Progressive Alignments

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Multiples Sequenz Alignment
Literatur: Kapitel 4 in Buch von David Mount
Thioredoxin-Beispiel heute aus Buch von Arthur Lesk
4. Vorlesung WS 2004/2005
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1
Alignments können einfach oder schwer sein
GCGGCCCA
GCGGCCCA
GCGTTCCA
GCGTCCCA
GCGGCGCA
********
TCAGGTACTT
TCAGGTAGTT
TCAGCTGGTT
TCAGCTAGTT
TTAGCTAGTT
**********
GGTGG
GGTGG
GGTGG
GGTGG
GGTGA
*****
TTGACATG
TTGACATG
TTGACATG
TTGACATG
TTGACATC
********
CCGGGG---A
CCGGTG--GT
-CTAGG---A
-CTAGGGAAC
-CTCTG---A
??????????
AACCG
AAGCC
ACGCG
ACGCG
ACGCG
*****
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Einfach
Schwierig wegen
Insertionen und
Deletionen
(indels)
2
Protein-Alignment kann durch tertiäre
Strukturinformationen geführt werden
Escherichia coli
DjlA protein
Homo sapiens
DjlA protein
nur so kann man letztlich auch bewertet, ob ein Sequenzalignment
korrekt ist.
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3
Definition von “Homologie”
•
Homologie: Ähnlichkeit, die durch
Abstammung von einem gemeinsamen
Ursprungsgen herrührt –
die Identifizierung und Analyse von
Homologien ist eine zentrale Aufgabe
der Phylogenie.
•
Ein Alignment ist eine Hypothese
für die positionelle Homologie
zwischen Basenpaaren bzw.
Aminosäuren.
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4
http://www.cellsignal.com
MSA für Thioredoxin-Familie
Farbe
gelb
grün
Aminosäuretyp
klein, unpolar
hydrophob
violett
rot
blau
polar
negativ geladen
positiv geladen
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Aminosäuren
Gly, Ala, Ser, Thr
Cys, Val, Ile, Leu
Pro, Phe, Tyr, Met, Trp
Asn, Gln, His
Asp, Glu
Lys, Arg
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5
Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
Thioredoxin: aus 5 beta-Strängen bestehendes beta-Faltblatt,
das auf beiden Seiten von alpha-Helices flankiert ist.
gemeinsamer Mechanismus: Reduktion von Disulfidbrücken in Proteinen
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Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
1) am stärksten konservierte Abschnitte entsprechen wahrscheinlich dem
aktiven Zentrum.
Disulfidbrücke zwischen Cys32 und Cys35 gehört zu konserviertem WCGPC[K
oder R] Motiv
Andere konservierte Sequenzabschnitte, z.B. Pro76Thr77 und Gly92Gly93
sind an der Substratbindung beteiligt.
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Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
2) Abschnitte mit vielen Insertionen und Deletionen entsprechen vermutlich
Schleifen an der Oberfläche. Eine Position mit einem konservierten Gly oder
Pro läßt auf eine Wendung der Kette (‚turn‘) schließen.
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Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
3) Ein konserviertes Muster hydrophober Bausteine mit dem Abstand 2 (d.h.,
an jeder zweiten Position), bei dem die dazwischenliegenden Bausteine
vielfältiger sind und auch hydrophil sein können, läßt auf ein -Faltblatt an der
Moleküloberfläche schließen.
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Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
4) Ein konserviertes Muster hydrophober Aminosäurereste mit dem Abstand
von ungefähr 4 läßt auf eine -Helix schließen.
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Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie
Die Thioredoxine sind Teil einer Superfamilie, zu der auch viele weiter entfernte
homologe Protein gehören,
z.B. Glutaredoxin (Wasserstoffdonor für die Reduktion von Ribonukleotiden bei
der DNA-Synthese)
Protein-Disulfidisomerase (katalysiert bei der Proteinfaltung den Austausch
falsch gefalteter Disulfidbrücken)
Phosducin (Regulator in G-Protein-abhängigen Signalübertragungswegen)
Glutathion-S-Transferasen (Proteine der chemischen Abwehr).
Die Tabelle des MSAs für Thioredoxinsequenzen enthält implizit auch Muster,
die man zur Identifizierung dieser entfernteren Verwandten nutzen kann.
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Multiples Sequenz-Alignment - Methoden
Es gibt im wesentlichen 3 unterschiedliche Vorgehensweisen:
(1) Manuell
(2) Automatisch
(3) Kombiniert
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Gründe für manuelles Alignment
manuelles Alignment bietet sich an falls
– Alignment einfach ist.
– es zusätzliche (strukturelle) Information gibt.
– automatische Alignment –Methoden in lokalen Minima feststecken.
– ein automatisch erzeugtes Alignment manuell “verbessert” werden kann.
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multiples Sequenzalignment
2 Methoden:
•
Dynamische Programmierung
– betrache 2 Proteinsequenzen von 100 Aminosäuren Länge.
- wenn es 1002 Sekunden dauert, diese beiden Sequenzen erschöpfend
zu alignieren, dann wird es
1003 Sekunden dauern um 3 Sequenzen zu alignieren,
1004 Sekunden für 4 sequences und
1.90258x1034 Jahre für 20 Sequenzen.
•
Progressives Alignment
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dynamische Programmierung mit MSA Programm
berechne zunächst paarweise Alignments
für 3 Sequenzen wird Würfel aufgespannt:
D.h. dynamische Programmierung hat nun Komplexität n1 * n2 * n3
mit den Sequenzlängen n1, n2, n3.
Sehr aufwändig! Versuche, Suchraum einzuschränken.
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dynamische Programmierung mit MSA Programm
Links: Baum für 5 Sequenzen ohne Paarung von Sequenzen.
Neighbour-joining Methode: berechne Summe aller Kantenlängen
S=a+b+c+d+e
(Kantenlängen sind bekannt)
In diesem Fall seien sich A und B am nächsten. Konstruiere daher den Baum
rechts.
Generell: Verbinde die Sequenzpaare mit den kürzesten Abständen …
 Man erhält den Baum mit der kleinsten Summe der Kantenlängen.
Konstruiere anhand phylogenetischem Baum ein versuchsweises Multiples
Sequenz Alignment.
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dynamische Programmierung mit MSA Programm
Dieses Alignment dient dazu, den möglichen Raum inmitten des Würfels
einzugrenzen, in dem das beste MSA zu finden sein sollte.
Grosse Rechenersparnis!
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Progressives Alignment
•
wurde von Feng & Doolittle 1987 vorgestellt
•
ist eigentlich eine heuristische Methode. Daher ist nicht garantiert, das
“optimale” Alignment zu finden.
•
benötigt (n-1) + (n-2) + (n-3) ... (n-n+1) paarweise Sequenzalignments
als Ausgangspunkt.
•
weitverbreitete Implementation in Clustal
(Des Higgins)
ClustalW ist eine neuere Version, in der den Parameter für Sequenzen
und Programm Gewichte (weights) zugeteilt werden.
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Überblick der ClustalW Prozedur
Hbb_Human
Hbb_Horse
Hba_Human
Hba_Horse
Myg_Whale
1
2
3
4
5
.17
.59
.59
.77
.60
.59
.77
CLUSTAL W
.13
.75
.75
Hbb_Human
2
-
3
Schnelle paarweise Alignments:
berechne Matrix der Abstände
4
Hbb_Horse
Hba_Human
1
Nachbar-VerbindungsBaumdiagramm
Hba_Horse
Myg_Whale
alpha-helices
1
2
3
4
5
PEEKSAVTALWGKVN--VDEVGG
GEEKAAVLALWDKVN--EEEVGG
PADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGA
AADKTNVKAAWSKVGGHAGEYGA
EHEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQ
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2
3
4
1
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progressive Alignments
entsprechend dem
Baumdiagramm
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ClustalW- Paarweise Alignments
•
Berechne alle möglichen paarweisen Alignments von Sequenzpaaren.
Es gibt (n-1)+(n-2)...(n-n+1) Möglichkeiten.
•
Berechne aus diesen isolierten paarweisen Alignments den “Abstand”
zwischen jedem Sequenzpaar.
•
Erstelle eine Abstandsmatrix.
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Clustal W - Nachbarschaftsbaum
•
aus den paarweisen Distanzen wird ein Nachbarschafts-Baum erstellt
•
Dieser Baum gibt die Reihenfolge an, in der das progressive Alignment
ausgeführt werden wird.
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21
Multiples Alignment - Erstes Paar
•
aligniere die beiden ähnlichsten Sequenzen zuerst.
•
dieses Alignment ist dann “fest” und wird nicht mehr angetastet. Falls
später ein GAP eingeführt werden muss, wird er in beiden Sequenzen
an der gleichen Stelle eingeführt.
•
Deren relatives Alignment bleibt unverändert.
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Clustal W – Zeit der Entscheidung
Ziehe den Baum heran um festzulegen, welches Alignment als nächstes
durchgeführt werden soll:
– aligniere eine dritte Sequenz zu den ersten beiden
oder
– aligniere zwei total verschiedene Sequenzen miteinander.
Option 1
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Option 2
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ClustalW- Alternative 1
Wenn beim Alignment einer dritten Sequenz mit
den ersten beiden eine Lücke eingefügt werden
muss um das Alignment zu verbessern, werden
beide als Einzelsequenzen betrachtet.
+
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ClustalW- Alternative 2
Falls, andererseits, zwei getrennte Sequenzen aligniert
werden müssen, werden diese zunächst miteinander
aligniert.
+
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Progressives Alignment – 1. Schritt
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgacagcta
gctcgatacacgatgactagcta
gctcgatacacgatgacgagcga
ctcgaacgatacgatgactagct
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgac-agcta
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Progressives Alignment – 2. Schritt
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgacagcta
gctcgatacacgatgactagcta
gctcgatacacgatgacgagcga
ctcgaacgatacgatgactagct
gctcgatacacgatgactagcta
gctcgatacacgatgacgagcga
4. Vorlesung WS 2004/2005
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Progressives Alignment – 3. Schritt
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgac-agcta
+
gctcgatacacgatgactagcta
gctcgatacacgatgacgagcga
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgac-agcta
Gctcgatacacga---tgactagcta
Gctcgatacacga---tgacgagcga
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28
Progressives Alignment – letzter Schritt
gctcgatacgatacgatgactagcta
gctcgatacaagacgatgac-agcta
gctcgatacacga---tgactagcta
gctcgatacacga---tgacgagcga
+
ctcgaacgatacgatgactagct
gctcgatacgatacgatgactagcta
Gctcgatacaagacgatgac-agcta
gctcgatacacga---tgactagcta
gctcgatacacga---tgacgagcga
-ctcga-acgatacgatgactagct4. Vorlesung WS 2004/2005
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ClustalW- Vor- und Nachteile
Vorteil:
– Geschwindigkeit.
Nachteile:
– keine objektive Funktion.
– Keine Möglichkeit zu quantifizieren ob Alignment gut oder schlecht ist.
– Keine Möglichkeit festzustellen, ob das Alignment “korrekt” ist.
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ClustalW - Lokales Minimum
Mögliche Probleme:
– in ein lokales Minimum zu geraten.
Falls zu einem frühen Zeitpunkt ein Fehler im Alignment eingebaut
wird, kann dieser später nicht mehr korrigiert werden.
– Zufälliges Alignment.
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Genauigkeit des Alignments verbessern
•
Sollen all Sequenzen gleich behandelt werden?
Obwohl manche Sequenzen eng verwandt und andere entfernt
verwandt sind?
•
Sollen alle Positionen der Sequenzen gleich behandelt werden?
Obwohl sie unterschiedliche Funktionen und Positionen in der
dreidimensionalen Strukturen haben können?
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ClustalW- Besonderheiten
•
Sequenzgewichtung
•
Variable Substitutionsmatrizen
•
Residuen-spezifische Gap-Penalties und verringerte Penalties in hydrophilen
Regionen (externe Regionen von Proteinsequenzen), bevorzugt Gaps in
Loops anstatt im Proteinkern.
•
Positionen in frühen Alignments, an denen Gaps geöffnet wurden, erhalten
lokal reduzierte Gap Penalties um in späteren Alignments Gaps an den
gleichen Stellen zu bevorzugen
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33
ClustalW- vom Benutzer festzulegende Parameter
•
Zwei Parameter sind festzulegen (es gibt Default-Werte, aber man sollte
sich bewusst sein, dass diese abgeändert werden können):
•
Die GOP- Gap Opening Penalty ist aufzubringen um eine Lücke in
einem Alignment zu erzeugen
•
Die GEP- Gap Extension Penalty ist aufzubringen um diese Lücke um
eine Position zu verlängern.
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Positions-spezifische Gap penalties
•
Bevor irgendein Sequenzpaar aligniert wird, wird eine Tabelle von GOPs
erstellt für jede Position der beiden Sequenzen.
•
Die GOP werden positions-spezifisch behandelt und können über die
Sequenzlänge variieren.
•
Falls ein GAP an einer Position existiert, werden die GOP und GEP
penalties herabgesetzt – und alle anderen Regeln treffen nicht zu.
•
Daher wird die Bildung von Gaps an Positionen wahrscheinlicher, an
denen bereits Gaps existieren.
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Vermeide zu viele Gaps
•
Solange kein GAP offen ist, wird GOP hochgesetzt falls die Position
innerhalb von 8 Residuen von einem bestehenden Gap liegt.
•
Dadurch werden Gaps vermieden, die zu eng beieinander liegen.
•
An jeder Position innerhalb einer Reihe von hydrophilen Residuen wird
GOP herabgesetzt, da diese gewöhnlich in Loop-Regionen von
Proteinstrukturen liegen.
•
Eine Reihe von 5 hydrophilen Residuen gilt als
hydrophiler stretch.
•
Die üblichen hydrophilen Residuen sind:
D
Asp
K
Lys
P
Pro
E
Glu
N
Asn
R
Arg
G
Gly
Q
Gln
S
Ser
Dies kann durch den Benutzer geändert werden.
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Divergente Sequenzen
•
Die am meisten divergenten Sequenzen (also am stärksten von allen
anderen Sequenzen verschiedenen) sind gewönlich am
schwierigsten zu alignieren
•
Es ist manchmal besser, ihr Alignment auf einen späteren Zeitpunkt
zu verschieben (nachdem die einfacheren Sequenzen aligniert
wurden)
•
Man kann dazu einen Cutoff wählen (der Default liegt bei 40%
Identität).
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Tips für progressives Alignment
•
Progressives Alignment ist ein mathematischer Vorgang, der völlig unabhängig
von der biologischen Realität abläuft.
•
Es kann eine sehr gute Abschätzung sein.
•
Es kann eine unglaublich schlechte Abschätzung sein.
•
Erfordert Input und Erfahrung des Benutzers.
•
Sollte mit Vorsicht verwendet werden.
•
Kann (gewöhnlich) manuell verbessert werden.
•
Es hilft oft, farbliche Darstellungen zu wählen.
•
Je nach Einsatzgebiet sollte der Benutzer in der Lage sein, die zuverlässigen
Regionen des Alignments zu beurteilen.
•
Für phylogenetische Rekonstruktionen sollte man nur die Positionen verwenden,
für die eine zweifelsfreie Hypothese über positionelle Homologie vorliegt.
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Alignment von Protein-kodierenden DNS-Sequenzen
• Es macht wenig Sinn, proteinkodierende DNS-Abschnitte
zu alignieren!
ATGCTGTTAGGG
ATGCTCGTAGGG
ATGCT-GTTAGGG
ATGCTCGT-AGGG
Das Ergebnis kann sehr unplausibel sein und entspricht eventuell nicht dem
biologischen Prozess.
Es ist viel sinnvoller, die Sequenzen in die entsprechenden Proteinsequenzen
zu übersetzen, diese zu alignieren und dann in den DNS-Sequenzen an den
Stellen Gaps einzufügen, an denen sie im Aminosäure-Alignment zu finden
sind.
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Software für manuelle Alignments
GDE- The Genetic Data Environment (UNIX)
CINEMA- Java applet available from:
– http://www.biochem.ucl.ac.uk
Seqapp/Seqpup- Mac/PC/UNIX available from:
– http://iubio.bio.indiana.edu
SeAl for Macintosh, available from:
– http://evolve.zoo.ox.ac.uk/Se-Al/Se-Al.html
BioEdit for PC, available from:
– http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/BIOEDIT/bioedit.html
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Beispiel: Src-Kinase HcK
Sequenz:
MGGRSSCEDP
YVPDPTSTIK
KGDQMVVLEE
RKDAERQLLA
RTLDNGGFYI
EKDAWEIPRE
AFLAEANVMK
SKQPLPKLID
GLARVIEDNE
VTYGRIPYPG
RPTFEYIQSV
GCPRDEERAP
PGPNSHNSNT
SGEWWKARSL
PGNMLGSFMI
SPRSTFSTLQ
SLKLEKKLGA
TLQHDKLVKL
FSAQIAEGMA
YTAREGAKFP
MSNPEVIRAL
LDDFYTATES
RMGCMKSKFL
PGIREAGSED
ATRKEGYIPS
RDSETTKGSY
ELVDHYKKGN
GQFGEVWMAT
HAVVTKEPIY
FIEQRNYIHR
IKWTAPEAIN
ERGYRMPRPE
QYQQQP
QVGGNTFSKT
IIVVALYDYE
NYVARVDSLE
SLSVRDYDPR
DGLCQKLSVP
YNKHTKVAVK
IITEFMAKGS
DLRAANILVS
FGSFTIKSDV
NCPEELYNIM
ETSASPHCPV
AIHHEDLSFQ
TEEWFFKGIS
QGDTVKHYKI
CMSSKPQKPW
TMKPGSMSVE
LLDFLKSDEG
ASLVCKIADF
WSFGILLMEI
MRCWKNRPEE
SMART ergibt:
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Beispiel: Src-Kinase HcK
Kinase-Einheit
Protein Data Bank
http://www.rcsb.org
1ATP
4. Vorlesung WS 2004/2005
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42
Beispiel: Src-Kinase HcK
SH3 Domäne
Src homology 3 (SH3) Domänen binden an Zielproteine mit Sequenzen, die Proline
und hydrophobe Aminosäuren enthalten. Pro-enthaltende Polypeptide können an
SH3 in zwei verschiedenen Orientierungen binden. SH3 Domänen sind kleine
Proteinmodule von ungefähr 50 Residuen Länge. Man findet sie in vielen
intrazellulären oder Membran-assoziierten Proteinen …
CATH: 1abo
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Beispiel: Src-Kinase HcK
SH2 Domäne
Die Src homology 2 (SH2) Domäne ist eine Proteindomäne mit etwa 100
Aminosäuren. SH2 Domänen funktionieren als Regelmodule von intrazellulären
Signalkaskaden indem sie mit grosser Affinität an Phospho-Tyrosin enthaltende
Peptide binden. SH2 Domänen findet man oft zusammen mit SH3 Domänen …
Ihre Struktur ist alpha+beta …
CATH:
1g83
4. Vorlesung WS 2004/2005
1fbz
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik
1aot
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Beispiel: Src-Kinase HcK
http://jkweb.berkeley.edu/
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Was kann man mit modularem Denken erreichen?
http://www.cellsignal.com
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46
Zusammenfasusng
Progressive Alignments sind die am weitesten verbreitete Methode für
multiple Sequenzalignments.
Sehr sensitive Methode ebenfalls: Hidden Markov Modelle (HMMer)
Multiples Sequenzalignment ist nicht trivial. Manuelle Nacharbeit kann in
Einzelfällen das Alignment verbessern.
Multiples Sequenzalignment erlaubt Denken in Proteinfamilien und –
funktionen.
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