er er g .B W k, eti en Kl as sis ch eG Zystische Fibrose (Mukoviszidose) Ratjen & Döring (2003), Lancet, 361:681-689 [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 1 er en eti k, W .B er g Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) eG Zystische Fibrose (Mukoviszidose) Gentest: ch Screening auf die 36 häufigsten Mutationen (PCR & Hybridisierung) sis ca. 90-95% der Mutationen sind damit nachweisbar (starke Schwankungen in verschiedenen Populationen) Kl as wenn negativ: direkte Sequenzierung des gesamten Gens (bis zu 3´000,CHF) [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 2 er er g Zyklus 4 DNA zu amplifizieren Schema der PCR Zyklus 3 usw. Zyklus 1 23 = 8 Kopien 16 Kopien 32 Kopien 236 = 68 Milliarden Kopien en eti k, 22 = 4 Kopien Zyklus 35 W DNA .B Zyklus 2 eG Muskeldystrophie Typ Duchenne Häufigkeit: 1:3000 bis 1:6000 ch Genetik: - X-chromosomal rezessiv sis - Dystrophin-Gen: 2400 kb, 85 Exons, 3685 Aminosäuren - Deletionen bei 2/3 der Betroffenen Kl as - In-Frame Mutationen: Muskeldystrophie Typ Becker [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 3 er er g Hämophilie A (Faktor VIII-Defizienz) Häufigkeit: .B 1 : 10 000 Klinik: W - Blutungen der Schleimhäute und innere Blutungen en eti k, - in 25% der Fälle mildere klinische Formen (bis zu 20% Faktor VIII Aktivität) eG Hämophilie A (Faktor VIII-Defizienz) Kl as sis ch Inversion of exons 1-22 of the factor VIII gene [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 4 er er g .B W k, eti en eG Fragiles X Syndrom Häufigkeit: 1 : 4000 (Männer) – 1 : 6000 (Frauen) ch Klinik: sis - Entwicklungsverzögerungen (Lernschwierigkeiten bis hin zur schweren geistigen Behinderung) - Krampfanfälle bei etwa 25% der betroffenen Kl as - Makroorchidie, auffallendes Gesicht - Verhaltensauffälligkeiten (autistoides Verhalten, ADHS: Aufmerksamkeitsdefizit/Hyperaktivitätssyndrom) [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 5 er W .B er g CGG expansion in FMR1 n = 6-52 premutation: n = 48-200 full mutation: n = 200 bis >1000 k, normal allele: Kl as sis ch eG en eti test: PCR, Southern-Blot [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 6 er er g Myotone Dystrophie (Curschmann-Steinert) Häufigkeit: .B 1 : 10´000 Klinik: W - häufigste autosomal-dominante neuromuskuläre Erkrankung - progredienter Verlauf k, - erste Symptome im jungen Erwachsenenalter, aber auch kongenitale Formen en eti - Begleitsymptome: Katarakt, geistige Behinderung eG Myotone Dystrophie (Curschmann-Steinert) Genetik: - autosomal dominanter Vererbungsmodus ch - DMPK-Gen, Chromosom 19q13.3 Kl as sis - Triplett-Expansion im 3´-UTR des DMPK-Gens [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 7 er en eti k, W .B er g Stammbaum einer Familie mit myotoner Dystrophie (Curschmann/Steinert) eG Chorea Huntington (Veitstanz) Häufigkeit: ~ 1 : 30´000 ch Klinik: - Erkrankungsmanifestation im 35.-45. Lebensjahr sis - Bewegungsstörungen - Wesensänderung (psychiatrische Auffälligkeiten) Kl as - kognitive Leistungseinbussen [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 8 Genetik: er .B - autosomal dominanter Vererbungsmodus er g Chorea Huntington (Veitstanz) - IT15-Gen (Huntingtin), Chromosom 4p16.3 - Triplett-Expansion (CAG) im translatierten Bereich W -> Polyglutaminerkrankung en eti k, - Antizipation (früheres Erkrankungsalter und Zunahme des Schweregrades in nachfolgenden Generationen) eG Chorea Huntington (Veitstanz) Gentest: - genetisches Beratungsgespräch ch - Problematik der präsymptomatischen/pränatalen molekulargenetischen Testung Kl as sis - Richtlinien zur Durchführung einer molekulargenetischen Diagnostik [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 9 er en eti k, W .B er g Chorea Huntington (Veitstanz) eG Genetische Ursachen der Retinopathia pigmentosa ~ 40 Gene identifiziert • Phototransduktion ch Rhodopsin AD Phosphodiesterase, AR und -UE AR CNCG1 & 2 3q21-24 5q31.2 4p16.3 4p12-cen 6q13-21 sis • Photorezeptor-Strukturproteine Peripherin AD 6p21.1 Kl as AR AR AR CRX NRL AD AD 19q13.3 14q11.1-12.1 • Spleißfaktoren PRPC8 PRP31 HPRP3 AD AD AD 17p13.3 19q13.4 1q21.1 • Unbekannte Funktion • Retinol-Metabolismus ABCR RLBP1 RPE65 • Transkriptionsfaktoren 1p21-13 15q26 1p31 CRB1 RP2 RPGR AR X X 1q31-32.1 Xp11.4-11.23 Xp21.1 [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 10 er er g Relevanz für die Diagnostik: W .B Heterogenität erschwert die molekulare Diagnostik (Nachweis von mehreren Hundert DNAVarianten in zahlreichen Genen) en eti k, -> erfordert neue, hocheffiziente Technologien Kl as sis ch eG Mutationserkennung mittels DNA-Sequenzierung: [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 11 er .B er g Gendiagnostik bei einem Patienten mit Netzhautablösung CTG CGG CTG CGA TGC TCA GGG Protein: LEU ARG LEU ARG CYS SER GLY Patienten-DNA CTG CGG CTG CGA AGC TCA GGG Protein: LEU ARG LEU ARG SER SER GLY en eti k, W Kontroll-DNA eG Mutationsanalyse mit Gen-Chips DNA Mikroraster (Genchip) Kl as sis ch enthält > 1000 Genvarianten in Form von kurzen, synthetischen Genabschnitten Kontrolle Patient CTG CGG CTG CGA TGC TCA GGG CTG CGG CTG CGA AGC TCA GGG [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 12 er k, W .B er g Digenic retinitis pigmentosa (RP) en eti ROM1: rod outer membrane protein 1 RDS: retinal degeneration slow / peripherin eG Triallelic inheritance in Bardet-Biedl syndrome (BBS) Kl as sis ch obesity, retinopathy, polydactyly, renal malformations, mental retardation, hypogenitalism [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 13 er er g .B W k, eti en eG 1. Entwicklung neuer Hochdurchsatzverfahren in der Gendiagnostik 2. Zunahme der Diagnostik bei Prädispositionen sis ch 3. Aufklärung der Ursachen multifaktorieller Erkrankungen (Herz-Kreislauf, Allergien, Diabetes, Asthma, Krebs, altersbedingte Erkrankungen) Kl as 4. Verstärkte funktionelle Analyse von Genen und Genvarianten 5. Aufklärung von Krankheitsmechanismen als Grundlage für die Therapie [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 14 er (biochemischer Defekt unbekannt!!!) .B 1. Kartierung im Genom er g Identifizierung krankheitsassoziierter Mutationen W - grosse Familienstammbäume - umfangreiche Patientenkollektive - strukturelle Chromosomenveränderungen 2. Identifizierung der Mutation(en) en eti k, - Auswahl von Kandidatengenen - Suche nach Mutationen - Untersuchung der Genfunktion (Biochemie, Zellbiologie, Tiermodelle) ch > 2000 kbp control Genetic Map Mutation-Analysis control Xp eG Identification of disease-causing mutations patients patients 1 2 3 4 5 6 sis cen Southern-Blot-Analysis Deletions Xq Kl as SSCP Gene Map Physical Map Human X chromosome (160 Mbp, 2000-3000 genes) 50-500 kbp 1-200 kbp DNA-Sequencing [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 15 er er g Retrieval of gene information from databases eti k, W .B search term: rhodopsin en http://genome.ucsc.edu/ eG Cytogenetic Diseases Duplications / Deletions (dup/del) Threshold cycle (CT) Allele 1 Allele 2 Chromosome 17p11.2-12 Normalized fluorescence ch Normalized fluorescence Kl as sis 22 22 Duplication of PMP22 Gene Normalized fluorescence Deletion of PMP22 Gene Normal Genome 22 23 Threshold cycle (CT) Allele 1 Allele 2 Chromosome 17p11.2-12 HNPP 21.5 22 Threshold cycle (CT) Allele 1 Allele 2 Chromosome 17p11.2-12 CMT PMP22 Reference Gene [email protected] www.medmolgen.uzh.ch 16