Ras: biologische Bedeutung und Methoden zur Mutationsbestimmung
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K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) Biologische Bedeutung Mutationsbestimmung durch Sequenzierung Ras ( rat sarcoma ) Gen Familie K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) Genomische Organisation der ras Proto – Onkogene: H-ras-1 H-ras-2 K-ras-1P 11p15.5 X (pter-28) 6p12 K-ras-2 12p12.1 N-ras 1p22 Kodieren für homologe 21 kDa Proteine (p21 Ras) p21 Ras bindet entweder GDP (inaktive Form) oder GTP (aktive Form) K-Ras und EGFR pathway p21 Ras spielen eine wichtige Rolle im EGFR Signalweg kontrollieren das Zellwachstum und die Differenzierung durch Enzym (GTPase) inaktiviert Monoklonale Antikörper blockieren gezielt den epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) K-Ras Wildtyp (= normal) K-Ras Mutationen: Nukleotidbindungsstellen (GTP bleibt gebunden) X Braf Signal wird autonom weitergeleitet Methoden zur K-Ras Mutationsbestimmung Übersicht Sensitivitätserhöhung durch Makrodissektion Kennzeichnung des Tumor-Areals auf HE durch PathologIn 4 – 6 x 5 µm Schnitte (Biopsien > 6) Mutationsbestimmung durch Sequenzierung nach Sanger 1. Schritt: PCR 3% Agarosegel Mutationsbestimmung durch Sequenzierung nach Sanger 2. Schritt: Sequenzierreaktion Elektrokinetische Injektion + - gefüllt mit Polymer neg. geladene DNA-Fragmente Hardware: ABI Prism 3130 Auswertesoftware: SeqScape v.2.5 Mutationsbestimmung durch Sequenzierung nach Sanger 3. Schritt: Kapillarelektrophorese (ABI 3130) Polymerpumpe Anode Polymer Puffer Detektionsfenster mit Laser Kapillaren gefüllt mit Polymer Puffer Kathode Probe Chromatogramm: Punktmutation im Codon 12 Hot spot Region: GGT GGC forward revers Codon 12: GGT>GAT Gly > Asp Ausgangsmaterial: Biopsie GGT>TGT (mit TheraScreen Kit bestätigt) WH K-ras: Insertion von 3 Basen WT Normalsequenz mutierte Sequenz Insert A K-ras Mutation: Substitution Codon 14 Basenaustausch 1 Base nach hot-spot Region (Codon 14) (Hot-spot: GGT GGC Codon 12 und 13) Bettina Pichlhöfer Biomedizinische Analytikerin AKH Wien, Klinisches Institut für Pathologie Email: [email protected] B-raf Mutation Hot spot Braf Ex 15: GTG>GAT p.600V>E K-ras Mutation: Substitution im Codon 14 - Proteinebene 12 13 14 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/ )
