Claudia Schierbaum WS 04/05 Löffler / Petrides: Biochemie
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Proteine Claudia Schierbaum WS 04/05 Löffler / Petrides: Biochemie & Pathobiochemie, 7.Auflage, Springer-Verlag Berlin Kapitel 3.4 und 3.5 Faltung, Fehlfaltung und Denaturierung von Proteinen • Denaturierung und Renaturierung von Proteinen • Denaturierungsfaktoren • Faltungscode/ Faltung von Proteinen • Krankheiten, die durch fehlgefaltete Proteine verursacht werden • Kompensationsmechanismen • Methoden zur Strukturbestimmung von Proteinen Proteine können denaturiert und renaturiert werden • Denaturierung = Zerstörung sämtlicher Strukturebenen mit Ausnahme der Primärstruktur; immer mit einem Funktionsverlust verbunden • Reversible Denaturierung - bei kleinen Proteinen möglich Beispiel: Ribonuclease Entfaltung und somit Denaturierung durch Behandlung mit einem Überschuß an Thiolen in Gegenwart hoher Harnstoffkonzentrationen. Nach Entfernung von Harnstoff und Mercaptoethanol durch Dialyse spontane Renaturierung. Fazit: sämtliche Informationen für die Ausbildung der Raumstruktur von Proteinen sind in der Primärstruktur enthalten Irreversible Denaturierung Meist durch chemische Veränderungen verursacht • Desaminierung von Asparagin und Glutaminseitenketten • Oxidation von Cysteinen und Methioninen • Glycosylierung von Lysinseitenketten • Racemisierung von Aspartaten Denaturierungsfaktoren Maßnahmen, welche die für die Aufrechterhaltung der Raumstruktur benötigten Wechselwirkungen zerstören • Temperatur : Hitzedenaturierung häufiger als Kältedenaturierung • Organische Lösungsmittel, z.B. Alkohol • chaotrope Salze (Harnstoff, Iminoharnstoff): führen in hoher Konzentration zur Solubilisierung des hydrophoben Kerns • pH-Änderungen, z.B. Trichloressigsäure, Perchlorsäure, Uranylessigsäure • Zusatz von Schwermetallsalzen: Denaturierung durch Koagulation Faltung, Faltungscode • Faltungscode ist weitgehend unbekannt Ursache: Keine sichere Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen aus der Aminosäuresequenz möglich 1. Konformationsraum ist extrem groß 2. das globale Minimum der freien Enthalpie der nativen Struktur ist sehr flach und kaum spezifisch • Schematische Darstellung durch das Modell des Faltungstrichers (folding funnel), das die freie Enthalpie im konformationell zugänglichen Raum darstellt. Reduzierung des multidimensionalen Konformationsraumes auf zwei Dimensionen. Faltungsvorgang U I N X Xn • • • • • U = ungefalteter Zustand N = native Struktur Xn = aggregierte und ausgefallene Faltungsintermediate (X) X = Faltungsintermediate, die nicht auf dem Faltungsweg liegen und die Faltung verzögern I = Zwischenzustand oder ganzes Ensemble von verschiedenen konformationellen Zuständen. Geschmolzener Tropfen (molten gobule): einige Sekundärstrukturelemente vorhanden, der hydrophobe Kern ist noch hydratisiert Levinthalsches Paradox • Der Konformationsraum von Proteinen ist viel zu groß, um in endlicher Zeit mit großer Wahrscheinlichkeit die native Struktur zu finden • Es besteht keine Notwendigkeit, während der Faltung alle möglichen Konformationen anzunehmen Krankheiten • Alzheimersche Krankheit • Creutzfeld-Jakobsche-Krankheit • BSE (bovine spongioform encephalopathy) Ursache: fehlgefaltete Proteine, die sich zu amyloidartigen Fibrillen zusammenlegen. Beobachtung: Übergang vom α-helicalen Zustand zur β-Faltblattstruktur. Kompensationsmechanismen • Spezialisierte proteolytische Systeme, z.B. Proteasomen und Lysosomen • Ausfällung: Bildung großer,stabiler Aggregate oder Polymere, die ab einer gewissen Größe ausfallen • Spezifische Enzyme, z.B. Peptidy-Propyl-Isomerase, ProteindisulfidIsomerasen Beschleunigung faltungsverzögernder Vorgänge • Chaperone: Gruppe von Proteinen ohne spezifische katalytische Funktion Bindung von Faltungintermediaten I oder fehlgefalteten Proteinen X Verhinderung der Aggregation Beschleunigung der richtigen Faltung durch Destabilisierung der Zwischenzustände Methoden zur Strukturbestimmung von Proteinen Dreidimensionale Struktur von Proteinen ist nicht aus der Aminosäuresequenz ableitbar Daher: Experimentelle Bestimmung der dreidimensionalen Struktur 1. Röntgenstrukturanalyse/ Röntgenkristallographie 2. NMR-Spektroskopie Röntgenstrukturanalyse / Röntgenkristallographie • Wichtigste Methode zur Untersuchung der räumlichen Struktur von Proteinen • Voraussetzung: das zu untersuchende Protein muss als Einkristall vorliegen • Limitierung: manche Proteine sind schwer bzw. überhaupt nicht zu kristallisieren Röntgenstrukturanalyse Vorgehensweise: • Gewinnung eines Kristalls, zunehmend mit Hilfe von Kristallisationsrobotern • Isolierung des Proteinkristalls • Bestrahlung mit monochromatischen Röntgenstrahlen • Röntgendetektoren liefern Diffraktionsbilder • Ermittlung der Phasen der elektromagnetischen Strahlung durch isomorphe Ersetzung, d.h. Schwermetallderivate der Proteine werden zusätzlich zum nativen Protein kristallisiert und analysiert • Strukturberechnung NMR-Spektroskopie • Relativ neue Methode • Bestimmung der Konformation gelöster Proteine • Vorteil: Analyse unter quasiphysiologischen Bedingungen ohne Kristallisation • Vorgehensweise: Strukturberechnung anhand der strukturabhängigen Wechselwirkungen zwischen den magnetischen Momenten der Kernspins der im Protein enthaltenen Atomkerne • Limitierung: nur für Moleküle bis zu einer Molekülmasse von etwa 100 kDa geeignet
