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Pyrosequencing –
eine neue und vielseitige Technologie
Flexible DNA Sequenzierung in Kombination mit präziser Quantifizierung
Nicht selten zeigen Medikamente bei
verschiedenen Patienten unterschiedliche Reaktionen. So kann eine bei
einer Person gut wirksame Behandlung bei einer anderen Person gar
keinen Effekt haben oder sogar zu
unerwünschten Nebenwirkungen führen. Dies liegt hauptsächlich an der
Variabilität des menschlichen Genoms.
Das Wissen um die individuellen genetischen Unterschiede soll Ärzten daher
bei der Auswahl der geeigneten und
auf den Patienten zugeschnittenen
Therapie helfen. Dies verspricht die
personalisierte Medizin.
Die Grundlage der personalisierten Medizin ist die Pharmakogenomik – die Erforschung der physiologischen Reaktion einer Person auf Medikamente je nach
genetischer Veranlagung. Sie ermöglicht
es Medizinern, die Therapien bezüglich
Effizienz und Effektivität individuell auf
den Patienten anzupassen. Vor allem im
onkologischen Bereich hat das Interesse
an personalisierter Medizin jüngst stark
zugenommen. Ein deutlicher Fokus liegt
hierbei bei der Bestimmung von genetischen Parametern, anhand derer Patientenpopulationen unterteilt werden kön-
nen, um spezifische Behandlungsmethoden
anzubieten. Eine der vielversprechendsten Technologien auf diesem Gebiet ist Pyrosequencing.
Pyrosequencing – eine schnelle, zuverlässige und sensitive Methode für die
Krebsforschung
Pyrosequencing beruht auf dem Prinzip
der Sequenzierung durch Synthese (siehe
Abbildung 1) und liefert Sequenzinformationen in Echtzeit. Im Gegensatz zu anderen Routinetechnologien der Molekulardiagnostik (wie z. B. PCR) liest Pyrosequencing
die DNA Sequenz. Anders als PCR, die nur
bekannte Sequenzen detektiert, erlaubt
Pyrosequencing die Erfassung sämtlicher,
d.h. bekannter und unbekannter Mutationen im betrachteten Genbereich. Während
Mutations- und Methylierungsanalysen
nach der traditionellen Sanger-Sequenzierungsmethode wenig sensitiv sind und
spezielle quantitative Sanger-Sequenzierungen zeit- und arbeitsintensive Klonierungen von PCR Produkten erfordern, bietet Pyrosequencing einfaches und flexibles
Sequenzieren (ohne notwendige Klonierungen) in Kombination mit hochgradig
präziser Quantifizierung in kurzer Zeit.
Pyrosequencing ist in der Krebsforschung sehr gut einsetzbar, es ermöglicht
beispielsweise die Detektion und Quantifizierung mehrerer und/oder komplexer
Mutationen in nur einem einzigen Test. Im
Gegensatz zu Real-Time-PCR Methoden
können dabei auch unbekannte Mutationen erkannt werden. Die Technologie ist
darüber hinaus ideal für die Quantifizierung von Methylierungen an mehreren
aufeinander folgenden CpG-Dinukleotiden. Des Weiteren können im gleichen Assay Single Nucleotide Polymorphismen
(SNPs) bestimmt werden. Pyrosequencing
ist ebenfalls wichtig für die Quantifizierung von Loss of Heterozygosity (LOH),
die z. B. bei der Identifizierung von Tumorsuppressorgenen hilft.
Große Aufmerksamkeit seitens der
Krebsforschung/-therapie erhält momentan ein spezieller Anwendungsbereich
rund um das KRAS Gen.
KRAS und Krebs
KRAS ist ein Onkogen, das eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Tumoren spielt. Mutationen innerhalb der
RAS-Familie (diese beinhaltet HRAS,
NRAS und KRAS) sind sehr häufig und
Schritt 1: Nach Anlagerung eines Sequenzierprimers an das zu sequenzierende einzelsträngige DNA Fragment werden die Enzyme DNA
Polymerase, ATP Sulfurylase, Luziferase und
Apyrase sowie die Substrate Adenosin 5’
Phosphosulfat (APS) und Luziferin zugegeben
Schritt 2: Das erste Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) wird automatisch in den
Reaktionsansatz dispensiert. Die DNA Polymerase baut das dNTP in den DNA Strang ein,
wenn es komplementär zur Base des Templates ist. Beim Einbau wird Pyrophosphat (PPi)
in äquimolarer Menge zum eingefügten Nukleotid frei.
Schritt 3: ATP Sulfurylase katalysiert die
Umwandlung von PPi und APS in ATP. Dieses
ATP wird von der Luziferase zur Umwandlung
von Luziferin in Oxyluciferin benötigt. Die
dabei frei werdende Lichtmenge ist proportional zur Menge an ATP. Das Licht aus der Luziferase-katalysierten Reaktion wird mit einem
CCD-Chip quantifiziert, in einer Software
verarbeitet und als sog. Pyrogramm grafisch
dargestellt.
Schritt 4: Apyrase baut kontinuierlich nicht
eingebaute Nukleotide und ATP ab. Wenn der
Abbau abgeschlossen ist, wird das nächste
Nukleotid hinzugefügt und der Zyklus beginnt
wieder bei Schritt 2.
Schritt 5: Die Zugabe der dNTPs folgt entsprechend der vorgegebenen Sequenz nacheinander. Statt Desoxyadenosintriphosphat (dATP)
wird dabei Desoxyadenosin alfa-thio triphosphat (dATP∙S) eingesetzt, da es von der DNA
Polymerase verwendet, aber nicht von der
Luziferase erkannt wird. Während des Pyrosequencing Laufes wird der zum Template komplementäre DNA Strang synthetisiert, und
anschließend die Sequenz durch Auswertung
der Peakhöhen im Pyrogramm bestimmt.
Abb. 1: Das Prinzip des Pyrosequencing
Pyrosequencing folgt einer Reihe verschiedener Schritte für jedes sequenzierte Nukleotid. Die Technologie basiert auf dem Prinzip der Sequenzierung durch Synthese und liefert quantitative Daten im
Sequenzkontext.
führen zu einem permanent aktiven RASProtein, welches in bis zu 30 % aller
menschlichen Tumore auftritt. Es wird
vermutet, dass solch eine onkogenetische
Aktivierung in vielerlei Aspekte der
Krebsentstehung und -progression involviert ist, wie z. B. entartetes Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung sowie
auch gesteigerte Invasion und Metastasierung (siehe Abb. 2). KRAS ist in ungefähr 35–45 % aller metastasierenden kolorektalen Krebserkrankungen (CRC),
15–50 % aller Lungenkrebse und 72–90 %
aller Pankreaskarzinome mutiert. Die
Mutationen wurden in verschiedenen Codons, wie zum Beispiel Codon 12,13 und
61 gefunden.
Studien haben gezeigt, dass durch die
Testung auf eine KRAS-Mutation besser
vorausgesagt werden kann, welche CRCPatienten von einer Behandlung mit monoklonalen Antikörpern gegen EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor) profitieren, z. B. Vectibix (Panitumumab) von
Amgen und Erbitux (Cetuximab) von Imclome\ Bristol-Myers Squibb\ Merck. Eine
solche Studie der belgischen Universität
Leuven gibt Hinweise darauf, dass der
KRAS-Mutationsstatus ein prognostischer Biomarker zur Beurteilung des Erfolgs von EGFR Therapien ist. In dieser
Studie hatten etwa 40 % aller CRC-Patienten Mutationen im KRAS Gen. Die Untersuchungsdaten deuten darauf hin,
dass diese Patienten nicht von EGFR Antikörpern profitieren und in manchen
Fällen sogar negative Nebenwirkungen
entwickeln, während Patienten ohne
KRAS-Mutation sehr wahrscheinlich auf
diese Behandlung ansprechen.
In Anbetracht dieser Studien änderten
die Europäischen Zulassungsbehörden
die Indikation für Vectibix (Panitumumab), so dass nur Patienten, in deren
Tumor die unmutierte KRAS-Genvariante vorliegt, das Medikament erhalten.
Das U.S. National Comprehensive Cancer Network (NCCN) gab im November
2008 neue CRC-Leitlinien heraus, die
empfehlen, lediglich Patienten mit Tumoren ohne mutiertes KRAS-Gen mit
EGFR Medikamenten zu behandeln.
Diese Organisation aus 21 Krebszentren
schlug ebenfalls vor, dass Onkologen
grundsätzlich den KRAS-Genstatus von
CRC-Patienten vor jeglicher Behandlung
feststellen sollten.
Ein molekulares Testverfahren
für den Krebs-Biomarker KRAS
Abb. 2: EGFR Signalkette und KRAS
KRAS ist der Haupteffektor der EGFR Signalkette und stellt einen wesentlichen Schalter in diesem
Signalweg dar. Bestimmte KRAS-Mutationen können den Signalweg dauerhaft aktivieren, so dass er
insensitiv gegen vorgeschaltete Inhibitoren, wie z. B. monoklonale Antikörper gegen EGFR, wird.
Qiagen hat kürzlich den ersten molekularen Test basierend auf Pyrosequencing
für KRAS eingeführt. Das PyroMark
KRAS Kit ist CE-markiert für in-vitro diagnostische Zwecke und wird momen-
tan bei metastasierten kolorektalen
Krebserkrankungen zur Bestimmung
des KRAS- Genstatus vor der Zweitlinientherapie mit Erbitux oder Vectibix
angewendet. Das Kit ermöglicht es auf
dem handlichen PyroMark Q24 MDx Instrument Mutationen in den Codons 12,
13 und 61 zu detektieren und quantifizieren.
Die in Codon 12 und 13 oder 61 enthaltenen Genabschnitte werden durch
PCR vervielfältigt und dann über den
definierten Bereich sequenziert, um die
relevanten Mutationen zu identifizieren
und quantifizieren. Das Design des Testverfahrens erlaubt es sogar, zusätzliche
seltenere Mutationen in den Codons zu
erkennen. Der umgebende Sequenzkontext dient dabei als integrierte Qualitätskontrolle für die Ergebnisse. Wissenschaftlern gelingt mit Pyrosequencing
eine schnellere, präzisere Entdeckung
von Mutationen als mit herkömmlichen
PCR-Methoden.
Eine vielversprechende Zukunft für
Pyrosequencing in der Krebsforschung
Jedes Jahr werden mehrere Milliarden
Dollar für die Verschreibung von Medi-
kamenten und andere Therapien ausgegeben, die sich schließlich bei bestimmten Personen als ineffektiv oder sogar
gefährlich herausstellen. Schätzungen
zufolge gehen alleine in Deutschland
etwa 58.000 Todesfälle jährlich auf die
Verschreibung ungeeigneter Medikamente zurück [1]. In den Vereinigten
Staaten belegen Studien, dass die am
häufigsten verschriebenen Medikamente bei weniger als 60 % der Patienten wirken [2]. Ohne deutliche Verbesserung der Möglichkeit, die richtige
Arznei den geeigneten Patienten zuordnen zu können, werden sich diese gegensätzlichen Effekte noch intensivieren und in einer alternden Gesellschaft
häufiger werden. DieKonsequenz daraus sind steigende Behandlungskosten.
Die Forschung rund um das KRASGen und seinen Einfluss auf die
Krebsentwicklung sowie um die personalisierte
Krebsbehandlung
selbst
steckt noch in den Kinderschuhen. Aber
mehr und mehr Wissenschaftler nutzen
diese Technologie und beginnen, die
heutigen Grenzen medizinischer Therapien zu überwinden und die Effektivität
und Sicherheit von Behandlungen zu
maximieren.
Quellen:
[1] Institute of Clinical Pharmacology, University
of Hannover, 7.3.2003
[2] Harvard Business Review, Oktober 2007
Kontakt
Dr. Janina Schaper
Qiagen GmbH
Global Product Manager
Hilden, Deutschland
Tel.: 02103/29-16375
[email protected]
www.pyrosequencing.com