Der Peptidtransporter TAP

Der Peptidtransporter TAP
Versuch 1A
Domänenorganisation von ABC-Transportern
Strukturelle Organisation des TAP-Komplexes
Antigenpräsentation über MHC-Klasse I
Peptidspezifität des humanen TAP-Komplexes
Modell für den Peptidtranslokationszyklus von
TAP
?
?
Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen und
Baculoviren
S.frugiperda
- Sf9 Zellen wurden aus Ovarien der Larven von
S.frugiperda etabliert
- Sf9 Zellen wachsen sowohl adhärent als auch in
Suspension und sind leicht zu kultivieren
Sf9
Zellen vor
Infektion
Sf9
Zellen
nach
Infektion
- Sf9 Zellen werden mit Baculoviren infiziert
(infizieren ausschließlich Invertebraten, sind also
für Menschen und Tiere ungefährlich)
- Das Baculovirusgenom enthält einen sehr
starken Promotor (der Polyhedrin-Promotor ist der
stärkste unter allen bekannten Promotoren)
- die Gene für TAP befinden sich hinter dem
Polyhedrin-Promotor, der kurz nach der Infektion
angeschaltet wird
Übexpression des Proteins
innerhalb von 24h
Membranpräparation aus Sf9-Zellen
Membranpräparation:
- 48 h nach Baculovirus-Infektion
werden Sf9-Zellen geerntet
- Zellen werden mit einem
Dounce-Homogenisator
aufgeschlossen (Kombination von
Druck und Scherkräften)
Dounce-Homogenisator
- nicht aufgeschlossene Zellen,
Zellkerne und Zelltrümmer werden
durch eine Zentrifugation bei
niedriger g-Zahl pelletiert
- im postnukleären Überstand
befinden sich die Membranen,
welche mittels Ultrazentrifugation
pelletiert werden
Proteinkonzentrationsbestimmung mittels
BCA-Test
- Protein und Cu2+ in alkalischer Lösung
führen zur Bildung von Cu1+
- BCA (Bicinchoninsäure): spezifisches
Nachweisreagenz für Cu1+
- 2 BCA-Moleküle + 1 Cu1+-Ion
wasserlösliches, violettes Reaktionsprodukt mit einem Absorptionsmaximum
bei 562 nm
Peptid-Bindungsassay mittels Fluoresceinmarkiertem Peptid
•
TAP bindet Peptide ATP unabhängig
•
Peptide : Fluoreszenz Peptid (RRYC(F)KSTEL)
Kompetitor Peptid (RRYQKSTEL)
•
Da Peptide positiv geladen sind, können sie unspezifisch an die Membran
(negativ) binden; unspezifische Bindung (Hintergrund) wird über die
Kompetition mit nicht markiertem Peptid bestimmt
•
Gearbeitet wird auf Eis, da off-Kinetik bei 4°C langsamer (Peptid kann
wegdiffundieren)
•
Ein TAP-Heterodimer bindet ein Peptid
über die Konzentration an
gebundenem Peptid kann die TAP-Konzentration bestimmt werden
Der Peptidtransporter TAP- Übersicht
1A: Membranpräparation
Proteinbestimmung: BCA Assay
Peptidbindung
1B: Markierung von Peptiden mit Iodoacetamidofluorescein
1C: Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP
1D: Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP
1E: Peptidtransportassay