Pflanzen- biotechnologie

Pflanzenbiotechnologie
ten Selektion konnten jetzt durch
Pyramidisierung Linien erhalten
werden, die wesentlich resistenter
gegen die Schadpilze sind.
Ist die Genstruktur aufgeklärt,
folgt die ungleich schwierigere
Aufgabe, dieser Struktur eine Funktion zuzuordnen. Im Fall der Resis-
tenzgene sind hier in jüngerer Zeit
deutliche Fortschritte erzielt worden. So kennt man heute die Funktionen, die viele der monogen wirkenden Resistenzgene, wie zum
Beispiel die Resistenzgene der Kartoffel gegen PVX (Potato virus X),
gegen Globodera (Kartoffelnemato-
Synthetische Gene zur Expression in transgenen Pflanzen – Matthias Pfeiffer, Uwe Köhler
Beispiel Signalpeptide oder Introns – nicht kodierende Sequenzen, die in Pflanzen oft regulatorische
Funktionen aufweisen – mit relativ einfachen Mitteln
in die Sequenz integriert werden.
Drei Basen von innen nach außen gelesen ergeben die
von dem Triplett kodierte Aminosäure, zum Beispiel
das Triplett CAC die Aminosäure Histidin (His).
Grafik: DHGP
Der wichtigste Faktor ist jedoch die Anpassung
des Gens an die sogenannte „Codon Präferenz“
des Zielorganismus. Der genetische Code ist ein
Triplettcode (das heißt, drei Nukleotide auf der DNA
kodieren für eine Aminosäure) und ist mit wenigen
Ausnahmen in allen Organismen gleich. Es gibt vier
verschiedene Nukleotide (G, A, T und C), daraus
ergeben sich für einen Triplettcode insgesamt 64 (43)
Codonvarianten, wovon drei nicht für Aminosäuren
kodieren, sondern als Stoppsignale der Translation dienen. Insgesamt gibt es 20 unterschiedliche Aminosäuren, die von den 61 verbliebenen Tripletts kodiert
werden. Das führt dazu, dass für die meisten Aminosäuren zwei, drei, vier oder sogar sechs Codons zur
Verfügung stehen. Daher kann ein Gen, das die Information für ein definiertes Protein trägt, in seiner
Codonzusammensetzung recht variabel sein.
Die chemische Synthese von Nukleinsäuren erlaubt
es, vollständige Gene de novo aufzubauen. In einem Ansatz werden eine Reihe von sequenziell
überlappenden kurzen Nukleinsäurestücken, so
genannte Oligonukleotide, auf chemischem Wege
hergestellt und durch enzymatische Reaktionen,
meist Ligase- oder Polymerase-Reaktionen, miteinander verknüpft. Auf diese Weise können DNAFragmente beliebiger Sequenz und Länge produziert werden, die nach Transfer in Pflanzenzellen in
die entsprechenden Proteine übersetzt werden.
Sequenzvergleiche haben gezeigt, dass prokaryotische, eukaryotische und virale Arten oft bestimmte
Präferenzen bei der Verwendung von alternativen
Tripletts haben. Viele Pflanzen besitzen im allgemeinen eher GC-reiche kodierende Sequenzen, während
tierische Gene tendenziell eher AT-reich sind. Bakterien variieren abhängig vom jeweiligen Stamm. So
ist zum Beispiel in E. coli K12 das Triplett AAA (und
nicht AAG) das bevorzugte Codon für die Aminosäure Lysin. 75 % der für Lysin kodierenden Tripletts
sind AAA. In der einkeimblättrigen Pflanze Zea mays
(Mais) ist dagegen das Codon AAG das bevorzugte
Triplett für Lysin: 72,5 % der Codons sind AAG.
Vor der Synthese kann die Gensequenz in silico,
also am Computer, an die Bedürfnisse des Wirtsorganismus angepasst werden. Hierbei werden alle
Faktoren berücksichtigt, die die Effektivität der Proteinexpression negativ beeinflussen, beispielsweise
Sekundärstrukturen, an denen die Proteinsynthese
vorzeitig abbrechen könnte. Andererseits können
auch wichtige positiv wirkende Elemente, zum
Die Codonpräferenz spielt bei der Expression
bakterieller oder tierischer Proteine in Pflanzen eine
große Rolle. Ist das Fremdgen aus Codons aufgebaut, die in der Pflanze weniger bevorzugt sind, wird
das Gen schlecht in Protein übersetzt. Die Pflanzenzellen besitzen nämlich nur einen begrenzten Vorrat an transferRNAs (tRNAs), die für den Transport
einer bestimmten Aminosäure bei der Protein-
20
mensch+umwelt spezial 17. Ausgabe 2004/2005
den) oder gegen die Kraut- und
Knollenfäule, im Stoffwechsel der
Zelle haben: Sie übertragen mit
Hilfe bestimmter Proteine Signale
zwischen Zellkompartimenten, zum
Beispiel aus dem Zellkern ins
Zytoplasma, so dass dort Abwehrreaktionen aktiviert werden.
Resistenzgene sind meist nicht
zufällig im Pflanzengenom verteilt,
sondern treten gehäuft in hot spots
auf. Damit wird eine Suchstrategie
möglich, mit der in der Nachbarschaft von bereits bekannten Resistenzgenen nach Erbanlagen für
neue Resistenzeigenschaften ge-
fahndet werden kann. Allerdings
finden sich dabei oft auch so genannte Resistenzgen-Analoge, die zwar
ähnliche DNA-Sequenzen besitzen,
letztlich aber nicht für aktive Proteine kodieren. Daher muß die resistenzvermittelnde Wirkung solcher
Kandidatengene durch Genüber-
synthese verantwortlich sind. Wird nun ein von der
Pflanze selten verwendetes Codon für die Translation des Fremdgens sehr oft benötigt, kommt es
schnell zur Ausdünnung der entsprechenden tRNAMoleküle. In der Folge pausiert die Translation des
Fremdgens oder es werden vermehrt falsche Aminosäuren in die Polypeptidkette eingebaut.
Es ist daher sinnvoll – oder gegebenenfalls sogar
notwendig –, die Sequenz eines Fremdgens an die
Gegebenheiten des Wirtsorganismus anzupassen.
Hierzu werden Codons mit einer geringen Präferenz
durch Codons mit hoher Präferenz ersetzt, ohne dass
sich dadurch die Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins ändert. Diese Methode wurde bereits
vielfach bei zweikeimblättrigen Pflanzen eingesetzt
(zum Beispiel bei der Expression von bakteriellem
Endotoxin in Kartoffeln). Einkeimblättrige Pflanzen
sind im Vergleich zu den zweikeimblättrigen noch GCreicher. Daher ist zum Beispiel die Expression bakterieller oder tierischer Gene in Reis bisher nur selten
geglückt. Die Verwendung Codon-angepasster
synthetischer Gene hat nun aber auch in dieser wichtigen Nutzpflanze zum Erfolg geführt.
Die Herstellung synthetischer Gene
a) Chemisch synthetisierte Oligonukleotide mit zueinander komplementären Enden werden gemischt.
b) Unter geeigneten Bedingungen hybridisieren die
passenden Enden der Oligonukleotide zu kurzen
Doppelsträngen.
c) und d) Die einzelsträngigen Zwischenräume werden
durch das Enzym DNA-Polymerase mit dem jeweiligen
Gegenstrang als Matrize aufgefüllt.
e) Die synthetische DNA ist nun doppelsträngig, allerdings sind die Rückgrate beider Stränge noch nicht
kovalent geschlossen.
f) Das Enzym Ligase verknüpft die freien Enden im
Rückgrat durch kovalente Bindung.
g) Das synthetische Gen ist nun vollständig und kann
zur Expression des von ihm kodierten Proteins weiterverwendet werden. Grafik: Medigenomix/H. Guldner
Dr. Matthias Pfeiffer, Biologe und
Betriebswirt, und Dr. Uwe Köhler,
Biologe, gehören der Martinsrieder
Firma Medigenomix an.
21