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pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-protonierte
Form verschiedenfarbig sind. Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pKa über ein Intervall von
1 - 2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration am pH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines
geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel des Indikators erkannt werden.
ELEKTROPHORESE
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen
Feld. Je nachdem ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur
Kathode (negativer Pol) oder zur Anode (positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung äussern
sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit und können so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zur Trennung von
Aminosäuren, Peptiden und Proteinen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen
je nach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder
zur Anode. Wenn der pH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung.
Die gebräuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine
kleine Menge des zu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getränkten
Träger aufgetragen. Übliche Trägermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den
Elektrophorese-Träger wird eine Gleichspannung angelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen
wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur räumlichen Auftrennung der Komponenten, die durch
geeignete Anfärbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können.
Fig. 5
Elektropherogramm von Serum eines Menschen. a) angefärbter Elektrophoresestreifen, b)
die bei der photometrischen Auswertung der Farbbänder entstandene Extinktionskurve; die
Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten, die durch Integration der Flächen
unter den einzelnen Gipfeln der Extinktionskurve ermittelt werden.
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Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel
Moleküle aufgrund ihrer Ladung und ihrer Grösse aufgetrennt werden. Während auf Agarose die
Serumproteine nur in die grösseren Gruppen Albumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline
aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Dutzende verschiedener Serumproteine zu unterscheiden. Ausschliesslich nach der Grösse aufgetrennt werden Proteine in der SDSGelelektrophorese (vgl. S. 14).
Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit qeladener Teilchen
im elektrischen Feld. Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die
Kraft Q@E, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q@E/f (1) beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoeffizient f = 6 πηr (r = Stokes'scher Radius, η = Viskosität des
Mediums). Gleichung (1) zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit proportional zum
Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, Volt/cm)
und proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und
Proteinen vom pH-Wert abhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Grösse der
Teilchen und von der Viskosität des Mediums.
Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R@I2 (R =
elektrischer Widerstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis
einige 100 V/cm und Stromstärken von gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem
Kühlsystem abgeführt.
CHROMATOGRAPHIE
Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden
Substanzen je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer
mobilen Phase ungleich verteilen. Die verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden
in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-, Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) und Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu trennenden
Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nichtkovalente Bindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen
Phasen. In der Gelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit
der verschiedenen Phasen für unterschiedlich grosse Moleküle. Während der chromatographischen
Trennung werden die stationäre und die mobile Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene
Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind je nach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle.