NMR-Spektroskopie

Erweiterte Lipoproteindiagnostik mittels
Ultrazentrifugation und
NMR-Spektroskopie und
PD DR. MED. DIETMAR PLONNÉ
POTSDAM, 16.06.2016
Verlauf der Atherosklerose
Cholesterinkristalle
Quelle: Image courtesy of Michigan State University, Georg Abela
Das Risiko sinkt mit dem LDL-Cholesterin
FOCUS 17/2009: Quelle: Exp Opin Emerg Drugs 2004; 9(2):269–279
Kardiovaskuläre Mortalität in USA 2000 vs. 1980
Yamamoto S, Kon V, Mechanisms for increased cardiovascular disease in chronic kidney dysfunction
Curr Opin Nephrol Hypertens. 2009 May ; 18(3): 181–188.
Lipidspiegel in Abhängigkeit vom Cystatin C
de Boer IH el al., Lipoprotein Abnormalities Associated with Mild Impairment of Kidney Function in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA).
Clin J Am Soc Nephrol. 2008 Jan; 3(1): 125–132.
Zusammenhang zwischen IMT und LDL-Cholesterin bei CKD
Lamprea-Montealegre JA et al., CKD, Plasma Lipids, and Common Carotid Intima-Media Thickness: Results from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis.
Clin J Am Soc Nephrol. 2012 Nov 7; 7(11): 1777–1785.
Aufbau der Lipoproteine
Lipoproteinstoffwechsel
Atherogenität verschiedener Lipoprotein-Subklassen
Gesamt-Cholesterin
 proatherogen (ApoB)
VLDL-C
VLDL-1

+
IDL-C
VLDL-2






+
 antiatherogen (ApoA1)
LDL-C
+
Typ A
Typ B
(70-90%)
(10-30%)
LDL-1
LDL-2


LDL-3
sdLDL
HDL-C
HDL-2
  
HDL-3



LDL-Cholesterin und LDL-Partikelanzahl
LDL-Chol
=
LDL-Chol
Typ A
Typ B (sdLDL)
(70-90% of population)
(10-30% of population)
Atherogenität
<<<
Atherogenität (3-7fach)
LDL-Anzahl ~ Konzentration
Bedeutung von Anzahl und Größe der LDL-Partikel
6 Odds
2 Odds
KHK
KHK
1 Odds
1 Odds
KHK
KHK
LDL-Größe ~ 1 / Dichte
Vermehrtes Auftreten von sdLDL
TG + HDL + sdLDL = Atherogener Lipoprotein Phänotyp (ALP)
Diabetes mellitus Typ 2 (40-50% der Patienten), Metabolisches Syndrom,
Insulinresistenz, Adipositas, CKD
Hämodialyse, Peritonealdialyse (60% der Patienten)
postprandiale Hypertriglyzeridämie
extrem fettarme, kohlenhydratreiche Diät
Familiäre Kombinierte Hyperlipoproteinämie (FKHL)
HIV-Patienten unter Therapie mit Proteaseinhibitoren
PCO-Syndrom
temporär während der Schwangerschaft
Geschlecht (Männer > Frauen)
Alter (Anstieg bei Frauen in der Postmenopause)
Beeinflussung der LDL-Partikelgröße
genetische Faktoren
35 - 45%
nichtgenetische Faktoren
65 - 75%
• ApoC-III
• Alter
• ApoA-V
• Geschlecht
• LPL (Lipoproteinlipase)
• Medikamente (Fibrate, Statine)
• HL (Hepatische Lipase)
• Hormone (Estrogen, Testosteron)
• CETP (Cholesterolester Transferprotein)
• Ernährung
• PLTP (Phospholipid Transferprotein)
• körperliche Aktivität
• Umgebung des LDL-Rezeptors
Studienlage zur Beeinflussung der
LDL-Größe und/oder LDL-Partikelzahl
die therapeutische Modulation der LDL-Größe war signifikant mit einem
verminderten KHK-Risiko assoziiert
Stanford Coronary Risk Intervention Project
Familial Atherosclerosis Treatment Study (FATS)
Veränderungen der LDL-Größe war das beste Korrelat für Veränderungen
der Koronarstenose
St Thomas’ Atherosclerosis Regression Study (STARS)
sdLDL hatten den stärksten Einfluß auf KHK-Regression bei Hypercholesterinämie
Pravastatin Limitation of Atherosclerosis in the Coronary Arteries (PLAC-I) trial
eine Vergrößerung der LDL-Partikel reduzierte signifikant die Restenosierungsrate bei
Stents (Circ J 2008; 72: 1059–1064)
Zusammenhang zwischen IMT und sdLDL bei CKD
Lamprea-Montealegre JA et al., CKD, Plasma Lipids, and Common Carotid Intima-Media Thickness: Results from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis.
Clin J Am Soc Nephrol. 2012 Nov 7; 7(11): 1777–1785.
Lipidspiegel in Abhängigkeit vom Cystatin C
de Boer IH el al., Lipoprotein Abnormalities Associated with Mild Impairment of Kidney Function in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA).
Clin J Am Soc Nephrol. 2008 Jan; 3(1): 125–132.
Methoden zur Bestimmung von LP-Subfraktionen
Analyse von Lipoprotein-Subfraktionen
DichtegradientUltrazentrifugation
NMR-Spektroskopie
LipoDens
Limbach Gruppe SE
Labor Ulm/Ravensburg
LipoComplete
numares/Regensburg
Dichtegradient-Ultrazentrifugation (LipoDens®)
100.000 rpm
400.000 x g
3 h; 15°C
Dichtegradient
Dichtemedium
Ultrazentrifugation
Gewinnung der LipoDens®-Fraktionen
160 µl
2
3
....... 20
Schlauchpumpe
84 Analysen/Patient
•
•
•
•
TG
Chol
LDL-direkt
HDL-direkt
21 Proben/Patient
160 µl
160 µl
1
160 µl
160 µl
Fraktionssammler
Serum
LipoDens®-Lipoproteinsubklassen
Kompletter Gradient
LDL-2
LDL-1
IDL
VLDL
LDL-3
HDL-2
HDL-3
350
300
mg/dl Fraktion
250
TG
Chol
LDL
HDL
LDL+HDL
200
150
100
50
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fraktionen
LipoDens®-Befundgrafik
NMR-Spektroskopie
http://www.numares-group.com/home.html
N
M
R
nuclear
magnetic
resonance
Spektroscopy
NMR Spektrometer
NMR-Spektrometer
1H-NMR-Spektroskopie
Image from LipoScience, Inc.
Beckoner O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.
Nature Protocols 2, 2692 - 2703 (2007)
LipoComplete -Befund (NMR-Spektroskopie)
LipoComplete -Befund (NMR-Spektroskopie)
Korrelation LipoComplete (NMR) und LipoDens (UZ)
Ultrazentrifugation
LipoDens®
Vorteile
• „Goldstandard“ der Lipoproteinanalytik
• sehr gute Reproduzierbarkeit
• quantitative Messung aller Lipide in allen
Fraktionen
• keinerlei Einschränkungen bezüglich
Probeneigenschaften (Lipämie)
• Lp(a) ist als Extrapeak quantitativ
auswertbar
Nachteile
• begrenzter Probendurchsatz (max. 8
Proben pro UZ-Lauf)
• relativ hoher manueller Arbeitsanteil
• Analysendauer:
4-5 Stunden für 8 Proben
NMR-Spektroskopie
LipoComplete®
Vorteile
• hoch-reproduzierbare Ergebnisse im
Hochdurchsatz
• hoher Automatisierungsgrad
• Partikelanzahl und Partikeldurchmesser
werden gemessen
• Analysendauer:
1 Stunde für 12 Proben
• Durchsatz:
250 Proben/24 h (600 MHz)
100 Proben/24 h (400 MHz)
Nachteile
• Stark lipämische Proben (> 1000 mg/dl) und
atypische Lipoproteine (Dyslipoproteinämie)
sind problematisch
• Lp(a) wird nicht erkannt
Laboranforderung
LipoDens
Ultrazentrifugation
kann immer eingesetzt werden
zwingenderweise dann, wenn LipoproteinSubklassen bei ausgeprägten
Hypertriglyzeridämien und
Dyslipoproteinämien bestimmt werden
sollen
differentialdiagnostische Abklärung einer
Dyslipoproteinämie (z.B. Typ III
Hyperlipoproteinämie nach Fredrickson)
LipoComplete
NMR-Spektroskopie
Fragestellungen, bei denen vordergründig
die Partikeleigenschaften (Partikelanzahl,
Partikelgröße) interessieren (z.B.
Risikostratifizierung, Therapiemonitoring
unter Statin-Therapie).
Rückführbarkeit LipoDens® gegeben,
sofern Triglyzeride < 1000 mg/dl und
normale Zusammensetzung der
Lipoproteine
Indikation für die Bestimmung von Lipoprotein-Subklassen
Erweiterte Risikostratifizierung bei: Diabetes mellitus Typ 2, Metabolischem
Syndrom, Insulinresistenz, PCOS (polyzystisches Ovarsyndrom),
Dialysepatienten, CKD, systemischen Entzündungen
Diagnose eines ALP (Atherogener Lipoprotein Phänotyp) bei erhöhten
Triglyzeriden mit gleichzeitig vermindertem HDL- und unauffälligem LDLCholesterin
Verifizierung der Verdachtsdiagnose auf eine Familiäre Kombinierte
Hyperlipoproteinämie (FKHL)
Weiterführende Abklärung bei Patienten mit erhöhtem familiären Herzinfarktrisiko
und unauffälligem Lipidstatus
Therapiekontrolle, Kontrolle von Diät- und Lifestyle-Maßnahmen
LipoDens®-Beispiel
Werte in mg/dl
Patient A
Patient B
Cholesterin
190
199
Triglyzeride
97
235
LDL-Cholesterin
122
123
HDL-Cholesterin
51
41
LipoDens® nach Therapie mit PCSK9-Inhibitor (Evolocumab)
LDL-direkt
VLDL
250
IDL
LDL-1
LDL-2
LDL-3
HDL-2
HDL-3
LDL-direkt (mg/dl)
200
13_02_2013
150
23_10_2015
23_11_2015
28_01_2016
100
08_04_2016
50
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fraktion
LipoDens® nach Therapie mit PCSK9-Inhibitor (Evolocumab)
HDL-direkt
VLDL
IDL
LDL-1
LDL-2
LDL-3
HDL-2
HDL-3
100
90
HDL-direkt (mg/dlFraktion)
80
70
13_02_2013
60
23_10_2015
50
23_11_2015
40
28_01_2016
30
08_04_2016
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fraktion
LipoComplete® nach Therapie mit PCSK9-Inhibitor
(Evolocumab)
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit
Einfluss von körperlicher Aktivität auf das Cholesterin
in den Lipoprotein-Fraktionen
Lipoprotein-Subfraktionen
120
60
100
50
Cholesterin (mg/dl)
Cholesterin (mg/dl)
Lipoprotein-Fraktionen
80
60
40
20
0
40
30
20
10
0
VLDL
IDL
LDL-total HDL-Total
LDL-1
LDL-2
LDL-3
untrainierte Hypercholesterinämiker
trainierte Hypercholesterinämiker
Halle, M., Metabolism, 46 (1997) 186-191
HDL-2
HDL-3
LipoDens® nach PCSK9-Therapie
Ultrazentrifugation
NMR-Spektroskopie
Beckoner O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic
procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue
extracts. Nature Protocols 2, 2692 - 2703 (2007)
Image from LipoScience, Inc.
Grundlagen der NMR-Spektroskopie
geladenes Teilchen (Atomkerne) mit
Spin
besitzen auch ein
magnetisches Moment
Welche Atomkerne haben einen Spin und sind magnetisch aktiv?
1H-NMR-Spektroskopie
Physikalische Grundlagen
Physikalische Grundlagen
At 600 MHz
N1/N0
= 0,9999013
= 98,7 x 10-6 excess spins
Physikalische Grundlagen
Vergleich LipoDens und NMR
Vergleich LipoDens und NMR
Physikalische Grundlagen
At 600 MHz
Nβ/Nα
= 0,9999013
= 98,7 x 10-6 excess spins
Resonanzbedingung
Resonanzbedingung
E Magnetfeld = E Strahlung
  h/2  B0 = h  
Resonanzfrequenz
 =  / 2  B0
900
21,0
NMR-Befund
NMR-Befund
Einfluss entzündungshemmende Medikamente auf Lipidspiegel
Methotrexat
HDL (LDL) (TG)
Hydroxychloroquine
HDL Chol LDL TG
Glucocorticoide
TG LDL (HDL?)
TNF-alpha Blocker
TG Chol  (LDL?) HDL
Tofacitinib
LDL HDL
Tocilizumab
HDL LDL TG Lp(a)
Rituximab
HDL LDL? TG?
Retinoide
TG LDL
Cyclosporine
(HDL?) Chol LDL? TG?
Dyslipidämie und Atherosklerose bei RA
Quelle: T. E. Toms et al. Dyslipidaemia in Rheumatological Autoimmune Diseases The Open Cardiovascular Medicine Journal, 2011, 5, 64-75
Mediators of endothelial dysfunction in inflammatory diseases
Quelle: C. M. Steyers et al. Endothelial Dysfunction in Chronic Inflammatory Diseases Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 11324-11349
Spektrum elektromagnetischer Wellen
Magnetfeldstärken
Das NMR-Experiment
Continuous-Wave-Verfahren(CW-Verfahren)
Konstante Frequenz (Field-sweep-Method)
E=h
E=hB0
Das NMR-Experiment
Continuous-Wave-Verfahren (CW-Verfahren)
Konstante Feldstärke (Frequence-sweep-Method)
E=hB0
E=h
Impulsspektroskopie (FT-NMR-Spektroskopie)
(FT = Fourier-Transformation)
NMR-Spektrum von Ethanol
Die chemische Verschiebung
Tetramethylsilan (TMS)
Die chemische Verschiebung
Die Resonanzfrequenz relative zur Referenz (TMS) in der ppm Skala wird die
Chemische Verschiebung genannt.