Differenzierung zellulärer Marker von bakteriellen Erregern
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Differenzierung zellulärer Marker von bakteriellen Erregern mittels Real-Time-PCR Werner Lehmann Attomol GmbH, Bronkow 6. Senftenberger Innovationsforum für Multiparameteranalytik 16. März 2012 Strategien der Erregerdiagnostik Direkter Nachweis: • Erregerkultur in vitro • Mikroskopie • Molekularer Nachweis • Antigennachweis Indirekter Nachweis: • Antikörpernachweis • Lymphozytentransformationstest Anti-Borrelia-IgG-µLINA Molekulare Marker Methoden zur Differenzierung von Markern Post-PCR-Nachweis ELISA Strip Test Biochip GenID, Hain, Attomol Affymetrix Greiner Flow Cytometric Assay Luminex Qiagen Bead Assay Illumina Attomol Real Time PCR Roche, Qiagen Attomol Molekularer Erregernachweis Post-PCR-Nachweis Reverse Hybridisierung Vorteile: • sehr sensitiv • genaue Typisierung von Erregern Nachteile: attomol® Mycobacterium tuberculosis DNA-LINA Sequenzierung • arbeitsaufwendig • teurere Reagenzien • Kontaminationsgefahr durch Amplifikat • qualitativ Molekularer Erregernachweis Real-time-PCR-Nachweis TaqMan-Sondensystem F Vorteile: • sehr sensitiv und spezifisch Q • semiquantitativ/quantitativ Hyprobe-Sondensystem • Schmelzkurvenanalytik • geringer Arbeitsaufwand, schnell A D • Kontaminationsrisiko ist gering LoopTag-Sondensystem Nachteile: PrimerVerlängerung A FRET A D SondenHybridisierung • teure Geräte • Differenzierung von nur 3-4 Amplikons LoopTag-Realtime-PCR-Sondensystem FRET FITC A C G C C TAGCCTAGGTAAAGGGCCTT Cy5 T G C G G CCAACGTTAACCCGGCCACGG -5‘ A C C TGTTAAGGCCG[N]1-100AATTGGCCGGTTGGAATTGGGCCGGTGCCGTTTAAGTCCGGT-3‘ Vorwärtsprimer FITC-5‘-ACGCCTTCCGGGAAATGGATGGCAT-3‘ Sonde 5‘-CCGTGGCCGGGTTAACGCAACC GGCGT -3‘-ATTO590 Patented! Sensitivität der LoopTag-PCR Vorteile: • großer linearer Meßbereich • Nachweis < 10 Kopien pro Ansatz • IS481-Repetition < 1 Genom/Ansatz Nachteile: • Kontaminationsgefahr Erreger interner Standard B. pertussis (BP283) B. pertussis (IS481) B. parapertussis Mycobacterium tub. Borrelia burg. Mycoplasma hom. Ureaplasma ureal. Template [fg in 5 µl] 30 <10 <10 <10 1 1 1 Template [Kopien in 5 µl] 1 7 <1 1 1 1 1 1 Schmelzkurve +++ +++ +++ + +++ +++ • Nachweis subklinischer Erregermengen Erregerdifferenzierung mittels LoopTag LoopTag Vorteile: • 2-3 Schmelzkurvenpeaks pro Meßkanal • toleriert Mutationen im Sondenbereich Nachteile: attomol® Bordetella-Realtime • Kompetition limitiert Sensitivität • keine komplexen Differenzierungen attomol® Mycoplasmen-Realtime Sensitivität/Spezifität der LoopTag-PCR attomol®Bordetella Realtime Interne Studie Nr. Probe B. pertussis/B. parapertussis B. pertussis/B. parapertussis IS481 IS1001 Bp283 IS1001 1 PK, Bp, Bpp + + + + 2 NK - - - - 3 PP1, Bp + - + - 4 PP2, Bp + - -- - 5 PP3, Bpp - + - + 6 PP4, B. holmesii + - - - PK NK PP Bp Bpp Positivkontrolle Negativkontrolle Patientenprobe Bordetella pertussis Bordetella parapertussis Sensitivität: Mutationen im Primerbindungsbereich können zu klinisch falschnegativen Bestimmungen führen. Spezifität: Sondensequenzen können zu klinisch falsch-positiven Bestimmungen führen. Zusammenfassung Real-time PCR Technologie: • hochsensitiv und spezifisch • begrenzt multiplextauglich Klinische Aussagekraft: • Nachweis der Nukleinsäure und nicht des lebenden Erregers • falsch-positive und falsch-negative Bestimmungen möglich Konsequenzen: • Einbeziehung des klinischen Bildes • Einsatz weiterer Verfahren
