Fluoreszenzzytologie der Harnblase

Urologe [A]
2001 · 40: 217–221 © Springer-Verlag 2001
Originalien
S.Tauber · B. Liedl · P. Schneede · F. Ließmann · R.Waidelich · A. Hofstetter
Urologische Klinik und Poliklinik,LMU München
Fluoreszenzzytologie
der Harnblase
Zusammenfassung
Die 5-Aminolävulinsäure-induzierte Fluoreszenzendoskopie empfiehlt sich als exzellente
Methode zum Nachweis schwer erkennbarer
Karzinome und des Carcinoma in situ der
Harnblase.Aufbauend auf den tumorassoziierten Fluoreszenzeigenschaften von Protoporphyrin IX sollte der Wert einer fluoreszenzmikroskopischen Beurteilung zytologischer Präparate evaluiert werden.Eine Untersuchung an 27 Patienten mit Verdacht auf
ein Urothelkarzinom ergab in der Fluoreszenzendoskopie und in der Fluoreszenzmikroskopie eine exakte Übereinstimmung des
Fluoreszenzverhaltens tumorsuspekter
Urothelzellen und Zellgruppen.
Somit konnten wir in der Pilotstudie
mit der Fluoreszenzmikroskopie Blasentumoren unterschiedlicher Differenzierungsgrade mit hoher Sensitivität diagnostizieren.
In diesem Verfahren sehen wir eine sinnvolle
Ergänzung der Standardzytologie, da sich
insbesondere die Beurteilung von hochdifferenzierten Blasentumoren und flachen prämalignen Läsionen ausschließlich in der
Fluoreszenzzytologie als unproblematisch
erwies.
Schlüsselwörter
Zytologie · Photodynamische Diagnostik ·
Fluoreszenz · Urothelkarzinom
M
it einer Inzidenz von 17–19 Neuerkrankungen/Jahr, bezogen auf 100.000
Menschen, ist das Harnblasenkarzinom
der zweithäufigste Tumor des Urogenitaltrakts, wobei die Tendenz steigend ist.
Mit 95% der Blasentumoren stellen Urothelkarzinome die größte Gruppe dar.
Seltener finden sich Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome, Sarkome und
Metastasen anderer Primärtumoren.
Die Standardmethode der Blasentumordiagnostik ist die Zystoskopie. Hierdurch lassen sich insbesondere die exophytischen und soliden Tumoren gut erkennen. Flache Schleimhautveränderungen, wie das Carcinoma in situ, werden dagegen häufiger übersehen. Zur
Erfassung dieser problematischen Tumoren werden die Zytologie, unterschiedliche immunologische Labortestverfahren und die durch 5-Aminolävulinsäure-induzierte Fluoreszenzendoskopie (AFE) ergänzend eingesetzt [6, 7].
Für die Standardzytologie wird zur Erkennung von hoch-, mittel- und entdifferenzierten Urothelkarzinomen eine
Sensitivität von 50%, 65–80% bzw.
85–90% angegeben [5, 12, 14]. Die zytologische Beurteilung hochdifferenzierter
Tumoren wird durch Harnwegsinfektionen, Harnsteinleiden und andere Störfaktoren erschwert, wodurch sich die
niedrige Sensitivität und Spezifität der
Standardzytologie erklärt.
Die derzeit angebotenen Tumormarker zum Karzinomnachweis aus
dem Urin, z. B. der Bard- oder der NMP22-Test, haben mit einer Sensitivität von
etwa 56% und einer Spezifität von etwa
67% bei der Diagnostik unterschiedlich
differenzierter Blasentumoren bislang
enttäuscht [10, 16]. Insofern sind diese
Labortestverfahren keine sinnvolle und
anerkannte Ergänzung der Zystoskopie
und Zytologie.
Unabhängig vom Differenzierungsgrad der Blasentumoren werden dagegen bei der AFE-Tumoren mit einer Sensitivität von 97% erkannt [7], (Tabelle 1)
Die bislang mit keiner anderen Methode erreichte Sensitivität bei der Diagnostik von Urothelkarzinomen war die
Grundlage für die Entwicklung einer
fluoreszenzgestützten Zytologie.
Methodik
Für die endoskopische Fluoreszenzdiagnostik zum Nachweis von Urothelkarzinomen der Harnblase wurde den Patienten etwa 1–2 h vor der Zystoskopie
mittels sterilem Einmalkatheter 50 ml
3%ige, mit Natriummonohydrogenphosphat-gepufferte (1,4%) 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) in die entleerte
Blase instilliert. Wir verwendeten das
sterile Lyophilisat der Fa. medac (Hamburg).
Fluoreszenzendoskopie
Das Prinzip der Fluoreszenzendoskopie
(AFE) beruht darauf, dass die 5-Aminolävulinsäure im Hämzellstoffwechsel in
Protoporphyrin IX umgewandelt wird.
Dieses gibt bei einer Fluoreszenzanre-
Dr. S.Tauber
Urologische Klinik und Poliklinik,
LMU München, Marchioninistraße 15,
81377 München
Der Urologe [A] 3•2001
| 217
Urologe [A]
2001 · 40: 217–221 © Springer-Verlag 2001
Originalien
S.Tauber · B. Liedl · P. Schneede
F. Ließmann · R.Waidelich · A. Hofstetter
Fluorescencezytology of the urinary
bladder
Abstract
5-aminolevulinic acid induced fluorescence
cystoscopy is invaluable for diagnosing urinary bladder carcinoma and its precursors.
Because neoplastic cells of the urinary bladder possess striking fluorescent properties
due to protoporphyrin IX, we initiated a
study to evaluate the use of fluorescence
microscopy in urinary sediments.In 27 patients suspected of having bladder carcinomas, we instilled 5-aminolevulinic acid into
their urinary bladders before transurethral
therapy and compared thereafter our studies
of standard cytological sediments with those
made under fluorescence microscopy.
The results of fluorescence cystoscopy
and those using urinary sediments for neoplastic cells under fluorescence microscopy
correlated extremely well.In this pilot study
using fluorescence microscopy, we found
that we could diagnose with precision
urinary neoplasms of different grades of differentiation.Accordingly, we regard fluorescence microscopy as a valuable complement
for standard urinary cytology, especially
since with fluorescence microscopy we can
readily recognize fluorescing cells of highly
differentiated urinary tumors and flat
premalignant dysplasias.
Keywords
Cytological sediments · Photodetection ·
fluorescence · Transitional cell carcinoma
Abb.1 Zytologische
Präparate mit entdifferenzierten Tumorzellen der
Harnblase bei 100-facher
Vergrößerung. Das Bild
zeigt den Befund bei
Fluoreszenzanregung
gung mit energiereichem, blauviolettem
Licht mit einer Wellenlänge um 400 nm
(D-LIGHT, Fa. Karl Storz, Tuttlingen) eine charakteristische Rotfluoreszenz mit
einer Wellenlänge um 630–700 nm ab.
Die Fluoreszenz kann mit dem bloßen
Auge unter Verwendung eines gelben
Langpassfilters, welcher in das Okular
der Beobachtungsoptik des Standardzystoskopes eingebaut ist, optisch erkannt
werden [1, 8].
Vor der endoskopischen Tumorbehandlung wurde den Patienten zur Standard- und Fluoreszenzzytologie jeweils
etwa 100 ml Spülflüssigkeit abgenommen. Die Spülflüssigkeit wurde aufgrund der höheren Aussagefähigkeit für
die Zytologie dem Spontanurin als Material vorgezogen.
Die für die Fluoreszenzzytologie
vorgesehene Spüllösung wurde in einem
lichtgeschützten Gefäß gekühlt asserviert. Innerhalb von 2 h wurde diese Lösung 5 min lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Das hierdurch gewonnene Sediment wurde resuspendiert und im Fluo-
reszenzmikroskop (Axiolab, Fa. Zeiss)
untersucht. Analog zur AFE verwendeten wir ein blauviolettes Anregungslicht
von 390–430 nm Wellenlänge.
Das von der AFE bekannte Ausbleichphänomen [1] der Fluoreszenz
war bei der Fluoreszenzzytologie entsprechend nachweisbar. Um eine reproduzierbare Beurteilung der zytologischen Präparate im Fluoreszenzmikroskop zu ermöglichen, wurden diese fotodokumentiert.
Analoge Bildausschnitte wurden
unter Weißlicht und Fluoreszenzbedingungen bei 100- bis 400facher Vergrößerung analysiert. Das in der Fluoreszenzzytologie gewonnene Bildmaterial wurde nach zytologischer Bewertung mit
der parallel angefertigten Standardzytologie verglichen. Die zytologische Beurteilung erfolgte verblindet durch einen
erfahrenen Zytologen.
In dieser Pilotstudie wurden die zytologischen Präparate von insgesamt
27 Patienten 1–7 h nach 5-ALA-Instillation untersucht.
Tabelle 1
Sensitivität und Spezifität in der Diagnostik von Urothelkarzinomen (in %)
Methode
Sensitivität
G1
Zytologie [5, 12, 14]
Bard [10]
NMP-22 [16]
AFE [7, 17]
G2–3
50
17
Spezifität
Cis
65–80
37
100
Gesamt
85–90
56
46
97
78–95
67
75
65a
a Ohne Berücksichtigung molekulargenetischer Veränderungen, Fluoreszenzquantifizierung
und Autofluoreszenz, mit >90%.
218 |
Der Urologe [A] 3•2001
Abb.2 Zytologische
Präparate mit entdifferenzierten Tumorzellen der
Harnblase bei 100-facher
Vergrößerung. Das Bild
zeigt den gleichen
Ausschnitt wie Abb. 1
bei Weißlicht
Abb.3 Entdifferenzierte
Tumorzellen bei 400facher
Vergrößerung bei
Fluoreszenzanregung
Abb.4 Entdifferenzierte
Tumorzellen bei 400facher
Vergrößerung unter
Weißlicht
Ergebnisse
Bei allen 17 Patienten mit einem durch
die transurethrale Resektion histologisch gesicherten Urothelkarzinom der
Harnblase fand sich in der 5-ALA-induzierten Fluoreszenzzystoskopie und
-zytologie eine positive Fluoreszenz.
Dabei handelte es sich 6-mal um ein
hochdifferenziertes, 4-mal um ein mittelgradig differenziertes, 5-mal um ein
entdifferenziertes Urothelkarzinom
und 2-mal um ein Carcinoma in situ.
Bei 10 Patienten ohne Tumornachweis
konnte keine Fluoreszenz nachgewiesen
werden.
Sowohl in der Übersichtsvergrößerung (100fach) als auch bei stärkeren
Vergrößerungen (400fach) beobachteten wir bei der Fluoreszenzdiagnostik
die typische, aus der AFZ bekannte Rotfluoreszenz des Protoporphyrin IX, die
sich auf mikroskopisch suspekte Urothelzellen mit prominenten, entrundeten Zellkernen begrenzte (Abb. 1, 2). Dabei fluoreszierte der Bereich des Zellkernes nicht (Abb. 3, 4).
Es fanden sich Malignitätskriterien
mit vergrößerten, polymorphen Zellen
mit großen Zellkernen, wodurch das
Kern/Plasma-Verhältnis zugunsten des
Zellkerns verschoben ist. Weitere typisch tumorsuspekte Zellveränderungen, wie Zellkerne mit hohem Chromatingehalt, prominente Nukleoli und eine
erhöhte mitotische Aktivität, zeigten
sich bei den entsprechenden zytologischen Präparaten nach der Standardfärbung (Abb. 5, 6).
In Verbänden gelagerte Urothelzellen waren bereits als fluoreszierende
Schwebteilchen in der Spülflüssigkeit bei
10facher Vergrößerung erkennbar.In keinem Fall war bei einem histologisch gesicherten Tumor oder bei positiver Standardzytologie ein negatives Ergebnis in
der Fluoreszenzzytologie nachzuweisen.
Andererseits wurde bei den 17 histologisch nachgewiesenen Tumoren
mit positiver Fluoreszenzzytologie in
3 Fällen ein negatives Ergebnis in der
Standardzytologie gefunden. Unauffällige Urothelzellen erschienen aufgrund
ihrer Autofluoreszenz grünlich. Ebenso
grünlich leuchteten suspekte Urothelzellen aus Spontanurin oder Spülurin ohne
vorangegangene 5-ALA-Instillation oder
nach bereits erfolgter Ausbleichung.
Erythrozyten sowie Leukozyten
zeigten keine Rotfluoreszenz. Das von
der AFE bekannte Ausbleichen der Fluoreszenz wird in der Fluoreszenzzytologie unter der lichtintensiven Mikroskopbeleuchtung bereits innerhalb von Sekunden bis hin zu wenigen Minuten beobachtet.
Protoporphyrin IX wird dabei unter Lichteinfluss chemisch umgesetzt,
sodass die Tetrapyrrolringe aufbrechen
und das delokalisierte Π-ElektronenSystem, das zu den starken Fluoreszenzbanden führt, zusammenbricht [1],
(Abb. 7, 8). Zur Dokumentation und reproduzierbaren Beurteilung der Befunde fotografierten wir die nicht ausgeblichenen Präparate.
Der Urologe [A] 3•2001
| 219
Originalien
Abb.5 Entdifferenzierte
Tumorzellen des gleichen
Patienten wie in Abb. 3 und
4, gefärbt nach Papanicolaou bei 100facher
Vergrößerung in der
Standardzytologie
Abb.6 Entdifferenzierte
Tumorzellen des gleichen
Patienten wie in Abb. 3 und
4, gefärbt nach Papanicolaou bei 400facher
Vergrößerung in der
Standardzytologie
Abb.7 Entdifferenzierte
Tumorzellen bei 400facher
Vergrößerung
Diskussion
Mit der Fluoreszenzzytologie lässt sich
bei Urothelkarzinomen der Harnblase
mikroskopisch die typische Rotfluoreszenz des Protoporphyrin IX nachweisen,
die man aus der Fluoreszenzdiagnostik
nach Applikation von 5-ALA in die
Harnblase kennt.
220 |
Der Urologe [A] 3•2001
Tumorzellen akkumulieren Protoporphyrin IX wesentlich stärker als Normalzellen. Dies wird durch eine gesteigerte Gewebepenetration und eine verstärkte Aufnahme von 5-ALA in die Zelle, eine gesteigerte Aktivität von Plasmaenzymen, eine erniedrigte Ferrochelataseaktivität, eine veränderte intrazelluläre Umverteilung und Ausschleusung von
Protoporphyrin IX und die erhöhte Proliferationsrate von Karzinomzellen erklärt [1, 2, 3, 4, 9, 11, 15].
Protoporphyrin-IX-Moleküle absorbieren am besten Licht um 400 nm,
d. h. „violettblaue“ Photonen. Ein Teil
der aufgenommenen Energie wird in
Form von „neu entstandenen“ Photonen
geringerer Energie und somit größerer
Wellenlänge abgegeben. Protoporphyrin IX emittiert typischerweise mit einer
Fluoreszenz von 636–705 nm „rote“ Photonen.
Dieses Fluoreszenzverhalten fanden
wir in unseren Untersuchungen bei allen Patienten, bei denen wir histologisch
ein Urothelkarzinom der Blase, unabhängig vom Differenzierungsgrad,
nachweisen konnten und bei denen die
AFE positiv war. Da die Hämbiosynthese an Mitochondrien gekoppelt ist, ließ
sich in der Fluoreszenzzytologie kaum
Fluoreszenz im Bereich der Zellkerne
nachweisen.
Das Ausbleichphänomen der suspekten Zellen und Zellgruppen unter
der lichtstarken Mikroskopbeleuchtung
macht eine zügige Bearbeitung oder eine Fotodokumentation notwendig. Die
untersuchten Patienten zeigten ein übereinstimmendes Fluoreszenzverhalten
bei endoskopischer Beurteilung der
Harnblase und bei der Fluoreszenzzytologie.
Harnblasenkarzinome werden aufgrund der Fluoreszenz bei der AFE mit
einer Gesamtsensitivität von ca. 97% erkannt [7, 17]. Da dem Fluoreszenzverhalten des makroskopisch erkennbaren
Blasentumors und der zytologisch betrachteten Einzeltumorzelle der gleiche
zelluläre Fluoreszenzmechanismus zugrunde liegt, bestand die Hoffnung, die
ausgezeichnete Gesamtsensitivität auf
die Fluoreszenzbeurteilung von zytologischen Präparaten zu übertragen. Unsere ersten Untersuchungsergebnisse
zeigen, dass zwischen der AFE und der
Fluoreszenzzytologie in dieser Hinsicht
eine Analogie besteht.
Durch die sensitive Erkennung nahezu aller Blasentumoren wäre damit
die Fluoreszenzzytologie der Standardzytologie sogar überlegen. Die simple,
farbbedingte und objektive Fluoreszenzbeurteilung der Zellen macht das Verfahren darüber hinaus unabhängig von
der Erfahrung des Untersuchers.
Abb.8 Entdifferenzierte
Tumorzellen bei 400facher
Vergrößerung. Effekte der
Fluoreszenzausbleichung
nach ca. 30 s intensiver
Mikroskopbeleuchtung
Fazit für die Praxis
Hochdifferenzierte Urotheltumoren werden bei der Standardzytologie bekanntlich
nur in 50% richtig diagnostiziert [5, 14].
Bei 17 erkannten Urothelkarzinomen in
der Fluoreszenzzytologie gegenüber 14
Urothelkarzinomen, die durch die Standardzytologie erkannt wurden, zeigte sich
die Überlegenheit der Fluoreszenzzytologie. Aufgrund der beschriebenen Vorteile
gegenüber der Standardzytologie sehen
wir für die Fluoreszenzzytologie folgende
sinnvolle Einsatzgebiete und Ergänzungen
zur Standardzytologie:
◗ Sichere und schnelle Beurteilung, insbe-
sondere hochdifferenzierter Urothelkarzinome und flacher maligner Läsionen.
◗ Einführung automatisierter, untersucherunabhängiger Bewertung von zytologischen Präparaten (z. B. durch Durchflusszytometrie).
◗ Differenzierung von Urothelkarzinomen
des oberen und unteren Harntrakts. Hier
wäre die Standardzytologie positiv, bei
negativer Fluoreszenzzytologie, außer
bei vesikoureteralem Reflux oder Ureterschienung.
Zur weiteren Beurteilung dieses Verfahrens korrelieren wir unsere Befunde der
Fluoreszenzzytologie, der AFE und der
Urinzytologie in einer randomisierten
Studie.
Literatur
1. Baumgartner R, Kriegmair M, Hofstetter A
(1999) Fluoreszenzdiagnostik des Harnblasenkarzinoms mit 5-Aminolävulinsäure.Grundlagen und Ergebnisse.Endo-Press,Tuttlingen
2. Datta S, Loh C, MacRobert A,Whatley S,
Matthewa P (1998) Quantitative studies of the
kinetics of 5-aminolaevulinic acid –induced
fluorescence in bladder transitional cell
carcinoma.Br J Cancer 78: 1113–1118
3. Jichlinski P, Forrer M, Mizeret J et al.(1997)
Clinical evaluation of a method for detecting
superficial surgical transitional cell carcinoma
of the bladder by light induced fluorescence of
protoporphyrin IX following the topical application of 5-aminolevulinic acid: Preliminory
results.Laser Surg Med 20: 402–408
4. Kennedy J, Pottier R, Pross D (1990) Photodynamic therapie with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical
experimence.J Photochem Photobiol
6: 143–148
5. Koss LG, Deitch D, Ramanathan AB,
Sherman AB (1985) Diagnostic value of cytology of voided urine.Acta Cytol (Baltimore)
29: 810
6. Kriegmair M, Baumgartner R, Knüchel R,
Stepp H, Hofstädter F, Hofstetter A (1994)
Fluorescence photodetection of neoplastic
urothelial lesions following intravesical instillation of 5-minolevulinic acid.Urology
44: 836–841
7. Kriegmair M, Baumgartner R, Knüchel R,
Ehsan A, Steinbach P, Lumper W, Hofstädter F,
Hofstetter A (1994) Photodynamische Diagnose urothelialer Neoplasien nach intravesikaler
Instillation von 5-Aminolävulinsäure.Urologe
A 33: 270–275
8. Kriegmair M, Baumgartner R, Knüchl R,
Stepp H, Hofstädter F, Hofstetter A (1996)
Detection of early bladder cancer by 5-aminolevulinic acid induced porphyrin fluorescence.
J Urol 155: 105–110
9. Kriegmair M, Stepp H, Steinbach P et al.(1995)
Fluorescence cystoscopy following intravesical
instillation of 5-aminolevulinic acid: a new
procedure with high sensitivity for detection of
hardly visible urothelial neoplasias.Urol Int
55: 190–196
10. Mahnert B,Tauber S, Kriegmair M et al.(1999)
BTA-Trak- A useful diagnostic tool in urinary
Bladder cancer? Anticancer Research
19: 2615–2620
11. Malik Z, Lugaci H (1987) Destruction of
erythro-leukaemic cells by photoactivation of
endogenous porphyrins.Br J Cancer
56: 589–595
12. Murphy WM, Emerson LD, Chandler RW,
Moinuddin SM, Soloway MS (1986) Flow
cytomertry versus urinary cytology in the
evaluation of patients with bladder cancer.
J Urol 136: 815
13. Rübben H, Jocham D (1991) Therapie des
oberflächlichen Blasenkarzinoms.Urologe A
30: 2–9
14. Rübben H, Rathert P, Roth S, Hofstädter F,
Giani G,Terhost B, Friedrichs R (1989) Exfoliative Urinzytologie.Harnwegstumorregister,
4.Aufl.Fort- und Weiterbildungskommission
der Deutschen Urologen Arbeitskreis Onkologie, Sektion Urinzytologie
15. Steinbach P, Kriegmair M, Baumgartner R,
Hofstädter F, Knüchel R (1994) Intravesical
instillation of aminolevulinic acid (ALA): The
fluorescent metabolite is limited to urothelial
cells.Urology 44: 676–681
16. Tauber S, Kriegmair M, Schmeller N,
Hofstetter A, Stieber P, Mahnert B (1998)
Die Bedeutung des quantitativen NMP-22Tests in der Nachsorge von Blasentumoren.
Der Urologe A 37: 14
17. Zaak D, Hofstetter A, Baumgartner R et al.
(1999) Die 5-Aminolävulinsäure-induzierte
Fluoreszenzendoskopie des oberflächlichen
Harnblasenkarzinoms.Urologe B 39: 113–120
Der Urologe [A] 3•2001
| 221