Mikroskopie: Theoretische Grundlagen

Mikroskopie: Theoretische Grundlagen
Ein Mikroskop ist ein Präzisionsinstrument, der richtige Umgang damit erfordert zuerst
theoretisches Grundwissen, damit es richtig bedient werden kann.
Für jeden Einstellknopf und jede Linse gibt es Namen, die gelernt werden müssen, um
sich über diese Dinge verständigen zu können. Dadurch werden Fehler vermieden, die
dazu führen können, dass man gar nichts erkennen kann, wenn man durch das
Mikroskop schaut.
Ein Mikroskop enthält 2 Linsensysteme: Okular und Objektiv. Jedes dieser
Linsensysteme trägt zur Vergrößerung bei. Die Vergrößerungsfaktoren eingraviert,
und zwar
Okular _________
Objektive: ___________ , ___________ , _____________
Die Vergrößerung errechnet sich durch Multiplikation der Okular- und der
Objektivvergrößerung.
Je näher man einen Gegenstand an das Auge führt, desto mehr Einzelheiten erkennt
man, wobei man aber sehr schnell feststellt, dass es eine Grenze gibt, bei deren
Unterschreiten das Auge den Gegenstand nicht mehr scharf abbilden kann, weil der
Krümmungsradius der Augenlinse nur in bestimmten Grenzen verändert werden kann.
Beim menschlichen Auge liegt diese Grenze( Bezugssehweite ) genannt, bei 250 mm.
Das Auge sieht den Gegenstand
unter dem Sehwinkel G.
Beim Betrachten eines
Gegenstandes interessiert uns, wie
genau wir Einzelheiten erkennen
können, ob es uns gelingt, zwei benachbarte Punkte noch getrennt wahrnehmen zu
können. Das Maß für die Unterscheidbarkeit zweier Punkte bezeichnet man als das
Auflösungsvermögen.
Zum Betrachten kleiner Objekte, wie z.B. der Zellen, reicht das Auflösungsvermögen des Auges nicht
aus. Wir brauchen deshalb optische Hilfsmittel. Das einfachste ist ein Vergrößerungsglas, eine Lupe,
deren Vergrößerung berechnet man nach der Formel
V = 250 [mm] / f [mm]
Hierbei sind die 250 mm die Bezugsweite des menschlichen Auges und f die Brennweite der Linse.
Kennt man die Vergrößerung einer Lupe, und möchte die Brennweite errechnen, so schreibt man die
Formel um
f [mm] = 250 [mm] / V
Einfache Lupen, die nur eine Linse bzw. ein Linsensystem enthalten, vergrößern bis zu ca. 20 oder
25fach. Möchte man Objekte stärker vergrößern, bedient man sich zweier Linsensysteme, und damit
sprechen wir von einem Mikroskop.
Strahlengang durch ein Lichtmikroskop
Das von der Lichtquelle (Lampe oder Sonnenlicht mit Spiegel)
ausgehende Licht wird durch eine Linse gebündelt. Durch eine
Mattscheibe (rau geschliffene Scheibe) unter dem Objekt, kann das
Licht auf das Objekt gleichmäßig verteilt werden.
Das Objektiv liefert vom Gegenstand ein vergrößertes, reelles
Zwischenbild.
Das bereits vom Objektiv vergrößerte Zwischenbild wird noch einmal
durch das Okular vergrößert. Das Endbild ist virtuell.
Die Gesamtvergrößerung ist das Produkt aus der Vergrößerung des
Objektivs und der Vergrößerung des Okulars:
Vges = VObjektiv x VOkular
Das Lichtmikroskop vergrößert bis 2000fach.
Die meisten Mikroskope besitzen mehrere Objektive, die abwechselnd durch eine
Drehvorrichtung (Revolver) in den Strahlengang gebracht werden, um den Abbildungsmaßstab
verändern zu können.
Auflösung:
Für die Auflösung ist vor allem das Objektiv verantwortlich. Eine schlecht aufgelöste Struktur
ist auch durch noch so starke Nachvergrößerung nicht besser zu erkennen.
Zur Beschreibung eines Objektivs genügt nicht nur der Vergrößerungsfaktor, sondern wir
brauchen als weitere Größe die sogenannte numerische Apertur [A]. Darunter versteht man
die Größe A = n sin alpha
n ist der Berechnungsindex des Mediums (in der Regel Luft, Brechungsindex=1) zwischen
Objekt (bzw. dem Deckglas) und der Frontlinse des Objektivs.
alpha ist der Öffnungswinkel, unter dem ein Strahl vom Objektiv gerade noch
aufgenommen werden kann. alpha kann niemals größer als 90° sein, somit kann die numerische
Apertur niemals Werte über 1 annehmen. In der Praxis ist der Wert 0,95 die oberste Grenze;
Einen höheren Aperturwert erhält man, wenn man die Luft zwischen Objektiv und
Deckglasoberfläche durch ein stärker brechendes Medium ersetzt
( Immersionsöl, spezielle Objektive)
Phasenkontrast:
Bei der normalen Lichtmikroskopie mit einfarbigem Licht wird das Licht beim Durchgang durch das
Objekt (abhängig von dessen Struktur) verändert. Es wird mehr oder weniger stark abgeschwächt.
Viele biologische Objekte erscheinen oft strukturlos. Zelle und Zellkern z. B. haben im sichtbaren
Spektralbereich die gleiche Durchlässigkeit, so dass Helligkeits- und Farbunterschiede nicht
wahrgenommen werden können. Unterschiede zwischen z.B. Zellkern und Plasma lassen sich durch
spezifische Färbungen darstellen, weil sie molekular unterschiedlich zusammengesetzt sind. Die
Färbung ist eine chemische Umsetzung, bei der gewisse Strukturen zerstört werden können. Man ist
sich daher nie ganz sicher, ob das, was man sieht, reell ist.
Beim Phasenkontrastverfahren arbeitet man bei indirektem Licht. Durch eine Blende unterhalb des
Kondensors wird das direkte Licht abgefangen. Nur ein Lichtring erreicht somit das Objekt. Durch diese
Blende im Strahlengang tritt nur indirektes, am Objektiv gebeugtes, Licht ins Mikroskop. Durch
Veränderung der Blendenöffnung erkennt man eine Verstärkung von Helligkeitsunterschieden und somit
eine Kontrastierung der Strukturen. Zellplasma und Zellkern z. B. sind auf diese Weise sehr leicht
voneinander zu unterscheiden.
Bedienung des Mikroskops
Jedes Okular kann mit Hilfe des Revolvers in den Lichtweg gebracht werden. Am
Objekttisch findet man verschiedene Systeme, mit denen der Objektträger fixiert
werden kann.
Grundsätzlich sind folgende Regeln zu beachten
Präparat erst bei schwacher, dann erst bei starker Vergrößerung
betrachten. Die Längen der Objektive sind so aufeinander abgestimmt, dass die
Bildschärfe beim Objektivwechsel nicht verloren geht.
Präparat zunächst mit dem Grobtrieb (großes Rad seitlich am Mikroskop)
+ / - scharf einstellen. Dabei wird er Objekttisch so nahe wie möglich an das
Objektiv herangeführt. Verfolgen Sie diesen Vorgang durch Beobachtung von der
Seite. Ein Zusammenstoß zwischen Objektiv und Objekt ist zu vermeiden. Beim
Beobachten des Präparats nur den Feintrieb (kleines Rad) verwenden, oder den
Grobtrieb verwenden, um den Abstand zwischen Objektiv und Präparat zu
vergrößern.
Kondensor (Linsensystem unterhalb des Objekttisches) so weit nach oben
drehen wie möglich. Die "Frontlinse" (die dem Objekt am nächsten liegt), bei
kleinen Vergrößerungen (3,2 x, 10 x) aus dem Lichtweg herausklappen. Sie nur bei
stärkeren Vergrößerungen verwenden.
Beleuchtungsstärke darf nicht zu hoch sein.
Leuchtfeldblende (Blende an der Lichtquelle) offen lassen.
Aperturblende (Blende am Kondensor) nur so weit schließen, bis Sie
optimalen Kontrast erhalten.
Arbeiten mit Phasenkontrast: Phasenkontrastblende in den Lichtweg
bringen. Aperturblende + / - ganz öffnen, Leuchtstärke der Lampe erhöhen.
Phasenkontrast erhalten Sie nur mit den dafür geeigneten Objektiven.
Das Präparat:
Präparat stets mit einem Deckglas abdecken. Auf der Oberseite des Deckglases
darf nie Wasser stehen. Sollte das trotzdem einmal der Fall sein, so muss es mit
einem Stück Filterpapier entfernt werden, bevor Sie das Präparat auf den
Objekttisch legen. Sollte, was noch schlimmer ist, ein Objektiv befeuchtet
worden sein, so ist es umgehend mit einem weichen Tuch [Kleenex] wieder zu
reinigen.
Das Präparat muss stets in Flüssigkeit eingebettet sein. Achten Sie darauf, dass
keine Luftblasen unter das Deckglas geraten, wenn Sie Ihr Präparat damit
bedecken. Stark lichtbrechende, meist runde Strukturen, die fast jeder Anfänger
am ersten Praktikumstag im Mikroskop erkennt, sind Luftblasen, die bei
sorgfältigem Arbeiten eigentlich nicht auftreten sollten.
Die Unterseite des Objektträgers soll genau so trocken sein wie die Oberseite
des Deckglases. Feuchtigkeitsspuren auf dem Objekttisch sind umgehend zu
entfernen.
Protokollführung
Über alle durchgeführten mikroskopischen Beobachtungen ist ein ausführliches Protokoll zu
führen.
Es soll korrekt, vollständig und übersichtlich sein
Versuche ohne eine gewissenhafte Protokollführung bedeuten Zeitverschwendung.
Richtlinien für ein Protokoll:
1. Überschrift (Titel), Bezeichnung des Präparates/Versuches. Name des Experimentators,
Datum.
2. Einleitung: Kurze Darlegung der Fragestellung (Stichworte sind oft ausreichend);
gegebenenfalls Nennung verwendeter Literaturstellen.
3. Material und Methoden: Herkunft des Versuchsmaterials, Mikroskopie: Angabe der
Vergrößerung .
Die Daten sind übersichtlich anzuordnen (Details nicht vergessen), damit sich der Verlauf des
Experiments bis in die Einzelheiten verfolgen lässt. Nur so können bei Misserfolgen die Fehler
gefunden werden.
Auch fehlgeschlagene Experimente sind in der gleichen Weise aufzuführen. Es ist
selbstverständlich überflüssig, Dinge abzuschreiben, die in einer vorliegenden
Versuchsanleitung beschrieben sind. Nur dann, wenn Sie von der Vorschrift abweichen, muss
die experimentelle Durchführung genau beschrieben werden.
4. Ergebnisse Messwerte sind in Form von Tabellen, Diagrammen u.s.w. übersichtlich
zusammenzustellen.
5. Zeichungen
• Beobachtete Strukturen - makroskopisch oder mikroskopisch - sind zeichnerisch
darzustellen.
• Gezeichnet wird grundsätzlich nur mit einem Bleistift auf weißem, glattem Papier.
Linien werden glatt durchgezogen (dünn vorzeichnen, dann verstärken).
• Stricheln,,,schummern", wischen u.s.w. ist zu vermeiden. Radieren ist erlaubt (und
meist unumgänglich - deshalb nur mit Bleistift zeichnen).
• Die Zeichnungen sollen möglichst groß sein, damit sie genügend Details
einzeichnen
können. Sie sollten etwa 2/3 bis 3/4 des zur Verfügung stehenden Raumes
einnehmen, so dass oben und unten noch Platz für die Beschriftung bleibt.
• Bei Strukturen, die aus vielen gleichartigen Elementen aufgebaut sind (etwa ein
Stängelquerschnitt, der viele ähnlich gebaute Zellen enthält), sind nur Ausschnitte zu
zeichnen.
• In einer Übersichtszeichnung soll angedeutet werden, wo welche Elemente liegen.
• Vor allem auf die Proportionen achten!
6. Diskussion
Ein Protokoll schließt mit einer Zusammenfassung der Ergebnisse, mit einer Diskussion" der
Ergebnisse, einer Erklärung, sowie gegebenenfalls einer Deutung, warum der eine oder der
andere Versuch fehlschlug.
Welche Zusatzversuche wären denkbar, um weitere Fragen zu beantworten.
Auch Kritik am Versuchsaufbau und der Wahl des Versuchsobjekts ist angebracht.
Welche Schlüsse können aus den Ergebnissen gezogen werden?
Wurden die eingangs gestellten Fragen befriedigend beantwortet,
oder sind die Ergebnisse nicht schlüssig?