Handhabung von Mikroorganismen

Handhabung von Mikroorganismen
„Handhabung von Mikroorganismen“
Inhalt:
1. Fragen zum Praktikum
2. Praktische Durchführung der Versuche
3. Literatur
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Handhabung von Mikroorganismen
1. Fragen zum Praktikum
1.1 Wie unterscheiden sich Prokaryonten und Eukaryonten?
Mikroorganismen sind in zwei Hauptgruppen unterteilt: die Eukaryonten und die
Prokaryonten.
Eukaryonten verfügen über einen echten Kern (karyon oder nucleus), der den größten Teil
des Genoms der eukaryotischen Zelle enthält. Die eukaryotische Zelle besitzt darüber
hinaus Organellen (Zellstrukturen, die in ihrer Funktion den Organen eines Lebewesens
entsprechen), die Mitochondrien bzw. bei Pflanzen die Chloroplasten, die einen anderen,
sehr kleinen Teil des Genoms in Form ringförmig geschlossener DNA – Moleküle
enthalten.
Prokaryonten fehlt ein von einer Membran umgebener Kern. Hier liegt die DNA als
ringförmig geschlossener Strang frei im Cytoplasma. Dieses Bakterien Chromosom enthält
alle zur Vermehrung der Zelle notwendigen Informationen. Die prokaryotische Zelle enthält
zusätzlich Plasmide (siehe Frage 6), die jedoch entbehrlich sind. Organellen sind keine
enthalten.
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1.2 Pasteurisieren, Sterilisieren, Ultrahocherhitzen,
Membranfiltration: Was ist das und was bewirken die Verfahren?
Pasteurisieren
Haltbarmachen von flüssigen Lebensmitteln (meist Milch) durch schonende Erhitzung auf
eine Temperatur von 55 °C bis 70 °C. Dabei werden Bakterien abgetötet, ohne eine
wesentliche Veränderung der Zusammensetzung, des Geschmacks sowie des Nährwertes
herbeizuführen. Der Name des Verfahrens ist nach dem französischen Chemiker Louis
Pasteur benannt, der es 1865 entwickelte, um das Vergären von Wein und Milch zu
verhindern. Milch wird beim Pasteurisieren 30 Minuten lang auf 63 °C erhitzt, anschließend
schnell abgekühlt und dann bei Temperaturen unter 10°C gelagert. Bier und Wein
pasteurisiert man durch zwanzigminütiges Erhitzen auf etwa 60 °C; bei einem neueren
Verfahren erhitzt man 30 Sekunden lang auf 70 °C und füllt die Getränke dann unter
keimfreien Bedingungen ab.
Grundlegende Regel: 80°C für 20 min.
Sterilisieren
Die Befreiung eines Materials von lebenden Mikroorganismen oder deren Ruhestadien
bezeichnet man als Entkeimung oder Sterilisation. Von der Sterilisation ist die
Teilentkeimung (Pasteurisieren) und auch die Konservierung zu unterscheiden. Die
Entkeimung oder Teilentkeimung erreicht man i.A. durch feuchte Hitze (andere
Möglichkeiten siehe Frage 3) in einem Autoklaven. Die vegetativen Zellen von Bakterien
und Pilzen werden schon bei Temperaturen um 60°C innerhalb von 5-10 min abgetötet,
Hefe- und Pilzsporen erst oberhalb 80°C und die Sporen von Bakterien oberhalb 120°C (15
min). Zu beachten ist: Je höher der Grad der Kontamination (Verunreinigung durch
unwillentlich eingeführte Mikroorganismen), also bspw. die Zahl der thermoresistenten
Sporen, um so länger muß erhitzt werden. Um Temperaturen über dem Siedepunkt des
Wassers zu erreichen, bedient man sich des Autoklaven. Die Sterilisationsdauer ist von der
Größe (Wärmekapazität) der zu sterilisierenden Geräte oder Behältnisse abhängig.
Grundlegende Regel: 120°C für 20 min.
Ultrahocherhitzen
Ultrahocherhitzen ist ein Verfahren um beispielsweise Milch haltbar zu machen. Dabei wird
die Milch für 10 Sekunden auf 135 bis 150°C erhitzt und sofort wieder auf 4 bis 5°C
heruntergekühlt. Alle lebenden Keime werden so abgetötet. Durch die hohen Temperaturen
verliert die Milch jedoch mehr wertvolle Vitamine und Geschmack als beim Pasteurisieren.
Das Ultrahocherhitzen stellt aber immer noch eine schonendere Methode Milch haltbar zu
machen dar, als das Abkochen. Die abgekühlte Milch wird anschließend Homogenisiert und
in sterile, lichtgeschützte Verpackungen abgefüllt. Im Handel wird die so behandelte Milch
als H-Milch angeboten und ist verpackt und bei Zimmertemperatur mindestens 6 Wochen
haltbar.
Membranfiltration
Verfahren: Bestimmung der Bakterienzahl in einer Wasserprobe durch Membranfiltration
Das Prinzip des Untersuchungsverfahrens ist die Anreicherung von Keimen aus einer
bestimmten Menge des zu untersuchenden Wassers auf der Oberfläche eines SartoriusMembranfilters durch Filtration. Der Membranfilter wird anschließend auf einen geeigneten
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Nährboden (je nach Art der nachzuweisenden Bakterien) aufgelegt und unter bekannten
Bedingungen (z.B. 48 Stunden bei 35oC) bebrütet. Aus dem Nährboden diffundieren die
Nährstoffe durch die Porenstruktur an die Keime (Bakterien) heran. Durch Teilung
entwickeln sich die Keime zu Kolonien. Diese Kolonien werden anschließend ausgewertet
und beurteilt. Die Apparatur besteht aus einem Filtrationsgerät für Unterdruck aus Edelstahl
und einem Edelstahlaufsatz (40 ml). Sie wird an eine Vakuumflasche luftdicht angeschlossen.
Durch die seitliche Öffnung ist die Vakuumflasche über ein Schlauchsystem mit
zwischengeschalteter Woulff' scher Flasche an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen. Zuerst
werden alle Teile aus Edelstahl durch Abflammen mit dem Bunsenbrenner sterilisiert. Dann
wird der geeignete Satorius-Membranfilter mit einer sterilen Pinzette in das Filtrationsgerät
eingelegt. Die Wasserprobe wird eingegossen und die Apparatur verschlossen. Durch
Anschalten der Wasserstrahlpumpe wird der nötige Unterdruck erzeugt, damit die Filtration
ablaufen kann. Inzwischen wurde die Nährkartonscheibe in eine sterile Petrischale gelegt und
ausreichend angefeuchtet. Der Membranfilter wird unter Vermeidung von Luftblasen auf die
Nährkartonscheibe gelegt. Die Petrischale wird bei 30oC für Gesamtkeimzahl und bei 37oC
für Escherichia-coli-Nachweis im Brutschrank ca. 48 Stunden bebrütet. Bei dem
Gesamtkeimzahlnachweis zeigen sich gelb bis rotgefärbte Kolonien, bei Nachweis von
Escherichia coli entstehen dunkelrote scharf konturierte Kolonien mit grünlichem Metallglanz
und dunkelrotem Punkt auf der Unterseite des Membranfilters.
Auswertung: Die Anzahl der entstandenen Kolonien auf dem Membranfilter entspricht der
Anzahl der Keime in der verwendeten Wasserprobe, der Wert wird nun auf die übliche
Einheit 1 Liter hochgerechnet.
Auszählmethode: Die wirksame Filtrationsfläche beträgt 12,5 qcm. Die Filterpapiere sind in
Quadrate von 9,6 qmm eingeteilt; ein Quadrat entspricht also 1/130 der Filtrationsfläche. Mit
Hilfe eines Binokulars werden entweder alle Keime gezählt oder einige Quadrate ausgezählt,
der Mittelwert gebildet und hochgerechnet.
Anforderungen an bestimmte Wasserqualitäten:
gesundes, als Trinkwasser brauchbares Wasser: maximal 100 000 Keime/Liter, aber keine
Colibakterien (vorher trotzdem abkochen!)
Badeanstalten mit natürlichem Wasserzufluß; dürfen maximal 1000 Colibakterien / Liter
haben
1.3 Beschreiben Sie weitere Methoden um bakterielles Wachstum zu
vermeiden bzw. zu verlangsamen
Trockene Hitze
Durch trockene Hitze werden Bakteriensporen erst bei höheren Temperaturen und bei
länger anhaltender Einwirkung abgetötet als durch feuchte Hitze. Gegen Hitze
unempfindliche Glasgeräte, Pulver, Öle und dgl. werden daher 2 Stunden bei 160°C in
einem Trockensterilisator entkeimt. Wenn es das zu sterilisierende Material erlaubt, erhitzt
man heute auf 180°C für 30 min. Erfahrungsgemäß werden dabei alle Sporen abgetötet. Die
Abtötung durch Hitze beruht auf der Koagulation der Zellproteine.
Bestrahlung
Von den zur Entkeimung bzw. Teilentkeimung gebräuchlichen Strahlungen (Ultraviolett-,
Röntgen-, Gammastrahlung) kommt der UV- Strahlung im Laboratorium die größte
Bedeutung zu. Die Strahlung der meisten UV- Lampen ist reich an den Strahlen der
Wellenlänge 260 nm, die vorzugsweise von den Nukleinsäuren absorbiert werden und bei
längerer Einwirkung zur Abtötung aller Bakterien führen. Die UV- Strahlung eignet sich zur
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Teilentkeimung von Räumen, wobei Bakterien rasch, die erheblich weniger
strahlungsempfindlichen Pilzsporen jedoch wesentlich langsamer abgetötet werden.
Ionisierende Strahlung
Röntgenstrahlen, Höhenstrahlen und Gammastrahlen, z.B. von 60Co, wirken durch die
Bildung von Hydroxylradikalen (OH.), die Makromoleküle zerstören. Zur Abtötung von
Zellen genügen bereits ungeheuer geringe Strahlendosen (Energiemengen). Dies ist
verständlich, da von dem Makromolekül DNA in einer Zelle nur eine einzige Kopie
vorliegt, während von Proteinen und Polysachariden viele Exemplare vorhanden sind. Ein
„Treffer“ in der DNA führt zum Zelltod, ohne dass an anderen Molekülen Veränderungen
nachweisbar sind. Ionisierende Strahlen können daher zur Entkeimung von Lebensmitteln
und anderen kompakten Materialien eingesetzt werden.
Chemische Mittel
Zur Sterilisation von Nahrungsmitteln, Pharmaka , Geräten und Apparaten sowie in der
Laboratoriumspraxis hat sich Ethylenoxid (Oxiran) bewährt. Es tötet sowohl vegetative
Zellen als auch Sporen ab, wirkt jedoch nur in Gegenwart von Wasser (5-15 %
Wassergehalt).
Kühlschrank
Die einfachste Methode das Wachstum zu verlangsamen, ist das Aufbewahren in einem
Kühlschrank, weil die meisten Kulturen erst bei Temperaturen ab 20°C „gerne“ wachsen.
1.4 Beschreiben Sie, wie man aus einer Bakterienmischkultur eine
Reinkultur herstellen kann
Anlegen einer Reinkultur
Mikroorganismen können aus der Natur isoliert werden durch Ausstrichverfahren:
Verdünnungsausstrich zum Isolieren von Einzelkolonien. Prinzip:
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Unter einer Reinkultur versteht man die Nachkommenschaft (Klon) einer einzelnen Zelle.
Eine Reinkultur herzustellen, die Reinheit zweifelsfrei zu beweisen und die Reinkultur von
Kontaminanten freizuhalten, ist die vornehmlichste Aufgabe des Mikrobiologen. Die
Isolierung einer Reinkultur von Mikroorganismen erfolgt bis auf Ausnahmen auf oder in feste
Nährböden. Sie beginnt mit der Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation
und erfordert, dass auch die aus der Zelle hervorgehende Kolonie von anderen Zellen oder
Kolonien getrennt bleibt.
Aerobe Bakterien werden nach dem Kochschen Plattengussverfahren oder – unter geringerem
Arbeitsaufwand – durch Ausstreichen mit einer Platindrahtöse auf einem Agarnährboden
vereinzelt (siehe Kapitel 2).
Anaerobe Bakterien werden in geschmolzenem, 45°C warmen Agar suspendiert und unter
Luftabschluß inkubiert (sieh Kapitel 2). Durch sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes
suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen bzw. Verdünnung in Agar lassen
sich die meisten Mikroorganismen in Reinkultur bringen.
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1.5 Sie wollen die Empfindlichkeit eines Bakteriums auf einige
Antibiotika testen. Wie gehen Sie vor?
Zum Nachweis von Antibiotika bzw. zum Testen der Empfindlichkeit eines Bakteriums auf
ein Antibiotikum wird ein Antibiotikumbildner auf den Mittelpunkt einer Nähragarplatte
aufgeimpft und die Indikatorbakterien radial strichförmig ausgestrichen (Strichtest). Nach
Bebrütung lassen sich aufgrund des Ausmaßes der Wachstumshemmung der verschiedenen
Indikatororganismen (es sind Hemmhöfe zu erkennen) Aussagen über das Wirkungsspektrum
des Antibiotikums machen. Die Antibiotika unterscheiden sich bezüglich ihrer Wirkung auf
Gram-positive und –negative Bakterien, auf Hefen, Dermatophyten und andere
Mikroorganismen in charakteristischer Weise.
Die meisten Antibiotika wurden im Zuge eines „Screening-Programms“ entdeckt. Darauf
wird hier aber nicht näher eingegangen.
1.6 Was ist ein Plasmid?
Viele Bakterien enthalten neben der chromosomalen DNA noch extrachromosomale DNA,
die ebenfalls als ringförmig geschlossener Doppelstrang vorliegt. Diese autonom
replizierenden DNA- Elemente werden als Plasmide bezeichnet.
Diese Plasmide enthalten sozusagen „Sonderinformationen“ des Bakteriums, die
weitergegeben werden. Z.B. die Information „Wie stelle ich ein Antibiotikum her?“ und
gleichzeitig, damit das Bakterium nicht selbst diesem gebildeten Antibiotikum zum Opfer
fällt, „Wie werde ich dagegen resistent?“.
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2. Praktische Durchführung der Versuche
2.1 Herstellung von Nähr – Agar (03.05.2001)
Der Nähr – Agar wurde nach Norm DEV / § 35 LMBG in folgender Zusammenstellung für
800 ml hergestellt:
•
•
•
•
Pepton
Fleischextrakt
NaCl
Agar
8g
8g
4g
14,4 g
Zusätzlich wurde folgender Nähr – Bouillon hergestellt:
•
•
•
Pepton
NaCl
Fleischextrakt
5g
2,5 g
5g
2.2 Sterilisation und Abgießen des Agars in Petrischalen
Der Nähr – Agar, der für das Mikroorganismen – Wachstum in Petrischalen notwendig ist,
wurde nun in einem Autoklav mit feuchter Hitze bei 120°C / 20 min sterilisiert (siehe Kapitel
1.2), um eine Kontamination auszuschließen.
Anschließend wurde der gesamte Nähr – Agar in Petrischalen ausgegossen (das Ausgussgefäß
wurde vor jedem Ausgießen über einen Bunsenbrenner gehalten, um eine Kontamination zu
vermeiden und anschließend wieder mit einem ebenfalls ausgebrannten Alu – Deckel wieder
verschlossen) und abgekühlt. Dabei musste auch beachtet werden, den Deckel der
Petrischalen nicht zu weit zu öffnen, um eine Kontamination durch in der Luft
umherfliegende Mikroorganismen zu vermeiden.
2.3 Probennahme und Auswertung (03.05. & 17.05.2001)
Nachdem der Agar in den Petrischalen ausgehärtet war, wurden verschiedene Proben von den
folgenden Gegenständen genommen:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
5 Luft – Proben, eine Schale blieb dabei ½ Minute geöffnet, die zweite 1 Minute, die
dritte 5 Minuten, die vierte 30 Minuten und die fünfte 44 Minuten, um den Verlauf der
Verunreinigung durch aus der Raumluft hineinfallende Mikroorganismen zu ermitteln.
Es wurden Fingerabdrücke genommen, von gewaschenen und ungewaschenen
Händen.
Geld in Form von Münzen und Scheinen
Speichel
Erde (mit Wasser verdünnt und dann aufgetragen)
Leitungswasser ohne Vorlaufen, Leitungswasser mit 5 Minuten Vorlaufen
Schuhspitze
Toilettendeckel
Haar
Türklinke
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Handhabung von Mikroorganismen
•
Husten
Die folgenden Ergebnisse konnten festgestellt werden:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Luftkontamination (in qualitativer Angabe der Kolonien)
½ min:
wenig (wahrscheinlich nicht vollkommen steril)
1 min:
keine
5 min:
wenig (ca. 4 Kolonien)
30 min:
wenig (ca. 10 Kolonien)
44 min:
viel (> 20 Kolonien)
Die Luftkontamination setzt also erst ab ca. 5 Minuten merkbar ein.
Fingerabdrücke:
Ungewaschene Hände:
viele Kolonien, viele Arten, auch Pilze
Gewaschene Hände:
das Ergebnis war nicht wesentlich besser bei
gewaschenen Händen (Kontamination des Wassers)
Geld:
10Pf Stück:
wenige Kolonien
2Pf Stück:
sehr wenige (wegen Grünspanbildung des Cu)
10FF Stück:
sehr viele Kolonien (wegen Silber / Nickel Legierung)
Speichel:
Sehr viele Kolonien
Erde:
Die Bodenprobe enthielt ebenfalls sehr viele Kolonien; festzustellen war außerdem,
dass fast ausschließlich helle bzw. transparente Organismen vorzufinden waren. Die
Verfärbung bei Luftorganismen ist ein Trick der Organismen, um sich vor Licht zu
schützen. Da die Bodenorganismen jedoch kaum mit Licht in Berührung kommen,
benötigen sie diesen Trick nicht.
Leitungswasser:
Ohne Vorlaufen:
sehr viele Kolonien
Mit Vorlaufen:
seltsamerweise fast noch mehr, was eigentlich nicht so
sein sollte
Schuhspitze:
Sehr viele Kolonien auch hier
Toilettendeckel:
Mit die höchste Kontamination. Hier konnten Organismen aller Farben und Formen
nachgewiesen werden.
Haar:
Zwei große Kolonien konnten hier erkannt werden.
Türklinke:
Nur eine Kolonie, was sehr erstaunlich war.
Husten:
Wenige Kolonien.
Gegen Ende wurden noch verschiedene Reinkulturzüchtungen nach dem unter Kapitel 1.4
beschriebenen Verfahren durch ausstreichen mit einer Platindrahtöse auf ein Nähr – Agar
angelegt.
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2.4 Auswertung der Reinkulturzüchtung (30.05.2001)
Die vier Reinkulturzüchtungen, die zum Ende des letzten Praktikums angelegt wurden,
erwiesen sich bis auf eine als nicht besonders Aussagekräftig, da durch Verschmierungen
nicht eindeutig eine einzige Reinkultur erzeugt werden konnte. Bei einer jedoch konnte mit
großer Sicherheit festgestellt werden, dass einzelne Kolonien als Klone eines einzigen
Organismus herangewachsen waren.
Mehr zur Reinkulturzüchtung und zur Vorgehensweise kann in Kapitel 1.4 nachgelesen
werden.
2.5 Anlegen einer BATCH – Kultur und Auszählen der entstandenen
Mikroorganismen (30.05. & 01.06.2001)
Batch – Kultur:
In dem oben dargestellten Diagramm kann der Verlauf des Wachstums einer statischen Kultur
(Batch – Kultur) entnommen werden. Die Kurve unterteilt sich in vier wichtige Bereiche:
1. Anlauf- (lag-) phase:
Die Anlaufphase umfasst das Zeitintervall zwischen der Impfung und dem Erreichen
der maximalen Teilungsrate. Die Dauer dieser Phase hängt unter anderem von der
Vorkultur und der Eignung der Nährlösung ab.
2. Exponentielle- (lg-) phase:
Ist die Anlaufphase überwunden beginnt das Wachstum der Zellen in exponentieller
Weise. Diese exponentielle (logarithmische) Wachstumsphase ist durch eine konstante
minimale Generationszeit charakterisiert.
3. Stationäre Phase:
Die stationäre Phase stellt sich ein, wenn die Zellen nicht mehr wachsen. Der
Übergang zur exponentiellen Phase erfolgt allmählich, weil durch die abnehmende
Substratkonzentration bereits vor dem völligen Verbrauch des Substrats eine
Herabsetzung der Wachstumsrate eintritt.
4. Absterbephase:
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Die Absterbephase und die Ursache des Absterbens von Bakterienzellen in normalen
Nährlösungen sind noch wenig untersucht.
Im Gegensatz zum Durchlaufverfahren gibt es keinen Zulauf und keinen Ablauf, die Zellen
sind also sich selbst überlassen.
In unserem Fall wurde ein Rotwein Hefe Bakterium verwendet, das in einen Reaktor gegeben
wurde. Alle 30 Minuten wurde eine Probe genommen und in einem Spektrometer untersucht.
Dabei wurde die Vertrübung im Vergleich zur ersten Probe jeweils bestimmt. Zusätzlich
wurde mit einer Thomakammer die Anzahl der Bakterien quantitativ unter dem Mikroskop
bestimmt.
Leider stellte sich im Laufe des Versuchs fest, dass die Kultur nicht im erwarteten Maße
anwuchs. Eine mögliche Erklärung wäre, dass das Wachstum in der lag-Phase feststeckte und
erst gegen Nachmittag / Abend richtig anglaufen wäre (der Versuch wurde um 8:00 Uhr
gestartet und gegen 14:00 Uhr abgebrochen).
Die bis dahin gewonnen Messdaten sind in folgender Tabelle aufgeführt:
Uhrzeit
11:50
12:10
12:25
12:40
Relative Trübung
0,05
0,072
0,097
0,116
∆min
0
20
35
50
Nach Abbruch des Versuchs wurde eine Verdünnungsreihe erstellt (siehe Kapitel 1.4) in
einem Verdünnungsbereich von 1/101 bis 1/1010.
Es folgte der Verdünnungsausstrich, der dann 1 Woche später zu folgenden Erkenntnissen
führte:
•
•
•
•
Es wurden in den einzelnen Petrischalen verschiedene Kulturen entdeckt, was
daraufhin deutet, dass eine Luft- oder sonstige Kontamination stattgefunden hat.
Bei den größten Verdünnungen wurden keine Kulturen entdeckt, erst ab 1/108 waren
Kolonien nachweisbar.
Es gab dann wieder Proben, bei denen keine Kolonien mehr zu erkennen waren,
obwohl die Verdünnung geringer wurde.
Lediglich bei den geringen Verdünnungen 1/109 und 1/1010 wurde das zu erwartende
Ergebnis erzielt
Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass der Verdünnungsausstrich wahrscheinlich
nicht steril angefertigt wurde bzw. den Organismen durch eine zu heiße Drahtöse oder einen
zu heißen Drigalsky Spatel verbrannt wurden.
3. Literatur
•
Hans G. Schlegel
„Allgemeine Mikrobiologie“
•
Webseite der FH-Heilbronn:
http://www.wb.fh-heilbronn.de/bionet/grundlagen.html
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