Sonikation in der Diagnostik periprothetischer Infektionen

Leitthema
Orthopäde
DOI 10.1007/s00132-015-3192-y
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015
N. Renz · S. Cabric · V. Janz · A. Trampuz
Zentrum für Septische Chirurgie, Center für Muskuloskeletale Chirurgie,
Charité – Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Deutschland
Sonikation in der Diagnostik
periprothetischer Infektionen
Stellenwert und praktische Umsetzung
Der Therapieerfolg bei einer periprothetischen Infektion ist maßgeblich
vom Nachweis aller verursachenden
Erreger abhängig. Mikroorganismen
bilden auf Implantaten Biofilme, eine
komplexe Struktur aus Bakterien und
amorpher Matrix, in welche sie eingebettet sind. Mit konventionellen mikrobiologischen Methoden, zu welchen die Kultur der Gelenkflüssigkeit und des periprothetischen Gewebes zählen, können Biofilme nicht immer nachgewiesen werden. Deswegen wurden auf Implantaten physikalische Methoden angewendet, um
mittels akustischer Energie im Ultraschallbereich (Sonikation) mikrobielle Biofilme von der Oberfläche effizient abzulösen.
Das Konzept des Biofilmes
Biofilme bestehen aus einer amorphen
Matrix polymerisierter Polysaccharide,
in welcher Mikroorganismen eingebettet sind und auf der Implantatoberfläche
adhärieren [1, 2]. Diese befinden sich in
einem stark verminderten metabolischen
Stadium und teilen sich deutlich langsamer [3]. Aus diesem Grund sind konventionelle Kulturen der Gelenkflüssigkeit
oder des periprothetischen Gewebes oft
falsch negativ [4, 5]. Biofilme entwickeln
sich über Wochen bis Jahre zu komplexen mehrschichtigen Gebilden, die über
rudimentäre Strukturen zur Ernährung
des Biofilmes (Wasserkanäle) und für die
Kommunikation zwischen den Bakterien
durch extrazelluläre Botenstoffe verfügen.
Frei lebende (planktonische) Bakterien
werden von Antibiotika, Antikörpern und
Phagozyten eliminiert, während adhärente Bakterien im Biofilm auf der Oberfläche überleben (. Abb. 1; [6]).
Zu den typischen Erregern von periprothetischen Infektionen gehören koagulasenegative Staphylokokken (ca.
30 %), Staphylococcus aureus (ca. 20 %),
Streptokokken und Enterokokken (ca.
10 %), gramnegative Stäbchen (ca. 10 %)
und Anaerobier (ca. 10 %), darunter insbesondere Propionibacterium acnes und
Finegoldia magna. In weiteren ca. 10 %
liegt eine Mischinfektion mit mehreren
Bakterien vor und bei 10–30 % kann kein
Erreger gefunden werden [7]. Pilze (Candida) kommen in 1–5 % der periprothetischen Infektionen vor, häufiger bei mehrfach operierten Patienten, ungenügender
chirurgischer Sanierung und bei Anwendung einer Vakuumversiegelung [8].
Mikrobiologische Methoden
zum Nachweis von
Implantatinfektionen
Die präoperative Gelenkpunktion mit
Kultur der Synovialflüssigkeit und die intraoperativen Kulturen von periprothetischen Gewebeproben haben eine Sensitivität von 60–80 % (. Tab. 1; [9]). Insbe-
sondere bei chronischen („low-grade“)
Infektionen oder bei Patienten mit vorangegangener Antibiotikatherapie sind diese Kulturen jedoch oft falsch negativ [5].
Durch bildgebende Verfahren konnten
Biofilme trotz negativer Kulturen auf der
Oberfläche von Implantaten nachgewiesen werden. Dies führte zu verschiedenen
Versuchen, Biofilme von der Oberfläche
abzulösen, z. B. durch Abkratzen („scraping“), Abstreichen („swabing“), rigoroses Mischen des Implantates in Flüssigkeit („vortexing“) [10], Anwendung von
Detergenzien, Antikoagulanzien oder
Enzymen („disolving“) [11] oder Beschallung mit niederfrequentem Ultraschall
(„sonication“) [12, 13]. Von diesen Methoden zeigte die Sonikation die effizienteste Ablösung von > 99,9 % der Biofilmbakterien von der Oberfläche des Implantates (. Abb. 2; [7, 14, 15]).
Wirkprinzip der Sonikation
Als Ultraschall bezeichnet man Schall mit
Frequenzen oberhalb des Hörfrequenzbereichs des Menschen (> 16 kHz). In nichtelastischen Medien (Flüssigkeiten) breitet
sich Ultraschall dämpfungsarm aus und
bildet bei hohen Schalldrücken Dampf-
Abb. 1 9 Biofilm auf
Prothesenoberfläche.
Frei lebende (planktonische) Mikroorganismen werden durch
Antibiotika und Antikörper abgetötet, während Bakterien im Biofilm persistieren
Der Orthopäde
1
Leitthema
Abb. 2 9 Rasterelektronenmikroskopie eines Staphylococcus-aureus-Biofilms auf Metallimplantat
vor der Sonikation (a) und
nach Anwendung der Sonikation (b). Vergrößerung,
100fach; Sonikation entfernt > 99,9 % der BiofilmBakterien
Abb. 3 9 Wachstum
von Staphylococcus
epidermidis aus einer
Gewebebiopsie (links)
und der Sonikationsflüssigkeit (rechts). In
der Sonikationsflüssigkeit werden bis zu
10.000-mal mehr Mikroorganismen als
aus dem periprothetischem Gewebe nachgewiesen.
blasen (Kavitation), die bei ihrem Kollaps auf der Oberfläche des Implantates
extrem hohe Drücke und Temperaturen
hervorrufen können, welche wie ein Bürste auf der Oberfläche wirken. Die oszillierende Kavitation wird z. B. zur Reinigung
von chirurgischen Instrumenten, Brillen
und Schmuck genutzt und ist auch aktueller Forschungsgegenstand in der mikrobiologischen Diagnostik [16, 17].
Zur schonenden Ablösung des Biofilms wird das Implantat in einer Flüssigkeit mit niederfrequentem (40 kHz) und
akustisch energiearmem (0,2–1 W/cm2)
Ultraschall beschallt. Dabei wird der Biofilm von der Implantatoberfläche durch
wirkende Mikroströmungen, Scherkräfte
und Kavitationsblasen abgelöst. Die Kavitationsereignisse sind energiearm, damit es zu keiner signifikanten Zerstörung
von Mikroorganismen kommt. Vor allem
gramnegative Bakterien und Anaerobier
sind auf Ultraschalleffekte empfindlich.
Mit der Sonikation werden bis 10.000-mal
mehr Bakterien als im periprothetischen
Gewebe nachgewiesen (. Abb. 3).
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Der Orthopäde
Klinische Anwendung
der Sonikation
Mittels der Sonikation konnte die Sensitivität gegenüber Gewebeproben signifikant verbessert werden (79 versus 61 %,
p < 0,001) bei einer Spezifität von 99 %.
Die Sensitivität ist insbesondere bei Patienten mit vorangehender Antibiotikatherapie verbessert, weil die im Biofilm
geschützten Bakterien trotz Antibiotika
überleben und diese in der Sonikationsflüssigkeit nachgewiesen werden können.
Die Einführung der Sonikation führte zu
einer häufigeren Detektion von Low-grade-Infekten bei vielen lockerungsbedingten, vermeintlich aseptischen Prothesenwechseln. Eine kombinierte Interpretation der Sonikationsbefunde mit der histologisch klassifizierten periprothetischen
Membran ergibt eine weitere Steigerung
der diagnostischen Validität [18].
Von molekularen Methoden erhofft
man sich eine verbesserte Diagnostik in
der Sonikationsflüssigkeit, insbesondere bei Patienten, welche vor der Probenentnahme Antibiotika erhalten haben. In
einer Studie mit 37 Patienten konnte mit
einer Multiplex-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) die Sensitivität für den Er-
regernachweis unter Antibiotikatherapie von 59 % auf 100 % verbessert werden
(p < 0,01) [19]. In einer weiteren Studie
wurden 86 Patienten mit einer Protheseninfektion (n = 24) und aseptischem Prothesenversagen (n = 62) untersucht [6].
Die Multiplex-PCR konnte die Sensitivität, verglichen zur Kultur, deutlich erhöhen (96 % versus 71 % bzw. 67 %), bei einer
Spezifität von 100 %. Derzeit werden mehrere neue Molekulartests untersucht, welche die Sensitivität und Spezifität des Erregernachweises aus der Sonikationsflüssigkeit weiter verbessen sollten.
Mikrobiologische
Verarbeitung des Implantates
mittels Sonikation
Nach der Sonikation wird die Sonikationsflüssigkeit mikrobiologisch untersucht. Abgelöste Biofilme werden in der
Sonikationsflüssigkeit qualitativ und
quantitativ mit hoher Sensitivität und
Spezifität nachgewiesen, sowohl in Kultur wie auch mit kulturunabhängigen Methoden (z. B. Molekularmethoden). Dazu gehören die Gram-Färbung und Mikroskopie (Sensitivität ca. 50 %), aerobe und anaerobe Kulturen (Sensitivität
80–90 %) und die nichtkulturelle Analytik [14]. Außerdem können Mischinfektionen bis zu 30 % und unterschiedliche
phänotypische Bakterienvarianten (Morphotypen) nachgewiesen werden, welche
in konventionellen Gewebeproben nicht
nachgewiesen wurden. Durch Inokulation
von Blutkulturflaschen kann die Sensitivität der Sonikationskultur weiter verbessert und beschleunigt werden [3].
Nach Zusatz von Ringer-Lösung oder
physiologischer Kochsalzlösung (Implantat zu ca. 90 % bedeckt) wird das Implantat kräftig geschüttelt (30 s) und für 1 min
Zusammenfassung · Abstract
dem Ultraschall ausgesetzt (40 kHz, 0,1–
1 W/cm2). Die entstehende Sonikationsflüssigkeit (das Sonikat) wird mikrobiologisch verarbeitet und die Bakterienmenge
quantitativ angegeben (Anzahl von koloniebildenden Einheiten pro Milliliter des
Sonikates) [3]. Außerdem kann die Sonikationsflüssigkeit für weitere kulturunabhängige Untersuchungen eingesetzt werden. Mit einer PCR oder anderen Molekulartechniken (z. B. DNA-Sequenzierung)
kann die Diagnostik zukünftig weiter verbessert werden [14, 19, 20].
Das Sonikat wird aerob (5–7 Tage)
und anaerob (10–14 Tage) und in Flüssigmedium inkubiert. Die Kulturen werden täglich hinsichtlich des Wachstums
kontrolliert. Der Nachweis von ≥ 50 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml ist ein
starker Indikator für eine implantatassoziierte Infektion, da nur mehrschichtige
Biofilme zu dieser hohen Bakteriendichte führen können [16]. Bei Zahlen unter
50 KBE/ml muss die Relevanz in Abhängigkeit von der klinischen Situation bestimmt werden und ist in der Regel nur
bei Patienten unter Antibiotikatherapie
oder bei Nachweis von anaeroben Bakterien relevant [14].
Praktische Umsetzung
der Sonikation
Alle orthopädischen Implantate aus primär sterilen Orten (Gelenkprothesen,
Schrauben, Platten, Nägel, andere Osteosynthesematerialien) können mit der Sonikationsmethode untersucht werden.
Implantate aus primär nichtsterilen Gebieten (z. B. VAC-Schwämme) können
mit der Sonikationsmethode zwar untersucht werden, für die Interpretation gelten jedoch die angegebenen Grenzwerte
von Mikroorganismen nicht.
Für die Sonikation sind wasserdichte
Plastikbehälter verschiedener Volumina
anzuwenden. Die Behälter werden autoklaviert (max. 121 °C für 15 min) oder mit
Ethylenoxid oder Plasmaverfahren sterilisiert und in der Nähe des Operationssaales gelagert. Implantate sind in der Regel
innerhalb von 24 h nach Entfernung zu
verarbeiten. Ist dies nicht möglich, werden die Implantate in Ringer-Lösung oder
0,9 % NaCl-Lösung bis zur weiteren Verarbeitung bei Raumtemperatur gelagert.
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© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015
N. Renz · S. Cabric · V. Janz · A. Trampuz
Sonikation in der Diagnostik periprothetischer
Infektionen. Stellenwert und praktische Umsetzung
Zusammenfassung
Der endoprothetische Ersatz gehört zu den
häufigsten und erfolgreichsten Operationen
der heutigen Medizin. Mit zunehmendem
Einsatz von Gelenkprothesen steigt auch die
Anzahl von periprothetischen Infektionen.
Der Nachweis von verursachenden Erregern
und deren antimikrobielle Empfindlichkeit
sind für eine erfolgreiche Antibiotikatherapie
entscheidend. Für eine zuverlässige Diagnose müssen neben konventionellen mikrobiologischen Methoden (Kultur der Gelenkflüssigkeit und der intraoperativen periprothetischen Gewebeproben) zusätzliche Methoden zum Nachweis von Biofilmen eingesetzt
werden. Mit der Sonikation der entfernten
Implantatkomponenten werden Mikroorganismen von der Implantatoberfläche abgelöst und anschließend in der Sonikationsflüssigkeit qualitativ und quantitativ nachgewie-
sen. Die Sonikation ist besonders hilfreich bei
chronischen Low-grade-Infektionen, bei welchen eine geringe Anzahl an Bakterien vorhanden sind und der Biofilm stärker an der
Prothesenoberfläche haftet. Die Sonikationsflüssigkeit eignet sich für aerobe und anaerobe Kulturen, sowie für neuere, kulturunabhängige Nachweismethoden (z. B. Molekularmethoden, Massenspektrometrie, Mikrokalorimetrie). Im Beitrag werden der Stellenwert,
die Vor- und Nachteile, sowie die praktische
Umsetzung der Sonikation von Implantaten
vorgestellt und kritisch diskutiert.
Schlüsselwörter
Periprothetische Infektion · Bakterien ·
Biofilm · Diagnostik · Gelenkprothesen ·
Mikrobiologische Techniken
Sonication in the diagnosis of periprosthetic infections.
Significance and practical implementation
Abstract
Endoprosthetic joint replacement is one of
the most common and most successful operations in current medicine. With the increase
in joint prosthesis implantations, the number
of periprosthetic infections is also rising. Detection of the causative pathogen and its antimicrobial susceptibility is crucial for successful antibiotic therapy. For a reliable diagnosis, in addition to conventional microbiological methods (synovial fluid culture and intraoperative periprosthetic tissue samples), other methods of detecting biofilms are used.
With sonication of the removed implant components, microorganisms are released from
the implant surface and then detected qualitatively and quantitatively in the sonication fluid. The sonication is particularly useful
Bei Entfernung einer zementierten Prothese, bei welcher der Zement Antibiotika enthält, sollen – soweit möglich – nur
die zementfreien Prothesenteile versendet und der Zementspacer separat transportiert werden. Durch Sonikation können noch wirksame Antibiotika aus dem
Zement freigesetzt werden und das Keimwachstum verhindern [8].
Das Implantat wird im Operationssaal
in einen sterilen Behälter gelegt und in-
for chronic, “low-grade” infections in which a
small number of bacteria are present and the
biofilm adheres more strongly to the prosthesis surface. The sonication fluid is suitable for
aerobic and anaerobic cultures, in addition to
newer, culture-independent detection methods (e.g., molecular methods, mass spectrometry, microcalorimetry). In the article the
significance, advantages and disadvantages,
and the practical implementation of the sonication of implants are presented and critically discussed.
Keywords
Periprosthetic joint infections · Bacteria ·
Biofilm · Diagnosis · Joint prosthesis ·
Microbiologic technics
nerhalb von 24 h in das Mikrobiologielabor transportiert. Plastiksäcke sind für
den Transport und die Sonikation von explantierten Prothesen nicht geeignet, da es
durch undichte Stellen der Säcke oft zur
Kontamination der Sonikationsflüssigkeit
mit Keimen aus dem Wasserbad kommt
[21]. Falls Implantate nicht in validierten Transportgefäßen ankommen, müssen diese mit sterilen Instrumenten unter
laminarem Luftfluss in passende Behälter
Der Orthopäde
3
Leitthema
Tab. 1 Sensitivität und Spezifität bei Untersuchungen für die Diagnose von periprothetischen
Infektionen
Untersuchung
Fistel
Akute Entzündung im periprothetischen Gewebea
Leukozytenzahl und Differenzierung in der Synovialflüssigkeitb
≥ 2 × 109/l Leukozyten oder ≥ 70 % Granulozyten
Sichtbarer Pus
Positive Kultur
- Synovialflüssigkeit
- Periprothetisches Gewebe
- Sonikationsflüssigkeit (≥ 50 KBE/ml)
Sensitivität (%)
20–30
95–98
Spezifität (%)
~ 100
98–99
93–96
20–30
97–98
~ 100
60–80
70–85
85–95
97
92
95
KBE koloniebildende Einheit.
aDefiniert als ≥ 1 bis ≥ 10 Neutrophile/High-power-Gesichtsfeld.
bPatienten in den ersten 6 Wochen postoperativ und mit einer entzündlichen Gelenkserkrankung (z. B. Psoriasis,
Krystallopathie, rheumatoide Arthritis) sind ausgeschlossen.
umgefüllt werden. Das Implantat wird
nach der Sonikation gereinigt und dem
Patienten ausgehändigt (Patienteneigentum) oder für eventuelle Nachuntersuchungen aufbewahrt.
Fazit
Mit der zunehmenden Anwendung von
Implantaten in der Medizin werden wir
vermehrt mit Biofilminfektionen und deren Nachweis konfrontiert. Neben orthopädischen Implantaten können auch vaskuläre Prothesen, Herzschrittmacher, Defibrillatoren, neurochirurgische Shunts
und Brustimplantate mit der Sonikation untersucht werden. Neue Untersuchungstests können die Sensitivität der
Sonikationskultur weiter verbessern.
Korrespondenzadresse
PD Dr. A. Trampuz
Zentrum für Septische
Chirurgie, Center für
Muskuloskeletale Chirurgie,
Charité – Universitätsmedizin
Berlin
Charitéplatz 1, 10117 Berlin
[email protected]
Einhaltung ethischer Richtlinien
Interessenkonflikt. N. Renz, S. Cabric, V. Janz und
A. Trampuz geben an, dass kein Interessenkonflikt
besteht.
Dieser Beitrag beinhaltet keine Studien an Menschen
oder Tieren.
4
Der Orthopäde
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