Zusammenfassung englisch/deutsch
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Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-systemin microgravity and space ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH; MEHRSEITIG) Diplom-Biologin Dana Michaela Simmet ZUSAMMENFASSUNG Dissertation „Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophagesystemin microgravity and space“ „Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-system in microgravity and space“ (Biotechnologie zur Erforschung des Monozyten-Makrophagen-Systems in Mikrogravitation und im Weltraum) untersucht die Einflüsse realer Mikrogravtion (µg) und simulierter Mikrogravitation (simg) auf Zellen des angeborenen, unspezifischen Immunsystems, sowie die Entwicklung und Anpassung der entsprechenden biotechnologischen Versuchsapparaturen, welche für diese Untersuchungen benötigt werden. Makrophagen einer Rattenzelllinie (NR8383) und makrophagenartige Zellen die von PMA-stimulierten, differenzierten humanen U937 Zellen stammen wurden bezüglich ihrer Funktionalität unter veränderten Schwerkraftsbedingungen erforscht. Makrophagen sind Teil des unspezifischen Immunsystems und bilden die erste Verteidigungslinie des Körpers. Sie patrouillieren den Körper und sind in der Lage, „eigen“ (dem Körper zugehörig) und „nicht eigen“ (fremd für den Körper) im Bezug auf Moleküle sowie Zellen zu unterscheiden. Treffen Makrophagen auf ein ihnen unbekanntes Molekül, umschließen sie diesen potentiellen Krankheitserreger (Phagozytose) und bauen ihn durch den Prozess des oxidativen oder respiratorischen Bursts ab. Zusätzlich aktivieren Makrophagen das adaptive, spezifische Immunsystem. Dieses ist in der Lage, eine starke Immunantwort einzuleiten, welche sich spezifisch gegen das entsprechende Pathogen richten. Generell müssen die Effekte von µg und simg auf dads Immunsystem in Kurzzeit- und Langzeit-Effekte unterschieden werden. Dieser Unterscheidung entsprechend ist die vorliegende Dissertation in zwei Hauptprojekte gegliedert: das TRIPLELUX-A Projekt, welches Kurzzeit-Effekte von µg und simg untersucht, und das SITI-2 Projekt, welches Langzeit-Effekte von µg und simg, erforscht. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass unter den untersuchten simg und µgBedingungen sowohl simg als auch µg Veränderungen in der Funktionalität des unspezifischen Immunsystems bezogen auf Kurzzeit- sowie Langzeit-Effekte zeigten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sowohl kurzzeit- als auch Langzeit-Effekte unter den untersuchten simg- sowie µg-Bedingungen beeinträchtigt waren. Die TRIPLELUX-A Kurzzeit-Effekte untersuchten die Prozess des oxidativen Burst der Makrophagen. Während dieses Prozesses wird ein in ein Vesikel eingeschlossenes potentielles Pathogen durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) abgebaut, welche in das Vehikel abgegeben werden. Diese Radikale sind teils zellintern, werden teils aber auch von der Zelle nach außen abgegeben und können durch eine Luminol-Reaktion gemessen werden. Bei dieser Reaktion reagieren freie Sauerstoffradikale mit Luminös unter Anwesenheit des Katalysators Merretich-Peroxidase (HRP) und es kommt zur Aussendung von Licht (Photonen). Diese Photonen können durch Photomultiplier-Röhren (Photoelektronenvervielfacher; PMTs) detektiert werden. Die Ausgabe erfolgt in relative light units (relativen Lichteinheiten; RLU), welche eine relative Größe für die Phagozytoserate des Makrophagen darstellt. Im Rahmen des TRIPLELUX-A Projekts wurde NR8383 Rattenmakrophagen ein Bestandteil der Hefezellwand, Zymosan, als Stimulus für die Phagozytose gegeben. Die entsprechende Reaktion wurde gemessen. Mehrere frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass die Phagozytoserate sowohl unter simg (Huber, 2007, Horn, 2011 and Horn Zusammenfassung (Deutsch; mehrseitig) 1 " von 4 " Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-systemin microgravity and space ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH; MEHRSEITIG) Diplom-Biologin Dana Michaela Simmet et al. 2011) als auch unter µg (Horn, 2011) vermindert gewesen war. Für simg kann die vorliegende Dissertation die Ergebnisse bestätigen. Das TRIPLELUX-A Projekt wurde für die Durchführung auf der ISS entwickelt. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit einem Teil der Weltraumexperimentvorbereitungen (Mission Frühjahr 2015), sowie auch mit der Etablierung eines Versuchsapparat-Systems (PMT-Klinostat) zur Durchführung von kinetischen Messungen des oxidativen Bursts unter simg-Bedingungen an der Universität Zürich, Schweiz. In Bezug auf die Weltraumexperimentvorbereitungen von TRIPLELUX-A wurden diverse Abschnitte des Zeitplans abgeschlossen und Missions-bedingte Anpassungen vorgenommen. Der Status des Projekts bei Beendigung der praktischen Arbeit war die aktuelle Vorbereitung für die Wiederholung eines SVT basierend auf den zu diesem Zeitpunkt aktuellen Weltraumexperiment-Vorgaben. Im simg-Teil diese Projekts, welcher nicht unmittelbar der WeltraumexperimentVorbereitung diente, wurde eine Versuchappartur-System (PMT-Klinostat; Horn et al., 2011) zur Untersuchung simulierter Mikrogravitation and er UZH, Schweiz, etabliert und nach bestimmten Schwerpunkten getestet. Es handelt sich dabei um einen schnellrotierenden, 2D-Klinostat, welcher eine Probe mit 60 Umdrehungen pro Minute dreht. Diese Drehung führt zu einer Mittelung des g-Vektors über die Zeit und somit zur simulierter Mikrogravitation bzw. Schwerelosigkeit. Ein an den Küvettenboden grenzender PMT war in der Lage, kinetische Messungen der Protonenabgabe zu detektieren. In der Vergangen seit hat diese System Ergebnisse erzeugt, welche denen aus µG in Parabelflügen sehr ähnlich waren (Horn, 2011). Für den Einsatz an der UZH wurde der vom DLR (Horn et al., 2011) gestellte PMTKlinostat an 3 neue Anforderungen angepasst. Die Küvetten wurden auf einen Innendurchmesser von 3 mm gebracht, dem Durchmesser, welcher auch beim „2D-DLRPipetten-Klinostat an der UZH vorliegt. In beiden Fällen wirkte also die gleiche maximale Restbeschleunigung von 1.2073 * 10-2 g am Rand der Küvette. Die zweite Vorgabe bestand darin, dass sowohl die Küvetten als auch die Stopfen in einer Art hergestellt werden sollten, durch die mögliche Kontaminationen mit LPS ausgeschlossen werden konnten. Die dritte Vorgabe stand darin, den konischen Boden der Küvette so zu optimieren, dass eine mögliche Ablenkung des Lichts durch unregelmäßige Glasdurchmesser ausgeschlossen werden konnte. Ale Vorgaben wurden erfüllt und das System erfolgreich getestet. Die oxidative Burst Reaktion der NR8383 Zellen in kompletten Durchläufen mit entweder simg oder 1g zeigte insgesamt niedrigere Signale für die simgMessungen. Weitere Experiment-Serien untersuchten, ob eine interne Kontrolle der Messung möglich wäre. Dies war von besonderem Interesse, da die Resultate von BurstMessungen des gleichen Tages und des gleichen Zellansatzes große Schwankungen aufwiesen. Um eine interne Kontrolle zu haben, wurden abwechselnde Intervalle von sim und 1g mit einer Dauer von 10, 5 oder 2 Minuten im Wechsel über den gesamten Experimentdurchlauf gemessen. Die Ergebnisse bestätigten wiederum, dass die NR8383 Zellen ind der Lage waren, binnen Sekunden auf Gravitationsunterschiede zu reagieren. Dies ermöglichte die Wahl der kürzesten Intervall-Einheit von 2 Minuten, welche die größte Menge and Datenpunkten bot. Die Ergebnisse der Zellen zeigten jedoch nicht die konstant gleiche Reaktionsweise wie sie aus früheren Untersuchungen anderer bekannt war: manche Wechsel in der Art des Gravitationstyps führten zu einer Abnahme des BurstSignals, manche zu einer Zunahme und manche zu gar keiner Reaktion - zutreffend für alle Ergebnisse sowohl für den Wechsel von 1g auf simg als auch für den Wechsel von simg auf 1g. Zusammenfassung (Deutsch; mehrseitig) 2 " von 4 " Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-systemin microgravity and space ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH; MEHRSEITIG) Diplom-Biologin Dana Michaela Simmet Das einzig durchgängig konstante Ergebnis war, dass die Zellen während des steilen Anstiegs der Reaktionskurve (Beginn der der Phagozytose) keinerlei Reaktion auf irgendeinen Gravitationswechsel zeigten. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Zellen zu dieser Zeit so mit der Phagozytose beschäftigt waren, dass sie entweder den Gravitationswechsel nicht wahrnehmen konnten oder nicht darauf reagieren konnten. Geplante Folgeexperimente im Rahmen des TRIPLELUX-A Projektes sollen den Hauptproduzenten der ROS während des oxidativen Burst bestimmen. Als Basis für diese Experimente wurden Vortests zur Zelltoxizität mit Allopurinol als Xanthineoxidase Inhibitor, Apocynin als NADPH-Oxidase Inhibitor und YCG063 als mitochondrialer ROS Inhibitor mit NR8383 Zellen durchgeführt. Die getesteten Konzentrationen von Allopurinol (0.1 - 3500 µM) zeigten keine Toxizität und hatten keinerlei Einfluss auf die Zellen. Apocynin (TestKonzentrationen: 0.0001 - 5 mM) verdeutlichte einen negativen Effekt mit einer Abnahme der Zeltzahl ab einer Konzentration von 0.004 mM. YCG063 (Test-Konzentrationen: 0.0005 - 0.1 mM) präsentierte negative Effekte ab einer Konzentration von 50 µM. Bei 100 µM kristallisierte der Inhibitor YCG063. Abgesehen von den Kurzzeit-Effekten, welche sich mit der Phagozytose der Makrophagen in TRIPLELUX-A beschäftigten, untersuchte das zweite in dieser Dissertation beschriebene Projekt Langzeit-Effekte (5 Tage µg) der realen Mikrogravitation auf die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle der Zelle sowie auf das Zytoskelett. Es wurden makrophagenartige, humane U937 Zellen verwendet. In Bezug auf die Missionsvorbereitung wurde die Hauptaufgabe, eine enge Zusammenarbeit mit der Industrie (ASTRIUM) zur Entwicklung einer komplett neuen Versuchsapparatur und deren Testung bezüglich biologische Anforderungen im Labor, erfüllt. Die einzelnen Anpassungen sind in der vorliegenden Dissertation im Detail beschrieben. Zusammenfassend wurden während er ersten Deutsch-Chinesischen Weltraummission SHENZHOU-8 im Oktober 2011 in der SIMBOX Änderungen für CD11a, CD11b, CD18, CD36, MHC-I, MHC-II, Aktin, Tubulin und ICAM-I untersucht. Für genauere Ergebnisse, bitte in Simmet et al., 2013, Paulsen et al., 2013 und Paulsen et al., 2014 nachlesen. Diese Dissertation präsentiert nur einen Auszug der Ergebnisse im Bezug auf die Moleküle CD11b und CD18 (bilden Mac-1), CD36 und MHC-II. Mac-1 ist ein Pattern-Recognition Receptor, welcher eine zentrale Rolle in der unspezifischen Immunantwort spielt indem er die Bindung von ICAM-1 auf Endothelzellen und T-Zellen vermittelt (Zell-Zell-Kontakte). playing a main role in the innate immune response by mediating the binding of ICAM-1 on endothelial and T cells (cell-cell-contacts). CD36 ist ein Integrales Membranprotein das apoptotische Zellen und viele andere Liganden bindet. MHC-II präsentiert CD4+ T-Zellen als Antigen wirkende Peptide, welche aus aufgenommenen Pathogenen stammen. MHC-II vermittelt somit Zell-Zell-Kommunikation und spielt eine sehr entscheidende Rolle ind er Aktivierung des spezifischen Immunsystems. All die genannten Moleküle waren unter µg deutlich herunterreguliert, bis auf CD11b, welches nur leicht herunterreguliert war. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das unspezifische Immunsystem wie es in SITI-2 untersucht wurde schwerwiegende Einschränkungen erleidet, sowohl bezogen auf die Moleküle, die bei der Zell-Zell-Interaktion eine Rolle spielen (Mac-1, MHC-II), als auch bezogen auf die Moleküle, welche in den Prozess der Phagozytose involviert sind (Mac-1, CD36). Betrachtet man die Ergebnisse beider Projekte (TRPIPLELUX-A and SITI-2) für µg und simg, zeigte das unspezifische Immunsystem schwerwiegende Einschränkungen erstens Zusammenfassung (Deutsch; mehrseitig) 3 " von 4 " Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-systemin microgravity and space ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH; MEHRSEITIG) Diplom-Biologin Dana Michaela Simmet in Bezug auf die Phagozytose, sowohl bei der Beobachtung von Kurzzeit- (TRIPLELUX-A, simg) als auch bei der Beobachtung von Langzeit-Experimenten (SITI-2, 5 days µg), und zweitens in Bezug auf Zell-Zell-Kommunikation und Aktivierung des spezifischen Immunsystems bei Langzeit-Beobachtungen (SITI-2, 5 days µg). Falls Makrophagen nicht in der Lage sein sollten, Phagozytose in einer auf dem Boden normalen Rate durchzuführen da entweder das Einschließen fremder Partikel eingeschränkt ist oder da der anschließende Abbau beeinträchtigt ist, könnte dies zu einer Invasion von Pathogenese führen die ernsthafte oder sogar lebensbedrohliche Infektionen mit sich bringen könnte. Wäre die Aktivierung des spezifischen Immunsystems eingeschränkt, könnte ein (partielles) Fehlschlagen der spezifischen Immunantwort zur Abwehr einer Infektion ebenfalls zu einer Invasion des Körpers mit Pathogenese führen, was wiederum eine Gefahr für Gesundheit oder sogar Leben darstellen könnte. Wenn man bedenkt, dass Astronauten (besonders bei Langzeitmissionen) erstens ohne Zugang zu medizinischer Versorgung wie sie auf der Erde existiert überleben müssen, zweitens in der Lage sein sollten, Arbeit zuverlässig zu verrichten und drittens in einem engen, abgeschlossenen Raum leben, was ein hohes Risiko von Krankheitsübertragungen mit sich bringt, wird deutlich dass weitere Untersuchungen in diesem Feld der Immunologie entscheidend für die Gesundheit und Leistungsfähigkeit einer Crew sein werden. Der Gesundheitszustand der Crew ist der entscheidende Faktor, der schließlich LangzeitMissionen ermöglichen oder unmöglich machen wird. Zusätzlich sind die zu Grunde liegenden molekularen Prozesse und Mechanismen in der Zelle auch bei vielen Krankheiten auf der Erde wichtig, z.B. bei Osteoporose. Das Verständnis dieser Prozesse wäre also nicht nur für Astronauten sonder auch für Patienten auf der Erde von Bedeutung. Das langfristige Ziel wäre die Entwicklung angemessener Gegenmaßnahmen, z.B. von Medikamenten, um die negativen Effekte, die entweder durch µg oder eine entsprechende Krankheit verursacht werden, zu verhindern. Zusammenfassung (Deutsch; mehrseitig) 4 " von 4 " Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-systemin microgravity and space ZUSAMMENFASSUNG (ENGLISCH; EINSEITIG) / SUMMARY Dana Michaela Simmet SUMMARY “Biotechnology for the investigation of the monocyte-macrophage-system in microgravity and space” investigates the influences of real microgravity (µg) and simulated gravity (simg) on cells of the innate immune system (IIS). It addresses the development and adaptations of the respective biotechnological hardware components required. Macrophages derived from a rat cell line (NR8383) and macrophageal cells derived from PMA-stimulated, differentiated human U937 monocytic cells were investigated regarding their functionality under altered gravity (g) conditions. In general, effects of µg and simg on the immune system need to be distinguished regarding short-term and long-term effects. Consistent with this distinction, this thesis is split in two projects, the TRIPLELUX-A (TPLX-A) project, examining short term effects of simg and µg, and the SITI-2 project, exploring long term effects of simg and µg. TPLX-A examined the oxidative burst reaction executed by macrophages following the phagocytosis of a potential pathogen (zymosan, part of the yeast cell wall). The underlying thesis dealt with part of the space preparations (mission planned for spring 2015). Many steps along the timeline of the space project were completed and mission-related changes implemented. Additionally, this thesis dealt with the establishment and testing of a hardware system (a fast-rotating 2D-PMT-clinostat (60 rpm), Horn et al., 2011) designed to investigate the oxidative burst reaction kinetically during simg. The PMT-clinostat provided by the DLR (Horn et al., 2011), was adapted to fit new requirements and tested successfully. Alternating intervals of simg and 1g lasting usually either 10, 5 or 2 minutes (min) were measured during one experiment run. NR8383 cells were able to react to these gravity changes within seconds, allowing for the interval duration of 2 min (highest number of data points). However, the cells’ reactions were not consistent: some changes in the type of gravity showed a decrease in burst signal, some an increase, some no reaction at all; with all results applicable for both types of g-changes (1g to simg and simg to 1g). The project SITI-2 examined long-term (5 days µg) effects of µg on the expression of different cell surface molecules and the cytoskeleton (macrophageal U937 cells). Supporting industry, a completely new set of hardware was developed and tested. During the space project flown inside SIMBOX on the first German-Sino space mission SHENZHOU-8 in October 2011, changes in CD11a, CD11b, CD18, CD36, MHC-I, MHC-II, actin, tubulin and ICAM-I were investigated and are partially presented within this thesis. Summarising both projects regarding µg and simg, the IIS did show serious impairments: firstly, regarding the process of phagocytosis during short term (TPLX-A, simg) as well as long term (SITI-2, 5 days µg, Mac-1, CD36) observations; and secondly, regarding cellcell-communication and activation of the adaptive immune system, both during long term observations (SITI-2, 5 days µg, Mac-1, MHC-II). If either the phagocytosis of macrophages or the adaptive immune response would be impaired, a potential invasion of pathogens could cause serious or even life-threatening infections. Taking into account that astronauts (especially on long term missions) have to survive without access to medical care, should be able to perform work reliably, plus live in a confined space (high risk of disease transmission), it becomes clear that further investigations in this field will be very important. The underlying molecular processes are also important in many diseases (e.g. in osteoporosis) on ground. Understanding them could be helpful for patients on ground and lead to the development of appropriate countermeasures for patients and astronauts as long-time goal. Zusammenfassung (Englisch; einseitig) / Summary 1 " of 1 "
