A7, Heckl: Genome Editing beim Menschen
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CRISPR-Cas9: Prinzipien und Anwendung der Genomeditierung 28.11.2016, Wissenswerte, Bremen Dirk Heckl Pediatric Hematology & Oncology Genome Editing und CRISPR-Cas9 Genome Editing: Genmodifikation durch DNA-Schädigung Genome Editing und CRISPR-Cas9 ZFNs & TALENs – Fakten & Probleme • Genomeditierung seit ~1996 • Modularer Aufbau aus DNA-bindenden Proteinbausteinen aufwändige Generierung • Externe Nuklease (Fok-I) als Dimer Spezifität: • Zwei Module mit 18-36 Basen Spezifität • Off-target on-the-fly (Dimerisierung ohne DNA-Bindung) Porteus&Carroll, Nat.Biotech 2004 Zink-Finger-Nukleasen -Klinische Studie gegen HIV Ausbreitung- • CCR5: Ko-Rezeptor von HIV • CCR5 ∆32 in 3% der mitteleuropäischen Bevölkerung, vermittelt Resistenz • Modifikation of T-Zellen der Patienten mittels CCR5-ZFN Ergebnis • Wirksamkeit in 1/12 Patienten • Keine Nebenwirkungen Tebas et al, NEJM 2014 Genome Editing und CRISPR-Cas9 Ursprung des Namens: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Cas9 Faszinierende Einfachheit trifft höchste Effizienz Cas: DNA-Bindung, RNA-Bindung, Topoisomerase, Nuklease (2x) Jinek et al., Science 2012; Cong et al., Science 2013; Mali et al., Science 2013 Die Evolution des Genome Editing 1: ZFN1 TALEN2 Ursprung Eukaryotic (Human) Prokaryotic Prokaryotic (Pflanzenpathogen) (Humanpathogen) Erstmals ~1996 2009/2010 2012/2013 Prinzip Protein:DNA Protein:DNA Protein:RNA:DNA Flexibilität (Design) niedrig hoch sehr hoch Activität variabel hoch hoch Toxizität (akut) hoch niedrig niedrig Kosten sehr hoch hoch niedrig Zinc Finger Nucleases Transcriptional Activator Like Effector Nucleases 3: Clustered Regularly Interspaced Short Palnindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-associated 9 2: CRISPR-Cas93 Das Off-Target Dilemma - Fazit 1. CRISPR-Cas9 bindet und schneidet nicht 100% kontrolliert 2. Die Off-Target Aktivität ist abhängig vom Ziel individuelles Ermitteln notwendig 3. Die Cas9 Bindung ist abhängig vom Status der DNA (Hetero-/Eu-chromatin) Off-target damit Zelltypabhängig 4. Off-Target Aktivität kann effektiv unterbunden werden • • • • min. 3 Fehlpaarung zu jeder anderen Stelle im Genom Kürzung der gRNA von 20 auf 18 Basen Verdoppelung der Zielsequenz Modifizierte Cas9 Varianten mit niedriger Off-Target-Aktivität Mit Kombination dieser Ansätze kann CRISPR-Cas9 als “sicher” betrachtet werden CRISPR-Cas9 - Applikationen Gentherapie Duchenne Muscular Dystrophy - alle Muskeln betroffen - in iPSC (in vitro) - in vivo (lokal) Young et al., Cell Stem Cells 2016 Tabebordbar et al., Science 2016 Gentherapie: angeborene Tyrosonämie Genkorrektur des FAH (fumarylacetoacetate hydrolase) Gens korrigiert TyrosinAbbau und verhindert Leberschäden Yin et al, Nat Biotech 2014 Genome Editing in der Gentherapie 1. Gentherapie erblicher Erkrankungen: maximal auf pre-klinischem Stadium 2. Erkrankungen im blutbildenden System durch Modifikation adulter Stammzellen (z.B. X-SCID, WASP, CGD, Sichelzell-Anämie, Thalassämien,…) 3. Metabolische Erkrankungen durch direkte Modifikation der Leber (oder des entsprechenden Organs) 4. Krebstherapie: Modifikation von T-Zellen genehmigt (USA) Modifikation von Keimbahnzellen (1) -CRISPR-Cas9 in humanen Zygoten- - β-Thalassämia (Defekt in ß-Globin (HBB)) Gentherapie Ansatz - Mikroinjektion von Cas9 mRNA und gRNA - Tripronukleäre Zygoten (normal 2PN) aus Cryokonservierung Liang et al., Protein Cell 2015 Modifikation embryonaler Zellen -CRISPR-Cas9 in humanen Zygoten- Durchschnittliche Schnittrate Rekombination mit homologem Gen (HBD) Unerwartete Off-Target Aktivität Liang et al., Protein Cell 2015 Modifikation von Keimbahnzellen (2) -CRISPR-Cas9 in humanen Zygoten- - CCR5 (anti-HIV) Gentherapie Ansatz Mikroinjektion von Cas9 mRNA und gRNA Tripronukleäre Zygoten (normal 2PN) aus Cryokonservierung Keine “off-target” Analyse Mäßige Effizienz Kang et al., JARG 2016 Fazit 1. CRISPR-Cas9 ist in jedem bisher getesteten Organismus anwendbar 2. CRISPR-Cas9 ist die effizienteste und flexibelste Genome Editing Technologie 3. Genome Editing hat das Potential nahezu jede angeborenen, genetische Krankheit zu heilen 4. Adulte Stammzellen oder ausgereifte Organe modifizierbar Keimbahnmodifikation nur sinnvoll, wenn Gesamtorganismus betroffen 5. Die finale Frage der Sicherheit von CRISPR-Cas9 ist nicht geklärt Testung und Vergleich von Methoden unter definierten Bedingungen in Zielzellen 6. Das Risiko der Behandlungsmethode sollte gegen das Risiko der Krankheitsfolgen abgewogen werden
