Bewertung des Bakterienkolonisierungsgrades auf mit easy
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Bestimmung des Grades bakterieller Kolonisierung auf mit dem Mittel easy-on™ gestrichenen Oberflächen Projektbericht entworfen für: Urban Hygiene Limited Sky Business Park Robin Hood Airport Doncaster England DN9 3GA Vorbereitet von: Dr. Jamie Young und Dr. Justine Daniels Biomedical Research Centre Autoren: Dr. Jamie Young Handelsforscher BMRC Sheffield Hallam University 7th Floor Norfolk Building Sheffield S1 1WB Juni 2006 Absatz A: Kolonisierung auf gestrichenen Oberflächen Absatz B: Bakterienfortbestand auf gereinigten Oberflächen Absatz C: Allgemeine Schlussfolgerung Absatz A: Kolonisierung auf gestrichenen Oberflächen Zusammenfassung Mit dauerhaftem Anstrich easy-on™ gestrichene, 20 mm dicke Platten, wurden auf Resistenz auf Bakterienkolonisierung innerhalb von 5 Tagen getestet. Das Wachstum von sieben pathogenen Bakteriensorten wurden während dieser Zeit verfolgt, wobei die Bakterien auf die Platten sowohl in zwei Nährstoffbindemittel hinzugegeben wurden, als auch in einfacher salziger Pufferlösung. Es wurde nachgewiesen, dass mit dem Anstrich easy-on™ gestrichene Platten die Kolonisierung und Wachstum von Bakterien Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica subs. enterica und Pseudomonas aeruginosa nach drei Tagen verhindern. Der Fortbestand der Bakterie Klebsiella pneumoniae wurde auch wesentlich Vermindert. Materialien und Methoden Bakteriensorten Sorte ATCC Identifizierungsnummer (American Type Culture Collection) Staphylococcus ATCC 12600 aureus subsp. aureus Escherichia coli ATCC 11775 Listeria monocytogenes ATCC 15313 Salmonella enterica subs enterica Bacillus cereus ATCC 43971 Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae Pseudomonas aeruginosa ATTC 13883 ATTC 14579 ATTC 10145 Beschreibung Wachstumsmedium Grampositiv, häufig Hautorganismus Nährungsbrühe Grampositiv, übliches Darmorganismus, einige Stämme pathogen Grampositiv, 10% der Menschen sind Träger, kann bei einigen Patienten seriöse Infektionen erregen Grampositiv, oft Erreger der Salmonellenvergiftung Nährungsbrühe Grampositiv, Erreger von Lebensmittelvergiftung. Erzeugt wärmewiderständige Sporen, die auch auf einige Desinfektionsmittel resistent sind. Grampositiv, oft erreger der noskomialen Lungenentzündung Nährungsbrühe Grampositiv, vierter üblicher Erreger von Krankenhausinfektionen. Erfordert sehr einfache Nährungsbindemittel und kolonisiert Oberflächen sehr leicht. BHI-Brühe CASO-Brühe Nährungsbrühe Nährungsbrühe Alle verwendeten Bakteriensorten wurden in Form vakuumgetrockneter Kulturen von der Firma DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Baunschweig, Deutschland) geliefert. Bindemittel Nährungsagar/-Brühe, Caso-Agar/-Brühe und BHI-Agar/-Brühe geliefert von der Firma Sigma-Aldrich (UK) Nährungsbrühe/Agar Pepton 5,0 g Fleischextrakt 3,0 g Agar, nach Bedarf 15,0 g Destilliertes Wasser 1000,0 g pH-Wert anpassen auf 7,0 Caso-Brühe/Agar Pepton vom Kasain 15,0 g Pepton vom Sojamehl 5,0 g NaCI 5,0 g Agar, nach Bedarf 15,0 g Destilliertes Wasser 1000,0 ml pH-Wert anpassen auf 7.3 BHI-Brühe/Agar BHI 37,0 g Agar, nach Bedarf 15,0 g Destilliertes Wasser 1000,0 ml Puffer und Lösungen Ringerlösung ¼ Natriumchlorid 2,25 g/L Kaliumchlorid 0,105 g/L Kalziumchlorid 6H2O 0,12 g/L Natriumbikarbonat Destilliertes Wasser bis 1000,00 ml pH 7,0 Alle in dieser Untersuchung verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden von der Firma Sigma-Aldrich (UK) geliefert, ausser es wird anders angeführt. Methode Sterilisierung gestrichener Platten 22 mm dicke und mit easy-on™ gestrichene Platten wurden 30 Minuten lang in 90%-iges Ethanol getaucht. Nach der Sterilisierung wurden die Platten in steriler Luftführungshutze luftgetrocknet. Wachstum von Bakterienkulturen Getrocknete Kulturen wurden 30 Minuten lang auf entsprechendem Bindemittel resuspendiert, danach gelagert in Kolben mit 250 ml Nährungsbrühe, Caso-Brühe oder BHIBrühe. Die Kolben wurden über Nacht auf 37ºC ausgebrütet. Nach der Ausbrütung wurden die Kulturen zentrifugiert und das Bindemittel wurde beseitigt. Die Zellen wurden danach in ¼ Ringerlösung resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Der Überstand wurde beseitigt und die Zellen wurden suspendiert im Bindemittel oder in der Ringerlösung, um eine Arbeitskonzentration von 107 Zellen/ml zu erreichen. Die Zellenanzahl wurde mit Hilfe des Hemocytometers und Lichtmikroskopie gezählt. Bakterienanbringung auf die Platten 200 μl gewaschener und resuspendierter Zellen wurden jeder gestrichenen Platte hinzugefügt. Zur negativen Kontrolle wurde steriles Nährungsmedium bzw. sterile Ringerlösung auf zusätzliche Platten hinzugegeben. Es wurde auch eine Gruppe von Platten genutzt, wo keine Bakterienzellen oder Bindemittel/Ringerlösung hinzugegeben waren. Die Platten wurden danach in sterile Petrischalen gelegt und aufgebrüht bei 22ºC. Bemusterung gestrichener Platten Die Platten wurden am Tag 0, 1, 3 und 5 ab der Hinzugabe der Bakterienkulturen bemustert. Jede Platte wurde in eine sterile Universalröhre samt 5 ml Ringerlösung gelegt. Die Röhren wurden 10 Minuten lang im Griffin-Schüttler geschüttelt zwecks Bakterienbeseitigung von gestrichenen Oberflächen. Eine Serie von Verdünnung in Ringerlösung wurde gemacht. Danach wurde 200 μl von 103-, 104- und 105-facher Lösung auf die entsprechenden Agarplatten gegeben. Die Platten wurden über Nacht zur Ausbrühung bei 37ºC gelassen. Am nächsten Morgen wurden Zellen gezählt. Jedes Experiment wurde auf dreifachen Platten wegen Reproduktionsmöglichkeit durchgeführt. Analyse Es wurde die arithmetische Mitte jeder wiederholten Gruppe genommen und die Standardabweichung errechnet. Ergebnisse Staphylococcus aureus Bei Bakterien, die in der Ringerlösung suspendiert waren, wurde komplette Eliminierung der Kulturzellen am dritten Tag bemerkt. Am fünften Tag wurde das bei in Nährmedium suspendierten Bakterien bemerkt. Der Verlust von Bakterienzellen verlief ziemlich schnell, mit Abfall von 107 cfu/ml bis 2x104 cfu/ml in der Ringerlösung und 7x104 cfu/ml im Nährungsmedium bis Tag 1 (Darstellung 1). Darstellung 1 Konzentration der Bakterienzellen von Staphylococcus aureus, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Schlussfolgerungen Das Anstrichmittel easy-on™ verhindert die Kolonisierung von Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica subs enterica und Pseudomonas aeruginosa nach drei Tagen auf gestrichenen Oberflächen. Das Anstrichmittel easy-on™ vermindert wesentlich den Fortbestand der Bakterie Klebsiella pneumoniae in puffriger Lösung nach Hinzugabe auf die behandelte Oberfläche. Das Anstrichmittel easy-on™ verhindert nicht die Kolonisierung von E. coli oder Bacillus cereus. Es wird jedoch die Verminderung der Zellenanzahl bemerkt. Wenn Verminderung der Zellenanzahl bemerkt wird, ist das üblicherweise bei Zellen, die in einfacher salziger Pufferlösung resuspendiert wurden. Absatz B: Bakterienfortbestand auf mit Daueranstrichmittel easy-on™ behandelten Oberflächen nach Anwendung des Desinfektionsmittels Presept (Dichloroisocyanurat) Zusammenfassung Holzplatten wurden mit Emulsionsfarbe auf Vinylbasis, Acrylfarbe oder dauerhaftem Anstrichmittel easy-on™ gestrichen. Es wurden Bakterienkulturen hinzugefügt, wonach die Oberflächen mit 1000 ppm Lösung des Produkts Presept (Johnson & Johnson, USA) gereinigt wurden. Nach der Reinigung wurden die Holzplatten 1 und 3 Tage lang auf Agarplatten aufgebrüht. Die Ergebnisse zeigen, dass mit dem Produkt behandelte Holzplatten durch einfaches Reinigungsverfahren von Bakterien befreit werden. Auf dem mit Emulsions- oder Acrylfarbe gestrichenen Platten haben die Bakterien auch nach Reinigung überlebt. Klebsiella pneumoniae Es wurde nachgewiesen, dass die Zellen nach Resuspension der Bakterien in Ringerlösung vollständig eliminiert werden; die Zellenanzahl ist jedoch nur auf 2,7x104 cfu/ml am fünften Tag gesunken, als die Bakterien im Medium resuspendiert wurden (Darstellung 6). Darstellung 6 Konzentration der Bakterienzellen Klebsielle pneumoniae, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Pseudomonas aeruginosa Bei Zellen, die in Ringerlösung suspendiert waren, wurde vollständiger Verlust von lebensfähigen Zellen am dritten Tag bemerkt, während bis zum fünften Tag bei im Medium suspendierten Zellen das Gleiche zu bemerken war. Zum langsameren Abfall der Zellenanzahl ist es bei Bakterien im Bindemittel gekommen, verglichen mit Bakterien in Ringerlösung (Darstellung 7). Darstellung 7 Konzentration der Bakterienzellen Pseudomonas aeruginosa, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Negative Kontrollen Keinerlei Bakterienwachstum wurde bei in diesem Experiment durchgeführten negativen Kontrollen bemerkt. Salmonella enterica subsp. enterica Es wurde vollständige Eliminierung von Bakterienzellen bis zum dritten Tag bei beiden Zellensuspensionen bemerkt. Bei den in Ringerlösung resuspendierten Bakterien war der Anzahlverlust etwas schneller im Vergleich zu Nährungsbindemittel, da die Zellenanzahl auf 7.6x104 cfu/ml, bzw. auf 1,8x105 cfu/ml bis zum ersten Tag gefallen ist (Darstellung 4). Darstellung 4 Konzentration der Bakterienzellen Salmonella enterica subsp. enterica, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Bacillus cereus Bakterienzellen waren im hohen Masse noch immer lebensfähig, sowohl in Ringerlösung, als auch im Nährstoffbindemittel. Die Zellenanzahl ist zwar gesunken, aber es wurde bemerkt, dass sie eine stabile Ebene von 3,1x104 cfu/ml in Ringerlösung und 1,2x104 cfu/ml im Nährstoffbindemittel bis zum dritten Tag erreicht hat. Es war kein bedeutsamer Unterschied zwischen der Zellenkonzentration in Ringerlösung und Nährstoffbindemittel bis zum fünften Tag festzustellen (Darstellung 5). Darstellung 5 Konzentration der Bakterienzellen Bacillus cereus, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Escherichia coli Es wurden lebensfähige Zellen von E. Coli am fünften Tag gefunden. Die Zellenanzahl hat sich mit der Zeit wirklich vermindert, ohne bedeutsamen Unterschied zwischen Nährstoff und Ringerlösung. Die finale Zellenkonzentration war 3,9x103 cfu/ml für die Ringerlösung und 2,5x103 im Bindemittel (Darstellung 2). Darstellung 2 Konzentration der Bakterienzellen Escherichia coli, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Listeria monocytogenes Vollständige Eliminierung der Zellen in Ringerlösung wurde bis Tag 3 bemerkt; bis Tag 5 auch im Nährstoffbindemittel. Die Verminderung der Zellenanzahl ist viel schneller bei in Ringerflüssigkeit suspendierten Bakterien, dessen Anzahl schon am Tag 1 auf 2,5x103 cfu/ml gesunken ist. Im Vergleich dazu war die Bakterienanzahl von in Nährstoff suspendierten Zellen 7,9x104 cfu/ml (Darstellung 3). Darstellung 3 Konzentration der Bakterienzellen Listeria monocytogenes, die in Zeitspannen auf gestrichene Platten hinzugefügt wurden. Fehlerbalken verweisen auf Standardabweichungen. Materialien und Methoden Bakterienstämme Bei diesem Experiment wurden die gleichen sieben Bakteriensorten wie im Absatz A verwendet. Plattenvorbereitung Holzplatten wurden mit matter Emulsion auf Vinylbasis gestrichen und mit dem Anstrichmittel easy-on™ bzw. Acrylfarbe gestrichen. Die Holzplatten wurden mit 1000 ppm Presept-Lösung vor Anbringung von Bakterienkulturen gereinigt. Bakterienanbringung Bakterienkulturen wurden über Nacht bei 37ºC aufgebrüht und danach im Kulturbindemittel verdünnt, um eine Bakterienkonzentration von 107 Zellen ml-1 zu erreichen. 100μl Bakterienkulturen wurden dann jeder Platte hinzugefügt und bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang aufgebrüht. Nach der Aufbrühung wurden die Platten zwei Mal mit sterilem Tuch gereinigt, das vorher in 1000 ppm Prepesept-Flüssigkeit getaucht wurde. Es wurde die allgemeine Reinigungsaktivität simuliert, und zwar so, dass die Holzplatten bei jedem Schritt zwei Mal in vertikaler Richtung geputzt wurden. Danach wurden die Platten nach unten gedreht und 30 Minuten lang auf nährstoffreiche Agarplatten gelegt, um den Bakterien den Übergang auf die Agarplatte zu ermöglichen. Danach wurden die Holzplatten weggeräumt und die Platten bei 37ºC über Nacht aufgebrüht. Bakterienkolonien wurden gezählt. Das Verfahren wurde dann mit Bakterien wiederholt, die drei Tage lang vor Reinigung auf Platten aufgebrüht wurden. Ergebnisse Es wurde nachgewiesen, dass auf mit dem Mittel easy-on™ gestrichenen und nachträglich mit der Lösung Presept gereinigten Platten, die Bakteriensorten nach 30 Minuten und drei Tagen Ausbrühung nicht überlebt haben. Nach 30 Minuten Ausbrühung und Reinigungsverfahren, haben alle Bakteriensorten E. coli, L monocytogenes, Staph. aureus und B. cereus überlebt, und zwar auf beiden mit Acrylfarbe und Emulsion behandelten Platten (Darstellung 1). Salm. enterica, K pneumoniae und Ps. aeroginosa haben nur auf mit Acrylfarbe gestrichenen Oberflächen überlebt. Die Ergebnisse nach 3 Tagen Ausbrühung waren identisch, mit gleichem Fortbestandsmuster. Darstellung 1 Fortbestand von Bakteriensorten auf Platten mit unterschiedlich angestrichenen Oberflächen nach 30 Minuten und Reinigungsverfahren. Schlussfolgerungen Nach dem Reinigungsprozess wurden alle Bakterien von den mit dem Mittel easy-on™ behandelten Oberflächen beseitigt. Die mit Acrylfarbe gestrichenen und nach der Reinigung getesteten Platten haben den Fortbestand von allen sieben Bakteriensorten ermöglicht. Die mit Emulsionsfarbe gestrichenen Oberflächen haben den Fortbestand der Bakterien Bacillus cereus,Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Listeria monocytogenes ermöglicht. Absatz C Allgemeine Schlussfolgerung Das Anstrichmittel easy-on™ verhindert die Kolonisierung einiger pathogener Bakteriensorten, einschliesslich Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica und Pseudomonas aeruginosa auf behandelten Oberflächen. Die mit dem Anstrichmittel easy-on™ gestrichenen Oberflächen sind leichter zu Reinigen als ungeschützte Flächen, die mit einfacher Farbe gestrichen wurden. Der dauerhafte Anstrich ermöglicht Dekontaminierung der Oberflächen durch Anwendung einfacher Reinigungslösungen, ohne die Oberflächen zu beschädigen. Die mit dem Anstrichmittel easy-on™ gestrichenen und mit Bakterien kontaminierten Oberflächen können gründlich mit einfacher Lösung gereinigt werden, wobei die Bakterien zu 100% beseitigt werden. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Bacillus cereus, Klebsiella pneumonia und Pseudomonas oeruginosa sind vollkommen von den gestrichenen Oberflächen nach Reinigung beseitigt. Im Gegensatz dazu haben sich Bakterien auf mit einfacher Farbe gestrichenen Oberflächen auch nach Reinigung erhalten.
