Chloroform, Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol Extraktion

Molekularbiologisches Praktikum
Phenol, Phenol/ Chloroform, Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol
Extraktion
Da für Molekularbiologische, Biochemische und Gentechnische Verfahren möglichst reine
Nukleinsäuren benötigt werden, müssen diese von den Proteinen aus der lysierten Zelle
deaktiviert und getrennt werden. Einer der wichtigsten Verfahren zur Trennung von
Proteinen und Nukleinsäuren ist die Phenol bzw. Phenol/ Chloroform bzw. Phenol/
Chloroform/ Isoamylalkohol Extraktion. Die Proteine werden durch das Phenol denaturiert.
Die Phenol Extraktion ist hocheffizient, da schon nach 3 Phenol Extraktionen sehr reine
Nukleinsäure-Fraktionen erhalten werden können. Die DNA bzw. auch RNA sammelt sich
in der wässrigen Phase an und kann leicht von der Zwischenphase getrennt werden.
Das Phenol sollte für eine DNA Extraktion Tris- bzw. TE- gepuffert sein und ein pH-Wert
von 7,8 haben. Für die RNA Aufreinigung wird in Aqua. Dest. Gelöstes Phenol verwendet,
dass einen pH-Wert von 4,8 besitzt. Bei diesem pH-Wert wird die DNA gezwungen, sich in
der organischen und der Protein- Interphase anzureichern, dies verringert eine
Kontamination der RNA durch DNA. Meistens befindet sich die wässrige Phase oben,
allerdings können sich auch beide Phasen mischen, sogar invertieren (Wenn große
Mengen gelöste Stoffe enthalten sind z.B. Salze oder Zucker.). Das Invertieren kann durch
eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform verhindert werden, da aufgrund der
höheren Dichte des Chloroforms eine klare Unterscheidung beider Phasen möglich ist.
Isoamylalkohol kann hinzugegeben werden um das Schäumen der Organischen Phase zu
verhindern, welches das pipettieren stark behindern kann.
Sicherheitshinweis:
Phenol ist giftig, ätzend und mutagen. Chloroform steht im Verdacht Krebs zu erzeugen!
Isoamylalkohol ist entzündlich und reizend. Versuche sollten unter dem Abzug
durchgeführt werden.
Hinweis:
Verwenden Sie nur Phenol welches keine Oxidation aufweist (rote Verfärbung)!
Chemikalien:
Phenol bzw.
Phenol/ Chloroform bzw.
Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol
Chloroform
Ethanol bzw. 2- Propanol
Durchführung:
1. Geben Sie die Nukleinsäure haltige Probe in ein PCR Reaktionsgefäß und geben
Sie 1 Volumen (z.B. 500µl) Phenol bzw. Phenol/ Chloroform bzw. Phenol/
Chloroform/ Isoamylalkohol hinzu.
2. Zur Isolation von kleinen DNA/ RNA Molekülen (<100 kb) wird die Probe gevortext,
b) mittlere DNA Moleküle (10-30 kb) durch leichtes Schütteln oder durch schnelles
Kippen, c) große DNA Moleküle (>30kb) z.B. durch Drehen auf einem Radschüttler.
3. Probe wird nun eine Minute bei 80% zentrifugiert, sollte danach keine klare
Trennung der Phasen zu erkennen sein, kann weiter bis 10 min. lang zentrifugiert
werden. An der Grenzlinie zwischen den Phasen müsste nun eine denaturierte
weiße Ansammlung von Proteinen zu sehen sein.
4. Die wässrige Phase (meistens oben) kann nun mit einer Pipette abpipettiert werden
und in ein neues PCR Reaktionsgefäß gegeben werden. Die mittlere und untere
Phase kann verworfen werden.
5. Schritte 1 – 4 werden solange wiederholt, bis keine Proteine mehr zu erkennen
sind.
6. Zur Reinigung der Nukleinsäure von Phenol wird 1 Volumen Chloroform hinzu
gegeben und Schritte 2 – 4 wiederholt. (Sollte nur Phenol verwendet worden sein,
sollte dieser Schritt 2x erfolgen!)
7. Rückgewinnung der Nukleinsäure durch Präzipitation mit 2 Volumina Ethanol,
alternativ 2- Propanol.
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