graphik angelehnt an [98]) TNF-R1 besitzt eine Todesdomäne und ist in der Lage, über die Aktivierung von Caspasen, Apoptose zu induzieren, allerdings nur, wenn die Proteinsynthese nicht intakt ist, sprich NF-κB, welches antiapoptotisch agiert, die Apoptose nicht hemmen kann [293]. Neben dieser proapoptotischen Funktion, wird über TNFR1 die Transkription von proinflammatorischen Genen induziert [143] (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, RANTES, TNF-α, Chemokine, induzierbare NO-Synthase etc.; zusammengefasst von Kruglov et al. [133]. 26 1. Einleitung Mit Hilfe von TNF-R1-Knockout-Mäusen wurde erkannt, dass TNF-R1 im Wesentlichen an der Formation von lymphatischem Gewebe beteiligt ist. So fehlen in TNF-R1-/--Mäusen beispielsweise die Peyer Plaques im Darm [163]. Auch die Formation von Keimzentren der B-Zellen wird über TNF-R1 beeinflusst. Ist der Rezeptor nicht vorhanden, fehlen diese [198]. Die Abwehr von intrazellulären Erregern wird ebenfalls größtenteils über eine Signaltransduktion von TNF-R1 geregelt. So sind Mäuse, denen TNF-R1 fehlt, deutlich anfälliger gegenüber Infektionen mit Tuberkulose, Listerien, Toxoplasmen, Pilzen etc. [75+221]. TNF-R2 induziert außerdem die Produktion von Zytokinen und anderen proinflammatorischen Molekülen sowie antiapoptotischen Genen. Die Todesdomäne ist bei ihm nicht vorhanden, über Interaktion mit TNF-R1 trägt er jedoch auch zur Apoptoseinduktion bei [126]. In aktivierten CD8+-Zellen initiiert er eine Apoptose auch unabhängig von TNF-R1 [297]. Diese These bestätigen Ban et al., die zeigen konnten, dass TNF-R2-Agonisten in der Lage waren autoreaktive CD8+-Zellen abzutöten, während gesunde und CD4+-Zellen nicht zerstört wurden [11]. Der Mechanismus ist allerdings noch nicht im Detail verstanden. Weiterhin spielt TNF-R2 eine wichtige Rolle in Bezug auf die Proliferation und das Überleben von T-Zellen in der Peripherie. Über ihn werden regulatorische T-Zellen aktiviert und deren Expansion beeinflusst [41]. Die verschiedenen Rezeptoren lösen demnach teilweise identische und teilweise gegensätzliche Vorgänge aus. Neben der protektiven Rolle bei Infektionen mit intrazellulären Erregern nimmt TNF-α bei Entzündungen und Autoimmunkrankheiten, wie dem oben erwähnten septischen Schock, der rheumatoiden Arthritis, Morbus Crohn, Diabetes mellitus Typ 1, Psoriasis und wahrscheinlich auch bei demyelinisierenden Erkrankungen wie der MS, gleichzeitig eine pathogene Rolle ein. 27 1. Einleitung 1.5.2 TNF-α in Autoimmunkrankheiten In der Pathologie vieler Autoimmunkrankheiten spielen proinflammatorische Zytokine, wie TNF-α eine entscheidende Rolle. Daher kann es aufschlussreich sein, die Funktionen von TNF-α zu untersuchen, um die Pathogenese von Autoimmunkrankheiten besser nachvollziehen zu können und gegebenenfalls neue Ansatzpunkte für Therapeutika zu finden. Bei der rheumatoiden Arthritis sind die Eigenschaften von TNF-α gut untersucht und es werden TNF-α-Inhibitoren zur Therapie eingesetzt. So kommt es durch eine Hemmung von TNF-α zu einer deutlichen Verbesserung der klinischen Symptomatik, der Laborparameter und des radiologischen Befundes [65+240]. Gleichzeitig finden sich bei den Betroffenen aber erhöhte Konzentrationen von Th1- und Th17-Zellen im Blut und den lymphatischen Organen, die proinflammatorische Zytokine produzieren. Dies untersuchten Notley et al. bei C57BL/6-Mäusen mit kollagen-induzierter Arthritis, dem Tiermodell der rheumatoiden Arthritis, und kamen zu dem Ergebnis, dass es zu einer Vermehrung von Th1- und Th17-Zellen kommt, die aus ungeklärten Gründen nicht die Gelenke erreichen. Sie konnten ebenfalls feststellen, dass sich, wenn TNF-α direkt nach der Immunisierung blockiert wird, nur die Th1-Zellen vermehren, während aus einer späteren Blockade eine erhöhte Konzentration von sowohl Th1- als auch Th17-Zellen resultiert. Aus weiteren Versuchen mit genveränderten Mäusen, bei denen selektiv TNF-R1 oder TNF-R2 inhibiert wurde, leiteten sie ab, dass TNF-R1 für die Inhibition von Th1-/Th17-Zellen verantwortlich ist. Bei TNF-R1-defizienten Mäusen war außerdem die Konzentration der p40-Untereinheit, die den Zytokinen IL-12 und IL-23 gemeinsam ist, deutlich erhöht, was die Vermehrung der Zellen und die gesteigerte Zytokinproduktion erklärt [185]. Auch bei EAE und MS wird die Rolle von TNF-α intensiv untersucht. Wheeler et al. konnten, ähnlich wie Notley et al., eine vermehrte IL-12 und IL-23 Expression bei mit MOG:35-55 immunisierten C57BL/6-Mäusen feststellen, wenn TNF-R1 fehlte. Hier war die IFN-γ-Ausschüttung vermehrt und außerdem 28 1. Einleitung die Konzentration von IFN-γ-positiven CD4+-Zellen im ZNS deutlich erhöht. Die IL17-Freisetung blieb hingegen unbeeinflusst. Dessen ungeachtet zeigten sich bei TNF-R1-/--Mäusen ein verspäteter Krankheitsbeginn und abgemilderte Symptome im Vergleich zum Wildtyp, was auf eine protektive Rolle von IFN-γ, z.B. über eine Beeinflussung der Zytokinausschüttung, hinweist [287]. Einige Studien zeigten eine TNF-R1-abhängige Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1 auf Astrozyten, das Leukozyten den Eintritt in das ZNS ermöglicht [15+85]. TNF-α und sein Rezeptor sind demnach wichtig für die Migration von Entzündungszellen in das ZNS und der damit verbundenen Krankheitsauslösung. Nach Ergebnissen von Kassiotis und Kollias ist es zu Beginn der Krankheit positiv, wenn TNF-α fehlt, im Verlauf ergibt sich jedoch ein Zusammenhang mit autoimmunem Myelinschaden. Myelinspezifische TGedächtniszellen werden nicht eliminiert und akkumulieren in der Milz, so dass es zum Einsetzen einer späten chronischen EAE kommt. Das Fehlen von TNFα führte nur zum verspäteten Einsetzen der Krankheit (fünf Tage), während die daraufhin entwickelte EAE bei TNF-/--SJL-Mäusen verschlimmert war (mehr perivaskuläre Infiltrate und Demyelinisierung) [83]. Im Krankheitsverlauf ist TNF-R2 wahrscheinlich nötig, damit es zur Besserung der Symptomatik kommt. Arnett et al. belegten die Rolle von TNF-α bei der Stimulation von Oligodendrozyten zum Wachstum und zur Remyelinisierung [8]. Eine erhöhte Konzentration von TNF-α wurde nicht nur bei der EAE, sondern auch in entzündlichen Läsionen und im Liquor von MS-Patienten gefunden [106+229]. Außerdem ließ sich ein Zusammenhang zwischen TNF-α und der Krankheitsprogression feststellen: bei Patienten mit chronisch progredienter MS war die Konzentration von TNF-α im Liquor im Vergleich zu Patienten mit einer stabilen MS oder anderen neurologischen Erkrankungen erhöht. TNF-α korrelierte im Liquor positiv mit dem Schweregrad der Behinderung gemessen mit dem EDSS (Expanded Disability Status Scale) und der Verschlechterung der neurologischen Symptomatik [232]. Dies und die zunächst erfolgversprechenden Ergebnisse mit der Blockade von TNF-α in der EAE und anderen Autoimmunkrankheiten, wie rheumatoider Arthritis, führten dazu, dass 29 1. Einleitung man eine Neutralisation von TNF-α auch bei MS-Patienten versuchte, leider mit negativen Ergebnissen. 1.5.3 TNF-α-Inhibition Es gibt verschiedene Möglichkeiten der Blockade von TNF-α bzw. seiner Wirkung. Man kann lösliches TNF-α abfangen und membrangebundes TNF-α blockieren. Auch Ansatzpunkte an den TNF-Rezeptoren sind denkbar. Außerdem könnte man versuchen die übermäßige Synthese von TNF-α zu inhibieren. Es gibt mittlerweile eine ganze Reihe von anti-TNF-α-Antikörpern: Infliximab, Certolizumab, Golimumab und die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Etanercept und Adalimumab [258]. Adalimumab (Humira®) ist ein monoklonaler humaner Antikörper gegen TNF-α, welcher bei Mäusen keine Wirkung hat. Etanercept (Enbrel®) hingegen ist ein rekombinanter TNF-R2, fusioniert mit dem Fc-Teil vom Immunglobulin G. Ein Immunglobulin-Fusionsprotein mit TNF-R1 ist ebenfalls unter dem Namen Lenercept bekannt und wurde unter anderem versuchsweise zur MS-Therapie eingesetzt. monoklonaler Infliximab (Remicade®) Antikörper gegen ist TNF-α. ein chimärer Relativ neu (Maus-Mensch) zugelassen sind Certolizumab (Cimzia®), ein pegylierter (mit Polyethylenglycol konjugiert) humanisierter anti-TNF-α-Antikörper, sowie Golimumab (Simponi®), ebenfalls ein humaner monoklonaler Antikörper gegen TNF-α. Sie blockieren sowohl lösliches als auch membrangebundenes TNF-α. Anwendungsgebiete sind z.B. die rheumatoide Arthritis, aber auch Morbus Crohn, Psoriasis und Morbus Bechterew. Aufgrund vielversprechender Ergebnisse im Tiermodell wurden zwei Studien mit anti-TNF-α-Antikörpern bei Patienten mit MS durchgeführt: Van Oosten et al. behandelten 1996 zwei Patienten mit schnell progredienter MS mit einem monoklonalen Antikörper gegen TNF-α (Infliximab) und beobachteten dann die klinischen Symptome, die kontrastmittelaufnehmenden Läsionen im MRT und 30 1. Einleitung den Immunstatus in Blut und Liquor. Es zeigten sich klinisch zwar keine neuen neurologischen Defizite, aber eine Vermehrung der Gadolinium-Anreicherung im Gehirn und eine erhöhte Konzentration von Leukozyten sowie ein erhöhter IgG-Index im Liquor, was auf eine vermehrte Durchlässigkeit der Bluthirnschranke und den Progress der Erkrankung hinweist. Anstatt die Aktivierung des Immunsystems zu hemmen, verstärkte die Behandlung diese und führte zu einer Erhöhung der Krankheitsaktivität [274]. Die Lenercept MS-Studiengruppe führte 1999 die zweite und bisher letzte Studie mit dem anti-TNF-α-Antikörper Lenercept gegenüber Placebo bei Patienten mit schubförmiger und sekundär progredienten MS durch. Dosisabhängig nahmen Attackenfrequenz und der Krankheitsschweregrad zu, woraufhin die Studie abgebrochen wurde. Die meisten Patienten entwickelten Antikörper gegen Lenercept, was zu vermehrtem Abbau des Medikaments führte. Es bleibt also fraglich, ob TNF-α überhaupt adäquat neutralisiert werden konnte. Nach den Misserfolgen dieser beiden Studien wurden keine weiteren Versuche mit TNF-α-blockierenden Medikamenten mehr initiiert. Hingegen gilt eine MS-Erkrankung als Kontraindikation für den Einsatz von TNF-α-Blockern, da sich bei einigen Patienten unter einer Therapie mit anti-TNF-α demyelinisierende Läsionen entwickelten. Der Datenbank der FDA zur Folge waren dies in den USA von 1998 bis 2001 von über 77.000 mit TNF-αInhibitoren behandelten Patienten mit rheumatoider Arthritis 19 Fälle, von denen 17 mit Etanercept und zwei mit Infliximab behandelt wurden, die demyelinisierte Läsionen aufwiesen [179]. Außerdem existieren diverse Fallberichte zur Entwicklung demyelinisierender Erkrankungen wie Optikusneuritiden [184], MS [249] und chronisch entzündlicher demyelinisierender Polyneuropathie [217]. Bis dato erfolgte die erfolgreiche Behandlung mit TNF-α-Inhibitoren von mehr als zwei Millionen Menschen [272], dabei wurden über 500 Fälle von neurologischen Erkrankungen als Nebenwirkungen beobachtet (zusammengefasst in [119]). Allerdings bleibt sowohl unklar wie hoch die Inzidenz von Demyelinisierungen im ZNS ist als auch, ob die Demyelinisierung tatsächlich auf die jeweiligen Medikamente zurückzuführen ist oder vielmehr eine Nebenerscheinung darstellt. In einer Fall-Kontroll-Studie von Bernatsky et 31 1. Einleitung al. wurde bei 10 000 mit TNF-α-Inhibitoren behandelten Patienten mit rheumatoider Arthritis bei etwa 30% demyelinisierende Erkrankungen beobachtet [21]. Eine Analyse von Fernández-Espartero et al., die die Daten der spanischen Datenbanken für Medikamenteninteraktionen und die bisher publizierten Literatur analysierten, ergab keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich einer erhöhten Inzidenz von einer Demyelinisierung unter anti-TNF-αTherapie. Die Inzidenz von MS, die mittels der Daten aus der spanischen Datenbank für den Einsatz von Biologicals bei rheumatoiden Erkrankungen (BIOBADASER) berechnet werden konnte, lag im Mittel bei 0,05 pro 1000 (95% Konfidenzintervall 0,01-0,33), indessen lag die Inzidenz der Normalbevölkerung bei 0,02-0,04 Fälle pro 1000 Menschen. Analysen der Daten von PubMed, Cochrane und EMBASE ergaben 48 Fälle von MS in Verbindung mit einer Therapie mit TNF-α Inhibitoren [71]. Inwiefern das Auftreten einer MS und die Therapie mit TNF-α-Inhibitoren zusammenhängen, bleibt also fraglich, sollte aber weiterhin evaluiert werden. 1.6 Zielsetzung der Arbeit Bei vielen Autoimmunkrankheiten gehört der Einsatz von TNF-α-Inhibitoren vor allem in fortgeschrittenen Stadien mittlerweile zum Therapiestandard. Man geht davon aus, dass TNF-α auch bei den Entzündungsprozessen in der EAE einer der wichtigen Mediatoren ist. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind allerdings noch nicht genau verstanden. Angesichts der Tatsache, dass in einer Studie zur chronisch entzündlichen Arthritis, dem Tiermodell der rheumatoiden Arthritis, im Effektororgan (Gelenk) eine deutliche Verminderung an schädigenden Th1- und Th17-Zellen und eine Besserung der Symptome beobachtet werden konnte [185], stellte sich die Frage, ob sich auch bei der EAE eine Verminderung der Zellzahlen im Effektororgan (ZNS), sowie eine klinische Verbesserung durch eine Blockade von TNF-α erreichen lässt. Bisher zeigten sich bei der Inhibition von TNF-α bei der EAE widersprüchliche Ergebnisse und der Einsatz von anti-TNF-α-Medikamenten löste bei MS eine 32 1. Einleitung Verschlechterung der Krankheit aus. Die Blockade von TNF-α soll vielmehr sogar eine Demyelinisierung als Nebenwirkung verursachen können. Es ist daher wichtig, die Wirkung von TNF-α genau zu analysieren, um Rückschlüsse auf mögliche neue Therapieoptionen ziehen zu können und zu verstehen, welche Prozesse bei einer TNF-α-Blockade ablaufen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen einer Inhibition von TNF-α auf Th1-Zellen in der Peripherie und im ZNS sowie parallel dazu die Histopathologie des Rückenmarks von mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen untersucht. Die histopathologischen Analysen wurden dabei nicht nur lichtmikroskopisch, sondern auch mittels Elektronenmikroskopie durchgeführt, um die Schädigungen noch detaillierter zu erfassen und neue Erkenntnisse über die pathologischen Prozesse zu gewinnen. Ziel der Studie war es, die Auswirkungen von TNF-α auf die Vorgänge im ZNS bei der EAE sowie die seiner Blockade auf beteiligte Zellreihen des Immunsystems und parallel dazu auf die Histopathologie des Rückenmarks zu untersuchen. Die Hypothese bestand darin, dass das TNF-α in entzündlichen Läsionen vorhanden ist und dort von Makrophagen freigesetzt wird. Es wurde angenommen, dass eine Blockade von TNF-α mit Enbrel®, entsprechend der Studie von Notley et al. [185], zu einer Verminderung der Th1-Zellzahlen im ZNS und zu einem verbesserten klinischen Verlauf führe sowie einen positiven Einfluss auf histopathologische Abläufe habe und folglich eine geringere Schädigung von Myelin und Axonen zu beobachten sein müsse. 33 2. Material und Methoden 2.1 Mäuse Sechs bis acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden von den Harlan Laboratorien (Sulzfeld, Deutschland) und Janvier (Saint Berthevin Cedex, Frankreich) gekauft und in individuell ventilierten Käfigen im Anatomischen Institut der Universität zu Köln gehalten. Das inkomplette Freund-Adjuvans (IFA) wurde aus einer 9:1 Mischung von Paraffinöl (EM Science, Gibbstown, New Jersey) und Mannit Monooleat (Sigma, Schnelldorf, Deutschland) hergestellt und dann unter Zugabe von 5 mg/ml Mycobakterium tuberculosis H37RA (Difco Laboratories, Franklin Lakes, New Jersey) zu komplettem Freund-Adjuvans (CFA) weiterverarbeitet. Die Mäuse wurden daraufhin durch eine subkutane Gabe von 100 g MOG:35-55 (EZ Biolab, Carmel, Indiana), emulgiert in CFA (Injektionsvolumen 200 μl), in beide Seiten der Flanken, immunisiert. Jede Maus erhielt am Tag der Immunisierung und jeweils 48 Stunden später intraperitoneal 200 ng Pertussis Toxin (List Biological Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) in 500 μl steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Die klinischen Symptome wurden anhand der standardisiert verwendeten EAE Scoring-Skala erhoben: (0-5) 0- keine Symptome, 1schlaffer Schwanz, 2- Hinterlaufschwäche, 3- Hinterlaufparese, 4- Quadriplegie, 5- Tod. Der klinische Score der Mäuse wurde dabei täglich von der Immunisierung bis zur Tötung bestimmt. An Tag 20 nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit CO2 eingeschläfert. Den Mäusen, die eine Behandlung erhielten, wurde ab dem dritten Tag nach der Immunisierung, entweder 100 μg Enbrel® (Pfizer, New York City, New York), 100 μg Humira® (AbbVie, North Chicago, Illinois) oder PBS (Injektionsvolumen 250 μl) verabreicht. Die Injektionen erfolgten jeweils jeden zweiten Tag. Enbrel® ist ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne vom TNF-R2/p75 und dem Fc-Fragment des 34 2. Material und Methoden humanen IgG1. Humira® ist vom gleichen Isotyp wie Enbrel®, neutralisiert aber das TNF-α bei Mäusen nicht. Alle Experimente wurden offiziell durch das LANUV genehmigt (AZ 2010.A629) und unter Berücksichtigung des deutschen Tierschutzgesetztes durchgeführt. 2.2 Histologie Um die Auswirkungen von anti-TNF-α auf die Rückenmarkspathologie in der MOG:35-55-induzierten EAE zu untersuchen, wurden Semi- und Ultradünnschnitte des lumbalen Rückenmarks von mit PBS (n=4), Enbrel® (n=4) oder Humira® (n=3) behandelten Mäusen angefertigt. Dafür wurden die Mäuse am 20. Tag nach der Immunisierung mit CO2 getötet und mit einer 4%iger Paraformaldehyd-/ 4%iger Glutaraldehyd-/ 0,1 M PBS-Lösung intrakardial perfundiert. Das lumbale Rückenmark wurde anschließend fixiert bei 4°C für mindestens 24 Stunden und vorsichtig aus dem Vertebralkanal entfernt. Das lumbale Rückenmark wurde in drei gleich dicke Segmente aufgeteilt, mit Kakodylsäure-Puffer gespült und mit 1%igem Osmium-Tetroxid (Chempur, Karlsruhe, Deutschland) behandelt. Das Gewebe wurde anschließend mit 1%igem Uranylacetat (Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland) in 70%igem Ethanol über Nacht zur Kontrastverstärkung behandelt. Die Proben wurden von Frau E. Janssen (Anatomisches Institut, Uniklinik Köln) in Epon (Fluka, St. Louis, Missouri) eingebettet und für mindestens 72 Stunden bei 60°C polymerisiert. 2.2.1 Ultradünnschnitte suchung und elektronenmikroskopische Unter- Zur Vorbereitung des Gewebes wurden die oben genannten Schritte entsprechend durchgeführt und dann aus drei Blöcken je Maus (vier mit PBS behandelte, drei mit Humira® behandelte und vier mit Enbrel® behandelte 35 2. Material und Methoden Mäuse) jeweils 30 80 nm dicke Ultradünnschnitte des in Plastik eingebetteten Gewebes mit einem Leica Ultracut UCT Ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) angefertigt, von denen jeweils zehn Schnitte pro Maus verwendet wurden. Diese wurden dann mit 1%iger wässriger Uranylsäurelösung für 20 Minuten und Bleicitratlösung nach Reynold (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) für sieben Minuten gefärbt. Die Proben wurden anschließend mit einem Zeiss EM 902 A Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV Beschleunigungsspannung untersucht und mit einem digitalen Elektronenmikroskopie-Kamerasystem (Mega View III, Olympus Soft Imaging Systems GmbH, Münster, Deutschland) mit einer 7000-fachen Vergrößerung jeweils zehn Bilder pro Maus abfotografiert. Die Anfertigung der Schnitte, die Färbung und das Anfertigen der Fotos wurden von Frau Dr. med. vet. M. Recks durchgeführt (Anatomisches Institut, Uniklinik Köln). Je Zehn Bilder vom ventrolateralen Trakt des Rückenmarks von im Score angepassten Mäusen, (vier Enbrel®-, drei Humira®- und vier nicht-immunisierten Kontrollmäuse), wurden hingehend des Myelinschadens und der Anzahl intakter Axone analysiert. Die Schnitte der mit PBS und mit Enbrel® behandelten Mäuse wurden zusätzlich noch hinsichtlich der Anwesenheit feiner axonaler Pathologien (i.e. mitochondriale Schwellung) untersucht. Die Bestimmung der Anzahl demyelinisierter Axone und der Axone mit feinen axonalen Pathologien erfolgte mit einer ImagePro Plus Software (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland). Die Fläche des ventrolateralen Traktes wurde ausgemessen und die Anzahl der demyelinisierten Axone und die Anzahl der Axone mit axonaler Pathologie auf die Fläche bezogen. Außerdem wurde die Infiltratgröße ausgemessen und ebenfalls auf die Gesamtfläche bezogen. Repräsentative Beispiele für die untersuchten Pathologien sind in Abbildung 2 dargestellt. 36 2. Material und Methoden Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Darstellung vom ventrolateralen Trakt des lumbalen Rückenmarks von (A) einer nicht-immunisierten Kontrollmaus und (B)-(D) mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen. (A) Axon ohne pathologische Veränderungen, der Pfeil zeigt auf ein unverändert erscheinendes Mitochondrium. (B) Axon mit veränderten Mitochondrien (Pfeile), repräsentativ für die feinen Axonpathologien. Die Mitochondrien erscheinen vergrößert und unregelmäßig. (C) Axon mit beginnender Demyelinisierung, beispielhaft mit Pfeilen markiert. Das Myelin stellt sich aufgelockert dar. (D) Demyelinisiertes Axon (*). 2.2.2 Semidünnschnitte gefärbt mit Methylenblau, lichtmikroskopische Analyse Die folgenden Schritte wurden von Frau Dr. med. vet. M. Recks und H. Batoulis (Anatomisches Institut, Uniklinik Köln) durchgeführt. Für die Semidünnschnitte zur lichtmikroskopischen Auswertung wurden die Mäuse (vier mit PBS behandelte, drei mit Humira® behandelte und vier mit Enbrel® behandelte) an 37 2. Material und Methoden Tag 20 nach der Immunisierung getötet und die oben genannten Schritte zur Präparation des Gewebes entsprechend durchgeführt. Dabei wurden die gleichen Mäuse untersucht, die auch für die elektronenmikroskopischen Analysen verwendet wurden. Es wurden jeweils zehn 500 nm dicke Schnitte je Maus aus drei Blöcken des in Plastik eingebetteten Rückenmarks mit einem Leica Ultracut UCT Ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) angefertigt. Im Anschluss erfolgte eine Färbung mit Methylenblau. Dafür wurden die Schnitte 10 Minuten mit einer Methylenblaulösung (0,05% in Wasser; Sigma, Schnelldorf, Deutschland) inkubiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurden die Objektträger mit einem Leica DM LB2 Mikroskop und mit einer AxioCam Kamera (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und der Zeiss Software (Axio Vision 40 4,7) in 20facher Vergrößerung digital fotografiert. Das Ausmaß der Entzündung wurde mittels eines semi-quantitativen Scores erfasst: 0- keine Infiltrate (entsprechend gesunden Mäusen); 1- partielle meningeale und perivaskuläre Infiltrate; 2ausgeprägte meningeale und perivaskuläre Infiltrate; 3- ausgeprägte meningeale und perivaskuläre Infiltrate und einige Infiltrate im Parenchym; 4ausgeprägte meningeale und perivaskuläre sowie ausgedehnte parenchymale Infiltrate. 2.2.3 Hämatoxylin/Eosin-Färbung, lichtmikroskopische Analyse Um die Auswirkungen einer TNF-α-Blockade auf das Gewebe des Rückenmarks zu untersuchen, wurden drei mit Enbrel® behandelte Mäuse und drei mit PBS behandelte Kontrollmäuse an Tag 20 nach der Immunisierung mit CO2 eingeschläfert und die Gewebeproben des lumbalen Rückenmarks wie oben beschrieben gewonnen. Die Proben wurden dann in Flüssigstickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C aufbewahrt. Es wurden jeweils fünf 7 μm dicke Querschnitte des Rückenmarks je Maus, von drei mit PBS und drei mit Enbrel® behandelten Mäusen, mit einem Kryostaten (Leica, Wetzlar, Deutschland) angefertigt und auf Polysine™ Objektträger 38 2. Material und Methoden (Menzel, Braunschweig, Deutschland) aufgebracht. Bis zur Färbung wurden die Schnitte bei -80°C aufbewahrt. Es wurden jeweils zwei Schnitte je Maus angefärbt. Zur Färbung mit Hämatoxylin/Eosin wurden die Schnitte zwei Stunden luftgetrocknet mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten fixiert und anschließend fünf Minuten mit destilliertem Wasser rehydriert. Dann wurden die Schnitte für vier Minuten in eine Hämatoxylinlösung (0,1%ig nach Mayer) gegeben, in destilliertem Wasser gewaschen und in leicht alkalischem Wasser für insgesamt sechs Minuten gespült. Anschließend wurden die Schnitte für drei Minuten in Eosin gegeben, in destilliertem Wasser geschwenkt und anschließend mittels aufsteigender Alkoholreihe und schließlich Xylol entwässert. Zuletzt wurden die Schnitte mit Entellan (Merck, Darmstadt, Deutschland) eingedeckt. Zur lichtmikroskopischen Analyse wurden die Proben mit einem Leica DM LB2 Mikroskop betrachtet und digitale Fotos in 4-facher (ein bis zwei Übersichtsbilder), 10-facher und 20-facher (jeweils mindestens fünf Detailbilder) Vergrößerung mit einer AxioCam Kamera (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und der Zeiss Software (AxioVision 40 4.7) angefertigt. Das Ausmaß der Entzündung wurde anhand des oben erwähnten semiquantitativen Scores (0-4; siehe Abschnitt 2.2.2) erfasst. 2.3 Immunhistochemien Das Gewebe wurde entsprechend des Abschnitts 2.2.3 präpariert, 10 Schnitte je Maus angefertigt und anschließend entsprechend der folgenden Protokolle gefärbt. Parallel wurden bei jeder Färbung Negativkontrollen angefertigt, bei denen die Erstantikörper jeweils nicht aufgetragen wurden. 2.3.1 TNF-α-Monofärbung Insgesamt wurden 14 Mäuse untersucht, davon acht mit PBS behandelte und sechs nicht-immunisierte Kontrollen und jeweils zehn Schnitte je Maus 39 2. Material und Methoden verwendet. Die Gefrierschnitte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend für zehn Minuten mit Aceton fixiert. Nach erneuter 30-60-minütiger Trocknung wurden die Schnitte mittels Dako-Fettstift mit einer hydrophoben Barriere versehen und für 30 Minuten mit 3%igem BSA, 5%igem Mausserum (Cell Sciences, Canton, Massachusetts) und 0,25%igem Triton X (Merck, Darmstadt, Deutschland) in TBS inkubiert. Anschließend wurde der Erstantikörper für TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) 1:40 in Diluent (5%iges Mausserum und 0,25%iges Triton X in TBS) aufgetragen und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte dann zunächst dreimal für je fünf Minuten mit TBS gewaschen und der Zweitantikörper (Kaninchen-anti-Ratte biotinyliert, Dako, Glostrup, Dänemark) in Diluent in einer Konzentration von 1:250 für zehn Minuten aufgetragen. Die nicht gebundenen Antikörper wurden mit erneutem Waschen, dreimal je fünf Minuten mit TBS, entfernt und zu den Schnitten dann für 45 Minuten NeutrAvidin Dylight 549 (Pierce, Rockford, Illinois) in einer Konzentration von 1:300 in TBS hinzugegeben. Danach wurde erneut dreimal für vier Minuten gewaschen und die Schnitte für 10 Minuten mit Höchst (Bisbenzimid H; Sigma, Schnelldorf, Deutschland; 1:1000 in TBS) inkubiert. Es folgte ein letztes dreimaliges Waschen der Schnitte für je vier Minuten mit TBS und das Eindecken mit AquaPolyMount (Polysciences, Warrington, Alaska). 2.3.2 TNF-α- und F4/80-Doppelfärbung Zur Doppelfärbung von TNF-α und F4/80 wurde zunächst die F4/80-Färbung gemäß des folgenden Protokolls durchgeführt. Es wurden jeweils zehn Schnitte von sechs mit Enbrel® und vier mit PBS behandelten Mäusen untersucht. Die Gefrierschnitte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend für 10 Minuten mit Aceton fixiert. Nach erneuter 30-60-minütiger Trocknung wurden die Schnitte mittels Dako-Fettstift mit einer hydrophoben Barriere versehen und für 30 Minuten mit 3%igem BSA, 5%igem Mausserum (CellSciences, Canton, Massachusetts) in TBS (Diluent) inkubiert. Als 40 2. Material und Methoden Erstantikörper wurde dann ein Ratte-anti-Maus F4/80-Antikörper (Klon BM 8; eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland) zur Färbung der Makrophagen in einer Konzentration von 1:500 in Diluent aufgetragen, nach zwei Stunden bei Raumtemperatur dann dreimal je fünf Minuten mit TBS gewaschen und anschließend ein Ziege-anti-Ratte Cy3-Zweitantikörper (Pierce, Rockford, Illinois) in einer Konzentration von 1:250 in Diluent aufgetragen. Anschließend erfolgte die Färbung von TNF-α entsprechend des Abschnitts 2.3.1, mit der Änderung, dass als Zweitantikörper ein biotinylierter Kaninchenanti-Ziege Antikörper (Dako, Glostrup, Dänemark) in einer Konzentration von 1:250 in Diluent (5% Mausserum, 0,25% Triton X in TBS) eingesetzt wurde. Ferner wurde NeutrAvidin Dylight 488 (Pierce, Rockford, Illinois) 1:250 in TBS, statt NeutrAvidin Dylight 549 (Pierce, Rockford, Illinois) in einer Konzentration von 1:300 in TBS, verwendet. 2.3.3 TNF-α- und SMI 32-Doppelfärbung Es wurden jeweils 10 Schnitte von 10 Mäusen untersucht (Enbrel® n=4, PBS n=6). Die Gefrierschnitte wurden zunächst zwei Stunden bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend mit einem Dako-Fettstift umrandet. Dann wurden die Schnitte bei -20°C in Methanol für zehn Minuten zur Fixierung kalt gestellt. Nun wurden die Schnitte zweimal für je zwei Minuten mit TBS (0,05 M; pH=7,6) gewaschen und anschließend für 60 Minuten mit dem Blockungs-Reagenz aus dem MOM-Kit (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien; zwei Tropfen in 2,5 ml TBS) geblockt. Es wurde erneut zweimal zwei Minuten mit TBS gewaschen und dann für fünf Minuten mit dem Diluent inkubiert (8% MOM Proteinkonzentrat in TBS). Im Anschluss wurde der Erstantikörper SMI 32 (Covance, Münster, Deutschland) in einer Konzentration von 1:1000 in Diluent aufgetragen und für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von erneutem zweimaligem Waschen für je zwei Minuten mit TBS. Dann wurde der Zweitantikörper (antiMaus IgG, MOM-Kit; Vector, Burlingame, Kalifornien; 1:250 in Diluent) aufgetragen und nochmals dreimal für je vier Minuten gewaschen. Als nächster 41 2. Material und Methoden Schritt folgte die TNF-α-Färbung entsprechend des Abschnitts 2.3.1 mit den Variationen entsprechend des Abschnitts 2.3.2. 2.3.4 Fluoreszenzmikroskopie Die Schnitte wurden mit einem Zeiss Axiophot Epifluoreszenzmikroskop betrachtet und mit der Leica Kamera (DFC 350 FX) und der zugehörigen Leica Software (FW 4000) digitale Bilder angefertigt, jeweils 15-20 Fotos je Maus. Es wurde die weiße Substanz mit einer ImagePro Plus Software (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland) vermessen. Zur Analyse der TNF-αMonofärbung wurden die TNF-positiven Ansammlungen (TNF-Spots, Beispiel siehe Abschnitt 3.2) ausgezählt und auf die Fläche der weißen Substanz bezogen. 2.4 ELISPOT 2.4.1 Zellpräparation Milz und ZNS An Tag 20 nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit CO2 getötet. Die Milz wurde unter sterilen Bedingungen entnommen und in einer weiteren Petrischale mit RPMI-1640 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) aufgefangen. Das Rückenmark wurde unter Spülung mit DMEM (PAA, Pasching, Österreich) aus dem Wirbelkanal herausgelöst und in einer Petrischale mit DMEM aufgefangen. Milz und Rückenmark wurden mit Hilfe eines Spritzenstopfens zerkleinert, anschließend durch einen 70 μm-Nylon-Zellfilter (BD Falcon, Heidelberg Deutschland) gefiltert, die unterschiedlichen Mengen mit RPMI-1640 bzw. DMEM auf 10 ml angeglichen und für 10 Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, die Zellen mit RPMI-1640 gewaschen und mit Hilfe von Acridin Orange (0,1%, Sigma, Schnelldorf, Deutschland)/Ethidium Bromid (0,1%, Serva, Heidelberg, Deutschland) sichtbar 42 2. Material und Methoden gemacht und entsprechend Dafür gezählt. wurden 90 μl Acridin Orange/Ethidium Bromid mit 10 μl Zellsuspension vermengt, anschließend 10 μl der Mischung entnommen und auf eine Bright-Line Zählkammer (Leica, Solms, Deutschland) gegeben und umgehend unter einem Zeiss Axiophot Epifluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) gezählt. Dabei wurde die Anzahl der gezählten Zellen der Milz mit 10 6 und des ZNS mit 105 multipliziert. Danach erfolgte die Resuspension der verbleibenden Zellen mit HL-1 (Lonza, Köln, Deutschland), welches mit 1% Glutamin (Sigma) sowie 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma) supplementiert war, auf das gewünschte Volumen, entsprechend einer gewünschten Zellkonzentration von 500.000 Zellen je Vertiefung der Platte (well). Da diese Zellzahlen bei den Proben des Rückenmarks meist nicht erreicht werden kann, werden dort so viele Zellen wie möglich plattiert und die exakte Zellzahl zu späterem Zeitpunkt zurückgerechnet. 2.4.2 Zellpräparation Blut Das Blut wurde nicht nur terminal untersucht, sondern bei den Kohorten 1, 2 und 3 zusätzlich 11-13 Tage nach der Immunisierung. Die Blutabnahmen vor der Tötung der Tiere erfolgten jeweils aus der Schwanzvene und das Blut wurde in kleinen mit Heparin versetzten Eppendorf-Gefäßen aufgefangen. Die Blutentnahme nach der Tötung der Tiere erfolgte, indem die Vena cava eröffnet, das Blut ebenfalls in kleinen Eppendorf-Gefäßen aufgefangen und anschließend gekühlt wurde. Aus den Eppendorf-Gefäßen wurde das Blut dann in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen überführt, die Eppendorf-Gefäße im Anschluss mit PBS gespült und die Unterschiede in den Mengen entsprechend mit PBS ausgeglichen, so dass PBS und Blut insgesamt in gleichen Anteilen vorhanden waren (1:1 PBS/Blut). Dann wurde zehn Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, das Serum abpipettiert und in Eppendorf-Tuben überführt. Anschließend wurde erneut resuspendiert, drei Milliliter Lysepuffer (0,15 M NH4Cl) hinzugegeben, die Proben in einem 37°C-Wasserbad erwärmt und nach 43 2. Material und Methoden zwei Minuten mit PBS gestoppt. Danach erfolgte eine erneute Zentrifugation für fünf Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute. Der Überstand wurde vorsichtig verworfen und wiederum resuspendiert. Dann wurde erneut Lysepuffer hinzugegeben, nach zwei Minuten abgestoppt und für fünf Minuten mit 1200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder vorsichtig entfernt und dann resuspendiert. Anschließend wurde mit RPMI-1640 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) gewaschen, erneut zentrifugiert, der Überstand verworfen und resuspendiert. Zum Zählen wurden die Zellen dann mit HL-1 (Lonza, Köln, Deutschland) auf einen Milliliter aufgefüllt und entsprechend des Abschnitts 2.4.1 angefärbt und gezählt und mit 106 multipliziert. Im Anschluss wurde mit HL-1 auf das benötigte Volumen aufgefüllt bei einer gewünschten Konzentration von 500 000 Zellen je Vertiefung (well). 2.4.3 ELISPOT Assay Auf Whatman Unifilter Filtrations-Mikroplatten (Whatman Inc., Florham Park, NJ) wurde ein Ratte-anti-Maus-Interferon-γ-Antikörper (finale Konzentration 3 μg/ml; Klon AN-18, eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland), in sterilem PBS aufgetragen und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde auf die Platten anti-IFN-γ aufgetragen und anschließend mit PBS gewaschen. Danach wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 1%igem BSA in PBS geblockt. Die Milzzellen wurden in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen je Vertiefung der Platte (well) und das Rückenmark in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen je Vertiefung plattiert. Die benötigten antigenpräsentierenden Zellen wurden mittels Bestrahlung der Milzzellen von naiven C57BL/6-Mäusen mit 26 Gray gewonnen und zu den Zellen des Rückenmarks in einer Konzentration von 2,5 x 105 Zellen je Well hinzugefügt. Die Zellen wurden entweder im Medium oder MOG:35-55 (finale Konzentration: 15 μg/ml) für 24 Stunden unter 7% CO2 bei 37°C inkubiert. Als Positivkontrolle wurden anti-CD3 Antikörper (Klon 2C11 eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland) in einer finalen Konzentration von 3 μg/ml aufgetragen. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit 44 2. Material und Methoden FITC-konjugierten anti-IFN-γ Antikörpern (0,5 μg/ml; hergestellt durch M. TaryLehmann, Case Western Reserve University, Cleveland, USA; Klon R4-6A2) bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach erneutem Waschen der Platten wurden diese für zwei Stunden mit anti-FITC-markierter alkalischer Phosphatase (1:500; Dako, Glostrup, Dänemark) inkubiert. Zuletzt wurden die Platten mit Vector Blue (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien) der Anleitung des Herstellers entsprechend entwickelt. Die Platten wurden über Nacht luftgetrocknet und die Spots mit einem ImmunoSpot Series 5 UV Analyzer (Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, USA) ausgezählt. Dabei repräsentieren die einzelnen kleinen Farbpunkte (Spots) die spezifische T-Zellantwort auf das aufgetragene Antigen. Sie haben einen Durchmesser zwischen 30 bis 150 μm [111] und befinden sich am Boden der Vertiefungen. Je größer der Spot ist, desto mehr Zytokine wurden von der zugehörigen T-Zelle als Reaktion auf die Antigen-Stimulation freigesetzt. Das Analysegerät erkennt diese Spots automatisch und kann zwischen echten Spots und Artefakten unterscheiden. Dabei werden große Vergrößerungen genutzt, um die runden, nicht scharf begrenzten und im Zentrum farbintensiveren Spots von den Artefakten zu differenzieren. Das Programm liefert dann die Anzahl der Spots, die die einzelnen Zellen, in diesem Fall Th1-Zellen, repräsentieren. Von den ausgezählten Ergebnissen wurden die nicht-antigenspezifischen IFN-γ- produzierenden Zellen im Medium, welches kein Antigen enthielt, abgezogen und die Ergebnisse auf 106 Zellen je Well angepasst. 2.5 Statistische Analysen Die statistischen Analysen wurden mit der SigmaPlot Software Version 11.0 (Chicago, Illinois) durchgeführt. Wilcoxon-Rangsummentests wurden für die statistische Analyse von Unterschieden beim klinischen Score, dem Krankheitsbeginn, der Immunspotanalyse (ELISPOT) und der Histologie angewendet. Die Unterschiede bei der Inzidenz wurden mittels dem Fisher-Test bestimmt. Zur Korrelation von klinischem Score und antigenspezifischer T45 2. Material und Methoden Zellantwort bzw. klinischem Score und TNF-α im histologischen Präparat wurden Spearman-Rangkorrelationen durchgeführt. Als statistische Signifikanz wurde p ≤ 0,05 gewählt. 46 Grenze für die 3. Ergebnisse 3.1 Die Anzahl der Th1-Zellen im Blut korreliert während des Krankheitsverlaufs nicht mit dem klinischen Score Da aus vorherigen Studien bekannt ist, dass während der Anfangsphase der MOG:35-55 EAE eine Korrelation zwischen der Anzahl der Th1-Zellen und dem klinischen Score besteht [138], sollte überprüft werden, ob sich diese Ergebnisse reproduzieren lassen und sich ein Fortbestehen dieser Korrelation im weiteren Krankheitsverlauf zeigt. Dafür wurden Messungen der Th1-Zellen bzw. des von ihnen sezernierten IFN-γ im Blut mittels ELISPOT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung der Mäuse durchgeführt und in Bezug zum klinischen Score gesetzt. Es zeigte sich, dass weder an Tag 12 (±1 Tag), welcher etwa dem Beginn der Krankheit entsprach, noch beim Abbildung 3: Immunospotanalyse (ELISPOT) von IFN-γ im Blut von mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen. Dargestellt sind IFN-γ Spots pro 1 Millionen Zellen in Bezug zum klinischen Score von mit PBS behandelten Kontrollmäusen. Jeder Punkt symbolisiert eine Maus. (A) An Tag 10, n=6. Es konnte keine Korrelation zwischen klinischem Score und Anzahl der IFN-γ Spots gefunden werden (Spearman-Rangkorrelation p=0,919; rs=0,034 (B) Finaler ELISPOT an Tag 20, n=11, ebenfalls keine Korrelation (Spearman Korrelation p=0,881; rs=0,049). 47 3. Ergebnisse Abbildung 4 Immunospotanalyse (ELISPOT) von IFN-γ im Blut an Tag 10 nach der Immunisierung. Jeder Punkt repräsentiert eine mit MOG:35-55 immunisierte und mit PBS behandelte Maus (n=6) sowie die Anzahl der Spots jeweils die Th1-Zellzahl. Auf der Ordinate aufgetragen der maximale klinische Score. Es besteht keine Korrelation zwischen maximalem klinischem Score und Th1-Zellzahl vor dem Krankheitsbeginn (Spearman-Rangkorrelation p=0,297). finalen ELISPOT an Tag 20 eine Korrelation zwischen klinischem Score und IFN-γ bestand (Tag 12: rs=0,0338; p=0,919 Spearman-Rangkorrelation bzw. Tag 20 rs=0,049; Zusätzlich p=0,881 wurde Spearman-Rangkorrelation; untersucht, ob die Zahl der siehe Abbildung Th1-Zellen vor 2). dem Krankheitsbeginn mit dem maximalen klinischen Score korreliert. Auch hier ließ sich keine Korrelation finden (Spearman-Rangkorrelation p=0,297; siehe Abbildung 4). Dies deutet daraufhin, dass die Th1-Zellen in der Peripherie nicht entscheidend zu sein scheinen bzw. nicht nur das IFN-γ von den Th1-Zellen beteiligt ist, sondern dass möglicherweise noch andere Zytokine oder andere Zellreihen bei der Schädigung eine Rolle spielen. Da TNF-α einer der zentralen Mediatoren der Abläufe im angeborenen Immunsystem ist und von verschiedenen Zellreihen ausgeschüttet wird, sollte dieser weiter untersucht werden. 48 3. Ergebnisse 3.2 TNF-α ist in entzündlichen Läsionen des Rückenmarks nachweisbar und korreliert signifikant mit dem klinischen Score TNF-α ist eines der proinflammatorischen Zytokine, welches vorwiegend von Makrophagen und Mikroglia, aber auch von anderen Zellen wie z.B. Th1- und Th17-Zellen freigesetzt wird. Es wird vermutet, dass TNF-α zu den Schädigungsvorgängen in der EAE beiträgt. Um dies zu überprüfen, wurden mit MOG:35-55 immunisierte C57BL/6-Mäuse jeweils 20 Tage nach der Abbildung 5: Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von TNF-α im entzündlichen Infiltrat. (A) Immunhistochemische Färbung von TNF-α in der weißen Substanz des lumbalen Rückenmarks einer repräsentativen mit PBS behandelten erkrankten Kontrollmaus, mit einem klinischem Score von 2,5. (B) Beispiel für einen TNF-Spot. (C) Bild außerhalb des Infiltrats von einer gesunden Kontrollmaus. (D) Negativkontrolle ohne Erstantikörper gegen TNF-α. Die Maßstableiste entspricht jeweils 100 μm. Krankheitsinduktion eingeschläfert und Proben des Rückenmarks gewonnen. Zur histologischen Untersuchung wurden immunhistochemische Färbungen des lumbalen Anteils des Rückenmarks durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass TNF-α in den entzündlichen Infiltraten vorhanden ist (siehe Abbildung 5). Zur 49 3. Ergebnisse Abbildung 6: Korrelation der Anzahl der TNF-α-positiven Spots in der weißen Substanz des Rückenmarks und des mittleren klinischen Scores nach Krankheitsbeginn von mit PBS behandelten Mäusen (n=8), sowie nicht-immunisierten Kontrollmäusen (n=6). Jeder Punkt repräsentiert eine Maus Es zeigt sich eine signifikante Korrelation zwischen Spots und klinischem Score (Spearman-Rangkorrelation p<0,001;rs=0,805). weiteren Analyse der Proben wurde die Anzahl der TNF-positiven Spots in den entzündlichen Infiltraten des Rückenmarks mittels Fluoreszenzmikroskopie bei acht mit MOG:35-55 immunisierten sowie sechs nichtimmunisierten Kontrollmäusen bestimmt und jeweils die Fläche der weißen Substanz ausgemessen. Der Quotient aus TNF-Spots pro Millimeter weiße Substanz wurde dann mit dem klinischen Score nach Ausbruch der Krankheit korreliert. Es zeigte sich dabei eine hoch signifikante Korrelation zwischen dem klinischen Score und der Anzahl der TNF-positiven Spots (rs=0,805; SpearmanRangkorrelation p<0,001; siehe Abbildung 6). TNF-α scheint demzufolge an den schädigenden Vorgängen im Rückenmark beteiligt zu sein. 50 3. Ergebnisse 3.3 Makrophagen/Mikroglia setzen TNF-α frei und TNF-α trägt zur Schädigung des Myelins bei Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob auch bei der EAE Makrophagen und Mikroglia zu den Zellen gehören, die TNF-α ausschütten. Mittels einer immunhistochemischen Doppelfärbung von F4/80 und TNF-α konnte nachgewiesen werden, dass sich im ZNS der immunisierten Mäuse (mit PBS behandelt n=4, mit Enbrel® behandelt n=6) Zellen befinden, die zum gleichen Zeitpunkt sowohl F4/80- als auch TNF-α-positiv sind (siehe Abbildung 7). Anhand der F4/80-Färbung kann nicht zwischen Makrophagen und Mikroglia unterschieden werden. In der EAE wird potentiell schädigendes TNF-α also von Makrophagen/Mikroglia freigesetzt. Abbildung 7: Doppelfärbung des lumbalen Rückenmarks einer mit MOG: 35-55 immunisierten repräsentativen Maus. TNF-α wird von Makrophagen freigesetzt und ist an beschädigtem Myelin zu finden. (A) Doppelfärbung Makrophagen (F4/80, orange) und TNF-α (grün). (B) Negativkontrolle ohne die jeweiligen Erstantikörper gegen TNF und F4/80. Die Maßstableiste entspricht jeweils 100μm. 51 3. Ergebnisse Mit Hilfe von weiteren immunhistochemischen Doppelfärbungen des Rückenmarks der oben verwendeten Mäuse (PBS n=4 und Enbrel®=6) mit der Kombination von TNF-α und SMI 32 konnte gezeigt werden, dass das TNF-α nicht nur in den entzündlichen Infiltraten vorhanden ist, sondern auch an den Stellen, an denen das Myelin beschädigt wurde (Abbildung 8). Abbildung 8: (A) Summationsbild der Doppelfärbung SMI 32 (grün) und TNF-α (orange). Gelb zu erkennen, beispielhaft mit Pfeilen markiert, ist beschädigtes Myelin, an dem sich TNF-α befindet. (B)-(D) zeigen die Doppelfärbung in Einzelbildern. In (E) ist die Negativkontrolle, jeweils ohne Erstantikörper gefärbt, dargestellt. Die Maßstableiste entspricht jeweils 100 μm. Ingesamt wurden 10 Mäuse (PBS n=4, Enbrel® n=6) untersucht. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass TNF-α einer Rolle in der Pathogenese der EAE spielt und einen entscheidenden Anteil an der Schädigung des Myelins und somit wahrscheinlich auch der Axone hat. Es drängt sich also die Frage auf, was passiert, wenn man TNF-α mittels eines Antikörpers blockiert. Wenn TNF-α eine Schädigung des Myelins verursacht, wäre zu erwarten, dass seine Inhibition zu einer Verminderung des Myelinschadens und somit auch zu einer Verbesserung des klinischen Erscheinungsbildes führt. Dies sollte in weiteren Versuchen überprüft werden. 52 3. Ergebnisse 3.4 Eine TNF-α Blockade vermindert die Inzidenz und verzögert das Einsetzen der EAE Es wurden insgesamt 17 C57BL/6-Mäuse mit MOG:35-55 in CFA zur Induktion einer EAE immunisiert. An Tag null und Tag zwei nach der Immunisierung wurde jeweils 200 ng Pertussis Toxin injiziert, um die Auslösung der EAE zu erleichtern. Von diesen 17 Mäusen wurden acht mit Enbrel® und neun Mäuse mit PBS behandelt. Die mit PBS behandelten Mäuse stellen die Kontrollgruppe dar. Sie erhielten jeweils jeden zweiten Tag eine entsprechende intraperitoneale Injektion. Der klinische Verlauf einer repräsentativen Kohorte ist in Abbildung 9A dargestellt. Im Unterschied zu den mit PBS behandelten Mäusen wiesen die mit Enbrel® behandelten eine signifikant reduzierte Inzidenz auf. Die mit PBS behandelten Mäuse entwickelten jeweils zu 100% Symptome. Es ließen sich hingegen nur bei 53% der mit Enbrel® behandelten Mäuse Symptome feststellen (p<0,05, Fisher-Test; siehe Abbildung 9B). Dabei wurde durch Enbrel® nicht nur die Inzidenz vermindert, sondern auch der Krankheitsbeginn signifikant zeitlich verschoben (p<0,05 Wilcoxon-Rangsummentest; Abbildung 9C). Er lag bei den mit PBS behandelten Mäusen im Mittel bei 10 (± 1) Tagen. Bei den Mäusen, die mit Enbrel behandelt worden sind, begann die Krankheit hingegen durchschnittlich bei 17 (± 3) Tagen. Wenn die EAE indessen eingesetzt hatte, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen (siehe Abbildung 9D). 53 3. Ergebnisse Abbildung 9: (A) Klinischer Verlauf einer repräsentativen Kohorte von mit PBS (schwarze Kreise; n=5), und mit Enbrel® behandelten Mäusen (weiße Dreiecke; n=3). (B) Inzidenz der verschiedenen Versuchsgruppen. Jeweils in schwarz dargestellt der Anteil der erkrankten Tiere und in grau gemustert der Anteil der gesunden Tiere. Es besteht eine signifikant verminderte Inzidenz der mit Enbrel® behandelten Mäusen gegenüber den mit PBS behandelten Mäusen(*p<0,05, Fisher-Test). In der PBS-Kontrollgruppe (n=9) erkrankten 100% der Tiere und in der Enbrel®-Gruppe (n=8) 50%. (C) Durchschnittlicher Krankheitsbeginn der jeweiligen Versuchsgruppen in Tagen nach der Immunisierung mit MOG:35-55. PBS (n=9), Enbrel® (n=4). Jeder Punkt symbolisiert eine Maus, die Striche jeweils den Mittelwert. Es zeigt sich ein signifikant verspäteter Krankheitsbeginn der Enbrel®-Gruppe gegenüber mit PBS behandelten Mäusen (*p<0,05 Wilcoxon-Rangsummentest). (D) Durchschnittlicher Score nach Krankheitsbeginn und die Standardabweichung bei den verschiedenen Versuchsgruppen (PBS n=6, Enbrel® n=5). Nach Beginn der Krankheit bestehen keine Unterschiede mehr zwischen den einzelnen Versuchsgruppen. n.s.= nicht signifikant 54 3. Ergebnisse 3.5 Eine TNF-α-Inhibition erhöht die antigenspezifische Antwort von Th1-Zellen in der Milz und dem Blut, hat jedoch keinen Einfluss auf die antigenspezifische Th1-Antwort im ZNS Um zu erfassen, inwiefern eine Behandlung mit anti-TNF-α die Antwort der Th1Zellen beeinflusst, wurden die Mäuse an Tag 20 nach der Immunisierung getötet und ELISPOT-Assays von Milz und ZNS der je mit Enbrel®, Humira® und PBS behandelten Mäuse durchgeführt. Auffällig dabei war vor allem eine deutlich vermehrte Th1-Zellantwort, repräsentiert durch eine Vermehrung der IFN-γ-Spots in der Milz der mit Enbrel® behandelten Tiere (siehe Abbildung 10A). Dieser Anstieg war hochsignifikant gegenüber den Humira®- und PBSKontrollmäusen (p<0,01 bzw. p<0,001 Wilcoxon-Rangsummentest). Bezogen auf die Konzentration von IFN-γ im Rückenmark hingegen bestand kein Unterschied zu den Kontrollmäusen (siehe Abbildung 10B). Bei einer repräsentativen Kohorte mit jeweils drei mit PBS und drei mit Enbrel® behandelten Mäusen wurde nach der Tötung zusätzlich zur Milz noch ein ELISPOT-Assay des Blutes durchgeführt. Auch hier zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Th1-Zellzahlen (p<0,05; Wilcoxon-Rangsummentest; siehe Abbildung 10C). 55 3. Ergebnisse 3.6 Die Anzahl der Th1-Zellen in der Milz korreliert nicht mit dem klinischen Score; die Anzahl der Th1-Zellen im ZNS hingegen weist eine Korrelation auf Abbildung 10: Auswirkungen der Blockade von TNF-α auf die Th1Zellen, repräsentiert durch die Anzahl der IFN-γ-Spots pro Millionen Zellen detektiert mittels ELISPOT. Die Mäuse wurden jeweils an Tag 20 nach der Immunisierung getötet. (A) In der Milz ist die Anzahl der IFN-γ Spots bei den Mäusen mit TNF-α-Inhibition (n=8) signifikant erhöht gegenüber der bei mit PBS (n=12) und Humira (n=8) behandelten Kontrollmäusen (*p<0,05, **p<0,01, Wilcoxon-Rangsummentest). (B) Im ZNS sind keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu beobachten (PBS n=13, Humira n=5, Enbrel n=7). (C) IFN-γ Spots im Blut von je drei mit PBS und drei mit Enbrel® behandelten Mäusen. Es zeigten sich signifikant mehr Spots bei den mit Enbrel® behandelten Tieren (*p<0,05; WilcoxonRangsummentest.) n.s.=nicht signifikant 56 3. Ergebnisse Die nächste Frage war nun, ob das gemessene IFN-γ, sprich die Antwort der Th1-Zellen, mit dem klinischen Score der Mäuse korreliert. Dies war zwar im ZNS (rs=0,668, p<0,05; Spearman-Rangkorrelation) jedoch nicht in der Milz (rs=0,567, p>0,05; Spearman-Rangkorrelation) der Fall. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass Enbrel zwar einen Einfluss auf die Th1-Zellzahl in der Milz hat, diese jedoch nicht entscheidend für das Krankheitsausmaß ist. Die Th1-Zellzahl im ZNS hingegen scheint den klinischen Verlauf mitzubestimmen, wird jedoch durch eine TNF-α-Blockade nicht beeinflusst. Um auf histopathologischer Ebene zu untersuchen, welchen Effekt die Blockade von TNF-α im ZNS hat, wurden detaillierte Untersuchungen des Gewebes durchgeführt. 3.7 Eine TNF-α-Inhibition hat keinen protektiven Effekt auf die entzündliche Aktivität, den Myelinschaden und feine Axonpathologien Eine Kohorte mit je vier mit Enbrel® bzw. PBS und drei mit Humira® behandelten Mäusen, wurden am 20. Tag nach der Induktion der EAE eingeschläfert und ein Teil des Rückenmarks zur histologischen Analyse entnommen. Dies lichtmikroskopische wurde für Auswertung die in elektronenmikroskopische Epon gebettet und Ultra- und bzw. Semidünnschnitte angefertigt. Die Semidünnschnitte wurden hinsichtlich eines semiquantitativen Scores beurteilt (siehe Abschnitt 2.2.2) sowie die mittlere Größe der Infiltrate bezogen auf die weiße Substanz bestimmt. Repräsentative Bilder sind in Abbildung 11 zu sehen. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der mit PBS oder Humira® behandelten Mäuse und denen, die Enbrel® erhielten (p=0,251; Wilcoxon-Rangsummentest). Bei den mit Enbrel® behandelten Mäusen zeigte sich eine Tendenz hin zu vermehrter Entzündung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. 57 3. Ergebnisse PBS Humira® Enbrel® # Mäuse 4 3 3 Klinischer Score im Mittel 2,50 (±0,41) 2,92 (±0,14) 2,69 (±0,13) Semiquantitativer Score Entzündung (Semidünn) 2,0 (±1,08) 2,33 (±0,94) 2,88 (±0,85) Infiltratgröße [%] 31,92 (±20,37) 29,73 (±10,36) 55,76 (±25,47) # demyelinisierte Axone/mm² 6,17×103 (±6,64×103) 5,58×105 (±9,33×105) 4,96×103 (±5,02×103) feine Axonpathologie/mm² 2,19×104 (±1,08×104) -- 2,75×104 (±1,12×104) Tabelle 1: Auswertungen histopathologischer Veränderungen des ZNS von mit PBS, Humira® und Enbrel® behandelten Mäusen (PBS n=4; Humira® n=3; Enbrel n=3. Feine Axonpathologien bei Humira® nicht bestimmt. Um die histopathologischen Veränderungen noch genauer zu analysieren, wurden zusätzliche elektronenmikroskopische Analysen des Rückenmarks derselben Mäuse durchgeführt, da die Schäden an den Axonen mit dem Lichtmikroskop nicht genau zu erfassen sind und elektronenmikroskopisch eine detaillierte Darstellung des Myelins möglich ist. Die Schnitte wurden hinsichtlich der Anzahl demyelinisierter Axone untersucht. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 sowie repräsentative Bilder in Abbildung 12 dargestellt. Hinsichtlich der demyelinisierten Nervenfasern zeigten sich in der statistischen Analyse keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (p=0,782; Wilcoxon-Rangsummentest). Die mit Enbrel® und mit PBS behandelten Mäuse wurden zusätzlich noch in Bezug auf feine axonale Pathologien untersucht. 58 3. Ergebnisse Dabei zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Differenzen (p=0,497; Wilcoxon-Rangsummentest). Bei einer anderen Kohorte bestehend aus drei mit Enbrel® und drei mit PBS Abbildung 11: Mit Methylenblau gefärbte Schnitte des lumbalen Rückenmarks, die lichtmikroskopisch untersucht wurden. Jeweils beispielhafte Bilder für (A) nicht immunisierte Kontrollmäuse sowie für (B) mit PBS, (C) mit Humira® und (D) mit Enbrel® behandelte, mit MOG:35-55 immunisierte Mäuse. Die immunisierten Tiere wurden jeweils 20 Tage nach der Immunisierung eingeschläfert, das Rückenmark entfernt, in Epon eingebettet und im Anschluss Semidünnschnitte angefertigt. Die Maßstableiste entspricht 100 μm. Ö=Ödem; INF=Infiltrat von Immunzellen im ZNS. 59 3. Ergebnisse behandelten, immunisierten und zu ähnlichem Zeitpunkt getöteten Mäusen, wurden Schnitte des Rückenmarks angefertigt und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. Die Proben wurden ebenfalls lichtmikroskopisch beurteilt und ein Score Abbildung 12 Elektronenmikroskopische Analysen vom Rückenmark mit MOG:35-55 immunisierter Mäuse, bzw. nicht immunisierter Kontrollen. Nach der Einbettung mit Epon wurden Ultradünnschnitte des Rückenmarks angefertigt und hinsichtlich Myelinpathologien und feinem axonalem Schaden untersucht. Dargestellt sind jeweils beispielhafte Bildausschnitte von (A) nicht immunisierten Kontrollmäusen, (B) mit PBS, (C) mit Humira® und (D) mit Enbrel® behandelten Mäusen. Die Maßstableiste entspricht 1 μm. Ö=Ödem; Db=beginnende Demyelinisierung der Nervenfaser; *=demyelinisierte Nervenfaser; FA=feine Axonpathologie; AL=Axolyse; ɸ=Makrophage. entsprechend dem der Semidünnschnitte angewandt (Score siehe Abschnitt 2.2.2, repräsentative Schnitte siehe Abbildung 13). In der statistischen Analyse zeigten sich erneut keine signifikanten Unterschiede (p=0,086; WilcoxonRangsummentest), aber eine Tendenz hin zu einem niedrigeren Score bei den mit Enbrel® behandelten Tieren (siehe Abbildung 14). 60 3. Ergebnisse Abbildung 13: Beispielhaft dargestellt ist die HE-Färbung von (A) einer nicht erkrankten mit PBS behandelten Kontrollmaus ohne Infiltrate, (B) einer mit Enbrel® behandelten Maus mit beginnendem perivaskulärem Infiltrat, Score 1 und (C) einer mit PBS behandelten erkrankten Kontrollmaus mit ausgedehnteren perivaskulären Infiltraten, die beginnen das Parenchym zu infiltrieren, Score 2,5. pINF=beginnendes perivaskuläres Infiltrat, INF=Infiltrat. Abbildung 14: Durchschnittlicher Score sowie seine Standardabweichung bei mit HE gefärbten Schnitten. Es wurde ein semiquantitativer Score (0-4), entsprechend dem der mit Methylenblau gefärbten Semidünnschnitte, eingesetzt. Analysiert wurden je drei mit Enbrel® sowie drei mit PBS behandelte Mäuse. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (Wilcoxon-Rangsummentest). n.s.=nicht signifikant 61 3. Ergebnisse 3.8 Nach Absetzen des TNF-α-Inhibitors verschlimmert sich der klinische Score der Mäuse Da die Gabe von TNF-αInhibitoren zu deutlichen einer Vermehrung der Zellzahlen in der Milz führte, wurde untersucht, welche Auswirkungen die Beendigung der Blockade auf den klinischen Verlauf hat. Die Verabreichung von PBS bzw. Enbrel® wurde bei mit MOG:3555 immunisierten Mäusen 13 Tage nach der Immunisierung beendet und die Effekte auf Verlauf den klinischen bei 10 mit Abbildung 15: Bei mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen wurde ab dem Zeitpunkt der Immunisierung anti-TNF-α (Enbrel®) verabreicht, die Gabe an Tag 13 beendet und der klinische Verlauf beobachtet. (A) Verlauf der mit Enbrel® behandelten Mäuse vor und nach der Behandlung. Die unterschiedlichen Symbole zeigen den Verlauf je einer Maus (n=5). (B) Verlauf des durchschnittlichen klinischen Scores vor und nach Beendigung der Behandlung mit Enbrel®- (n=5; schwarze Kreise) und PBS-Gabe (n=4; rote Dreiecke). Außerdem dargestellt ist die Standardabweichung. Es zeigte sich bei den mit Enbrel® behandelten Mäusen eine signifikante Verschlechterung des klinischen Scores nach Behandlungsende (Tag 10-13 gegenüber Tag 14-19; Wilcoxon-Rangsummentest p<0,05). 62 3. Ergebnisse Enbrel® behandelten und 19 mit PBS behandelten Kontrollmäusen beobachtet (siehe Abbildung 15 A und B). Dabei zeigte sich ein signifikant erhöhter Score von Tag 14-19 gegenüber Tag 10-13 nach der Immunisierung (p<0,05 Wilcoxon-Rangsummentest) bei den mit Enbrel® behandelten Tieren. In der Kontrollgruppe zeigte sich keine signifikante Differenz nach Absetzen von PBS (p>0,05 Wilcoxon-Rangsummentest). Abbildung 16: ELISPOT der Milz von jeweils mit Enbrel® behandelten Mäusen. Einerseits bei einer durchgehenden Behandlung bis zum Zeitpunkt der Tötung (n=5) der Mäuse an Tag 24, andererseits bei Beendigung der Behandlung an Tag 13 (n=10). Es zeigt sich eine signifikante Verminderung der IFN-γ Spots nach Absetzen des anti-TNF-α-Inhibitors (p<0,05, WilcoxonRangsummentest). Die IFN-γ Spots repräsentieren die Th1-Zellen. Um zu analysieren, wie sich die Th1-Zellen unter diesen Umständen verhalten, wurden die Mäuse an Tag 24 nach der Immunisierung eingeschläfert und die Th1-Zellen in der Milz mittels ELISPOT, repräsentiert durch IFN-γ positive Spots, untersucht (siehe Abbildung 16). Repräsentative Abbildungen der Immunospotanalyse sind in Abbildung 17 dargestellt. In der Gruppe, in der Enbrel® an Tag 13 abgesetzt wurde, fand sich eine deutliche Reduktion der IFN-γ Spots gegenüber der Gruppe, die Enbrel® weiterhin erhielt (p<0,01, Wilcoxon-Rangsummentest). Daraus lässt sich schließen, dass die Behandlung mit anti-TNF-α die Erhöhung der Th1-Zellzahl in der Milz bedingt. 63 3. Ergebnisse Abbildung 17: Repräsentative Abbildungen der Immunospotanalyse (ELISPOT). (A)-(C) bei mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen, bei denen Enbrel® an Tag 13 abgesetzt wurde. (A) Antigen, (B) Medium, (C) Positivkontrolle. (D)-(F) Mäuse, die durchgehend Enbrel® erhielten. (D) Antigen, (E) Medium, (F) Positivkontrolle. Die Punkte in (A) und (D) repräsentieren jeweils die antigenspezifische Reaktion (IFN-γ-Ausschüttung) einer Th1-Zelle. 64 4. Diskussion Viele Zellen setzen bei Entzündungsreaktionen TNF-α frei und diese Freisetzung wird als einer der wichtigen Mechanismen bei verschiedenen Autoimmunkrankheiten erachtet. Dennoch sind die Einflüsse, die TNF-α auf das Immunsystem ausübt, noch nicht im Detail verstanden. Die Wirkungen von TNF-α scheinen teils widersprüchlich und bei den verschiedenen Krankheitsentitäten voneinander abweichend. So wird eine Blockade von TNF-α bei einigen Autoimmunkrankheiten wie z.B. Morbus Crohn oder rheumatoider Arthritis erfolgreich eingesetzt, ist aber bei anderen wie z.B. Lupus erythematosus oder MS nicht wirksam, sondern kann diese hingegen sogar begünstigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung einer Inhibition von TNF-α mittels Enbrel® auf T-Helferzellen und die Rückenmarkspathologie in einem Tiermodell der MS untersucht. 4.1 Die Th1-Zellzahlen im Blut korrelieren weder zu Beginn noch im Verlauf der EAE mit dem klinischen Score Es konnte weder zu Beginn der EAE, welcher etwa Tag zehn nach der Immunisierung lag, noch im weiteren Krankheitsverlauf eine Korrelation zwischen klinischem Score und den Th1-Zellzahlen im Blut von mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen beobachtet werden. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen einer anderen Studie [138], bei der in der akuten Phase der EAE eine Korrelation zwischen Th1-Zellen und klinischem Score bei einer mit PLP 139-151 induzierten EAE bei SJL-Mäusen bestand. Bei ebenfalls durchgeführten Untersuchungen einer mit MOG:35-55 induzierten chronischen EAE bei C57BL/6- Mäusen korrelierte die Anzahl der Zellen Th1-Zellen positiv mit der Höhe des maximalen klinischen Scores. Dies war in der vorliegenden Arbeit ebenfalls nicht der Fall. Es ist nicht auszuschließen, dass diese 65 4. Diskussion widersprüchlichen Ergebnisse durch die in dieser Arbeit relativ geringe Stichprobengröße der untersuchten Proben an Tag 15 verursacht wurden. Die Unterschiede bezüglich der Ergebnisse der SJL-Mäuse können durch die unterschiedlichen EAE-Modelle und verwendeten Mausstämme bedingt sein. An Tag 30 nach der Immunisierung hingegen war die Stichprobengröße größer und es zeigte sich ebenfalls keine Korrelation zwischen klinischem Score und Th1-Zellzahl. Dies deutet darauf hin, dass die Anzahl der Th1-Zellen in der Peripherie zu diesem Zeitpunkt nicht entscheidend für den Krankheitsverlauf sind bzw. man laut den Ergebnissen dieser Arbeit nicht von der Anzahl der Th1Zellen in der Peripherie auf die Schädigung im ZNS schließen kann. Möglicherweise sind vielmehr die in das ZNS-eingewanderten Th1-Zellen oder weitere Zellreihen entscheidend. Es ist ebenfalls möglich, dass andere Zytokine als IFN-γ eine Rolle spielen. Neben IFN-γ wird von Th1-Zellen beispielsweise TNF-α freigesetzt. Gleichzeitig setzen aber auch diverse weitere Zellreihen, wie z.B. Makrophagen, TNF-α frei. 4.2 TNF-α ist in entzündlichen Läsionen zu finden und korreliert signifikant mit dem klinischen Score Da TNF-α einer der Mediatoren ist, der von diversen Zellen des Immunsystems freigesetzt wird, sollte seine Beteiligung an den Vorgängen der EAE näher untersucht werden. TNF-α wurde mittels immunhistochemischer Färbungen von Rückenmarksquerschnitten in den entzündlichen Läsionen von mit MOG:35-55 immunisierten und mit PBS behandelten Mäusen nachgewiesen. Dabei TNF-α korrelierte positiv mit dem klinischen Score. Während sich sowohl bei gesunden immunisierten als auch bei nicht-immunisierten Mäusen kaum TNF-α in der weißen Substanz befand, war TNF-α bei erkrankten Mäusen deutlich erhöht. TNF-α scheint folglich an der Beschädigung des Myelins und der damit verbundenen klinischen Verschlechterung beteiligt zu sein. Somit wären positive Resultate von einer TNF-α-Blockade zu erwarten gewesen. 66 4. Diskussion 4.3 TNF-α wird von Makrophagen/Mikroglia freigesetzt und ist mit einer Beschädigung des Myelins assoziiert Mittels zusätzlicher immunhistochemischer Doppelfärbungen konnte sichtbar gemacht werden, dass TNF-α bei C57BL/6-Mäusen mit MOG:35-55 induzierter EAE in den entzündlichen Infiltraten von F4/80-positiven Zellen (Makrophagen/Mikroglia) freigesetzt wird und sich an Axonen mit beschädigtem Myelin befindet. Daraus lässt sich schließen, dass TNF-α einer der Mediatoren ist, der an der Schädigung des Myelins beteiligt ist und somit zur Krankheitspathogenese beiträgt. 4.4 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf den klinischen Verlauf und den Krankheitsbeginn Eine Hemmung von TNF-α mit Enbrel® führte zu einem signifikant verzögerten Einsetzen der Symptomatik im Vergleich zu einer Behandlung mit PBS. Die Inzidenz war bei einer Behandlung mit Enbrel® im Vergleich zu der Verabreichung von PBS ebenfalls signifikant vermindert. Anti-TNF-α ist ab dem Zeitpunkt der Immunisierung verabreicht worden. Vermutlich konnten so die pathogenen Auswirkungen dieser initialen Erhöhung gehemmt und der Krankheitsbeginn verzögert werden. Es ist bekannt, dass TNF-α bei der EAE schon vor dem Ausbruch von Symptomen eine vermehrte Produktion von TNFα durch Mikroglia erfolgt und daraufhin T-Zellen und Makrophagen stimuliert werden [215]. Die Ergebnisse bezüglich des klinischen Verlaufs bei Mäusen zeigen, dass eine Blockade von TNF-α ausschließlich vor dem Beginn der Erkrankung eine positive Wirkung erzielen konnte. Die Inhibition verhinderte zwar das Einsetzen der Krankheit oder verzögerte den Krankheitsbeginn, der klinische Verlauf nach dem Einsetzen der Symptome wurde 67 hingegen nicht beeinflusst. 4. Diskussion Dementsprechend ist es nur hilfreich TNF-α schon früh zu blockieren, vorzugsweise, bevor die ersten Symptome auftreten. Die dargestellten Beobachtungen können auf die duale Rolle zurückgeführt werden, die TNF-α bei Entzündungsvorgängen einnimmt. TNF-α wirkt an zwei verschiedenen Rezeptoren und übt so unterschiedliche Funktionen aus. Während TNF-R1 eher proinflammatorische und proapoptotische Eigenschaften zugeschrieben werden, übt TNF-R2 eher regulatorische, protektive und proliferationsstimulierende Funktionen aus. Über TNF-R2 wird beispielsweise die Expansion regulatorischer T-Zellen beeinflusst, was zur neuronalen Protektion beitragen kann [41]. Eine genauere Betrachtung der einzelnen Rezeptoren und seiner Liganden ist notwendig, um die teils widersprüchlichen Ergebnisse einer Blockade und des Einfluss von TNF-α nachvollziehen zu können. Verglich man TNF-/--Mäuse mit Kontrollmäusen, bei denen TNF-α vorhanden war, zeigte sich ein verspätetes Einsetzen der Krankheit. Im Anschluss entwickelte sich allerdings eine EAE mit chronischem Verlauf und es konnte eine Vermehrung der autoreaktiven T-Zellen in der Milz nachgewiesen werden [83] Wahrscheinlich wurde die Elimination autoreaktiver T-Zellen bei einem Fehlen von TNF-α verhindert, z.B. über die Beeinflussung der Auslösung von Apoptose, welche dann im Verlauf zu einer chronischen Schädigung führen konnten. Auch in der vorliegenden Arbeit waren die CD4+-Zellen vermehrt in der Milz zu finden und es liegt möglicherweise ein ähnliches Phänomen vor. Normalerweise ist es nicht möglich bei Mäusen, die sich einmal von der akuten Episode der EAE (EAE mit MOG:35-55, in C57BL/6-Mäusen) erholt haben, eine erneute Krankheitsepisode auszulösen, vorausgesetzt, dass keine schubförmig remittierende Verlaufsform der EAE induziert worden ist. Es zeigten sich bei einer Modulation von TNF-α nun aber andere Ergebnisse. Während TNF-/-Mäuse resistent gegenüber einer initialen EAE-Induktion waren, konnte sie bei einem zweiten Versuch der Krankheitsinduktion ausgelöst werden. TNF-R1-/-Mäuse hingegen behielten ihre Resistenz [122]. Dies spricht für eine pathogene Rolle des TNF-α via TNF-R1 und unterstreicht die duale Rolle des TNF-α und seiner Blockade. Die Relevanz von TNF-R1 bezüglich der pathogenen 68 4. Diskussion Mechanismen in der EAE ließ sich in weiteren Experimenten mit KnockoutMäusen reproduzieren, bei denen entweder TNF-R1 oder sowohl TNF-R1 als auch TNF-R2 ausgeschaltet wurden. Beide Mausstämme waren resistent gegenüber der Auslösung einer EAE. Schaltete man hingegen nur TNF-R2 aus, führte dies zu einer Verschlechterung der Erkrankung, einer vermehrten Zytokinproduktion der Th1-Zellen und einer vermehrten Infiltration von CD4+-TZellen und Makrophagen. Der Krankheitsbeginn war nur geringfügig verzögert. Dies spricht für die Notwendigkeit von TNF-R1 zur Auslösung der Krankheit wohingegen TNF-R2 regulatorische Funktionen ausübt und die Autoimmunantwort verringert [250]. Bei einer TNF-α-Blockade scheint also initial die positive Wirkung über eine Verhinderung der Signaltransduktion via TNF-R1 zu dominieren, während im Verlauf eine fehlende Regulation über TNF-R2 überwiegt und es so zu einer Verschlimmerung der klinischen Symptomatik kommt. Es existieren zwei unterschiedliche Formen von TNF-α, eine lösliche und eine membrangebundene. Das lösliche TNF-α hat eine höhere Affinität zu TNF-R1 und das membrangebundene zu TNF-R2. Prinzipiell können aber jeweils beide Rezeptoren über beide TNF-Spaltprodukte aktiviert werden [98]. In einer Studie von Alexopoulou et al. mit TNF-Knockout- und mTNF-Mäusen, welche ausschließlich die membranöse Form des TNFs freisetzten, konnte gezeigt werden, dass die Tiere, die lediglich mTNF besaßen, nicht an EAE erkrankten. Wenn hingegen beide Formen des TNF-α fehlten, wurde auch in dieser Studie lediglich der Erkrankungsbeginn zeitlich verzögert. Die Entwicklung einer EAE war aber trotzdem möglich [4]. Sie schlossen daraus, dass mTNF die Krankheitsinduktion direkt unterdrücken kann. Das sTNF hingegen scheint zu Beginn der Krankheit eine proinflammatorische Wirkung zu haben, welche dann im Verlauf nicht mehr vorranging ist, denn auch wenn TNF-α fehlt, schützt dies nicht vor einer Erkrankung an EAE. Setzt man nun Enbrel® ein, welches als unselektiver TNF-α-Blocker wirkt und sowohl sTNF als auch mTNF-α abfängt, muss davon ausgegangen werden, dass sowohl die proinflammatorischen als auch die regulatorischen Wirkungen des TNF-α beeinflusst werden. Diese These wird durch weitere Studien [29+253] unterstützt, die die Gabe von 69 4. Diskussion Etanercept, dem Wirkstoff von Enbrel®, mit einem sTNF-Blocker verglichen. Im Gegensatz zu der unselektiven Blockade mit Etanercept führte die selektive Blockade des sTNFs zu einer deutlichen Verbesserung der klinischen Symptomatik. Der Krankheitsbeginn konnte, entsprechend der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, sowohl mit einer Gabe von Etanercept als auch mit einer selektiven Blockade von sTNF verzögert werden. Ursächlich vorstellbar für die initial-positiven Effekte einer unselektiven TNF-α-Hemmung ist, neben der Verhinderung einer direkt zytotoxischen Wirkung des TNF-α, auch ein indirekter Einfluss durch eine verminderte Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren. In [253] wurde dieser Hypothese allerdings widersprochen. Durch die unselektive Blockade der Signaltransduktion wurden die schädlichen Mediatoren nicht herunter, sondern sogar hochreguliert. Eine selektive Blockade hingegen führte zu einer verminderten Freisetzung der Signaltransduktoren. Da die Messung der Mediatoren jedoch lediglich zu dem Zeitpunkt, an dem die Mäuse den höchsten klinischen Score aufwiesen und nicht zu Krankheitsbeginn erfolgte, lässt sich nicht ausschließen, dass eine Verschiebung des Einsetzens der EAE nicht doch durch eine Reduktion der zu Beginn anwesenden proinflammatorischen Zytokine bedingt ist, dieser Effekt dann jedoch im Verlauf entsprechend verloren geht. TNF-R1 und TNF-R2 können allerdings nicht isoliert voneinander betrachtet werden, da sich die beiden Rezeptoren gegenseitig beeinflussen und zum Teil über Rezeptor-übergreifende Funktionen verfügen. Alle Zellen, die TNF-R2 exprimieren, besitzen gleichzeitig auch TNF-R1. Es scheint dabei von vielen verschiedenen Faktoren abzuhängen, inwieweit welcher Rezeptor aktiviert wird, unter anderem vom Zelltyp, vom Aktivierungsstatus und vom Milieu, das die Zellen umgibt [146+204]. Hinweise für die Interaktion von TNF-R1 und TNF-R2 ergeben sich vor allem daraus, dass eine Apoptose auch über TNF-R2 ausgelöst werden kann, obwohl bei diesem keine eigene intrazelluläre Todesdomäne vorliegt, wie es hingegen bei TNF-R1 der Fall ist [78]. Daher wird angenommen, dass eine intrazelluläre Kommunikation zwischen den beiden Rezeptoren stattfindet (zusammengefasst in [69]). Dies muss bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien beachtet werden, da es so selbst bei 70 4. Diskussion einer selektiven Blockade gegebenenfalls zu unerwünschten Wirkungen über den Rezeptor, der eigentlich gehemmt werden sollte, kommen kann. Eine weitere mögliche Erklärung für eine Verzögerung des Krankheitsbeginns und die Senkung der Inzidenz ist eine verminderte Permeabilität der BHS in der Abwesenheit von TNF-α. Bei TNF-α-Knockout-Mäusen konnten Fabis et al. zeigen, dass die Durchlässigkeit der BHS deutlich herabgesetzt ist, wenn TNFα fehlt [67]. Eine vermehrte Permeabilität der BHS wird als ein wichtiger Parameter im Ablauf der Krankheitsinduktion angesehen. T-Zellen gelangen durch die Expression von VLA-4, dem Liganden von VCAM-1, über die BHS [60]. Die Hypothese, dass es durch eine Blockade von TNF-α zu einer geringeren Einwanderung schädigender CD4+-Zellen in das ZNS kommt, wird durch Studienergebnisse unterstützt, in denen gezeigt werden konnte, dass den Leukozyten mittels einer TNF-R1-abhängigen Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1 auf Astrozyten die Migration in das ZNS ermöglicht wird [15+85]. Unter normalen Bedingungen ist kein VCAM-1 im ZNS vorhanden [30]. Bei MS und unter Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen hingegen, wurde eine Expression von VCAM-1 auf Endothelzellen, Mikroglia und Astrozyten beobachtet [36+113+220]. Bei einer Inhibition von TNF-α wurde weniger VCAM-1 von Endothelzellen exprimiert [15]. Im Gegensatz dazu konnten Gimenez et al. zeigen, dass T-Zellen auch unter Abwesenheit von TNFR1 in das ZNS einwandern können, allerdings lediglich in den perivaskulären Raum und die Leptomeningen. Eine Migration bis in das Parenchym ist nicht möglich. Es ist demnach nicht die Expression von VCAM-1 auf Endothelzellen, die von TNF-R1 abhängig ist, sondern vielmehr die VCAM-1-Expression im Parenchym, die durch eine TNF-α-Blockade unterdrückt werden kann. Diese VCAM-1-Expression konnte räumlich Astrozyten zugeordnet werden, woraufhin Gimenez et al. davon ausgehen, dass die VCAM-1-Expression von Astrozyten für die Einwanderung der T-Zellen in das ZNS-Parenchym verantwortlich ist. Dabei ist nicht ganz klar, ob die Expression von VCAM-1 selbst TNF-R1mediiert ist und zu einer Einwanderung der Zellen in das ZNS führt oder ob nicht vielmehr andere Effektormoleküle wie MMPs oder andere Adhäsionsmoleküle von TNF-R1 abhängig sind. Anti-TNF-α-Inhibitoren können 71 4. Diskussion die weiße Substanz des ZNS so vor der Invasion von autoreaktiven T-Zellen schützen. Vereinzelt konnten allerdings auch bei TNF-R1-/--Mäusen VCAM-1exprimierende Zellen im Parenchym detektiert werden. Eine Erklärung dafür bietet der Einfluss von IFN-γ. Es wirkt ähnlich wie TNF-α, induziert die VCAM-1Expression auf Astrozyten ermöglicht den T-Zellen ebenfalls den Übertritt über die Bluthirnschranke, wenn auch in geringerem Maße als es TNF-α oder die Kombination von TNF-α und IFN-γ tun [85]. Weiteren Ergebnissen zur Folge könnte es von den unterschiedlichen Typen von Zellen, die TNF-α freisetzen, abhängig sein, welche Wirkung durch TNF-α erzielt wird. Kruglov et al. schalteten selektiv TNF-α entweder komplett, isoliert in myeloischen oder isoliert in T-Zellen aus. Bei vollkommener TNF-α-Defizienz oder wenn TNF-α in myeloischen Zellen fehlte, war der Krankheitsbeginn erneut signifikant verzögert. Zusätzlich konnte eine Verminderung der Anzahl der in das ZNS einwandernden CD4+-Zellen an Tag 14 nach der Immunisierung beobachtet werden. Diese Verminderung war bei den Experimenten der vorliegenden Arbeit nicht zu verzeichnen. Dabei muss angemerkt werden, dass hier auch keine Untersuchungen der CD4+-Zellzahlen im ZNS zu diesem frühen Krankheitszeitpunkt durchgeführt worden ist. Als Ursache wird eine verminderte Expression von Chemokinen postuliert, wenn TNF-α nicht vorhanden war. Im Verlauf zeigte sich allerdings eine vermehrte Anzahl von CD4 +-Zellen und CD11b+-Zellen (z.B. Neutrophile, Makrophagen), sowohl im ZNS als auch peripher in der Milz. Es ist also möglich, dass sich die initialen Effekte auf eine Verminderung der Rekrutierung von T-Zellen in das ZNS zurückführen lassen, z.B. über eine verminderte Expression von VCAM-1 oder VLA-4. Im Verlauf gehen diese Effekte allerdings verloren. Gleichzeitig findet keine Hemmung der Expansion autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie mehr statt. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls beobachtet und wird an anderer Stelle noch detaillierter diskutiert. Wenn hingegen den T-Zellen selbst das TNF-α fehlte, konnte eine Verbesserung der klinischen Symptomatik sowie eine Verminderung der Anzahl demyelinisierter Axone beobachtet werden. Im Verlauf gingen diese positiven Effekte allerdings ebenfalls verloren. Außerdem zeigte sich eine Vermehrung von autoreaktiven T-Zellen im ZNS. Als Ursache wurde 72 4. Diskussion eine Vermehrung dieser Zellen in sekundär lymphatischen Organen angenommen. Gleichzeitig wanderten aber weniger CD11b+ myeloische Zellen in das ZNS ein. Das von T-Zellen freigesetzte TNF-α scheint also einerseits zur Rekrutierung von Makrophagen in das ZNS beizutragen, andererseits aber die CD4+-T-Zellen in der Peripherie zu hemmen [134]. Daraus kann man schließen, dass einer initialen Blockade von TNF-α positive Effekte zugeschrieben werden können, da der Übertritt von autoreaktiven T-Zellen und im Verlauf auch myeloischer Zellen in das ZNS verhindert wird. Bei der Progression der Krankheit überwiegen aber regulatorische Effekte, wie z.B. eine Hemmung der Expansion von autoreaktiven Zellen in der Peripherie. Die Inhibition von TNF-α hat im Verlauf also negative Einflüsse. Hier sind wahrscheinlich auch von TNF-α unabhängige Mechanismen für die Schädigungen im ZNS verantwortlich. 4.5 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf IFN-γ-freisetzende Th1-Zellen Th1-Zellen werden als eine der an EAE und MS beteiligten Zellreihen angesehen, unter anderem da eine EAE mittels adoptivem Transfer von Th1Zellen ausgelöst werden kann [197] und in Läsionen sowie im Liquor und im Blut von MS-Patienten erhöhte Konzentrationen von Th1-Zellen gemessen werden konnten [132+187+246]. TNF-α gilt als einer der Mediatoren, der die Th1-Zellen beeinflusst. Im Tiermodell der rheumatoiden Arthritis konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Th1-Zellen im Effektororgan (i.e. Gelenk) unter Gabe von Enbrel® signifikant vermindert werden konnte [185]. Dies leitete zu der Annahme, dass das auch bei EAE der Fall sein könnte. So wurden in der vorliegenden Arbeit die Effekte von einer Enbrel®-Gabe auf die Konzentrationen von Th1-Zellen im ZNS, im Blut und in der Milz untersucht. Interessanterweise wurde eine Hochregulation der Th1-Zellen im Blut und in der Milz beobachtet, wohingegen die Zellen im ZNS nicht vermehrt waren. Die klinische Symptomatik war durch diese Zellerhöhung allerdings nicht beeinflusst 73 4. Diskussion und korreliert nicht mit den Zellzahlen in der Peripherie, sondern mit denen im ZNS. Eine mögliche Erklärung für die Vermehrung der Zellzahlen bietet eine Betrachtung des Einflusses von TNF-α auf proliferationsfördernde Faktoren. IL12 stellt beispielsweise einen dieser Faktoren dar. TNF-α hemmt die Expression der p40-Untereinheit, die IL-12 und IL-23 gemeinsam ist [85+289]. Eine Blockade von TNF-α führt entsprechend zu einer Enthemmung der Zellproliferation und somit zu einer vermehrten Th1-Zellzahl. In einer Studie, in der selektiv TNF-R1 ausgeschaltet worden ist, fand sich ebenfalls eine erhöhte Th1-Zellzahl und eine Vermehrung der p40-mRNA [63]. Eine Hemmung von TNF-α führt also zu einer Enthemmung der Regulation über TNF-R1 und trägt so zu der Expansion von T-Zellen bei. Welche Funktion übt nun IFN-γ aus und wie genau stehen TNF-α und IFN-γ, das unter anderem von Th1-Zellen freigesetzt wird, in Verbindung? Die Bedeutsamkeit des IFN-γ und der Th1-Zellen ergibt sich, wie bereits erwähnt, daraus, dass eine EAE durch den Transfer von autoreaktiven Th1Zellen ausgelöst werden kann [284]. Dies lässt vermuten, dass eine Hemmung von IFN-γ zu einer Besserung der klinischen Symptomatik führen müsste. Dies konnte in einer Studie bestätigt werden, in der durch eine Blockade von IFN-γ eine Progression von EAE verhindert wurde [121]. Außerdem führte die Verabreichung von IFN-γ zu einer Verschlechterung der Symptomatik [216]. Die Funktion von IFN-γ ist allerdings nicht eindeutig. In Studien mit KnockoutMäusen, in welchen IFN-γ und sein Rezeptor ausgeschaltet wurden, kam es zu einer ausgeprägteren EAE bzw. zu einem Verlust der Resistenz gegenüber einer Induktion der EAE, im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp [131]. Ähnliche Resultate erzielte man mit einer Verabreichung von Antikörpern gegen IFN-γ [154]. Chu et al. konnten eine Vermehrung der enzephalitogenen CD4+-T-Zellen feststellen, wenn Mäusen IFN-γ fehlte [44]. Im Gegensatz dazu wiesen Mäuse, bei denen die Gene für IFN-γ ausgeschaltet wurden, in einer neueren Studie ein verzögertes Einsetzen der Krankheit auf. Identisch zu den Resultaten einer TNF-α-Blockade mit Enbrel®, konnte der Krankheitsverlauf hingegen nicht positiv beeinflusst werden. Dabei wurde IFN-γ allerdings nicht von Th1-Zellen, 74 4. Diskussion sondern vielmehr von NK-Zellen freigesetzt. Der Krankheitsbeginn konnte vermutlich verschoben werden, da pathogene CD4+-Zellen weniger VLA-4 präsentierten und so nicht in das ZNS einwandern konnten. Es ist demnach möglich, dass nicht die Th1-Zellen für die Krankheitsinduktion verantwortlich sind, sondern vielmehr andere IFN-γ-freisetzende Zellen zur Krankheitsauslösung beitragen, indem sie z.B. den CD4+-Zellen über vermehrte VLA-4-Präsentation den Eintritt in das ZNS ermöglichen. Diese Zellen werden unter anderem durch TNF-α stimuliert. Eine TNF-α-Blockade beeinflusst so die Freisetzung von IFN-γ und hemmt sowohl seine inflammatorische als auch seine regulatorische Wirkung. TNF-α beeinflusst das Krankheitsgeschehen also indirekt [60]. Ein weiteres Beispiel für den indirekten Einfluss auf beteiligte Zelltypen stellt die von TNF-α-abhängige Stimulation potentiell autoreaktiver Th1- und Th17-Zellen über dendritische Zellen dar [115]. IL-12 und IFN-γ sind jedoch nicht die einzigen Parameter, die auf die Regulation von T-Zellen Einfluss nehmen. Regulatorische T-Zellen supprimieren Th1-Zellen beispielsweise über eine Freisetzung von IL-10 [7]. TNF-α gilt dabei als einer der Mediatoren, der die Funktion der Tregs stimuliert [128]. Eine Blockade von TNF-α würde folglich zu einer gestörten Funktion regulatorischer T-Zellen führen. Es konnte gezeigt werden, dass TNF-α seine Wirkung auf Tregs vor allem über TNF-R2 ausübt [273]. Dieser Rezeptor befindet sich jedoch ebenfalls auf T-Effektorzellen (Teff), zu denen auch die Th1-Zellen gehören. Über die Bindung von TNF-α an TNF-R2 wird so die Th1-Zellproliferation stimuliert ([41], zusammengefasst in [42]). Eine Blockade des TNF-α könnte die gewünschte Hemmung der Expansion von autoreaktiven Th1-Zellen bedingen, was den verspäteten Krankheitsbeginn erklären könnte. Im Verlauf fiele durch die Inhibition von TNF-α aber auch die Regulation der T-Zell-Proliferation über Tregs weg. Die Vermehrung der Th1-Zellen erfolgt dann wahrscheinlich über von TNF-α unabhängige Mechanismen. Andere Studien kamen hingegen zu dem Schluss, dass TNF-α nicht zu einer Stimulation von Tregs, sondern im Gegenteil zu einer Hemmung dieser führt, unter anderem durch eine verminderte Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 [180+269]. Eine Blockade von TNF-α müsste demnach zu einer Vermehrung der regulatorischen 75 4. Diskussion T-Zellen und zu einer Suppression der Th1-Zellaktivität führen. Diese postulierte anti-TNF-α-Wirkung konnte aber weder in dieser Arbeit noch in diversen anderen Studien bestätigt werden, in denen die Auswirkungen einer TNF-αBlockade auf Th1-Zellzahlen betrachten wurden [4+36+85+113]. Tregs regulieren Th1-Zellen nicht nur über eine Hemmung der proliferationsstimulierenden Zytokine, sondern fangen über ihre Rezeptoren auch freies TNF-α ab. Entsprechend wird die Stimulation der Th1-Zellen über TNF-α zusätzlich indirekt gehemmt [43]. Auch Teffs selbst setzen TNF-α frei, das dann Tregs stimuliert und die Teffs über einen negativen Feedbackmechanismus hemmt [90]. Letztlich stellt die Interaktion von Teffs und Tregs ein komplexes Zusammenspiel dar, in dem es durch die Verschiebung der Zell-Verhältnisse zu einer Störung der Homöostase kommt. Dieses Ungleichgewicht kann dann zu Schädigungen führen. Es stellt sich die Frage warum die Effekte von anti-TNF-α-Medikamenten so heterogen sind. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen bietet eine Betrachtung der unterschiedlichen Typen von Tregs. Wie bereits erwähnt, wird TNF-R2 von Tregs exprimiert. Untersucht man nun aber die Stimulationswege der unterschiedlichen Subtypen der Tregs genauer, zeigt sich, dass die natürlichen Tregs über eine TNF-α-TNF-R2-Interaktion stimuliert werden. Die induzierbaren Tregs haben hingegen TGF-β als Aktivator und können unabhängig von TNF-α agieren [108]. Nimmt man nun an, dass bei verschiedenen Krankheitsentitäten verschiedene Tregs zur Regulation autoreaktiver T-Zellen dominieren, könnten so die Unterschiede in der Wirkung von TNF-α-blockierenden Medikamenten erklärt werden. Bei einer Krankheit mit überwiegend induzierbaren Tregs würde eine Blockade von TNF-α vor allem seine proinflammatorischen Wirkungen neutralisieren, der regulatorische Einfluss der Tregs aber bliebe erhalten. Bei vorwiegender Beteiligung von natürlichen Tregs hingegen wären negative Effekte durch eine TNF-α Hemmung zu erwarten, da der hemmende Einfluss der Tregs wegfiele. Ungeachtet dessen ist es möglich, dass die autoreaktiven Zellen, die sich im ZNS befinden, unabhängig von der Stimulation durch TNF-α und der Regulation von Tregs sind, da das Krankheitsausmaß nicht mit den peripheren Th1-Zellen, 76 4. Diskussion sondern mit den im ZNS vorhandenen Zellen korrelierte und die Th1-Zellen im ZNS nicht vermehrt waren. T-Zellen benötigen immer zwei voneinander unabhängige Signale zur Stimulation, welche von antigenpräsentierenden Zellen, wie z.B. den dendritischen Zellen stammen [12]. Das eine Signal wird über die MHCs und das zweite über andere Rezeptoren auf den Zellen wie z.B. CD28 oder TNF-R2 übertragen. Testete man nun den Einfluss einer TNF-α-Blockade auf die Kostimulation von CD4+-Zellen, zeigte sich, dass die Freisetzung von IL-2 durch eine Blockade von TNF-α vermindert wurde. Dadurch wurden die Zellen empfänglicher für eine Hemmung durch das Zytokin TGF-β. Wenn man TGF-β neutralisierte, konnte dieser hemmende Effekt aufgehoben werden. Stimulierte man nun aber die T-Zellen über CD28, konnte die inaktivierende Wirkung der TNF-α-Blockade vollständig aufgehoben werden [93]. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch Kim und Teh, wobei CD28 in ihrer Studie nicht in der Lage war die fehlende TNF-R2-Wirkung vollständig auszugleichen [126]. Demnach wird TNF-α für die Aktivierung von Th1-Zellen im ZNS möglicherweise nicht benötigt, da eine Stimulation auch unabhängig von TNF-α erfolgen kann. Ebenfalls denkbar ist aber, dass die TNF-α-Blockade die ZNS-Zellen nicht erreichen kann, da die BHS für Antikörper wie Enbrel® nicht durchlässig ist. Es wird so deshalb nur die periphere Immunantwort reguliert. TNF-α-Inhibitoren können allerdings mittlerweile so modifiziert werden, dass die Überwindung der Bluthirnschranke möglich ist. Bei Morbus Parkinson erwiesen sich solche neuen, ZNS-gängigen TNF-α-Inhibitoren als neuroprotektiv [298]. Ob dies auch bei EAE und MS der Fall wäre, lässt sich allerdings aufgrund der Erkenntnisse aus Studien mit TNF-/--Mäusen bezweifeln. Um genauere Aussagen treffen zu können, müssten jedoch weitere Studien mit ZNS-gängigen TNF-α-Inhibitoren auch bei EAE-Modellen durchgeführt werden. Es stellt sich weiterhin die Frage, was mit den in der Milz akkumulierten TZellen passiert, wenn die TNF-α-Blockade wieder abgesetzt wird. Die hier aufgeführten Daten deuten darauf hin, dass die in der Milz gesammelten TZellen dann in das ZNS migrieren und dort Schaden anrichten. Dies wurde 77 4. Diskussion untersucht, indem der klinische Verlauf nach Absetzen des TNF-α-Inhibitors im Vergleich zum Verlauf nach Absetzen von PBS beobachtet worden ist. Auch wurden die Th1-Zellzahlen in der Milz verglichen, einerseits bei Versuchstieren, die durchgängig Enbrel® erhielten und andererseits bei Tieren, bei denen Enbrel® an Tag 13 nach der Immunisierung abgesetzt worden ist. Es zeigte sich eine signifikante Verschlechterung des klinischen Scores nach Absetzen der TNF-α-Inhibition in Verbindung mit abnehmenden Th1-Zellzahlen in der Milz. Es scheint, als wären die autoreaktiven T-Zellen durch die Blockade von TNF-α daran gehindert worden in das ZNS einzuwandern. Allerdings sind diese Ergebnisse mit Vorsicht zu betrachten, da keine sicherere Aussage darüber getroffen werden kann, ob die Mäuse, bei denen die TNF-α-Blockade abgesetzt worden ist, schon ein Plateau im klinischen Verlauf erreicht hatten. Dies war bei den mit PBS behandelten Kontrollen etwa ab Tag 13 zu beobachten, könnte sich aufgrund des verzögerten Krankheitsbeginns unter TNF-α-Inhibition bei den mit Enbrel® behandelten Tieren hingegen erst später zeigen. Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass sich die Verschlechterung der klinischen Symptomatik auch bei einer weiteren Verabreichung von Enbrel® gezeigt hätte und nicht auf die Beendigung der Behandlung zurückzuführen ist. Weitere Untersuchungen wären nötig, um dies auszuschließen. Die verringerten Zellzahlen in der Milz hingegen sprechen für die These, dass die Zellen in das ZNS einwandern konnten und die Verschlechterung des klinischen Verlaufs verursacht haben. In weiteren Studien müsste der Frage nachgegangen werden, ob nach Absetzen des TNF-α-Inhibitors eine Vermehrung der Zellzahlen im ZNS erfolgt und diese die Erhöhung des klinischen Scores bedingt. 4.6 Der Einfluss einer TNF-α-Inhibition auf die Histopathologie Um die Wirkung einer Blockade von TNF-α auf die pathologischen Vorgänge im ZNS zu untersuchen, wurden feingewebliche Untersuchungen des lumbalen Rückenmarks von C57BL/6-Mäusen mittels Licht- und Elektronenmikroskopie 78 4. Diskussion durchgeführt. Dabei wurden sowohl mit Hämatoxylin/Eosin und Methylenblau gefärbte Semidünnschnitte mit Hilfe eines semiquantitativen Scores analysiert als auch Ultradünnschnitte im Hinblick auf eine Schädigung des Myelins und feine Axonpathologien untersucht und die Versuchsgruppen jeweils verglichen. Insgesamt ließen sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten Mäusen feststellen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit, in der die Blockade von TNF-α keinen signifikant protektiven Effekt bezüglich der entzündlichen Infiltrate und der histopathologischen Schädigung aufwies, konnte in einer Studie von Taoufik et al. eine protektive Wirkung von Etanercept bezüglich des Myelin- und Axonschadens beobachtet werden. Dieser Effekt zeigte sich zum Zeitpunkt des Krankheitspeaks, also dem Zeitpunkt, an dem der höchste klinische Score bestimmt worden ist. Die klinische Symptomatik wurde hingegen nicht positiv beeinflusst. Im Verlauf (Tag 35 nach der Immunisierung) war kein positiver Effekt im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen zu beobachten [253]. Im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit wurden bei Taoufik et al. keine ultrastrukturellen Analysen mittels Elektronenmikroskopie durchgeführt. Diese bilden die pathologischen Vorgänge an den Axonen deutlich genauer ab, als es mit der Lichtmikroskopie möglich ist. Betrachtet man den klinischen Verlauf der EAE unter einer Blockade von TNF-α, geht der positive Effekt zu Beginn der Erkrankung im Verlauf des Entzündunggeschehens verloren. Nur anfangs könnte eine Schädigung des Myelins verhindert werden. Dies bestätigt eine Studie von Brambilla et al., die ebenfalls Etanercept mit einer selektiven Blockade von sTNF verglichen und weiterführende ultrastrukturelle Analysen der Axone und ihres Myelins durchführten. Entsprechend den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit war die Anzahl der demyelinisierten Axone unter einer Gabe von Etanercept nicht geringer als bei Mäusen vom Wildtyp. Unter der Gabe des selektiven TNF-α-Blockers hingegen zeigten sich eine geringere Anzahl demyelinisierter Axone und weniger Axolyse. Außerdem wurde eine signifikante Vermehrung der Remyelinisierung in Assoziation mit einer Blockade des sTNF gefunden, was durch eine größere Anzahl von TNF-R2 Rezeptoren auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu erklären war. TNF-R1 hingegen 79 4. Diskussion befindet sich auf Neuronen und es wird angenommen, dass TNF-α bei diesen Zellen im Wesentlichen schädliche Auswirkungen über den Rezeptor hat [29]. Schaltete man selektiv TNF-R1, TNF-R2 oder beide Rezeptoren parallel aus, zeigte sich keinerlei Demyelinisierung, wenn keiner der beiden Rezeptoren vorhanden war. Bei fehlendem TNF-R1 waren leichte perivaskuläre und leptomeningeale Infiltrate sowie eine Demyelinisierung zu beobachten. Bei fehlendem TNF-R2 präsentierte sich eine ausgedehnte Entzündung mit deutlicher Demyelinisierung [251]. Diese angenommene protektive Rolle von TNF-R2 wird durch Ergebnisse von Akassoglou et al. bestätigt. Sie arbeiteten mit Mäusen, denen nur TNF-R1 fehlte. Diese bildeten keinerlei Demyelinisierung aus und es ließen sich im ZNS keine Infiltrate finden [3]. Arnett et al. konnten die unterschiedlichen Auswirkungen von TNF-R1 und TNFR2 auf die demyelinisierenden Vorgänge noch genauer spezifizieren. Sie induzierten keine EAE, sondern lösten eine Demyelinisierung aus, indem sie Mäuse mit dem Toxin Cuprizon fütterten und untersuchten die Auswirkungen sowohl bei Mäusen vom Wildtyp als auch bei TNF-α- und TNF-R1- sowie TNFR2-Knockout-Mäusen. Mit dem Cuprizon-Modell ist es möglich demyelinisierende und remyelinisierende Vorgänge zu untersuchen. Einige Wochen nach Beendigung der Fütterung mit Cuprizon begannen die Axone wieder zu remyelinisieren. Die TNF-α-Konzentrationen im ZNS waren bei Mäusen, die das Gift erhielten, sowohl in Phasen der Demyelinisierung als auch der Remyelinisierung erhöht, während bei gesunden Kontrollmäuse ohne Cuprizonbehandlung keine Erhöhung von TNF-α zu verzeichnen war. TNF-α-/-Mäuse wiesen zu Beginn signifikant weniger Demyelinisierung auf, im Verlauf ging dieser Unterschied aber verloren. Dies steht im Einklang mit den Beobachtungen der vorliegenden Arbeit und der These, dass eine Inhibition von TNF-α nur zu Beginn positive Effekte zeigt. Nach einer Beobachtungszeit von sechs Wochen war die Anzahl der demyelinisierten Axone bei Mäusen vom Wildtyp und TNF-α-Knockout-Mäusen vergleichbar. Interessanterweise zeigten sich aber deutliche Unterschiede bezüglich remyelinisierender Vorgänge. Mäuse, denen TNF-α fehlte, wiesen deutlich weniger remyelinisierte Axone auf, als Mäuse vom Wildtyp. Unter selektiver genetischer Modifikation von entweder 80 4. Diskussion TNF-R1 oder TNF-R2 konnte dann gezeigt werden, dass die Remyelinisierung bei den Mäusen geringer ausfiel, denen TNF-R2 fehlte. Bei reiner TNF-R1Defizienz hingegen war eine normale Remyelinisierung vorhanden. In weiteren Experimenten konnte dies auf eine Verminderung der Oligodendrozytenvorläuferzellen bei TNF-R2-defizienten Mäusen zurückgeführt werden [8]. TNF-R1 ist demnach an schädigenden Abläufen an den Axonen beteiligt, während TNF-R2 eine essentielle Funktion bei der Remyelinisierung und somit der Regeneration von neurologischen Defiziten ausübt. In einer Studie von Selmaj et al. gab es Hinweise darauf, dass Lymphotoxin, welches ebenfalls an TNF-R1 bindet, eine ausgeprägtere schädigende Wirkung auf Oligodendrozyten ausübt, als es TNF-α selbst tut [231]. Dies befürwortet die These, dass die Zerstörung von Oligodendrozyten v.a. TNF-R1-abhängig erfolgt und würde das Fehlen eines positiven Effekts bei TNF-α-Blockade jedenfalls zum Teil erklären, da Lymphotoxin von dieser nicht beeinflusst wird. Man muss außerdem beachten, dass sich bei den histologischen Analysen die Problematik ergibt, dass in der Regel nie das ganze Rückenmark betrachtet werden kann und auf den einzelnen Schnitten immer nur ein kleiner Teil abgebildet ist. Es bleibt nicht sicher auszuschließen, dass sich nicht noch deutlich mehr Infiltrate in den Rückenmarksabschnitten befinden, die nicht erfasst worden sind oder aber auch besonders die Stellen mit vermehrten Infiltraten betrachtet wurden. Die in dieser Arbeit aufgeführten Ergebnisse bezüglich des fehlenden positiven Einflusses einer TNF-α-Blockade auf die Demyelinisierung stehen im Einklang mit den Ergebnissen anderer Studiengruppen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Ergebnisse nicht nur schnittbedingt zu Stande gekommen sind. Insgesamt scheint TNF-α eine duale Funktion im Bezug auf die Schädigung von Myelinscheiden auszuüben. Während zu Beginn die schädigende Wirkung im Vordergrund steht, überwiegt im Verlauf der protektive Effekt über TNF-R2 unter anderem auf Remyelinisierungsvorgänge. Mit einer Blockade von TNF-α verhält es sich entsprechend umgekehrt. Inwieweit dies an einer mangelnden Fähigkeit des TNF-α-Inhibitors zur Penetration der BHS liegt, bleibt fraglich und es müssten weitere Studien durchgeführt werden, um zu erfassen, wie genau die 81 4. Diskussion histopathologischen Veränderungen unter der Verabreichung von ZNSgängigen TNF-α-Inhibitoren oder auch bei einer selektiven Blockade von TNFR1 aussehen würden. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass der Myelinschaden nicht auch durch andere proinflammatorische Zytokine, wie dem erwähnten Lymphotoxin, oder durch reaktive Sauerststoff-Spezies bedingt ist [56]. NO korreliert beispielsweise mit dem Krankheitsausmaß und dem Myelinschaden [271]. Es wird durch Makrophagen und Mikroglia freigesetzt und stimuliert seinerseits die Freisetzung von TNF-α [39]. Ähnliches gilt für den exitatorischen Transmitter Glutamat. Sein Abbau wird durch TNF-α gehemmt ([73], zusammengefasst in [100]). Eine Blockade von TNF-α müsste so einen indirekt positiven Effekt haben. Auch eine Beteiligung weiterer Zellreihen wie beispielsweise CD8 +-T-Zellen oder B-Zellen, die myelinspezifische Antikörper bilden, wäre denkbar und konnte bei einigen Patienten mit MS nachgewiesen werden [236]. Neumann et al. konnten CD8+-Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft zu demyelinisierten Axonen finden und Granzym B, das gegen das Myelin gerichtet war, nachweisen [182]. Inwieweit TNF-α bei der EAE Einfluss auf diese Zellen nimmt und welche Auswirkungen seine Blockade hätte, bleibt weiteren Studien vorbehalten. Eine neue Art der elektronenmikroskopischen Darstellung, die scannende Elektronenmikroskopie (SEM), ermöglicht eine genauere Erfassung der Veränderungen der Myelinscheiden durch eine dreidimensionale Abbildung der Strukturen. Dies haben Bando et al. genutzt, um die Veränderungen am Myelin zu unterschiedlichen Krankheitsphasen der EAE zu untersuchen. Als frühestes Zeichen konnte eine Ablösung des Myelins von den Axonen erkannt werden, noch bevor überhaupt Entzündungszellen eingewandert waren. Diese Vorgänge wurden außerdem in der weißen Substanz, die frei von Infiltraten war, beobachtet. Das weist darauf hin, dass eine Myelinablösung ein frühes Zeichen der Schädigung ist, welches der eigentlichen Demyelinisierung vorausgeht. Zum Zeitpunkt des Peaks der Krankheit fanden sich komplexere Veränderungen des Myelins, wie z.B. verdoppeltes Myelin mit einem Anteil von 82 4. Diskussion etwa 30% und im chronischen Verlauf kam es dann zu einem aus multiplen Schichten bestehenden Myelin, das einen Prozentsatz von etwa 60% einnahm. Neben diesen Veränderungen des Myelins wurden ebenfalls veränderte Mitochondrien detektiert, welche der in der vorliegenden Arbeit untersuchten feinen axonalen Pathologien ähnelten. Auch an den Axonen ließen sich Veränderungen, wie z.B. eine Schlängelung erkennen, wobei nicht klar ist, ob dies in einer Zerstörung der Axone mündet. Interessanterweise wurden die jeweiligen Veränderungen ebenfalls in den Gehirnen verstorbener MS-Patienten beobachtet. Bei mit Cuprizon ausgelöster Demyelinisierung, zeigte sich hingegen keine Veränderungen der Axone [13]. Solche genaueren analytischen Methoden lassen viel exaktere Untersuchungen der einzelnen potentiell geschädigten Kompartimente und somit auch Rückschlüsse auf die Krankheitspathophysiologie zu. Mit weiterführenden Studien, die diese Methode einsetzen, könnten protektive aber auch negative Effekte von potentiellen Medikamenten genauer ausgewertet werden und die Erkenntnisse entsprechend zur Evaluation neuer und prinzipiell auch bereits vorhandener MS-Medikamente genutzt werden. 4.7 Ergänzung durch parallel erhobene Ergebnisse In den folgenden Abschnitten wird Bezug genommen auf Ergebnisse, die in unserer Arbeitsgruppe in parallel durchgeführten Experimenten erarbeitet wurden. Sie ergänzen die in dieser Arbeit aufgeführten Ergebnisse und tragen zum weiteren Verständnis der Problematik bei. 4.7.1 CD4+-Zellen und Makrophagen Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden Schnitte des lumbalen Rückenmarks im Hinblick auf das Vorhandensein von CD4+-Zellen und Makrophagen untersucht und die jeweiligen Zellzahlen in Bezug zum klinischen 83 4. Diskussion Score der Mäuse gesetzt. Während CD4+-Zellen nicht mit dem klinischen Score korrelieren, besteht eine Korrelation von Makrophagen und der klinischen Symptomatik. Dies unterstützt die These, dass vielmehr Makrophagen als CD4+-Zellen im Krankheitsverlauf die entscheidende pathogene Rolle spielen. Es spricht außerdem für die Beteiligung von TNF-α, da in dieser Arbeit nachgewiesen konnte, dass TNF-α in entzündlichen Läsionen bei an EAE erkrankten Mäusen von F4/80-positiven Zellen freigesetzt wird und ebenfalls mit dem klinischen Score korreliert. 4.7.2 Immunhistochemische Untersuchungen mit SMI 99 und 312 Bei weiteren immunhistochemischen Untersuchungen des lumbalen Rückenmarks von mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen konnte festgestellt werden, dass sowohl der Grad des Axonschadens, dargestellt mit SMI 312 als auch der Auffälligkeiten an den Myelinscheiden, gefärbt mit SMI 99, mit der Anzahl der Makrophagen korreliert. Dabei wurden die gleichen Mäuse verwendet, bei denen auch die TNF-α-Färbung durchgeführt wurde. Wie bereits angesprochen, sind Makrophagen einer der Zelltypen, die TNF-α freisetzen und es konnte gezeigt werden, dass sich TNF-α an beschädigtem Myelin befindet. Die Ergebnisse der hier aufgeführten immunhistochemischen Färbungen unterstreichen demnach die These, dass TNF-α an den histopathologischen Abläufen des ZNS beteiligt ist. Sie begründeten außerdem die Annahme, dass eine Blockade von TNF-α einen positiven Einfluss auf die Histopathologie haben müsse. Dies bestätigte sich jedoch, wie oben bereits aufgeführt, nicht. 4.7.3 Klinischer Verlauf bei einer mit Humira® behandelten Kontrollgruppe Durch unsere Arbeitsgruppe wurden zusätzliche Erhebungen der klinischen Daten von einer weiteren Kontrollgruppe, die mit Humira® (n=10) behandelt worden ist, durchgeführt, welche die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse 84 4. Diskussion bekräftigen. Humira® dient dabei als Kontrollantikörper, mit dem eine Inhibition von TNF-α bei Mäusen nicht möglich ist. Es kann so zusätzlich sichergestellt werden, dass die beobachteten Effekte nicht ausschließlich darauf zurückzuführen sind, dass ein Antikörper verabreicht worden ist, sondern auf der Blockade von TNF-α beruhen. Es zeichneten sich in allen Untersuchungen der klinischen Ergebnisse der Mäuse identische Tendenzen der PBS- und Humira®-Kontrollgruppen ab. Der Krankheitsbeginn war entsprechend der mit PBS behandelten Mäuse früher als bei den mit Enbrel® behandelten Mäusen (12 ± 0,6 Tage vs. 17± 3 Tage, p<0,01) und alle behandelten Tiere erkrankten (Inzidenz von 100%). Nach dem Einsetzen der Krankheit zeigten sich jedoch ebenfalls keine Unterschiede bezüglich der klinischen Scores [17]. 4.7.4 Auswirkungen der TNF-α-Inhibition auf IL-17-freisetzende Th17-Zellen Die EAE wurde lange Zeit als rein Th1-mediierte Erkrankung angesehen, unter anderem weil im ZNS von Erkrankten Th1-Zytokine vorherrschen und eine EAE durch den Transfer von enzephalitogenen T-Zellen ausgelöst werden kann [132+186+197+246]. Wie bereits erwähnt, werden Th1-Zellen über das Zytokin IL-12 stimuliert. Dieses setzt sich aus den Untereinheiten p35 und p40 zusammen. Nimmt man an, dass die EAE eine rein Th1-mediierte Erkrankung ist, müsste eine Blockade von IL-12 bzw. seiner Untereinheiten oder seines Rezeptors zu einer Verbesserung, wenn nicht sogar Verhinderung der Krankheit führen. Dies wurde in diversen Studien untersucht, es ließ sich aber weder eine Resistenz gegenüber der Erkrankung, noch eine Verbesserung der Symptomatik feststellen, sondern es zeigte sich im Gegenteil sogar eine Verschlechterung des klinischen Erscheinungsbilds [18+89+296]. Schaltete man gezielt die p35-Untereinheit aus, zeigte sich keine Verbesserung der EAE, sondern ein verschlechterter Verlauf [89]. Dies erforderte ein Umdenken bezüglich des Th1-Paradigmas. Die Tatsache, dass die p40-Untereinheit des IL12 sowohl Bestandteil des IL-12 als auch Teil des IL-23 ist, welches seinerseits 85 4. Diskussion Th17-Zellen stimuliert, rückte die Th17-Zellen näher in den Fokus. Diese sind ein relativ neu entdeckter CD4+-Zell-Subtyp, der proinflammatorische Zytokine, wie IL-17, IL-6, TGF-β und auch TNF-α freisetzt [140]. Schaltete man selektiv die gemeinsame p40-Untereinheit aus, waren die entsprechenden Mäuse resistent gegenüber einer Auslösung von EAE. Gleiches galt für Mäuse, denen die für IL-23 spezifische p19-Untereinheit fehlte [49]. Auf die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th17-Zellen nehmen TGF-β, IL-6 und IL-21 Einfluss. Dies wird verstärkt durch TNF-α und IL-1β. IL-23 hingegen trägt vielmehr zur Reifung und zum Überleben der Th17-Zellen bei (zusammengefasst in [62]). Nimmt man nun TNF-α als einen der Th17-stimulierenden Mediatoren und die Th17-Zellen als eine in der Pathogenese der EAE wichtige Zellreihe, so leitet dies zu der Annahme, dass eine Blockade von TNF-α zu einer verminderten Stimulation von Th17-Zellen führen sollte sowie der Verlauf der EAE positiv beeinflusst werden müsste. Daher wurde in Versuchen, die parallel zu den Experimenten dieser Arbeit durchgeführt wurden, zusätzlich zur IFN-γ-Detektion mittels ELISPOT repräsentativ für die Th1-Zellantwort, auch die Th17-Zellen über die Analyse von IL-17-positiven Spots untersucht. Die Ergebnisse erwiesen sich als sehr ähnlich. Es fand keine Erhöhung der Th17-Zellantwort im ZNS statt. Die Th17-Antwort im ZNS korrelierte aber mit dem klinischen Score. Entsprechend der Th1-Antwort war die Th17-Antwort in der Milz signifikant erhöht (p<0,05; Wilcoxon-Rangsummentest). Eine Korrelation von Th17-Zellen in der Milz und dem klinischen Score war hingegen ebenfalls nicht vorhanden. Auch die Vermehrung der Th17-Zellen in der Peripherie scheint also keinen Einfluss auf die Krankheit zu haben, jedenfalls solange diese Zellen unter antiTNF-α-Gabe in der Milz zurückgehalten werden und nicht in das ZNS gelangen. Studien, in denen versucht wurde zu eruieren welche der beiden T-HelferZelllinien nun eine schwerwiegendere Form der EAE auslöst, kamen zu uneinheitlichen Ergebnissen. So beschrieben Langrish et al. eine verschlimmerte EAE, wenn diese durch den adoptiven Transfer von Th17Zellen ausgelöst wurde [140]. Im Gegensatz dazu konnten Kroenke et al. keine Unterschiede im klinischen Erscheinungsbild zwischen einer durch Th1- oder Th17-Zellen-ausgelöste EAE feststellen. Allerdings unterschieden sich die 86 4. Diskussion vorherrschenden Zellentypen, die in das ZNS rekrutiert wurden. Bei einer Th1Zell-mediierten EAE wurden eher einwandernde Makrophagen beobachtet, während bei einer Th17-Zell-mediierten EAE Neutrophile vorherrschten [132]. Es unterschieden sich aber nicht nur die einwandernden Zellen sondern auch die Topographie der Läsionen sowie die entsprechende klinische Präsentation der Erkrankung. Bei einer EAE durch Th17-Zellen war vorzugsweise das Gehirn betroffen und es zeigte sich eine atypische EAE. War die EAE hingegen durch Th1-Zellen ausgelöst worden, entwickelte sich eine klassische Form der EAE mit Läsionen im Rückenmark [246]. Dabei waren nicht die absoluten Zellzahlen entscheidend, sondern vielmehr das Verhältnis von Th1- zu Th17-Zellen. Je nachdem, welcher Zelltyp überwog, bestand eine Neigung zu Infiltraten im Rückenmark bzw. im Gehirn der Mäuse. Außerdem nehmen Hofstetter et al. an, dass das Verhältnis von Th17-Zellen zu Tregs bestimmt, ob sich ein chronischer Verlauf ausbildet oder nicht [107], auch wenn Th17-Zellen weniger empfänglich für die Regulation über Tregs als Th1-Zellen sind [33]. Siffrin et al. konnten zeigen, dass Th17-Zellen Axonschaden durch Veränderungen der Kalzium-Homöostase auslösen konnten und somit zu neuronaler Dysfunktion führten. Diese Blockade der Signalübertragung bedingte nicht nur einen Schaden der Axone, sondern ebenfalls des Myelins [235], erwies sich aber zunächst noch als potentiell reversibel. Th17-Zellen tragen demnach auch zur Schädigung von Myelin und Axonen bei. Th17-Zellen bewirken außerdem eine Störung der Permeabilität der BHS. Die Endothelzellen der Bluthirnschranke besitzen Rezeptoren für die Zytokine der Th17-Zellen. Vor allem beteiligt sind IL-17 und IL-22. IL-17 stimuliert dabei die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in den Endothelzellen. Daraus resultiert eine Störung der Tight Junctions über eine Aktivierung des kontraktilen Apparates des Endothels und es kommt gleichzeitig zu einer vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen (zusammengefasst in [116]). Dies stellt einen potentiellen Mechanismus für die schädigende Wirkung von Th17-Zellen dar. Eine gemeinsame Betrachtung von sowohl Th1- als auch Th17-Zellen ist insofern sinnvoll, als dass die beiden Zellreihen eng miteinander in Verbindung 87 4. Diskussion stehen. In einer Studie zu chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, in denen Th1- und Th17-Zellen ebenfalls wichtige Anteile an der Pathogenese haben, konnte gezeigt werden, dass Th1-Zellen durch Th17-Zellen supprimiert werden können. Während auf naiven CD4+-T-Zellen keine IL-17-Rezeptoren vorhanden sind, war im Verlauf der Th1-Zelldifferenzierung eine Hochregulation der IL-17-Rezeptoren auf den Th1-Zellen zu beobachten. Die Transkriptionsfaktoren zur Th1-Differenzierung, z.B. T-bet und STAT1, waren unter Anwesenheit von IL-17 deutlich herunter reguliert. Dies war jedoch nur in frühen Stadien der Th1-Differenzierung der Fall, im Verlauf ließ sich diese Suppression nicht erkennen [188]. Es können hingegen nicht nur Th1-Zellen von Th17-Zellen supprimiert werden, sondern auch der gegenteilige Mechanismus ist denkbar. Die Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL17-A und IL17-F aus Th17-Zellen konnte in Zellkulturen durch die Zugabe von IFN-γ gehemmt werden. Neben dieser Hemmung kam es zusätzlich noch zu einer Verschiebung von IL-17A zu IFN-γ. Dabei sind die Transkriptionsfaktoren T-bet und STAT-1 die Faktoren, die eine voneinander unabhängige Suppression der Th17-Zellen bedingen [294]. Th1- und Th17-Zellen beeinflussen und regulieren sich demnach gegenseitig. Ein weiterer Hinweis dafür, wie sehr die beiden Zellreihen miteinander interagieren, ist, dass zusätzlich zu den IL-17oder IFN-γ-freisetzenden Th17- oder Th1-Zellen auch Zellen existieren, die sowohl positiv für IL-17 als auch für IFN-γ sind. Je nachdem welche Chemokinrezeptoren diese präsentieren, setzen sie entweder mehr IL-17 (CCR1+CCR5-) oder mehr IFN-γ (CCR2+CCR5+) frei [226]. Dabei stellt sich die Frage, ob ein Zelltyp existiert, der Th1- und Th17-Zytokine ausschüttet oder ob sich nicht vielmehr die einzelnen Zelltypen ineinander umwandeln. Eine Variabilität wird für Th17-Zellen schon länger angenommen, während für Th1Zellen eine hohe Stabilität postuliert wurde. Es war jedoch zunächst fraglich, ob diese Variabilität nur in vitro oder auch in vivo vorhanden ist. Während Lexberg et al. annehmen, dass sich diese Plastizität am Lebenden nicht reproduzieren lässt [147], konnten Hirota et al. zeigen, dass sich Th17-Zellen auch in vivo zu IFN-γ-Produzenten umwandeln können. Dabei war ein Wechsel von IL-17produzierenden Th17-Zellen zu einer 88 Produktion von IFN-γ vom 4. Diskussion vorherrschenden entzündlichen Milieu bzw. der jeweiligen Erkrankung abhängig. Bei der chronisch entzündlichen EAE fand ein Wechsel von IL-17 zu IFN-γ statt, bei einer akuten kutanen Candida albicans Infektion hingegen war keine Transformation zu beobachten. Interessant ist außerdem, dass der Großteil der Menge des produzierten MOG-spezifischen IFN-γ von den Zellen mit einem Th17-Ursprung stammte und nicht von Th1-Zellen. Th17-Zellen produzierten relativ schnell nur noch geringe Mengen an IL-17A. Fehlte den Mäusen aber IL-23, waren keine doppelt positiven IFN-γ und IL-17-Zellen zu finden [104]. Es könnten also die Th17-Zellen sein, die sich im entzündlichen Milieu zu IFN-γ-Produzenten umwandeln, die einen wichtigen Teil der pathogenen Vorgänge der EAE mediieren. Diese Ergebnisse bieten eine Erklärung dafür, warum IL-23 so wichtig für die EAE zu sein scheint, wie schon von Yeh et al. beobachtet [294]. Es macht außerdem verständlicher warum es so schwierig ist, der EAE eine konkrete Zellreihe zuzuordnen. Lee et al. konnten zeigen, dass TGF-β der entscheidende Faktor für eine vermehrte IL17-Produktion ist und dass vor allem das Verhältnis von TGF-β zu IL-23 und IL12 bestimmt, ob IL-17 oder IFN-γ von den Th17-Zellen freigesetzt wird. Wenn TGF-β nicht mehr anwesend war, unterdrückte IL-12 die für die Th17Differenzierung wichtigen Transkriptionsfaktoren RORγt und RORα und führte zur Expression von für Th1-Zellen typische Faktoren [142]. Der vorherrschende Zelltyp scheint dabei auch von der genetischen Ausstattung der Mäuse abhängig zu sein. Bei einer EAE bei C57BL/6-Mäusen waren vor allem Th1Zellen beteiligt, während bei einer EAE bei SJL-Mäusen eher Th17-Zellen dominierten (zusammengefasst in [62]). Da diese unterschiedlichen genetischen Ausstattungen gleichzeitig verschiedene Verlaufstypen der EAE bedingen, könnte somit die Dominanz des jeweiligen Zelltyps zu den Unterschieden im Verlauf beitragen. Interessanterweise scheint TNF-α auf den Wechsel vom Th17- zum Th1Phänotyp Einfluss zu nehmen. In einer Studie zur juvenilen idiopathischen Polyarthritis konnte die Umwandlung von Th17- zu Th1-Zellen durch Etanercept verhindert werden [158]. Laut Ghoreschi et al. stellt die Transformation von Th17- zu Th1-Zellen einen der 89 wesentlichen Vorgänge bei 4. Diskussion Autoimmunkrankheiten wie der EAE dar [84]. Nimmt man an, dass die Zytokine von Th1-Zellen bzw. die der von Th17- zu Th1-Zellen transformierten Zellen für die Pathogenese der EAE entscheidend sind, würde dies eine mögliche Erklärung dafür liefern, warum Enbrel® die T-Zellen in der Peripherie zwar vermehren, diese jedoch nicht pathogen zu sein scheinen, da sie wie in dieser Arbeit dargestellt, den klinischen Score nicht verschlimmern. Inwieweit sich diese beobachteten Mechanismen auf einer im ZNS stattfindende EAE übertragen lassen, bleibt jedoch fraglich. Eine aktuelle Studie von Liu et al. ergab nun, dass sich nicht nur Th17- in Th1Zellen umwandeln können, sondern auch eine Konversion von Th1- zu Th17Zellen möglich ist. Die angenommene Stabilität der Th1-Zelllinie wird damit in Frage gestellt. Die Umwandlung von Th1- zu Th17-Zellen wurde über TGF-β und IL-6 reguliert, wohingegen IL-23 nicht beteiligt war. Dabei läuft die Konversion von Th1- zu Th17-Zellen wahrscheinlich über eine TGF-βinduzierte, vermehrte Expression des Transkriptionsfaktors Runx1, der unter anderem an der IL-17-Freisetzung sowie der Th17-Differenzierung beteiligt ist [151]. Diese Beobachtungen wurden allerdings nur in vitro und nicht in vivo gemacht und es bleibt dahingestellt, ob dieses konstruierte Modell einerseits auf lebende Tiere und andererseits auf das EAE-Modell übertragbar ist. Ein Problem bei der isolierten Betrachtung von IFN-γ und IL-17 bezüglich der Pathogenese der EAE ist, dass diese auch in Abwesenheit der beiden induziert werden kann [294]. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung bietet die Beteiligung von GM-CSF. Dieses Zytokin wird sowohl von Th1- als auch von Th17-Zellen freigesetzt und könnte der entscheidende entzündliche Faktor bei der EAE sein. Schaltete man GM-CSF gezielt aus, konnte keine EAE ausgelöst werden [62]. Außerdem stimuliert IL-23 die Produktion von GM-CSF durch Th17-Zellen, während TGF-β sie unterdrückt, was die postulierte pathogene Rolle von IL-23 unterstreicht [171]. Bezüglich der Bedeutung von IL-23 in der EAE bestehen unterschiedliche Studienergebnisse und Ansichten. Einige kamen zu dem Schluss, dass ein Fehlen von IL-23 bzw. seinen Untereinheiten p19 oder auch p40, der mit IL-12 gemeinsamen Untereinheit, zur Resistenz gegenüber der Auslösung einer EAE 90 4. Diskussion führt und IL-23 außerdem vor allem zur Aufrechterhaltung der Entzündung im Verlauf der EAE beiträgt [18+51]. In einer anderen Studie hingegen konnte eine EAE auch unter Abwesenheit von p19 durch den adoptiven Transfer enzephalitogener Zellen ausgelöst werden. IL-23 scheint nach diesen Ergebnissen also weniger auf die Effektorphase als auf die Generation bzw. die Vermehrung und das Überleben der schädigenden Zellen Einfluss zu nehmen [254]. Insgesamt stehen sowohl die beteiligten Zellen als auch die freigesetzten Zytokine in Interaktion miteinander und regulieren sich jeweils gegenseitig. Es ist schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, einzelne Teile gezielt auszuschalten ohne Einfluss auf die anderen zu nehmen. So hat auch eine Inhibition von TNFα, welches Teil dieses komplexen Netzwerkes der Interaktion von Immunmediatoren ist, immer Auswirkungen auf mehrere Bereiche und so sowohl potentiell positive als auch potentiell negative Effekte. Dies konnte auch in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Zu beachten ist außerdem, dass nicht sicher ist, ob diese Mechanismen beim Menschen exakt identisch und somit auf die MS übertragbar sind. Auch sind die Abläufe bei den einzelnen Autoimmunkrankheiten nur schwer vergleichbar und es ist fraglich inwiefern sich die einzelnen pathologischen Abläufe entsprechen. 4.7.5 Auswirkungen der TNF-α-Inhibition auf axolytische Vorgänge Neben der Demyelinisierung ist die Axolyse einer der histopathologischen Vorgänge, die bei MS und EAE beobachtet werden können. In der akuten Phase der Erkrankung ist eher die Entzündung vorherrschend, die zunächst noch reversibel ist, während es im Verlauf zu irreversiblen chronischen Schäden mit einem Verlust von Axonen kommt [290]. Recks et al kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Sie konnten zusätzlich noch zeigen, dass eine Demyelinisierung in allen Krankheitsphasen vorhanden ist [213]. Bei der MS wurde im chronischen Verlauf ein Verlust von etwa 70% der Axone beobachtet, welcher mit dem klinischen Erscheinungsbild korrelierte [26]. 91 4. Diskussion Es wird angenommen, dass der Verlust von Axonen auch schon zu Beginn der Erkrankung zu finden ist, jedoch erst klinisch in Erscheinung tritt, wenn etwa 1530% der Nervenfasern nicht mehr intakt sind. Allerdings zeigte sich bei diesem frühen Verlust von Axonen keine Korrelation mit den eingewanderten T-Zellen und den entzündlichen Infiltraten ([290], zusammengefasst in [203]). Dies wirft die Frage auf, welcher Pathomechanismus hinter dem Verlust von Axonen steht. Wie bereits erläutert, gibt es verschiedene Theorien zum Entstehungsmechanismus des axonalen Schadens und der damit verbundenen Axolyse. Es kann entweder direkt das Axon oder erst das Myelin und im Anschluss das Axon geschädigt werden. In jedem Fall kommt es aber zu einer Zerstörung der Myelinscheiden und Axone mit der Freisetzung der jeweiligen Bestandteile, die dann von Makrophagen und Mikroglia ingestiert und neu präsentiert werden (Epitope Spreading). Eine Studie von Siebert und Brück, in der verschiedene Knockout-Mäuse im Hinblick auf axolytische Vorgänge untersucht wurden, zeigte, dass Mäuse denen ICAM-1, ein Adhäsionsmolekül von Makrophagen, sowie Mäuse, denen TNF-α fehlte, signifikant weniger Axolyse aufwiesen als Vergleichstiere vom Wildtyp. Gleichzeitig befand sich auch eine geringere Anzahl an Makrophagen im ZNS [234]. Eine TNF-α-Blockade hatte hier demnach eine positive Wirkung. Diese bestätigte sich bei den Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe nicht. Es konnten keine Unterschiede bezüglich der Axolyse zwischen den einzelnen Versuchsgruppen detektiert werden. Wenn man davon ausgeht, dass Demyelinisierung und axonaler Schaden bzw. der Verlust von Axonen eng zusammen hängen, wäre es unwahrscheinlich, dass eine Inhibition von TNF-α positive Einflüsse auf den einen Vorgang, aber keine oder negative auf den anderen hätte. Zu beachten ist, dass in der Studie von Siebert et al. das periphere Nervensystem untersucht worden ist, wohingegen in der vorliegenden Arbeit das ZNS betrachtet wurde. Vermutlich bestehen Unterschiede zwischen den pathogenen Abläufen im zentralen und peripheren Nervensystem, unter anderem bedingt durch den Schutz der BHS und durch unterschiedliche Typen von Zellen, die anwesend sind. 92 4. Diskussion Fasst man die Ergebnisse bezüglich der histopathologischen Analysen bei einer Blockade von TNF-α im Vergleich zu mit PBS oder Humira® behandelten Kontrollmäusen zusammen, kann man davon ausgehen, dass eine Inhibition von TNF-α mit Enbrel® keinen schützenden Effekt auf das Gewebe ausübt. Weitere Studien wären nötig, um die möglichen positiven Effekte z.B. durch eine selektive TNF-R1-Blockade zu untersuchen. 4.7.6 Auswirkungen Vorgänge der TNF-α-Inhibition auf apoptotische Eine Funktion des TNF-α ist die Auslösung von apoptotischen Vorgängen, vor allem über die Bindung an TNF-R1. Es konnte beobachtet werden, dass TNF-α auch eine Apoptose von Oligodendrozyten auslösen kann und so zu Schädigung des Myelins und im Verlauf der Schädigung der Nervenfasern beiträgt [168+169]. Paintlia et al. führten diesen Mechanismus auf eine Wirkung über TNF-R1 zurück. Diese Schädigung der Oligodendrozyten wird durch IL-17 noch weiter verstärkt [195]. Hövelmeyer et al. beschrieben den durch TNF-α ausgelösten Verlust von Oligodendrozyten als einen der zentralen Vorgänge der EAE, der durch eine TNF-TNF-R1- und eine Fas-Fas-Ligand-Interaktion ausgelöst wird. Fehlte nur eines der beiden, waren lediglich ein verspäteter Krankheitsbeginn und mildere Symptome zu beobachten, entsprechend der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit. Mäuse, bei denen sowohl TNF-R1 als auch Fas ausgeschaltet war, waren jedoch nahezu resistent gegenüber einer EAE, obwohl die Infiltration von Lymphozyten in das ZNS nicht beeinflusst wurde [109]. Dies zeigt, dass der Schaden der Oligodendrozyten, mediiert durch Fas und TNF-R1, wichtig für die klinische Symptomatik der EAE ist. TNF-α ist demnach nicht als einziger Mediator für die Apoptose verantwortlich. Nicht nur bei Oligodendrozyten selbst kann eine Apoptose durch TNF-α ausgelöst werden, sondern ebenso bei neuronalen Vorläuferzellen, die sich z.B. zu Neuronen und Oligodendrozyten weiterentwickeln. In diesem Fall war wiederum TNF-R1 und nicht TNF-R2 beteiligt [233]. 93 4. Diskussion McGuire et al. beschäftigten sich mit der Frage, wie genau die Apoptose der Oligodendrozyten verursacht wird. Sie kreierten genveränderte Mäuse, bei denen bei Oligodendrozyten die Fas-assoziierte Todesdomäne (kurz FADD) ausgeschaltet wurde. FADD wird unter anderem durch TNF-α aktiviert. Die FADD-Knockout-Mäuse waren zwar nicht resistent gegenüber der Auslösung einer EAE, zeigten aber eine deutliche Milderung der Symptomatik. Gleichzeitig wurde eine Reduktion demyelinisierender Vorgänge beobachtet. Diese wurde auf eine Verminderung der Apoptose von Oligodendrozyten, die durch eine Interaktion mit FADD ausgelöst wird, zurückgeführt. Oligodendrozyten erwiesen sich in vitro als resistent gegenüber einem TNF-α-mediierten Zelltod. Ein Einfluss von FADD bzw. seiner Abwesenheit auf die Antwort von T-Zellen während der EAE fand sich jedoch nicht. Trotzdem erwies sich das Fehlen von FADD im Verlauf der Erkrankung als positiv. Bei verminderter Zerstörung der Oligodendrozyten kommt es gleichzeitig zu einer geringeren Freisetzung von Myelinbestandteilen und das Epitope Spreading wird somit eingedämmt [169]. Nimmt man an, dass TNF-α einer der wichtigen Mediatoren bei den Abläufen der Apoptose der Oligodendrozyten ist, würde das bedeuten, dass eine Blockade von TNF-α einen positiven Einfluss auf die Apoptose haben müsste. In einer Studie, in der ein rekombinanter Fc-TNF-R1-Antikörper eingesetzt wurde, konnte diese Wirkung bestätigt werden. Es kam zu einer signifikanten Verminderung der Apoptose der Oligodendrozyten [56]. Diese Ergebnisse zum direkten Einfluss von TNF-α auf die Apoptose von Oligodendrozyten, ließen sich durch unsere Arbeitsgruppe jedoch nicht reproduzieren. Neben der Erkenntnis, dass eine Inhibition von TNF-α keine histoprotektiven Effekte hatte, wurde keine Assoziation von Neurodegeneration und Apoptose beobachtet und somit vermutet, dass TNF-α in dem verwendeten Modell keinen Einfluss auf den Verlust von Axonen durch eine Auslösung von Apoptose hat. Es muss also eher eine direkt toxische Wirkung, die nicht zur Apoptose führt oder eine indirekte Toxizität z.B. über die Aktivierung anderer Zellreihen angenommen werden. Es gibt neben der Signaltransduktion via TNF-α noch andere Signalwege, die zu einer Apoptose von Oligodendrozyten führen können, beispielsweise mittels eines weiteren Mitglieds der TNF-Rezeptor-Familie, dem Neutrotrophinrezeptor 94 4. Diskussion p75, mit welchem neuronale Wachstumsfaktoren interagieren [92]. Dabei muss angemerkt werden, dass diese neueren Ergebnissen zur Folge sowohl proapoptotische als auch antiapoptotische Funktionen, z.B. über NF-κB, zugeschrieben werden (zusammengefasst in [168]). Weitere Möglichkeiten zur Auslösung einer Apoptose, die unabhängig von der TNF-α-getriggerten über Caspasen ist, besteht Glutamat- [223] oder ATP-Rezeptor-vermittelt. Diese verursachen eine Erhöhung der Kalziumpermeabilität über IonenkanalRezeptoren [167].TNF-α kann bewirken, dass Mikroglia Glutamat in das ZNS freisetzen, welches dann in hohen Konzentrationen vorliegt und zu einer Exzitotoxizität an den Neuronen führt (zusammengefasst in [168]). Dieser durch Glutamat verursachte Schaden, bzw. die autokrine Freisetzung von großen Mengen an Glutamat durch Mikroglia, kann durch eine Blockade von TNF-R1 unterdrückt werden [252]. TNF-α kann aber nicht nur Einfluss auf die Apoptose von Oligodendrozyten, sondern auch auf die Apoptose von autoreaktiven Lymphozyten haben. In einer Studie mit an Morbus Crohn erkrankten Patienten, in der Infliximab und Etanercept verglichen wurden, ließ sich eine durch Infliximab ausgelöste Apoptose von autoreaktiven Lymphozyten beobachten. Dies galt hingegen nicht für Etanercept. Demzufolge wären keine Apoptose-fördernden Effekte autoreaktiver Lymphozyten durch eine Blockade von TNF-α mit Enbrel® zu erwarten gewesen. Ein Grund für diesen Unterschied könnten die divergierenden Bindungseigenschaften von Infliximab und Etanercept sein. Während Etanercept lediglich ein einzelnes lösliches TNF-α-Molekül abfangen kann, ist Infliximab in der Lage zwei unterschiedliche TNF-α-Moleküle zu binden, was dann zu Unterschieden in der Signaltransduktion führen könnte [270]. Insgesamt würde eine Blockade von TNF-α eine vermehrte Apoptose von Oligodendrozyten und somit die Schädigung von Nervenfasern einerseits nicht zwangsläufig verhindern, da eine Apoptose über andere Signaltransduktionskaskaden möglich ist. Andererseits könnte eine Blockade der Apoptosestimulation darüber hinaus negative Auswirkungen haben, da so auch in potentiell schädlichen Zellen keine Apoptose mehr ausgelöst werden 95 4. Diskussion würde. Die positiven Einflüsse einer Hemmung von TNF-α auf Apoptose und klinische Symptomatik sind also fraglich. 4.8 Ausblick Die Blockade von TNF-α mit Enbrel® bei mit MOG:35-55 immunisierten C57/BL6-Mäusen hat keinen positiven Einfluss auf die histopathologischen Abläufe bei der EAE. Dies leitet zu der Annahme, dass auch die mangelnde Wirksamkeit einer TNF-α-Blockade beim Menschen durch fehlende Einflüsse auf die Histopathologie bedingt ist. Dabei ist fraglich, ob die Antikörper ihren Wirkort überhaupt erreichen konnten. Gleichzeitig ist unsicher, ob bei der MS beim Menschen die gleichen pathologischen Mechanismen zugrunde liegen wie bei der EAE. Es ist ebenfalls nicht sicher, welche Zellreihen, wie z.B. CD8+-, BZellen oder neuer entdeckte T-Helferzellreihen wie z.B. Th9-Zellen, bei der MS eine Rolle spielen. Die Vorgänge im Immunsystem sind noch so unverstanden, dass sich der Entwicklung effektiver Therapeutika nur Schritt für Schritt genähert werden kann. Bezüglich der Inhibition von TNF-α könnte man versuchen den Signalweg über TNF-R1 gezielt zu Blockieren oder Aktivatoren für TNF-R2 zu entwickeln, allerdings immer mit dem Risiko von unerwünschten Nebeneffekten. Eine unselektive Blockade von TNF-α ist, jedenfalls nach bisherigem Wissensstand und unterstützt durch diese Studie, weder bei MS noch bei seinem Tiermodell EAE wirksam. Selbst die Tatsache, dass sich bei einer prophylaktischen Verabreichung des Medikamentes bei der EAE positive Resultate bezüglich der Inzidenz und des Krankheitsbeginns zeigten, nützt für die Behandlung von MS wenig, da sich eine prophylaktische Gabe eines TNF-α Inhibitors beim Menschen verbietet. 96 5. Zusammenfassung Ziel der Arbeit war es zu untersuchen auf welche Vorgänge im ZNS TNF-α Einfluss nimmt und welche Auswirkungen eine Blockade von TNF-α zum einen auf die T-Helferzellen und zum anderen auf die histopathologischen Abläufe im Rückenmark von mit MOG:35-55 immunisierten Mäusen hat. Es konnte gezeigt werden, dass: i. Th1-Zellen im Krankheitsverlauf nicht mit dem klinischen Score korrelieren. ii. TNF-α von Makrophagen/Mikroglia freigesetzt wird, an den entzündlichen Vorgängen in den Läsionen der EAE beteiligt ist und mit dem klinischen Score korreliert. iii. eine Inhibition von TNF-α die Inzidenz der EAE vermindert und den Krankheitsbeginn verzögert. iv. eine Inhibition von TNF-α die Th1-Antwort in der Peripherie verstärkt (Milz und Blut), die antigenspezifische Antwort im ZNS jedoch nicht beeinflusst wird. v. die Th1-Antwort in der Milz nicht mit dem klinischen Score korreliert, die im ZNS hingegen schon. vi. eine Inhibition von TNF-α keinen positiven Einfluss auf histopathologische Veränderungen wie Demyelinisierung und feine Axonpathologien hat. vii. sich der klinische Score nach dem Absetzen des TNF-α Inhibitors verschlechtert. Die durch diese Beobachtungen gestützte, vermutlich positive Wirkung einer TNF-α-Blockade bestätigte sich also nur zum Teil. Zwar konnte der Krankheitsbeginn verzögert und die Inzidenz vermindert werden, wenn die Krankheit aber erst einmal begonnen hatte, wurde der Verlauf nicht mehr positiv beeinflusst. Auch bezüglich der histopathologischen Abläufe führte die Blockade 97 5. Zusammenfassung zu keiner Besserung. Dies lässt sich auf die duale Rolle, die TNF-α bei entzündlichen Vorgängen einnimmt, zurückführen. Während über TNF-R1 eine vor allem schädigende Wirkung ausgelöst wird, werden über TNF-R2 überwiegend regulatorische und protektive Funktionen moduliert. Eine ungezielte TNF-α-Inhibition führt also zwangsläufig zur Beeinflussung sowohl schützender als auch schädigender Vorgänge. Die Blockade verursachte erhöhte Konzentrationen der Th1-und Th17-Zellen in der Peripherie, welche allerdings keine schädigende Wirkung auf das ZNS ausüben konnten, solange diese in der Milz verblieben. Die Zellzahlen in der Peripherie korrelierten zudem nicht mit dem klinischen Score. Die Hemmung von TNF-α stimulierte also die Expansion der T-Helferzellen, ein vermehrter Übertritt über die BHS wurde hingegen verhindert, da die Zellzahlen im ZNS keine Erhöhung aufwiesen. Dies bestätigte sich insbesondere durch die Beobachtungen nach dem Absetzen des TNF-α-Inhibitors: es kam zu einem Abfall der Zellen in der Milz in Verbindung mit einer Verschlechterung der klinischen Symptomatik, was als indirekter Hinweis für die vermehrte Infiltration von CD4+-Zellen in das ZNS interpretiert werden kann. Bezüglich der Histopathologie zeigten sich keine positiven Effekte einer Blockade von TNF-α. Es war im Gegenteil sogar eine Tendenz zu einer Verschlechterung unter der Behandlung mit Enbrel® bei den Semidünnschnitten zu beobachten. In diesem Fall wurde die Hypothese, dass sich die Blockade von TNF-α positiv auf die Histopathologie auswirkt, also nicht bestätigt. Gleichzeitig ist nicht abschließend klar, inwiefern die fehlenden positiven Effekte der TNF-α-Blockade darauf zurückzuführen sind, dass Enbrel® einerseits wahrscheinlich nicht in der Lage war die BHS zu überwinden und seine Wirkung am Effektororgan, dem ZNS, zu entfalten und andererseits darauf, dass eine unselektive TNF-α-Blockade erfolgte. So wurde sowohl das tendenziell schädliche, lösliche TNF-α als auch das tendenziell protektive, transmembrane TNF-α blockiert. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse die Annahme, dass TNF-α eine duale Rolle in der EAE zukommt und demonstrieren die Auswirkungen seiner Blockade bei den Abläufen bei der mit MOG:35-55 induzierten EAE. Sie tragen 98 5. Zusammenfassung zum Verständnis der Frage bei, warum sich TNF-α-Inhibitoren bei der EAE und ebenso bei der MS als nicht wirksam erwiesen haben, werfen aber gleichzeitig neue Fragen auf: könnte eine gezielte Blockade von TNF-R1 oder des löslichen TNF-α positive Effekte erzielen? Wäre eine systematische Aktivierung von TNFR2 eine mögliche Therapiealternative? Diese Fragestellungen sind immer gepaart mit der Problematik, dass in sehr komplex verbundene Prozesse eingegriffen wird und dies die Gefahr schwerwiegender Nebenwirkungen mit sich bringt. Die Klärung dieser Fragen bleibt weiteren Studien vorbehalten. 99 6. Literaturverzeichnis 1 Aggarwal BB (2003). Signalling pathways of the TNF superfamily: a doubleedged sword. Nat Rev Immunol. 3(9):745-5 2 Agrawal S, Anderson P, Durbeej M, van Rooijen N, Ivars F, Opdenakker G, Sorokin LM (2006).Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med.203(4):1007-19 3 Akassoglou K, Bauer J, Kassiotis G, Pasparakis M, Lassmann H, Kollias G, Probert L (1998). Oligodendrocyte apoptosis and primary demyelination induced by local TNF/p55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: Models for multiple sclerosis with primary oligodendrogliopathy. Am J Pathol. 153(3):801-13 4 Alexopoulou L, Kranidioti K, Xanthoulea S, Denis M, Kotanidou A, Douni E, Blackshear PJ, Kontoyiannis DL, Kollias G (2006). Transmembrane TNF protects mutant mice againstintracellular bacterial infections, chronic inflammation and autoimmunity. Eur J Immunol. 36(10):2768-80 5 Almolda B, González B, Castellano B (2010). Activated microglial cells acquire an immature dendritic cell phenotype and may terminate the immune response in an acute model of EAE. J Neuroimmunol. 223(1-2):39-54 6 Aloisi F, Ria F, Adorini L (2000). Regulation of T-cell responses by CNS antigenpresenting cells: different roles for microglia and astrocytes. Immunol Today. 21(3):141-7 7 Annacker O, Pimenta-Araujo R, Burlen-Defranoux O, Barbosa TC, Cumano A, Bandeira A (2001).CD25+ CD4+ T cells regulate the expansion of peripheral CD4 T cells through the production of IL-10.J Immunol.166(5):3008-18 8 Arnett HA, Mason J, Marino M, Suzuki K, Matsushima GK, Ting JP (2001). TNF alpha promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nat Neurosci. 4(11):1116-22 100 6. Literaturverzeichnis 9 Babbe H, Roers A, Waisman A, Lassmann H, Goebels N, Hohlfeld R, Friese M, Schröder R, Deckert M, Schmidt S, Ravid R, Rajewsky K (2000)Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.J Exp Med. 192(3):393-404 10 Bailey SL, Schreiner B, McMahon EJ, Miller SD (2007). CNS myeloid DCs presenting endogenous myelin peptides ‘preferentially’ polarize CD4+ T(H)-17 cells in relapsing EAE. Nat Immunol. 8(2):172-80 11 Ban L, Zhang J, Wang L, Kuhtreiber W, Burger D, Faustman DL (2008). Selective death of autoreactive T cells in human diabetes by TNF or TNF receptor 2 agonism. Proc Natl Acad Sci USA. 105(36):13644-9 12 Banchereau J, Steinman RM (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392(6673):245-52 13 Bando Y, Nomura T, Bochimoto H., Murakami K, Tanaka T, Watanabe T, Yoshida S (2015). Abnormal morphology of myelin and axon pathology in murine models of multiple sclerosis. Neurochemistry International. 81:16-27 14 Barbano RL, Dal Canto MC (1984).Serum and cells from Theiler's virus-infected mice fail to injure myelinating cultures or to produce in vivo transfer of disease. The pathogenesis of Theiler's virus-induced demyelination appears to differ from that of EAE.J Neurol Sci. 66(2-3):283-93 15 Barten DM, Ruddle NH (1994). Vascular cell adhesion molecule-1 modulation by tumour necrosis factor in experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 51(2):123-33 16 Batoulis H, Recks M (2011) Experimental autoimmune enzephalomyelitisachievements and prospective advances. APMIS 119(12):819-30 17 Batoulis H, Recks MS, Holland FO, Thomalla F, Williams RO, Kuerten S (2014). Blockade of tumour necrosis factor-α in experimental autoimmune encephalomyelitis reveals differential effects on the antigen-specific immune response and central nervous system histopathology.Clin Exp Immunol.175(1):41-8 101 6. Literaturverzeichnis 18 Becher B, Durell BG, Noelle RJ (2002). Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12. J. Clin. Invest. Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12 19 Ben-Nun A, Wekerle H, Cohen IR (1981). The rapid isolation of clonable antigenspecific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 11(3):195-9 20 Bernard CC, Carnegie PR (1975). Experimental autoimmune encephalomyelitis in mice: immunologic response to mouse spinal cord and myelin basic proteins. J Immunol.114(5):1537-40 21 Bernatsky S, Renoux C, Suissa S (2010).Demyelinating events in rheumatoid arthritis after drug exposures.Ann Rheum Dis.69(9):1691-3 22 Bettelli E, Kuchroo VK (2005). IL-12- and IL-23-induced T helper cell subsets: birds of the same feather flock together. J Exp Med. 201(2):169-71 23 Beutler B, Mahoney J, Le Trang N, Pekala P, Cerami A (1985). Purification of cachectin, a lipoprotein lipase-suppressing hormone secreted by endotoxininduced RAW 264.7 cells. J Exp Med. 161(5):984-95 24 Beutler B, van Huffel C (1994). Unravelling function in the TNF ligand and receptor families. Science. 264(5159):667-8 25 Bitsch A, Schuchardt J, Bunkowski S, Kuhlmann T, Brück W (2000). Acute axonal injury in multiple sclerosis. Correlation with demyelination and inflammation. Brain. 123 ( Pt 6):1174-83 26 Bjartmar C, Kidd G, Mork S, Rudick R, Trapp BD (2000). Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced Nacetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients. Ann Neurol. 48(6):893-901 27 Blink SE, Caldis MW, Goings GE, Harp CT, Malissen B, Prinz I, Xu D, Miller SD.(2014).γδ T cell subsets play opposing roles in regulating experimental autoimmune encephalomyelitis.Cell Immunol.290(1):39-51 102 6. Literaturverzeichnis 28 Bohatschek M, Kloss CU, Kalla R, Raivich G (2001). In vitro model of microglial deramification: ramified microglia transform into amoeboid phagocytes following addition of brain cell membranes to microglia-astrocyte cocultures. J Neurosci Res. 64(5):508-22 29 Brambilla R, Ashbaugh JJ, Magliozzi R, Dellarole A, Karmally S, Szymkowski DE, Bethea JR (2011). Inhibition of soluble tumour necrosis factor is therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes axon preservation and remyelination. Brain. 134(Pt 9):2736-54. 30 Brosnan CF, Cannella B, Battistini L, Raine CS (1995). Cytokine localization in multiple sclerosis lesions: correlation with adhesionmole cule expression and reactive nitrogenspecies. Neurology. 45(6 Suppl 6):S16-21 31 Bruck W, Schmied M, Suchanek G, Brück Y, Breitschopf H, Poser S, Piddlesden S, Lassmann H (1994). Oligodendrocytes in the early course of multiple sclerosis. Ann Neurol. 35(1):65-73 32 Brucklacher-Waldert V, Carr EJ, Linterman MA, Veldhoen M.(2014).Cellular Plasticity of CD4+ T Cells in the Intestine.Front Immunol.5:488 33 Brucklacher-Waldert V, Stuerner K, Kolster M, Wolthausen J, Tolosa E (2009). Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis. Brain 132(Pt 12):3329-41 34 Brückener KE, el Bayâ A, Galla HJ, Schmidt MA (2003).Permeabilization in a cerebral endothelial barrier model by pertussis toxin involves the PKC effector pathway and is abolished by elevated levels of cAMP.J Cell Sci.116(Pt 9):1837-46 35 Burns J, Bartholomew B, Lobo S (1999) Isolation of myelin basic protein-specific T cells predominantly from the memory T-cell compartment in multiple sclerosis. Ann Neuro. 45(1):33-9 36 Cannella B, Raine CS, (1995). The adhesion molecule and cytokine profile of multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 37(4):424-35 103 6. Literaturverzeichnis 37 Carswell EA, OLD LJ, Kassel RL, Green S, Fiore N, Williamson B (1975). An endotoxin-induces serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 72(9):3666-70 38 Cazzato G1, Mesiano T, Antonello R, Monti F, Carraro N, Torre P, Bosco A, Cargnelutti D (1995).Double-blind, placebo-controlled, randomized, crossover trial of high-dose methylprednisolone in patients with chronic progressive form of multiple sclerosis.Eur Neurol.35(4):193-8 39 Chao CC, Hu S, Ehrlich L, Peterson PK (1995).Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.Brain Behav Immun.9(4):355-65 40 Charcot J (1868). Histologie de la sclerose en plaque. Gaz. Hopitaux 41:554-66 41 Chen X, Baumel M, Mannel DN, Howard OM, Oppenheim JJ (2007). Interaction of TNF with TNF receptor type 2 promotes expansion and function of mouse CD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol. 179(1):154-61 42 Chen X, Oppenheim JJ (2011). Contrasting effects of TNF and anti-TNF on the activation of effector T cells and regulatory T cells in autoimmunity. FEBS Letters. 585(23):3611-8 43 Chen X, Oppenheim JJ (2011). The phenotypic and functional consequences of + + tumour necrosis factor receptor type 2 expression on CD4 FoxP3 regulatory T cells. Immunology. 133(4):426-33 44 Chu CQ, Wittmer S, Dalton DK (2000). Failure to suppress the expansion of the activated CD4 T cell population in interferon gamma-deficient mice leads to exacerbation of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med. 192(1):123-8 45 Coleman MP, Perry VH (2002). Axon pathology in neurological disease: a neglected therapeutic target. Trends Neurosci. 25(10):532-7 46 Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P (2000). Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N Engl J Med. 343(20):1430-8 104 6. Literaturverzeichnis 47 Constantinescu CS, Wysocka M, Hilliard B Ventura ES, Lavi E, Trinchieri G, Rostami A (1998) Antibodies against IL-12 prevent superantigen-induced and spontaneous relapses of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 161(9):5097-104 48 Crawford MP, Yan SX, Ortega SB, Mehta RS, Hewitt RE, Price DA, Stastny P, Douek DC, Koup RA, Racke MK, Karandikar NJ (2004). High prevalence of autoreactive, neuroantigen-specific CD8+ T cells in multiple sclerosis revealed by novel flow cytometric assay. Blood 103(11):4222-31 49 Cua DJ, Sherlock J, Chen Y Murphy CA, Joyce B, Seymour B, Lucian L, To W, Kwan S, Churakova T, Zurawski S, Wiekowski M, Lira SA, Gorman D, Kastelein RA, Sedgwick JD (2003) Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature 421(6924):744-8 50 Dal Canto MC, Lipton HL (1975). Primary demyelination in Theiler’s virus infection. An ultrastructural study. Lab Invest.33:626–637 51 Daniel J. Cua, Jonathan Sherlock, Yi Chen, Craig A. Murphy,Barbara Joyce, Brian Seymour, Linda Lucian*, Wayne To,Sylvia Kwan, Tatyana Churakova, Sandra Zurawsk,Maria Wiekowsk, Sergio A. Lira, Daniel Gormank, Robert A. Kasteleink, Jonathon D. Sedgwick (2003). Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain, Nature 421(6924):744-8 52 Daten von Multiple Sclerosis International Federation. http://www.msif.org/research/epidemiology-of-ms/ (Zuletzt abgerufen 26.02.2015) 53 Dayer JM, Beutler B, Cerami A (1985). Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells and dermal fibroblasts. J Exp Med. 162(6):2163-8 54 De Stefano N, Matthews PM, Filippi M, Agosta F, De Luca M, Bartolozzi ML, Guidi L, Ghezzi A, Montanari E, Cifelli A, Federico A, Smith SM (2003). Evidence of early cortical atrophy in MS: relevance to white matter changes and disability. Neurology. 60(7):1157-62 55 De Stefano N, Matthews PM, Fu L Narayanan S, Stanley J, Francis GS, Antel JP, Arnold DL (1998). Axonal damage correlates with disability in patients with 105 6. Literaturverzeichnis relapsing-remitting multiple sclerosis. Results of a longitudinal magnetic resonance spectroscopy study. Brain. 121 ( Pt 8):1469-77 56 di Penta A, Moreno B, Reix S, Fernandez-Diez B, Villanueva M, Errea O, Escala N, Vandenbroeck K, Comella JX, Villoslada P (2013). oxidative stress and proinflammatory cytokines contribute to demyelination and axonal damage in a cerebellar culture model of neuroinflammation. PLoS One. 8(2) 57 Domingues HS, Mues M, Lassmann H, Wekerle H, Krishnamoorthy G (2010). Functional and pathogenic differences of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. PLoS ONE 5(11):e15531 58 Drulovic J, Savic E, Pekmezovic T, Mesaros S, Stojsavljevic N, DujmovicBasuroski I, Kostic, Vasic JV, Mostarica Stojkovic M, Popadic D (2009) Expression of Th1 and Th17 cytokines and transcription factors in multiple sclerosis patients: does baseline T-bet mRNA predict the response to interferonbeta treatment? J Neuroimmunol. 215(1-2):90-5 59 Duffy SS, Lees JG, Moalem-Taylor G (2014). The contribution of immune and glial cell types in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Mult Scler Int. 2014:285245 60 Dungan LS, McGuinness NC, Boon L, Lynch MA, Mills KHG (2014). Innate IFNpromotes development ofexperimental autoimmune encephalomyelitis: a role for NKcells and M1 macrophages. European Journal of Immunology. 44(10):2903-17 61 Dymet DA, Ebers GC, Sadonovic AD (2004). Genetics of Multiple Sclerosis. Lancet Neurol. 3(2):104-10 62 El-behi M, Rostami A, Ciric B (2010). Current Views on the Roles of Th1 and Th17 Cells in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5(2):189-97 63 Eliçabe RJ, Cargnelutti E, Serer MI, Stege PW, Valdez SR, Toscano MA, Rabinovich GA, Di Genaro MS (2010). Lack of TNFR p55 results in heightened expression of IFN-γ and IL-17 during the development of reactive arthritis. J Immunol. 185(7):4485-95 106 6. Literaturverzeichnis 64 Elliott EA, McFarland HI, Nye SH, Cofiell R, Wilson TM, Wilkins JA, Squinto SP, Matis LA, Mueller JP (1996).Treatment of experimental encephalomyelitis with a novel chimeric fusion protein of myelin basic protein and proteolipid protein.J Clin Invest.98(7):1602-12 65 Elliott MJ, Maini RN, Feldmann M, Kalden JR, Antoni C, Smollen JS, Leeb B , Breedfeld FC, Macfarlane JD, Bijl H, Woody JN (1994). Repeated therapy with monoclonal antibody to tumour necrosis factor alpha (cA2) in patients with rheumatoid arthritis.. Lancet. 344(8930):1125-7 66 Espejo C, Penkowa M, Demestre M, Montalban X, Martínez-Cáceres EM (2005). Time-course expression of CNS inflammatory, neurodegenerative tissue repair markers and metallothioneins during experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 132(4):1135-49 67 Fabis MJ, Scott GS, Kean RB, Koprowski H, Hooper DC (2007). Loss of bloodbrain barrier integrity in the spinal cord is common to experimental allergic encephalomyelitis in knockout mouse models. Proc Natl Acad Sci USA. 104(13):5656-61 68 Fabriek BO, Van Haastert ES, Galea I, Polfliet MM, Dopp ED, Van Den Heuvel MM, Van Den Berg TK, De Groot CJ, Van Der Valk P, Dijkstra CD (2005). CD163positive perivascular macrophages in the human CNS express molecules for antigen recognition and presentation. Glia 51(4):297-305 69 Faustman D, Davis M (2010). TNF receptor 2 pathway: drug target for autoimmune diseases. Nat Rev Drug Discov. 9(6):482-93 70 Ferguson B, Matyszak MK, Esiri MM Perry VH (1997). Axonal damage in acute multiple sclerosis lesions. Brain. 120 ( Pt 3):393-9 71 Fernández-Espartero MC, Pérez-Zafrilla B, Naranjo A, Esteban C, Ortiz AM, Gómez-Reino JJ, Carmona L; BIOBADASER Study Group (2011).Demyelinating disease in patients treated with TNF antagonists in rheumatology: data from BIOBADASER, a pharmacovigilance database, and a systematic review.Semin Arthritis Rheum. 40(4):330-7 107 6. Literaturverzeichnis 72 Fillmore PD1, Brace M, Troutman SA, Blankenhorn EP, Diehl S, Rincon M, Teuscher C (2003). Genetic analysis of the influence of neuroantigen-complete Freund's adjuvant emulsion structures on the sexual dimorphism and susceptibility to experimental allergic encephalomyelitis.Am J Pathol.163(4):1623-32 73 Fine SM, Angel RA, Perry SW, Epstein LG, Rothstein JD, Dewhurst S, Gelbard HA (1996).Tumor necrosis factor alpha inhibits glutamate uptake by primary human astrocytes. Implications for pathogenesis of HIV-1 dementia.J Biol Chem. 271(26):15303-6 74 Flugel A, Bradl M, Kreutzberg GW, Graeber MB (2001). Transformation of donorderived bone marrow precursors into host microglia during autoimmune CNS inflammation and during the retrograde response to axotomy. J Neurosci Res. 66(1):74-82 75 Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R, Mak TW, Bloom BR (1995).Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity. 2(6):561-72 76 Fogdell-Hahn A1, Ligers A, Grønning M, Hillert J, Olerup O (2000). Multiple sclerosis: a modifying influence of HLA class I genes in an HLA class II associated autoimmune disease.Tissue Antigens 55(2):140-8 77 Ford ML, Evavold BD (2005). Specificity, magnitude and kinetics of MOG-specific CD8+ T cell response during experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 35(1):76-85 78 Fotin-Mleczek M1, Henkler F, Samel D, Reichwein M, Hausser A, Parmryd I, Scheurich P, Schmid JA, Wajant H (2002).Apoptotic crosstalk of TNF receptors: TNF-R2-induces depletion of TRAF2 and IAP proteins and accelerates TNF-R1dependent activation of caspase-8. J Cell Sci.115(Pt 13):2757-70 79 Freund J, Stern E, Pisami T (1947). Isoallergic encephalomyelitis and radiculitis in guinea pigs after one injection of brain and mycobacteria in water-in-oil emulsion. J Immunol.57(2):179-94 80 Frisullo G, Nociti V, Iorio R Patanella AK, Marti A, Caggiula M, Mirabella M, Tonali PA, Batocchi AP (2008). IL17 and IFN 108 production by peripheral blood 6. Literaturverzeichnis mononuclear cells from clinically isolated syndrome to secondary progressive multiple sclerosis. Cytokine. 44(1):22-5 81 Gately MK, Renzetti LM, Magram J Stern AS, Adorini L, Gubler U, Presky DH (1998) The interleukin-12/interleukin-12-receptor system: role in normal and pathologic immune responses. Annu. Rev. Immunol. 16:495-521 82 Gay FW, Drye TJ, Dick GW, Esiri MM (1997). The application of multifactorial cluster analysis in the staging of plaques in early multiple sclerosis. Identification and characterization of the primary demyelinating lesion. Brain. 120 ( Pt 8):1461-83 83 George Kassiotis, Manolis Pasparakis, George Kollias and Lesley Probert (1999). TNF accelerates the onset but does not alter the incidence and severity of myelin basic protein induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur. J Immunol. 29(3):774-80 84 Ghoreschi, K., Laurence A, Yang XP, Tato CM, McGeachy MJ, Konkel JE, Ramos HL, Wei L, Davidson TS, Bouladoux N, Grainger JR, Chen Q, Kanno Y, Watford WT, Sun HW, Eberl G, Shevach EM, Belkaid Y, Cua DJ, Chen W, O'Shea JJ (2010). Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467(7318):967-71 85 Gimenez MA, Sim JE, Russell JH (2004). TNFR1-dependent VCAM-1 expression by astrocytes exposes the CNS to destructive inflammation. J Neuroimmunol. 151(1-2):116-25 86 Gold R, Linington C, Lassmann H (2006).Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.Brain. 129(Pt 8):1953-71 87 Goverman J, Brabb T (1996). Rodent models of Experimental allergic encephalomyelitis applied to the study of multiple sclerosis. Lab Anim Sci. 46 (5):482-92 88 Goverman, J (1999).Tolerance and autoimmunity in TCR transgenic mice specific for myelin basic protein. Immunol Rev.169:147-59. 109 6. Literaturverzeichnis 89 Gran B, Chu N, Zhang GX, Yu S, Li Y, Chen XH, Kamoun M, Rostami A (2004) Early administration of IL-12 suppresses EAE through induction of interferongamma. J Neuroimmunol. 156(1-2):123-31 90 Grinberg-Bleyer Y, Saadoun D, Baeyens A (2010).Pathogenic T cells have a paradoxical protective effect in murine autoimmune diabetes by boosting Tregs. J Clin Invest 120(12):4558-68 91 Grytten Torkildsen N1, Lie SA, Aarseth JH, Nyland H, Myhr KM (2008). Survival and cause of death in multiple sclerosis: results from a 50-year follow-up in Western Norway. Mult Scler. 14(9):1191-8 92 Gu C, Casaccia-Bonnefil P, Srinivasan A, Chao MV (1999). Oligodendrocyte apoptosis mediated by caspase activation. J Neurosci. 19(8):3043-9 93 Gunnlaugsdottir B, Skaftadottir I, Ludviksson BR (2008). Naïve human T-cells become non-responsive towards anti-TNFalpha (infliximab) treatment in vitro if costimulated through CD28. Scand J Immunol. 68(6):624-34 94 Hamilton JA, Anderson GP, (2004) GM-CSF biology. Growth Factors 22(4):225-31 95 Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, Turner H, Murphy TL, Murphy KM, Weaver CT (2005). Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6(11):1123-32 96 Haugen M, Frederiksen JL, Degn M (2014).B cell follicle-like structures in multiple sclerosis-with focus on the role of B cell activating factor.J Neuroimmunol. 273(12):1-7 97 Hauser SL, Bhan AK, Gilles F, Kemp M, Kerr C, Weiner HL (1986). Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19(6):578-87 98 Hehlgans T, Männel D (2002). The TNF-TNF Receptor System. Biol Chem. 383(10):1581-5 110 6. Literaturverzeichnis 99 Hehlgans T, Pfeffer K (2005) The intriguing biology of the tumour necrosis factor/ tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology 115(1):1-20 100 Hendriks JJ, Teunissen CE, de Vries HE, Dijkstra CD (2005). Macrophages and neurodegeneration Brain Research Reviews. 48(2):185-95 101 Heppner F, Greter M, Marino D, Falsig J, Raivich G, Hövelmeyer N, Waisman A, Rülicke T, Prinz M, Priller J, Becher B, Aguzzi A (2005). Experimental autoimmune encephalomyelitis repressed by microglial paralysis. Nature Medicine. 11(2):146-52 102 Hickey WF, Kimura H (1988). Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239(4837):290-2 103 Hillert J, Olerup O (1993). HLA and MS. Neurology 43(11):2426-7 104 Hirota K, Duarte JH, Veldhoen M, Hornsby E, Li Y, Cua DJ, Ahlfors H, Wilhelm C, Tolaini M, Menzel U, Garefalaki A, Potocnik AJ, Stockinger B (2011). Fate mapping of IL-17-producing T cells in inflmmatory responses. Nature Immunology. 12(3):255-63 105 Hobom M, Stroch MK, Weissert R, Maier K, Radhakrishnan A, Kramer B, Bähr M, Diem R (2004). Mechanisms and time course of neuronal degeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Pathol. 14(2):148-57 106 Hofman FM, Hinton DR, Johnson K, Merrill JE (1989). Tumour necrosis factor identified in multiple sclerosis brain. J Exp Med. 170(2):607-12 107 Hofstetter H, Gold R, Hartung HP (2009). Th17 cells in MS and experimental autoimmune encephalomyelitis. Int MS J. 16(1):12-8 108 Housley WJ, Adams CO, Nichols FC Puddington L, Lingenheld EG, Zhu L, Rajan TV, Clark RB (2011) Natural but not inducible regulatory T cells require TNF-alpha signaling for in vivo function. J Immunol. 186(12):6779-87 109 Hövelmeyer N, Hao Z, Kranidioti K, Kassiotis G, Buch T, Frommer F, von Hoch L, Kramer D, Minichiello L, Kollias G, Lassmann H, Waisman A (2005). Apoptosis of 111 6. Literaturverzeichnis oligodendrocytes via Fas and TNF-R1 is a key event in the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 175(9):5875-84 110 Howell OW, Reeves CA, Nicholas R, Carassiti D, Radotra B, Gentleman SM, Serafini B, Aloisi F, Roncaroli F, Magliozzi R, Reynolds R (2001).Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis.Brain. 134(Pt 9):2755-71 111 https://www.ucytech.com (zuletzt abgerufen 02.04.2015) 112 Huang YM, Xiao BG, Ozenci V, Kouwenhoven M, Teleshova N, Fredrikson S, Link H (1999). Multiple sclerosis is associated with high levels of circulating dendritic cells secreting pro-inflammatory cytokines. J Neuroimmunol. 99(1):82-90 113 Hurwitz AA, Lyman WD, Guida MP, Calderon TM, Berman JW (1992). Tumor necrosis factor alpha induces adhesion molecule expression on human fetal astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 176(6):1631-6 114 Iwakura Y, Nakae S, Saijo S, Ishigame H (2008). The roles of IL-17A in inflammatory immune responses and host defense against pathogens. Immunol Rev. 226:57-79 115 Iwamoto S, Iwai S, Tsujiyama K, Kurahashi C, Takeshita K, Naoe M, Masunaga A, Ogawa Y, Oguchi K, Miyazaki A (2007). TNF-α drives human CD14+ monocytes to differentiate into CD70+ Dcs evoking Th1/Th17 response. J Immunol. 179(3):144957 116 Jadidi-Niaragh F, Mirshafiey A (2011).Th17 Cell, the New Player of Neuroinflammatory Process in Multiple Sclerosis. Scandinavian Journal of Immunology. 74(1):1-13 117 Jäger A, Dardalhon V, Sobel RA, Bettelli E, Kuchroo VK (2009) Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol. 183(11):7169-77 118 Jiang Z, Jiang JX, Zhang GX (2014). Macrophages: A double-edged sword in experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunol Lett.160(1):17-22 112 6. Literaturverzeichnis 119 Kaltsonoudis E, Voulgari PV, Konitsiotis S, Drosos AA (2014). Demyelination and other neurological adverse events after anti-TNF therapy.Autoimmun Rev.13(1):548 120 Kamm CP1, Uitdehaag BM, Polman CH (2014). Multiple sclerosis: current knowledge and future outlook.Eur Neurol. 72(3-4):132-41 121 Kanakasabai S, Chearwae W, Walline CC, Iams W, Adams SM, Bright JJ (2010). Peroxisome proliferator-activated receptor agonists inhibit T helper type 1 (Th) and Th7 responses in experimental allergic encephalomyelitis. Immunology. 130(4):572-88 122 Kassiotis G, Kollias G (2001). Uncoupling the Proinflammatory from the immuosuppressive Properties of tumor necrosis factor (TNF) at the p55 TNF receptor level: implications for pathogenesis and therapy of autoimmun demyelination. J Exp Med. 193(4):427-3 123 Kaye JF, Kerlero de Rosbo N, Mendel I, Flechter S, Hoffman M, Yust I, Ben-Nun A (2000).The central nervous system-specific myelin oligodendrocytic basic protein (MOBP) is encephalitogenic and a potential target antigen in multiple sclerosis (MS).J Neuroimmunol.102(2):189-98 124 Kebir H, Ifergan I, Alvarez JI, Bernard M, Poirier J, Arbour N, Duquette P, Prat A (2009). Preferential recruitment of interferon-gamma-expressing TH17 cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66(3):390-402 125 Kida S, Steart PV, Zhang ET, Weller RO (1993). Perivascular cells act as scavengers in the cerebral perivascular spaces and remain distinct from pericytes, microglia and macrophages. Acta Neuropathol(Berl) 85(6):646-52 126 Kim EY, Priatel JJ, Teh SJ, Teh HS (2006). TNF receptor type 2 (p75) functions as a costimulator for antigen-driven T cell responses in vivo. J Immunol. 176(2):102635 127 Kim S, Moon C., Wie MB, Kim H., Tanuma N, Matsumoto Y, Shin T (2000). Enhanced expression of constitutive and inducible forms of nitric oxide synthase in autoimmune encephalomyelitis. J Vet Sci. 1(1):11-7 113 6. Literaturverzeichnis 128 Kleijwegt FS, Laban S, Duinkerken G, Joosten AM, Zaldumbide A, Nikolic T, Roep BO (2010).Critical role for TNF in the induction of human antigen-specific regulatory T cells by tolerogenic dendritic cells.Immunol.185(3):1412-8 129 Konno H, Yamamoto T, Iwasaki Y, Saitoh T, Suzuki H, Terunuma H (1989). Ia expressing microglial cells in experimental allergic encephalomyelitis in rats. Acta Neuropathol. 77(5):472-9 130 Kotter MR, Li WW, Zhao C, Franklin RJ (2006). Myelin impairs CNS remyelination by inhibiting oligodendrocyte precursor cell differentiation. J Neurosci. 26(1):328-32 131 Krakowski M, Owens T (1996). Interferon-gamma confers resistance to experimental allergic encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 26(7):1641-6 132 Kroenke M, Carlson J, Andjelkovic V, Segal BM (2011). IL-12- and IL-23modulated T cells induce distinct types of EAE based on histology, CNS chemokine profile, and response to cytokine inhibition. J Exp Med 205(7):1535-41 133 Kruglov A, Kuchmiy A, Grivennikov SI, Tumanov AV, Kuprash DV, Nedospasov SA (2008). Phyiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: Mouse models. Cytokine and Growth Factor Reviews. 19(3-4):231-44 134 Kruglov AA, Lampropoulou V, Fillatreau S, Nedospasov SA (2011). Pathogenic and protective functions of TNF in neuroinflammation are defined by its expression in T lymphocytes and myeloid cells. J Immunol. 187(11):5660-70 135 Kuerten S, Javeri S, Tary-Lehmann M, Lehmann PV, Angelov DN (2008). Fundamental differences in the dynamics of CNS lesion development and composition in MP4- and MOG peptide 35–55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Immunol. 129(2):256-67 136 Kuerten S, Lichtenegger FS, Faas S, Angelov DN, Tary-Lehmann M, Lehmann PV (2006). MBP-PLP fusion protein-induced Neuroimmunology 177(1-2):99-111 114 EAE in C57BL/6 mice, J 6. Literaturverzeichnis 137 Kuerten S, Nowacki TM, Kleen TO, Asaad RJ, Lehmann PV, Tary-Lehmann M (2008). Dissociated production of perforin, granzyme B, and IFN-gamma by HIVspecific CD8(+) cells in HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses. 24(1):62-71 138 Kuerten S, Rottlaender A, Rodi M, Velasco VB Jr, Schroeter M, Kaiser C, Addicks K, Tary-Lehmann M, Lehmann PV (2010). The clinical course of EAE is reflected by the dynamics of the neuroantigen-specific T cell compartment in the blood. Clin Immunol.137(3):422-32 139 Kurtzke JF (1983). Epidemiology of multiple sclerosis. Multiple Sclerosis, pp. 49–95 140 Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, Mattson J, Basham B, Sedgwick JD, McClanahan T, Kastelein RA, Cua DJ (2005). IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201(2):233-40 141 Lassman H (1983). Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: its value as an experimental model for multiple sclerosis. J Neurol. 229(4):207-20 142 Lee YK, Turner H, Maynard CL, Oliver JR, Chen D, Elson CO, Weaver CT (2009). Late developmental plasticity in the T helper 17 lineage. Immunity 30(1):92-107 143 Legler DF, Micheau O, Doucey MA, Tschopp J, Bron C (2003). Recruitment of TNF receptor 1 to lipid rafts is essential for TNFalpha-mediated NF-kappaB activation. Immunity. 18(5):655-64 144 Lehmann PV, Forsthuber T, Miller A, Sercarz EE (1992).Spreading of T-cell autoimmunity to cryptic determinants of an autoantigen.Nature.358(6382):155-7 145 Lemke G (1988). Unwrapping the genes of myelin.Neuron.1(7):535-43 146 Lenardo MJ (1991).Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis.Nature 353(6347):858-61 147 Lexberg MH, Taubner A, Förster A, Albrecht I, Richter A, Kamradt T, Radbruch A, Chang HD (2008). Th memory for interleukin-17 expression is stable in vivo. Eur. J. Immunol. 38(10):2654-64 115 6. Literaturverzeichnis 148 Link H, Sun JB, Wang Z, Xu Z, Löve A, Fredrikson S, Olsson T (1992) Virusreactive and autoreactive T cells are accumulated in cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 38(1-2):63-73 149 Linnington C, Webb M, Woodhams PL (1984). A novel myelin-associated glycoprotein defined by a mouse monoclonal antibody.J Neuroimmunol.6(6):387-96 150 Litzenburger T, Fassler R, Bauer J, Lassmann H, Linington C, Wekerle H, Iglesias A, (1998). B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188(1):169-80 151 Liu HP, Cao AT, Feng T, Li Q, Zhang W, Yao S, Dann SM, Elson CO, Cong Y (2015). TGF-β converts Th1 cells into Th17 cells through stimulation of Runx1 expression. Eur J Immunol. 10.1002 152 Lovett-Racke AE, Rocchini AE, Choy J, Northrop SC, Hussain RZ, Ratts RB, Sikder D, Racke MK (2004) Silencing T-bet defines critical role in the differentiation of autoreactive T lymphocytes, Immunity 21(5):719-31 153 Lovett-Racke AE, Trotter JL, Lauber J, Perrin PJ, June CH, Racke MK (1998). Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated costimulation in multiple sclerosis patients. A marker of activated/memory T cells. J Clin Invest. 101(4):725-30 154 Lublin FD, Knobler RL, Kalman B, Goldhaber M, Marini J, Perrault M, D'Imperio C, Joseph J, Alkan SS, Korngold R. (1993). Monoclonal anti-gamma interferon antibodies enhance experimental allergic encephalomyelitis. Autoimmunity. 16(4):267-74 155 Luchinetti C, Bruck W, Parisi J, Scheithauer B, Rodriguez M, Lassmann H (2000). Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol. 47(6):707-17 156 Lunn MP, Crawford TO, Hughes RA, Griffin JW, Sheikh KA (2002). Anti-myelinassociated glycoprotein antibodies alter neurofilament spacing. Brain. 125(Pt 4):904-11 157 Lyons JA, Ramsbottom MJ, Cross AH (2002). Critical role of antigen-specific antibody in EAE induced by recombinant MOG. Eur J Immunol. 32(7):1905-13 116 6. Literaturverzeichnis 158 Maggi L, Cimaz R, Capone M, Santarlasci V, Querci V, Simonini G, Nencini F, Liotta F, Romagnani S, Maggi E, Annunziato F, Cosmi L (2014). Etanercept Inhibits the Tumor Necrosis Factor –Driven Shift of Th17 Lymphocytes Toward a Nonclassic Th1 Phenot ype in Juvenile Idiopathic Arthritis. Arthritis Rheumatol. 66(5):1372-7 159 Magliozzi R, Howell O, Vora A, Serafini B, Nicholas R, Puopolo M, Reynolds R, Aloisi F (2007).Meningeal B-cell follicles in secondary progressive multiple sclerosis associate with early onset of disease and severe cortical pathology.Brain.130(Pt 4):1089-104 160 Magliozzi R, Howell OW, Reeves C, Roncaroli F, Nicholas R, Serafini B, Aloisi F, Reynolds R (2010).A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis.Ann Neurol.68(4):477-93 161 Mao P, Reddy PH (2010). Is multiple sclerosis a mitochondrial disease? Biochim Biophys Acta. 1802(1):66-79 162 Martenson RE, Deibler GE, Kies MW (1969) Microheterogeneity of guinea pig myelin basic protein.J Biol Chem. 244(16):4261-7 163 Matsumoto M, Fu YX, Molina H, Chaplin DD (1997). Lymphotoxinalpha- deficient and TNF receptor-I-deficient mice define developmental and functional characteristics of germinal centers. Immunol Rev. 156:137-44 164 Matsushima, GK, Morell P (2001). The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11(1):107-16 165 Matsushita T, Yanaba K, Bouaziz JD, Fujimoto M, Tedder TF (2008). Regulatory B cells inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression. J Clin Invest. 118(10):3420-30 166 Matusevicius D, Kivisakk P, He B, Kostulas N, Ozenci V, Fredrikson S, Link H (1999) Interleukin-17 mRNA expression in blood and CSF mononuclear cells is augmented in multiple sclerosis. Mult Scler. 5(2):101-4 117 6. Literaturverzeichnis 167 Matute C, Torre I, Pérez-Cerdá F, Pérez-Samartín A, Alberdi E, Etxebarria E, Arranz AM, Ravid R, Rodríguez-Antigüedad A, Sánchez-Gómez M, Domercq M (2007). P2X7 receptor blockade prevents ATP excitotoxicity in oligodendrocytes and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 27(35):9525-33 168 Mc Guire C, Beyaert R, van Loo G (2011). Death receptor signalling in central nervous system inflammation and demyelination. Trends Neurosci. 34(12):619-28 169 Mc Guire C, Volckaert T, Wolke U, Sze M, de Rycke R, Waisman A, Prinz M, Beyaert R, Pasparakis M, van Loo G (2010). Oligodendrocyte-specific FADD deletion protects mice from autoimmune-mediated demyelination. J Immunol. 185(12):7646-53 170 McCoy MK, Tansey MG (2008). TNF signaling inhibition in the CNS: implications for normal brain function and neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 5:45 171 McGeachy MJ, Bak-Jensen KS, Chen Y, Tato CM, Blumenschein W, McClanahan T, Cua (2007). DJ TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated pathology. Nat Immunol. ;8(12):1390-7 172 McGeachy, M., Chen Y, Tato CM, Laurence A, Joyce-Shaikh B, Blumenschein WM, McClanahan TK, O’Shea JJ, Cua DJ (2009). The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo. Nat. Immunol. 10(3):314-24 173 McRae BL, Vanderlugt CL, Dal Canto MC, Miller SD (1995). Functional evidence for epitope spreading in the relapsing pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med.182(1):75-8 174 Medana I, Martinic MA, Wekerle H, Neumann H (2001). Transection of major histocompatibility complex class I-induced neurites by cytotoxic T lymphocytes. Am J Pathol. 159(3):809-15 175 Mendel I, Kerlero de Rosbo N, Ben-Nun A (1995). A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical 118 chronic experimental autoimmune 6. Literaturverzeichnis encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.Eur J Immunol.1951-9 176 Mikita J, Dubourdieu-Cassagno N, Deloire MS, Vekris A, Biran M, Raffard G, Brochet B, Canron MH, Franconi JM, Boiziau C, Petry KG (2011).Altered M1/M2 activation patterns of monocytes in severe relapsing experimental rat model of multiple sclerosis. Amelioration of clinical status by M2 activated monocyte administration.Mult Scler.17(1):2-15 177 Miller SD (1995). Pathogenesis of Theiler’s murine encephalomyelitis virus-induced demyelinating disease – a model of multiple sclerosis. ACLAD Newslett.16:4–6 178 Miyara M, Sakaguchi S (2007).Natural regulatory T cells: mechanisms of suppression.Trends Mol Med.13(3):108-16 179 Mohan N, Edwards ET, Cupps TR, Oliverio PJ, Sandberg G, Crayton H, Richert JR, Siegel JN (2001). Demyelination occurring during anti-tumor necrosis factor alpha therapy for inflammatory arthritides. Arthritis Rheum. 44(12):2862-9 180 Nagar M, Jacob-Hirsch J, Vernitsky H, Berkun Y, Ben-Horin S, Amariglio N, Bank I, Kloog Y, Rechavi G, Goldstein I (2010). TNF activates a NF-kappa B-regulated cellular program in human CD45RA−regulatory T cells that modulates their suppressive function. J Immunol 184(7):3570-81 181 Nave KA, Milner RJ (1989). Proteolipid proteins: structure and genetic expression in normal and myelin-deficient mutant mice.bCrit Rev Neurobiol.5(1):65-91 182 Neumann H, Medana IM, Bauer J, Lassmann H (2002). Cytotoxic T lymphocytes in autoimmune and degenerative CNS diseases. Trends Neurosci. 25(6):313-9 183 Neumann H, Schmidt H, Cavalié A, Jenne D, Wekerle H (1997). Major histocompatibility complex (MHC) class I gene expression in single neurons of the central nervous system: differential regulation by interferon (IFN)-gamma and tumor necrosis factor (TNF)-alpha. J Exp Med. 185(2):305-16 184 Noguera-Pons R, Borrás-Blasco J, Romero-Crespo I, Antón-Torres R, NavarroRuiz A, González-Ferrandez JA (2005). Optic neuritis with concurrent etanarcept and isoniazid therapy. The Annals of Pharmacotherapy. 39(12):2131-5 119 6. Literaturverzeichnis 185 Notley CA, Inglis JJ, Alzabin S, McCann FE, McNamee KE, Williams RO (2008). Blockade of tumor necrosis factor in collageninduced arthritis reveals a novel immunoregulatory pathway for Th1 and Th17 cells. J Exp Med. 205(11):2491-7 186 O’Connor RA, Prendergast CT, Sabatos CA, Lau CW, Leech MD, Wraith DC, Anderton SM (2008). Cutting edge: Th1 cells facilitate the entry of Th17 cells to the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 181(6):3750-4 187 O’Connor RA, Prendergast CT, Sabatos CA, Lau CW, Leech MD, Wraith DC, Anderton SM (2008). Cutting edge: Th1 cells facilitate the entry of Th17 cells to the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 181(6):3750-4 188 O’Connor W Jr, Kamanaka M,Booth CJ, Town T, Nakae S, Iwakura Y, Kolls JK, Flavell RA (2009). A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10(6):603-9 189 Oleszak EL, Zaczynska E, Bhattacharjee M, Butunoi C, Legido A, Katsetos CD (1998). Inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine are found in monocytes/macrophages and/or astrocytes in acute, but not in chronic, multiple sclerosis. Clin Diagn Lab Immunol. 5(4):438-45 190 Olitsky PK, Tal C (1952) Acute disseminated encephalomyelitis produced in mice by brain proteolipide (Folch-Lees).Proc Soc Exp Biol Med.79(1):50-3 191 Oliver AR, Lyon GM, Ruddle NH (2003).Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.J Immunol.171(1):462-8 192 Olsson T, Zhi WW, Höjeberg B, Kostulas V, Jiang YP, Anderson G, Ekre HP, Link H (1990). Autoreactive T lymphocytes in multiple sclerosis determined by antigeninduced secretion of interferon-gamma. J Clin Invest. 86(3):981-5 193 Owens T (2003). The enigma of multiple sclerosis: inflammation and neurodegeneration cause heterogeneous dysfunction and damage. Curr Opin Neurol. 16(3):259-65 120 6. Literaturverzeichnis 194 Owens T, Wekerle H, Antel J (2001).Genetic models for CNS inflammation.Nat Med.7(2):161-6 195 Paintlia MK, Paintlia AS, Singh AK, Singh I (2011). Synergistic activity of interleukin-17 and tumor necrosis factor-alpha enhances oxidativestress-mediated oligodendrocyte apoptosis. J Neurochem. 116(4):508-21 196 Panitch HS, Hirsch RL, Schindler J, Johnson KP (1987). Treatment of multiple sclerosis with gamma interferon: exacerbations associated with activation of the immune system. Neurology. 37(7):1097-102 197 Pasare C, Medzhitov R (2003) Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cell-mediated suppression by dendritic cells. Science 299(5609):1033-6 198 Pasparakis M, Alexopoulou L, Episkopou V, Kollias G (1996). Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice. a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response. J Exp Med. 184(4):1397-411 199 Pender MP, Nguyen KB, MCCombe PA, Kerr JF (1991). Apoptosis in the nervous system in experimental allergic encepahlomyelitis, J Neurol Sci. 104 (1):81-7 200 Pennica D, Nedwin GE, Hayflick JS, Seeburg PH, Derynck R, Palladino MA, Kohr WJ, Aggarwal BB, Goeddel DV(1984). Human tumor necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature. 312(5996):724-9 201 Perry VH, Anthony DC (1999). Axon damage and repair in multiple sclerosis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354(1390):1641-7 202 Perry VH, Gordon S (1988). Macrophages and microglia in the nervoussystem. Trends Neurosci. 11(6):273-7 203 Peterson L, Fujinami R (2007). Inflammation, demyelination, neurodegeneration and neuroprotection in the pathogenesis of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 184(1-2):37-44 121 6. Literaturverzeichnis 204 Pimentel-Muiños FX, Seed B (1999).Regulated commitment of TNF receptor signaling: a molecular switch for death or activation.Immunity 11(6):783-93 205 Poduslo SE (1983). Proteins and glycoproteins in plasma membranes and in the membrane lamellae produced by purified oligodendroglia in culture.Biochim Biophys Acta.728(1):59-65 206 Pöllinger B, Krishnamoorthy G, Berer K, Lassmann H, Bösl MR, Dunn R, Domingues HS, Holz A, Kurschus FC, Wekerle H (2009). Spontaneous relapsingremitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells.J Exp Med.206(6):1303-16 207 Pouly S, Becher B, Blain M, Antel JP (2000). Interferon-gamma modulates human oligodendrocyte susceptibility to Fas-mediated apoptosis. J Neuropathol Exp Neurol. 59(4):280 208 Praet J, Guglielmetti C, Berneman Z, Van der Linden A, Ponsaerts P (2014). Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev.;47:485-505 209 Raivich G, Banati R (2004). Brain microglia and blood-derived macrophages: molecular profiles and functional roles in multiple sclerosis and animal models of autoimmune demyelinating disease. Brain Res Rev. 46(3):261-81 210 Rangachari M, Kuchroo VK (2013).Using EAE to better understand principles of immune function and autoimmune pathology.J Autoimmun. 45:31-9 211 Reboldi A, Coisne C, Baumjohann D, Benvenuto F, Bottinelli D, Lira S, Uccelli A, Lanzavecchia A, Engelhardt B, Sallusto F (2009). C-C chemokine receptor 6regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nat Immunol. 10(5):514-23 212 Recks M, Addicks K, Kuerten S (2011). Spinal cord histopathology of MOG peptide 35–55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis is time- and scoredependent. Neuroscience Letters. 494(3):227-31 213 Recks MS, Stormanns ER, Bader J, Arnhold S, Addicks K, Kuerten S (2013). Early axonal damage and progressive myelinpathology define the kinetics of CNS 122 6. Literaturverzeichnis histopathology in a mouse model of multiple sclerosis. Clinical Immunology. 149(1):32-45 214 Reese TS, Karnovsky MJ (1967).Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase.J Cell Biol.34(1):207-17 215 Renno T, Krakowski M, Piccirillo C, Lin JY, Owens T (1995). TNFalpha expression by resident microglia and infiltrating leukocytes in the central nervous system of mice with experimental allergic encephalomyelitis. Regulation by Th1 cytokines. J Immunol. 154(2):944-53 216 Renno T, Taupin V, Bourbonniere L, Verge G, Tran E, De Simone R, Krakowski M, Rodriguez M, Peterson A, Owens T (1998). Interferon-gamma in progression to chronic demyelination and neurological deficit following acute EAE. Mol. Cell. Neurosci. 12(6):376-89 217 Richez C, Blanco P, Lagueny A, Schaeverbeke T, Dehais J (2005). Neuropathy resembling CIDP in patients receiving tumor necrosis factor-alpha blockers. Neurology. 64(8):1468-70 218 Rivera-Quinones C, McGavern D, Schmelzer JD, Hunter SF, Low PA, Rodriguez M (1998). Absence of neurological deficits following extensive demyelination in a class I-deficient murine model of multiple sclerosis. Nat Med. 4(2):187-93 219 Rivers TM, Sprunt DH, Berry GP (1933). Observations on attempts to produce acute disseminated encephalomyelitis in monkeys. J Exp Med. 58 (1):39-53 220 Rosenman SJ, Shrikant P, Dubb L, Benveniste EN, Ransohoff RM (1995). Cytokine-induced expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by astrocytes and astrocytoma cell lines. Journal of Immunology. 154(4):1888-99 221 Rothe J, Lesslauer W, Lötscher H, Lang Y, Koebel P, Köntgen F, Althage A, Zinkernagel R, Steinmetz M, Bluethmann H (1993). Mice lacking the tumour necrosis factor receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes. Nature. 364(6440):798-802 123 6. Literaturverzeichnis 222 Sagerstrom CG, Kerr EM, Allison JP, Davis MM (1993). Activation and differentiation requirements of primary T cells in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 90(19):8987-91 223 Sánchez-Gómez MV, Alberdi E, Ibarretxe G, Torre I, Matute C (2003). Caspasedependent and caspase-independent oligodendrocyte death mediated by AMPA and kainate receptors. J. Neurosci. 23(29):9519-28 224 Santiago E, Pérez-Mediavilla LA, López-Moratalla N (1998). The role of nitric oxide in the pathogenesis of multiple sclerosis. J Physiol Biochem. 54(4):229-37 225 Sanvito L,Constantinescu CS, Gran B, ‘t Hart BA (2010) The Multifaceted Role of Interferon- in Central Nervous SystemAutoimmune Demyelination The Open Autoimmunity Journal, 2 151-159 226 Sato W, Aranami T, Yamamura T (2007). Cutting edge: human Th17 cells are identified as bearing CCR2+CCR5 phenotype. J Immunol. 178(12):7525-9 227 Schmidt J, Metselaar JM, Wauben MH, Toyka KV, Storm G, Gold R (2003).Drug targeting by long-circulating liposomal glucocorticosteroids increases therapeutic efficacy in a model of multiple sclerosis.Brain. 126(Pt 8):1895-904 228 Segal BM, Constantinescu CS, Raychaudhuri A, Kim L, Fidelus-Gort R, Kasper LH (2008). Ustekinumab MS Investigators, Repeated subcutaneous injections of IL12/23 p40 neutralising antibody, ustekinumab, in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase II, double-blind, placebo-controlled, randomized, doseranging study. Lancet Neurol. 7(9):796-804 229 Selmaj K, Raine CS, Cannella B, Brosnan CF (1991). Identification of lymphotoxin and tumour necrosis factor in multiple sclerosis lesions. J Clin Invest. 87(3):949-54 230 Selmaj K, Raine CS, Cross AH (1991). Anti-tumor necrosis factor therapy abrogates autoimmune demyelination. Ann Neurol.30(5):694-700 231 Selmaj K, Raine CS, Farooq M, Norton WT, Brosnan CF (1991). Cytokine cytotoxicity against oligodendrocytes. Apoptosis induced by Lymphotoxin. J Immunol. 147(5):1522-9 124 6. Literaturverzeichnis 232 Sharief MK, Hentges R (1991). Association between tumour necrosis factor-alpha and disease progression in patients with multiple sclerosis. N Engl J Med. 325(7):467-72 233 Sheng WS, Hu S, Ni HT, Rowen TN, Lokensgard JR, Peterson PK (2005). TNFalpha-induced chemokine production and apoptosis in human neural precursor cells. J Leukoc Biol. 78(6):1233-41 234 Siebert H, Brück W (2003). The role of cytokines and adhesion molecules in axon degeneration after peripheral nerve axotomy: a study in different knockout mice. Brain Research 960(1-2):152-6 235 Siffrin V, Radbruch H, Glumm R, Niesner R, Paterka M, Herz J, Leuenberger T, Lehmann SM, Luenstedt S, Rinnenthal JL, Laube G, Luche H, Lehnardt S, Fehling HJ, Griesbeck O, Zipp F (2010). In vivo imaging of partially reversible th17 cellinduced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33(3):424-36 236 Silber E, Sharief MK (1999). Axonal degeneration in the pathogenesis of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 170(1):11-8 237 Simpson JE, Newcombe J, Cuzner ML, Woodroofe MN (1998). Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and other beta-chemokines by resident glia and inflammatory cells in multiple sclerosis lesions. J Neuroimmunol. 84(2):238-49 238 Sixt M, Engelhardt B, Pausch F, Hallmann R, Wendler O, Sorokin LM (2001).Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.J Cell Biol.153(5):933-46 239 Skurkovich S, Boiko A, Beliaeva I, Buglak A, Alekseeva T, Smirnova N, Kulakova O, Tchechonin V, Gurova O, Deomina T, Favorova OO, Skurkovic B, Gusev E (2001). Randomized study of antibodies to IFN-gamma and TNFalpha in secondary progressive multiple sclerosis. Mult Scler. 7(5):277-84 240 Smolen JS, Han C, Bala M , Maini RN, Kalden JR, van der Heijde D, Breedveld FC, Furst DE, Lipsky PE (2005). Evidence of radiographic benefit of treatment with infliximab plus methotrexate in rheumatoid arthritis patients who had no clinical 125 6. Literaturverzeichnis improvement: a detailed subanalysis of data from the anti-tumor necrosis factor trial in rheumatoid arthritis with concomitant therapy study. Arthritis Rheum. 52(4):1020-30 241 Sospedra M, Martin R, (2005), Immunology of Multiple Sclerosis, Annu Rev Immunol.23: 683–747 242 Stalder AK, Carson MJ, Pagenstecher A, Asensio VC, Kincaid C, Benedict M, Powell HC, Masliah E, Campbell IL (1998). Lateonset chronic inflammatory encephalopathy in immune-competent and severe combined immune-deficient (SCID) mice with astrocyte- targeted expression of tumor necrosis factor. Am J Pathol. 153(3):767-83 243 Steinman L (2001). Multiple sclerosis: a two-stage disease. Nat Immunol. 2(9):7624 244 Steinman L (2007) A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage. Nat. Med. 3(2):139-45 245 Storch MK, Piddlesden S, Haltia M, Iivanainen M, Morgan P, Lassmann H (1998). Multiple sclerosis: in situ evidence for antibody- and complement-mediated demyelination. Ann Neurol. 43(4):465-71 246 Stromnes IM, Cerretti LM, Liggitt D, Harris RA, Goverman JM (2008). Differential regulation of central nervous system autoimmunity by T(H)1 and T(H)17 cells. Nat Med. 4(3) 247 Stromnes IM, Goverman JM (2006). Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.Nat Protoc.1(4):1810-9 248 Sun D, Whitaker JN, Huang Z, Liu D, Coleclough C, Wekerle H, Raine CS (2001). Myelin antigen-specific CD8+ T cells are encephalitogenic and produce severe disease in C57BL/6 mice. J Immunol. 166(12):7579-87 249 Suskal SA, Nadiminti L, Granstein RD (2006). Etanercept and demyelinating disease in a patient with psoriasis. Journal of the American Academy of Dermatology. 54(1):160-4 126 6. Literaturverzeichnis 250 Suvannavejh G, Hae-Ock L, Padilla J, Dal Canto M, Barrett T, Miller S (2000). Divergent roles for p55 and p75 tumor necrosis factor receptors in the pathogenesis of MOG35-55-induced EAE. Cellular Immunology. 205(1):24-33 251 Suvannavejh GC, Lee HO, Padilla J, Dal Canto MC, Barrett TA, Miller SD (2000). Divergent roles for p55 and p75 Tumor Necrosis Facto Receptors in the pathogenesis of MOG – 35 55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Cellular Immunology. 205(1):24-33 252 Takeuchi H, Jin S, Wang J, Zhang G, Kawanokuchi J, Kuno R, Sonobe Y, Mizuno T, Suzumura A (2006). Tumor Necrosis Factor- Induces Neurotoxicity via Glutamate Release from Hemichannels of Activated Microglia in an Autocrine Manner. J Biol Chem. 281(30):21362-8 253 Taoufik E, Tseveleki V, Chu SY, Tselios T, Karin M, Lassmann H, Szymkowski DE, Probert L (2011).Transmembrane tumour necrosis factor is neuroprotective and regulates experimental autoimmune encephalomyelitis via neuronal nuclear factor kappa B. Brain. 134(Pt 9):2722-35 254 Thakker P, Leach MW, Kuang W, Benoit SE, Leonard JP, Marusic S (2007). IL-23 Is Critical in the Induction but Not in the Effector Phase of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Immunol. 178(4):2589-98 255 The Lenercept Multiple Sclerosis Study Group and The University of British Columbia MS/MRI Analysis Group (1999).TNF neutralization in MS: results of a randomized, placebo-controlled multicenter study.Neurology.53(3):457-65 256 Thompson AJ, Polman CH, Miller DH, McDonald WI, Brochet B, Filippi M,Montalban X, De Sá (1997) Primary progressive multiple sclerosis. Brain. 120 ( Pt 6):1085-96 257 Thornton AM, Shevach EM (1998).CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production.J Exp Med.188(2):287-96 258 Tracey D, Klareskog L, Sasso EH, Salfeld JG, Tak PP (2008). Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther. 117(2):244-79 127 6. Literaturverzeichnis 259 Tracey KJ, Fong Y, Hesse DG, Manogue KR, Lee AT, Kuo GC, Lowry SF, Cerami A (1987). Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330(6149):662-4 260 Tran EH, Hoekstra K, van Rooijen N, Dijkstra CD, Owens T(1998). Immune invasion of the central nervous system parenchyma and experimental allergic encephalomyelitis, but not leukocyte extravasation from blood, are prevented in macrophage-depleted mice. J Immunol. 161(7):3767-75 261 Trapp BD, Peterson J, Ransohoff RM Rudick R, Mörk S, Bö L (1998).. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338(5):278-85 262 Traugott U, Lebon P (1988). Multiple sclerosis: involvement of interferons in lesion pathogenesis. Ann Neurol. 24(2):243-51 263 Tsunoda I, Fujinami RS (2010).Neuropathogenesis of Theiler's murine encephalomyelitis virus infection, an animal model for multiple sclerosis.J Neuroimmune Pharmacol.5(3):355-69 264 Tsunoda I, Iwasaki Y, Terunuma H, Sako K, Ohara Y (1996).A comparative study of acute and chronic diseases induced by two subgroups of Theiler's murine encephalomyelitis virus.Acta Neuropathol.91(6):595-602 265 Tsunoda I, Kuang LQ, Libbey JE, Fujinami RS (2003). Axonal injury heralds virusinduced demyelination. Am J Pathol. 162(4):1259-69 266 Tsunoda I, Kuang LQ, Theil DJ, Fujinami RS (2000). Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsingremitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains.Brain Pathol.10(3):402-18 267 Tzartos JS, Friese MA, Craner MJ, Palace J, Newcombe J, Esiri MM, Fugger L (2008). Interleukin-17 production in central nervous system-infiltrating T cellsand glial cells is associated with active disease in multiple sclerosis. Am J Pathol. 172(1):146-55 128 6. Literaturverzeichnis 268 Ure DR, Rodriguez M (2002).Preservation of neurologic function during inflammatory demyelination correlates with axon sparing in a mouse model of multiple sclerosis.Neuroscience.111(2):399-411 269 Valencia X, Stephens G, Goldbach-Mansky R, Wilson M, Shevach EM, Lipsky PE (2006). TNF downmodulates the function of human CD4+CD25hi T regulatory cells. Blood. 108(1):253-61 270 Van den Brande JM, Braat H, van den Brink GR, Versteeg HH, Bauer CA, Hoedemaeker I, van Montfrans C, Hommes DW, Peppelenbosch MP, van Deventer SJ (2003). Infliximab but not Etanercept Induces Apoptosis in Lamina Propria TLymphocytes From Patients With Crohn’s Disease. Gastroenterology. 124(7):177485 271 Van der Veen RC, Hinton DR, Incardonna F, Hofman FM (1997).Extensive peroxynitrite activity during progressive stages of central nervous system inflammation.J Neuroimmunol.77(1):1-7 272 Van Hauwermeiren F1, Vandenbroucke RE, Libert C (2011).Treatment of TNF mediated diseases by selective inhibition of soluble TNF or TNFR1.Cytokine Growth Factor Rev.22(5-6):311-9 273 Van Mierlo GJ, Scherer HU, Hameetman M, Morgan ME, Flierman R, Huizinga TW, Toes RE (2008).Cutting edge: TNFR-shedding by CD4+CD25+ regulatory T cells inhibits the induction of inflammatory mediators.J Immunol.180(5):2747-51 274 Van Oosten BW, Barkhof F, Truyen L, Boringa JB, Bertelsmann FW, von Blomberg BM, Woody JN, Hartung HP, Polman CH (1996). Increased MRI activity and immune activation in two multiple sclerosis patients treated with the monoclonal anti-tumor necrosis factor antibody cA2. Neurology. 47(6):1531-4 275 Vanden Eijnden S, Goriely S, De Wit D, Willems F, Goldman M (2005). IL-23 upregulates IL-10 and induces IL-17 synthesis by polyclonally activated naive T cells in human. Eur J Immunol. 35(2):469-75 276 Vanderlugt CL, Begolka WS, Neville KL, Katz-Levy Y, Howard LM, Eagar TN, Bluestone JA, Miller SD (1998).The functional significance of epitope spreading and its regulation by co-stimulatory molecules.Immunol Rev.164:63-72 129 6. Literaturverzeichnis 277 Vassalli P (1992). The pathophysiology of tumor necrosis factors. Annu Rev Immunol. 10:411-52 278 Veremeyko T, Siddiqui S, Sotnikov I, Yung A, Ponomarev ED (2013).IL-4/IL-13dependent and independent expression of miR-124 and its contribution to M2 phenotype of monocytic cells in normal conditions and during allergic inflammation.PLoS One.8(12) 279 Waldner H, Whitters MJ, Sobel RA, Collins M, Kuchroo VK (2000). Fulminant spontaneous autoimmunity of the central nervous system in mice transgenic for the myelin proteolipid protein-specific T cell receptor.Proc Natl Acad Sci USA.97(7):3412-7 280 Wang D, Ayers MM, Catmull DV, Hazelwood LJ, Bernard CC, Orian JM (2005). Astrocyte-associated axonal damage in pre-onset stages of experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 51(3):235-40 281 Warren KG, Catz I (1994). Relative frequency of autoantibodies to myelin basic protein and proteolipid protein in optic neuritis and multiple sclerosis cerebrospinal fluid. J Neurol Sci. 121(1):66-73 282 Weinshenker BG, Bass B, Rice GP, Noseworthy J, Carriere W, Baskerville J, Ebers GC (1989). The natural history of multiple sclerosis: a geographically based study. I. Clinical course and disability. Brain. 112 ( Pt 1):133-46 283 Weir CR, Nicolson K, Bäckström BT (2002). Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in naive mice by dendritic cells presenting a selfpeptide. Immunol. Cell Biol. 80(1):14-20 284 Wekerle H, Cohen IR (1981). The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 11(3):195-9 285 Wensky AK, Furtado GC, Marcondes MC, Chen S, Manfra D, Lira SA, Zagzag D, Lafaille JJ (2005) IFN-gamma determines distinct clinical outcomes in autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 174(3):1416-23 130 6. Literaturverzeichnis 286 Werner P, Pitt D, Raine CS (2001). Multiple sclerosis: altered glutamate homeostasis in lesions correlates with oligodendrocyte and axonal damage. Ann Neurol. 50(2):169-80 287 Wheeler RD, Zehntner SP, Kelly LM, Bourbonniere L, Owens T (2006). Elevated interferon gamma expression in the central nervous system of tumour necrosis factor receptor 1-deficient mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunology. 118(4):527-38 288 Whitaker JN, Kirk KA, Herman PK, Zhou SR, Goodin RR, Moscarello MA, Wood DD (1992) An immunochemical comparison of human myelin basic protein and its modified, citrullinated form, C8. J. Neuroimmunol. 36(2-3):135-46 289 Williams RO, Feldmann M, Maini RN (1992). Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci USA. ;89(20):9784-8 290 Wujek JR, Bjartmar C, Richer E, Ransohoff RM, Yu M, Tuohy VK, Trapp BD (2002). Axon Loss in the Spinal Cord Determines Permanent Neurological Disability in an Animal Model of Multiple Sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 61(1):23-32 291 Xue Z, Li W, Wang H, Huang B, Ge Z, Gu C, Liu Y, Zhang K, Yang J, Han R, Peng M, Li Y, Zhang D, Da Y, Yao Z, Zhang R (2014). ZSTK474, a novel PI3K inhibitor, modulates human CD14+ monocyte-derived dendritic cell functions and suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis. J Mol Med. (Berl). 92(10):1057-68 292 Yednock TA, Cannon C, Fritz LC. Sanchez-Madrid F, Steinman L, Karin N (1992). Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature; 356(6364):63-6 293 Yeh WC, Shahinian A, Speiser D, Kraunus J, Billia F, Wakeham A, de la Pompa JL, Ferrick D, Hum B, Iscove N, Ohashi P, Rothe M, Goeddel DV, Mak TW (1997). Early lethality, functional NF-kappaB activation, and increased sensitivity to TNFinduced cell death in TRAF2-deficient mice. Immunity. 7(5):715-25 131 6. Literaturverzeichnis 294 Yeh WI, McWilliams IL, Harrington LE (2014). IFN γ inhibits Th17 differentiation and function via Tbet-dependent and Tbet-independent mechanisms. Journal of Neuroimmunology. 267(1-2):20-7 295 Yura M, Takahashi I, Serada M, Koshio T, NakagamiK, Yuki Y, Kiyono H (2001) Role of MOG-stimulated Th1 type “light up” (GFP+) CD4+ T cells for the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), J.Autoimmun. 17(1):17-25 296 Zhang GX, Gran B, Yu S, Li J, Siglienti I, Chen X, Kamoun M, Rostami A (2003). Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in IL-12 receptor- 2deficient mice: IL-12 responsiveness is not required in the pathogenesis of inflammatory demyelination in the central nervous system. J. Immunol. 170(4):2153-60 297 Zheng L, Fisher G, Miller RE, Peschon J, Lynch DH, Lenardo MJ (1995). Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature. 377(6547):348-51 298 Zhou QH, Sumbria R, Hui EK, Lu JZ, Boado RJ, Pardridge WM (2011).Neuroprotection with a Brain-Penetrating Biologic Tumor Necrosis Factor Inhibitor. J Pharmacol Exp Ther. 339(2):618-23 299 Zhu J, Yamane, H,Paul WE (2010) Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol 28:445-89 300 Zozulya AL, Clarkson BD, Ortler S, Fabry Z, Wiendl H (2010). The role of dendritic cells in CNS autoimmunity. J Mol Med. (Berl). 88(6):535-44 132 7. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen 7. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen Im Rahmen dieser Dissertation wurde folgende Publikation erzielt: Batoulis H, Recks MS, Holland FO, Thomalla F, Williams RO, Kuerten S (2014). Blockade of tumour necrosis factor-α in experimental autoimmune encephalomyelitis reveals differential effects on the antigen-specific immune response and central nervous system histopathology. Clin Exp Immunol.175(1):41-8 133 8. Lebenslauf 8. Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. 134
