Elektrophorese Physikalische Grundlagen
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Elektrophorese Trennung von Teilchen aufgrund unterschiedlicher Wanderungsgeschwindigkeiten in einem elektrischen Feld -+ -+ Trennung 82 Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden MAH Physikalische Grundlagen Elektrische Feldstärke E= F ⇔ F = E ⋅ z ⋅e z ⋅e Stokessche s Gesetz FR = 6 ⋅ π ⋅ r ⋅η ⋅ v Wanderungs geschwindi gkeit E ⋅ z ⋅ e = 6 ⋅ π ⋅ r ⋅η ⋅ v ⇔ v = E ⋅ z ⋅e 6 ⋅ π ⋅ r ⋅η Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden E: F: z: e: FR: r: η: v: Elektrische Feldstärke Kraft Ladung Elementarladung Reibungskraft Teilchenradius Viskosität Wanderungsgeschwindigkeit 83 MAH 1 Trägerelektrophorese > Papierelektrophorese > Gelelektrophorese – Celluloseacetat – Stärke > > > > > > oder – Agar Säulenelektrophorese – Agarose – Polyacrylamid U ≥ 100 V Puffer (0,01 bis 0,1 M) Elektroden aus Platin, Kohle oder Edelstahl Elektrolytische Reaktionen stören nicht (Diaphragmen) Kühlsystem Detektion durch Anfärbung o. ä., photometrisch Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 84 MAH Spezielle Verfahren, Anwendungen > isoelektrische Fokussierung pH-Gradient > Disk-Elektrophorese pH-Abstufung, verschiedene Gele > zweidimensionale Elektrophorese kontinuierliche Elektrophorese > anorg. Ionen > Alkaloide, Antibiotika, Zucker > Nucleinsäuren > Aminosäuren, Peptide, Proteine > Zucker u. a. Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 85 MAH 2 SDS-PAGE (1) O + H3C + (CH2)11 O S O Na O m = const. z O O S O O 2n O ca. 5% n * O NH2 O N C N H H2 H n * radikalische Polymerisation CONH2 CONH2 O O S O O O n NH2 radikalische Polymerisation Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 86 MAH SDS-PAGE (2) > Protein-SDS-Komplexe sind negativ geladen ⇒ Wanderung zur Anode > ca. 1 SDS pro 2 AS (1,4 g SDS / 1 g Protein) Teilchengröße (Masse) ist ungefähr proportional zur Ladung ⇒ Wanderungsgeschwindigkeit aufgrund des elektrischen Feldes ist konstant > Trennung durch Siebeffekt des Gels Puffer (mit schwacher Säure, z.B Glycin pKS2 = 9,6) Sammelgel (pH 6,8, großporig, hohe Feldstärke) Trenngel (pH 8,8, feinporig, niedrigere Feldstärke) Puffer Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 87 MAH 3 Kapillarelektrophorese Quarzglas-Kapillare – kleiner Innendurchmesser ⇒ großes Oberflächen-Volumen-Verhältnis ⇒ effiziente Wärmeableitung ⇒ Verminderung von Radialdiffusion und Konvektion 2-35 kV -+ Kapillare UV/VIS-Detektor Puffergefäß oder MS Puffergefäß oder elektrochem. Detektor Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 88 MAH Elektro-endoosmotischer Fluß (EOF) pH > 2,5: Silanol-Gruppen des unbeschichteten Quarzglases werden (teilweise) deprotoniert Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 89 MAH 4 Strömungsprofile HPLC: Strömung durch Druckdifferenz Reibung an der Kapillarwand ⇒ parabolisches Strömungsprofil CE: Kraft geht von der Kapillarwand aus Reibung an der Kapillarwand ⇒ flaches Strömungsprofil Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 90 MAH 91 MAH Probenfokussierung (Stacking) κPZ EPZ vPZ < > > Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden κPuffer EPuffer vPuffer 5 MEKC Oberflächenaktive Substanzen, Tenside Mizellare Elektrokinetische KapillarChromatographie hydrophil lipophil pseudostationäre, mizellare Phase Migration Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden Netto-Geschwindigkeit 92 EOF MAH Anwendungen > Peptide, Proteine > Kohlenhydrate > DNA-Sequencing > anorg. Ionen > Arzneistoffe > Analyten aus biologischen Flüssigkeiten > Enantiomerentrennung – chirale Selektoren (z. B. Cyclodextrine) Instrumentelle Analytik, Elektrochemische Methoden 93 MAH 6
