Samenvatting biologie van kanker – maart/april 2014

Samenvatting biologie van kanker – maart/april 2014 – Manon Meerman
Hoorcollege biologie van kanker – 17 maart 2014 – de Jonge
Kanker: genetische ziekte; multi-step process  genetische veranderingen laten
transformatie van normale naar kankercellen steeds sneller verlopen.
Hallmarks of Cancer (Weinberg):
Cel gaat minder snel dood
Kan zijn eigen groeisignaal genereren
Kan ontsnappen aan groeionderdrukkende signalen
Kan invaseren en metastaseren
Kan oneindig doordelen
Kan eigen vaatgroei (angiogenese) induceren: nodig bij groei boven 3-4 mm (zuurstof
en voedingsstoffen).
Daarnaast ook  andere cellulaire energiehuishouding (minder glycolyse: minder ATP via
mitochondriën), genomische instabiliteit/mutaties, tegengaan activatie IS, inductie eigen
ontstekingsreactie (meer groeifactoren  meer groei: tumor).
Benigne tumor  goedaardig; blijft bij elkaar in besloten omgeving.
Maligne tumor  kwaadaardig; groeit invasief in omringend weefsel (bijv. stroma).
Verschillende kankers ontstaan uit verschillende weefsel-/celtypen:
Carcinoom: epitheel
Sarcoom: spier-/bindweefsel
Leukemie: hematopoïetische systeem
Glioma: hersencellen
Melanoom: pigmentcellen huid
Grootste groep is die van carcinomen  2 subtypes: adenocarcinomen (klieromringend
epitheel) en squamous cel carcinomen (buitenkant ergens van, bijv. de huid).
Afhankelijk v/h celtype zijn er andere subtypes.
Melanomen  uit pigmentcellen (huid): patiënt ontwikkelt donkere plekken/wildgroei op de
huid met verdikkingen. Vaak 1 mutatie in RAF-eiwit  gevoelig voor druk. Tumor krijgt wel
nieuwe mutaties (slechte prognose).
Meest voorkomende kankers zijn epitheliale tumoren v/d long, darm, borst, maag en
baarmoderhals.
Kanker ontstaat uit 1 abnormale cel.
Eicel  2 X-chromosomen: op X zit een dehydrogenase-eiwit met 2 varianten, één minder
hittestabiel dan de andere. De ene X wordt uitgeschakeld (random). In offspring zal een X
van moeder en een X van vader actief zijn.
Heterozygoot voor dehydrogenase-eiwit  als mensen een tumor krijgen, welke variant tot
expressie? Als één v/d allelen altijd verloren gaat, moet het een monoklonale tumor zijn.
 Testen op agarosegel  altijd één v/d 2 varianten verloren: niet specifiek een bepaalde.
Als een gedifferentieerde cel deelt en één X is uitgeschakeld, dan blijft dat zo.
In die cel is somatische mutatie opgetreden  in normale cellen, niet erfelijk. Betekent niet
dat kanker niet erfelijk kan worden doorgegeven!
Kan door chromosomale translocatie, carcinogene stoffen, straling, virussen.
Twee gameten geven een zygote. Cellen differentiëren tot normale lichaamscellen.
Mutatie in lichaamscel  ander soort cellen  groeit uit: wordt niet doorgegeven aan
offspring!
Mutaties in kiembaancellen (germ-line) geef je wel door: erfelijke mutatie. Kanker in
kiembaancellen komt niet voor: lethaal. Mutatie die bijdraagt aan kanker wel.
Translocatie chromosoom 9 en 22  9q+ en 22q-: Philadelphia-chromosoom (leukemie).
Kanker ontstaat uit accumulaties van mutaties in de tijd.
Spontane mutatiefrequentie (Goldie & Coldman)  1 mutatie in 1 gen in 105/106 celdelingen;
hoeft nergens tot de leiden, maar er zijn veel delingen. Nu ook steeds meer jongere mensen
met kanker.
Baarmoederhalskanker  ontwikkelt uit minder afwijkende cellen: ontwikkeling kent
verschillende stadia.
Laag gradige neoplasie: nog steeds normale cellen; verdikte wand (5-10% krijgt kanker).
Hoog gradige neoplasie: alleen nog maar delende cellen (40-70% krijgt kanker).
Ontwikkeling naar kanker kan wel 10 jaar duren.
Darmkanker  ontwikkelt uit poliepen (adenomen):
Kankerstamcellen: lijken op stamcellen, maar niet helemaal hetzelfde. Normale stamcellen
kunnen zichzelf vernieuwen  mutaties: kankerstamcel.
Transit amplifying cells kunnen door mutaties ook stamceleigenschappen krijgen.
Kankerstamcellen zijn in kleine populatie v/d tumor te vinden.
Versnelling kankerproces:
Opeenvolgende cycli v mutaties/selecties
Toegenomen genetische instabiliteit  helpt afwijkende cel meer afwijking te verkrijgen;
o Chromosomaal: te laten zien met kleuring; ieder chromosoom een andere kleur  zijn
chromosomen nog origineel of heeft er herschikking/crossing over/translocatie
plaatsgevonden?
o Epigenetisch: verandering van histonen (acetylatie/methylatie): genen
kunnen niet meer afgelezen worden (geen genexpressie) of DNA-methylatie:
geen aflezing v/d promotor meer.
Minder celdood (apoptose/autofagie) en differentiatie  gedifferentieerde cellen delen
minder.
Apoptose  rol bij embryogenese en verwijderen oud epitheel/geactiveerde immuuncellen.
Proces is verloren bij aantal kankers, sowieso minder bij afwijkende cellen.
Verminderde autofagie  speelt grote rol in celoverleving/celdood: insluiten v beschadigde
cytoplasmatische organellen (bijv. mitochondriën) en eiwitaggregaten in autofagosoom 
fuseren met autolysosomen  afbraak producten + transport naar cytosol voor hergebruik.
Teveel autofagie leidt tot type II PCD. Apoptose is type I PCD. In kankercellen gaat van alles
mis; krijgt nieuwe eigenschappen  agressiever.
Toegenomen proliferatie  bijv. poliep: apoptose niet afgenomen, maar meer deling
(inbalans). Normaliter: cellen delen, oude cellen in apoptose (homeostase).
2 mogelijkehden:
o Toegenomen celdeling  cellen delen in hoog tempo: relatief meer cellen.
o Afgenomen apoptose  niet alle oude cellen dood: meer cellen over.
Vaak een combi van beide.
Onafhankelijkheid v/d omgeving (metastase)  vaatgroei nodig om tumor te verbinden
met vaten, ook voor voedingsstoffen en afvoer afvalstoffen. Alleen zo kunnen ze
metastaseren.
Metastase zorgt voor slechte prognose van kankers (slechte behandeling).
Geen random proces  kankercellen hechten daar waar juiste voedingsstoffen zijn: bij
borstkanker hebben kankercellen receptoren (CXCR4) die liganden (CXCL12) binden
gemaakt op botcellen  tumor metastaseert naar botcellen. Minder/niet naar andere
weefsels.
 Nieuwe therapie: blokkeren ligand? Antagonist?
Epidemiologie  grote verschillen tussen landen: afhankelijk van omgevingsfactoren:
Mutagene stoffen: rook, asbest.
DNA-schade door straling: UV, radioactiviteit.
Virussen: HPV en HIV.
Ames test  hoe mutageen is een stof? Mutageen ≠ carcinogeen!
Mengen leverextract, (potentiaal) mutagene stof en histidine-afhankelijke Salmonella 
mengen: op bodem zonder histidine brengen  als de stof mutageen is worden er kolonies
gevormd: stof veroorzaakt mutaties in de bacterie waardoor ze niet meer histidine-afhankelijk
zijn.
Toename in aantal vrouwen dat sterft aan longkanker: afhankelijk van frequentie roken is
incidentie hoger. Niet-rokers kunnen ook longkanker krijgen.
Omgevingsfactoren belangrijk  longkanker nam toe na WO II: meer rokende vrouwen.
Lifestyle belangrijk: hoog in vet, laag in groenten, roken  kunnen leiden tot kanker.
Betrokken genen:
Oncogenen  1 mutatie in één allel is genoeg: proto-oncogen  oncogen.
Aanwezigheid van Wt-gen maakt dan niet meer uit.
“Gain of function”-mutatie: geeft een dominant groeistimulerend effect.
Tumor suppressor genen  beide allelen moeten gemuteerd worden: anders neemt
Wt-allel de functie over. “Loss of function”-mutatie. Induceert erfelijke kanker.
Identificatie kankergenen  kippenonderzoek:
Bij opnieuw inspuiten steeds snellere ontwikkeling van sarcomen.
 Virus was de oorzaak: transformeerde cellen door eigen virale genen (oncogenen) te
integreren in het genoom: induceert kanker.
Er zijn veel virussen bekend die kanker kunnen induceren!
Meeste humane/dierlijke oncogenen zijn gemuteerde vormen van normale, cellulaire genen:
v-onc  virale oncogenen.
c-onc  cellulaire oncogenen: reguleren celgroei en celcyclus.
Mutatie of overexpressie oncogen (bijv. Ras)  verhoogde genactiviteit: proliferatie gaat
door ondanks cel-cel contact.
Virussen kunnen ook tumor suppressor genen onderdrukken, bijv. HPV-virus:
Normale cel: controle op celdeling: 1) normale cellen hebben Rb op de
transcriptiefactor  geen eiwitafschrijving, 2) actief p53 als extra controle  geen
celproliferatie door aanmaak van p21 (blokker celdeling).
HPV virusinfectie: bevat E6 en E7 eiwit: E7 bindt Rb  de transcriptiefactor kan actief
worden en eiwitten aanmaken belangrijk voor celdeling. E6 blokkeert p53: opnieuw
geen goede blok op celproliferatie.
Chemopreventie  aspirine, celecoxib (adenomen).
In een poliep worden COX-1 en -2 geïnduceerd, bij normale cellen alleen COX-1, bij een
poliep ook COX-2. Aspirine is een COX-2 remmer en wordt dus ingezet als chemopreventief
middel.
Cel wordt langzamerhand iets afwijkend: produceert factoren die stromacellen aanzetten tot
TNF-productie  activatie signaaltransductieroutes in epitheelcellen: maken COX-2 
verschillende effecten:
Verlies contactinhibitie
Ondergrond-onafhankelijke groei
Verlies E-cadherine
Snellere deling
Tumorcellen gebruiken omgeving om factoren te krijgen die de cel nodig heeft.
HPV-vaccin  bevat antilichamen tegen de virussen.
Langdurig gebruik van chemopreventie middelen  effectiviteit vs. toxiciteit?
Hoorcollege biologie van kanker – 18-03-2014 – Schuringa
Hoofdstuk 4
Oncogen: gemuteerd gen dat bijdraagt aan kankerontwikkeling. Heten proto-oncogenen in
normale, niet-gemuteerde staat. Spelen rol bij celdeling.
TSG: genen die kankerontwikkeling kunnen blokkeren/onderdrukken. TSGs sturen productie
v eiwitten die onderdeel uitmaken van een systeem dat celdeling reguleert; tumor suppressor
eiwit houdt celdeling onder controle.
Identificatie oncogenen  experiment:
Fibroblasten blootstellen aan carcinogenen: DNA extraheren  transfectie m.b.v.
calciumfosfaat precipitatie  alle 20.000 genen onafhankelijk terugstoppen in normale
fibroblasten: wat is de rol v/h gen?
Niet alle gemuteerde genen veroorzaken kanker; degene die dat wel doen vertonen
afwijkende groei in het schaaltje: daarna bestuderen gen in vivo en analyse v/d genen.
Ook te doen met DNA v humane tumorcellen  klomp fibroblasten
(kanker groeigedrag). Daarna analyse v/h DNA in de afwijkende cellen.
VB: erbB  gen dat verschillende kankers (vooral borst) kan induceren:
probleem bij borstkanker is amplificatie van erbB in de tumorcel; leidt tot
slechte prognose.
Analyse erbB-expressie:
Blot  expressie erbB van 4 borstkankerpatiënten: heel veel DNA,
RNA en eiwit aanwezig v/h gen bij patiënt 1
Immunohistochemie  donkere kleuring bij patiënt 1, dus veel
eiwitexpressie in die cellen.
FISH  m.b.v. probes (groen voor erbB2) kun je zien hoeveel
kopieën erbB2 er in de cel zitten: normaliter 2, nu meer
(genduplicatie/-amplificatie).
Kaplan-Meier plot: uitzetten grote groepen patiënten tegen diagnose. Patiënten zonder
genamplificatie vs. patiënten met >5 kopieën  laatste groep veel slechtere prognose: meer
mensen ziek.
Plot met alle chromosomen (x) vs. frequentie veranderde transcripten (y): duplicaties van
veel verschillende chromosomen veroorzaken bijv. Wilms tumor  ziekte door amplificatie
van meerdere genen op verschillende chromosomen.
Ewings sarcoma  amplificatie op chromosoom 8: handig voor identificatie betrokken genen.
N-myc: oncogen: patiënten met weinig kopieën myc vs. patiënten met >10 kopieën myc:
laatste groep heeft slechtere diagnose en ernstiger ziekteverloop.
myc veroorzaakt neuroblastoom.
Tumor niet altijd door genduplicatie, ook bijv. door genmutaties, bijv. Ras-mutaties
(blaaskanker).
Ras  belangrijk signaaltransductie-eiwit, vaak gemuteerd op positie 12 (glycine naar
valine). Sowieso vaak gemuteerd, rol bij meerdere kankers.
Klein GTPase eiwit in 2 mogelijke toestanden: GDP-gebonden (inactief) of GTP-gebonden
(actief); wisselt hier steeds tussen. Mutatie op 12 zorgt ervoor dat Ras altijd actief is (GTPgebonden)  continue signaaltransductie.
Vroeger werden transfectie-experimenten gebruikt om te tracen welk deel van een eiwit
gemuteerd is en als oncogen functioneert, nu wordt er gewoon gebruik gemaakt van
sequencing  welke mutaties en waar?
Chromosomale translocaties: stukjes homoloog chromosoom wisselen uit.
Bijv. Burkitts’ Lymphoma: 8q- en 14q+: myc komt in buurt van promoter die hard aan staat.
myc-locus normaliter sterk gereguleerd: door translocatie komt voor myc een sterk actieve
promoter  veel myc-expressie.
Komt veel voor in lymfoïde leukemieën.
miRNAs  komen eerst als pre miRNA tot expressie, maar worden geprocessed tot kleine
stukjes miRNA; kunnen messenger v/e eiwitcoderend gen binden.
Expressie van veel miRNAs  binden uiteinde transcript: 1) instabiliteit RNA en 2) translatie
verloopt inefficiënt.
Bij sommige translocaties is de negatieve regulatoire bindingsite voor miRNAs afwezig en
wordt er veel meer RNA gevormd.
Translocatie kan ook leiden tot verandering in functie van genen: breekpunten v
chromosomen midden in een gen: bijv. 9-22  op 9 zit abl en op 22 bcr. Breekpunt resulteert
in fusie-eiwit  Bcr-Abl fusie-eiwit.
Abl (kinase): strak gereguleerd, door fusie is controle weg: eiwit altijd aan  downstream
targets gefosforyleerd. Fusie-eiwit is anders gevouwen, andere functie.
Fosforylering heeft een ATP-binding site nodig  eiwit is nu altijd in ATP-gebonden vorm
(geen ADP), dus altijd actief.
Bcr-Abl expressie  aanschakeling erg veel signaaltransductieroutes in de cel.
 Belangrijke info: waarom ontstaan dit soort kankers? Kennis van fusie-eiwit 
analogen te maken die passen in binding pocket met hogere affiniteit dan ATP: geen
actief eiwit meer (Gleevec bijv.): ATP-analogen.
Samengevat: kanker wordt veroorzaakt door veranderingen in DNA:
* Mutaties in genen
* Genoomamplificaties  verhoogde expressie van bijv. groeistimulerende genen (myc)
* Chromsomale translocaties  verhoogde expressie oncogenen: fusie aan actieve
promoters, verlies v negatieve regulatie en fusie-eiwitten met veranderde functie.
Hoofdstuk 5: hoe kunnen oncogenen cellen transformeren?
Normale versies van oncogen-gecodeerde eiwitten zijn belangrijk bij celdeling en regulatie
daarvan.
Metazoa (meercelligen) hebben cel-celinteracties: cellen in de buurt bepalen wanneer
andere cellen delen, differentiëren, doodgaan. Vaak via groeifactoren/cytokines.
Weefselhomeostase hangt af van:
Generatie van nieuwe cellen wanneer nodig.
Verwijderen van overschot/onnodige cellen.
Wondherstel.
Goede immuunrespons.
Cellen kunnen zelf niet beslissen of ze gaan delen of niet, gaat via groeifactoren.
Bijv. dunne darm  veel soorten cellen (stamcellen, mucusvormende, vili enz.):
communicatie heel belangrijk.
Bloedplaatjes  produceren PDGF (groeifactor) voor andere cellen, ook essentieel voor
bloedstolling; chemoattractant voor fibroblasten, gemaakt op plek v/d wond; zorgt ook dat
fibroblasten gaan delen.
Mitogeen: groeifactor die celdeling stimuleert.
Wound healing assay  laag fibroblasten, deel weg m.b.v. pipet: toevoegen van PDGF zorgt
voor migratie van fibroblasten. Defect voor PDGF-receptor  geen migratie.
v-Src: eerste oncogen gevonden in virussen; overexpressie v-Src in normale cellen
transformeert ze:
Verandering celvorm.
Verhoogde glucose-opname.
Anchorage-independent growth.
Zijn er verschillende targets voor het kinase?
Src is een tyrosine kinase, dus fosforyleert substraten.
Normale fibroblasten  expressie van Src en analyse van eiwitexpressie met Ab’s die
gefosforyleerde substraten herkennen. In cellen met Src-expressie enorm scala aan banden;
Src heeft dus veel targets!
EGF-receptor  ectodomain (bindt ligand), transmembraan-/plasmamembraandomein. De
laatste heeft veel homologie met Src.
Tyrosine kinase familie: 59 stuks op 20.000 genen. Allemaal iets anders eigenschappen,
maar intracellulair erg homoloog (extracellulair, ligand bindend niet); allemaal eigen ligand.
 Mutaties hierin zorgen voor allerlei kankers.
Veel receptor-ligandparen niet in eencellige eukaryoten, maar pas in meercelligen!
AEV (virus) kan erythroleukemie induceren: muteert erbB oncogen  codeert voor de EGFreceptor; bij infectie met AEV raakt het ectodomain verloren (wat het ligand bindt). Hoe kan
dit functioneren als oncogen?
Kankercel  aantal variaties:
Mutaties die structuur beïnvloeden  kan leiden tot ligand-onafhankelijke
signaaltransductie of verdwijnen ectodomain.
Overexpressie membraaneiwitten  ligand-onafhankelijke signaling.
 Een veranderde groeifactor receptor kan gaan functioneren als onco-eiwit.
Normaliter: cel stimuleert zichzelf niet bij signaling. Cel maakt PDGF, maar dat bindt andere
cellen. Kankercellen maken GF’s voor eigen receptoren of vice versa: signaling systeem is
veranderd! Sprake van verkeerde paracriene signaling.
Paracriene signaling  andere cellen.
Endocriene signaling  andere weefsels.
Dimerisatiemodel: waarom is een dimeerreceptor actief?  transfosforylatie.
Kinasedomeinen zitten zo dat alleen anderen binnen een dimeer kunnen fosforyleren;
bijeenbrengen monomere receptoren door een ligand is genoeg voor aanschakelen
signalering.
Samengevat tot nu toe:
Meercelligen maken gebruik van ligand-receptor interacties om extracellulaire
signaleringen mogelijk te maken (autocrien, endocrien, paracrien).
Receptoractivatie: ligandbinding, transfosforylatie en fosforylatie van intracellulaire
eiwitten.
Kanker kan ontwikkelen door: hoge expressie autocriene groeifactoren/liganden, hoge
receptorexpressie en receptormutaties.
Cytokinereceptoren: zelf geen tyrosine kinasedomein, maar recruteren deze, bijv. Tyk2 of
Jak1. Ligandbinding  dimerisatie  transfosforylatie door tyrosine kinasedomeinen.
Als ze actief zijn kunnen residuen in de receptor zelf wel worden gefosforyleerd.
Fosforylatie-residuen: tyrosine, threonine en serine.
Serine/threonine kinase receptoren: bijv. TGF-β receptoren.
Ligandbinding  dimerisatie: transfosforylatie en signaaltransductie.
Notch signaling: begint wanneer twee cellen met elkaar
communiceren; ene cel heeft Notch tot expressie, andere het ligand
Delta (op membraan). Als Delta bindt aan Notch-receptor vinden
aantal cleavage-stpapen plaats (proteolytische activiteit): eerst wordt
een extracellulair deel van Notch geknipt, dan intracellulaire cleavage
 intracellulair geknipt Notch vormt de TF  gaat naar de kern 
regulatie genexpressie.
Patched-Smoothened signaling: 2 membraaneiwitten die elkaar
negatief beïnvloeden. Membraan/vesikeleiwitten.
Patched heeft negative invloed op Smoothened: actief
Smoothened activeert Gli  Gli (TF) raakt v/d membraan
verwijderd, gaat naar kern en reguleert genexpressie.
Ligand Hedgehog  bindt Patched en activeert het: repressie op
Smoothened valt weg.
Wnt-signaling: eindpunt is β-catenine (TF): zonder ligand wordt dit
afgebroken.
Geen celactivatie zorgt ervoor dat eiwitcomplex β-catenine
fosforyleert  afbraak. Zonder β-catenine (TF) geen signaling.
Binding Wnt-ligand aan Frizzled  axine weggetrokken naar het
membraan; complex valt uiteen: zonder axine geen degradatie van
β-catenine  gaat naar kern en reguleert daar genexpressie (stimulatie proliferatie en
stamcelstatus).
Integrines (membraaneiwitten): zitten op cellen; extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit
glycoproteïnen, hyaluronzuur en proteoglycanen; hebben invloed op gedrag v/d cel.
Cellen kunnen ECM binden via integrine-receptoren  dimeren bestaan uit α- en y-keten.
Activatie integrines  signaaltransductie: bijv. continue reorganisatie van cytoskelet (actine).
Integrines clusteren tot focal adhesions: punt waarop cel sterk kan
interacteren met ECM.
Activatie Ras  zorgt voor integrine-onafhankelijke groei zonder focal
adhesions: onafhankelijke groei = kenmerk van kanker! Ras in kankers vaak
geactiveerd; proliferatie kan zo plaatsvinden zonder ECM context.
Normaliter: activatie integrines echt nodig voor proliferatie.
 Anchorage-independent growth
Hoofdstuk 6
Cel + mix van groeifactoren in serum  eerst worden immediate early genes aangezet.
RNAs worden uit de kern getransporteerd en zetten een tweede zet transcriptiefactoren aan
(delayed early gene response).
Er zijn 229 immediate early genes die supersnel kunnen reageren op groeifactoren.
Niet alle responsen gaan via genexpressie!
Fosforylatie  fosfaatgroep is negatief geladen: als deze op tyr/ser/thr komt induceert het
conformationele verandering.
Negatieve lading kan ook interacteren met positieve lading  verschillende domeinen in
eiwitten hebben bepaalde lading  stabiele interactie-units ontstaan, bijv. SH2.
SH2: bouwsteen voor tyrosinekinases in veel eiwitten; heeft een tyrosine- en een arginineresidu (positief)  stabiel.
Tyrosine fosforylatie stuurt locatie/activiteit van cytoplasmatische eiwitten: gefosforyleerde
eiwitten vormen platform voor andere eiwitten.
Omgeving bepaalt welke andere eiwitten kunnen binden. Specifieke interactiepartners sturen
specificiteit.
Groot scala aan post-translationele modificaties  scala aan specificiteit.
Groeifactorreceptoren kunnen Ras activeren via SH2 en SH3-domeinen.
Ras gebonden door membraaneiwitten:
Ras in één oncogen  hoe kunnen diverse fenotypes bereikt worden in cellen door een
enkel oncogen? Ras kan verschillende signaaltransductieroutes activeren:
MAPK pathway: actief Ras activeert Raf  Mek  Erk (MAPK)  activatie TFs die
zorgen voor genexpressie. Msk1 (TF) is betrokken bij chromatine remodeling
(epigenetica) en elF4E (TF) is betrokken bij eiwitsynthese  meer eiwitsynthese.
Veel mutaties in deze pathway! Mutaties in B-Raf kunnen deze pathway activeren
zonder Ras-activatie.
PI3K pathway: gebruik van lipiden in de lipide membraanlaag.
PIP2 gefosforyleerd tot PIP3 (trifosforylering) : vormt docking site voor eiwitten met PHdomeinen en recruteren ze naar het membraan. Akt-PKB één v/d belangrijkste.
PTEN draait de pathway om  kanker: PI3K hyperactief, PTEN inactief = continue
signaling.
Cdc42 pathway: induceert verandering in actineskelet: celbeweging en –adhesie.
Dus: Ras induceert 3 pathways:
* MAPK  transcriptie, eiwitsynthese.
* PI3K  remming apoptose, eiwitsynthese, celcyclus progressie.
* Cdc42  celbeweging en –adhesie.
Mutaties in alle voorgaande pathways kunnen kanker induceren.
Hematopoïese: vorming van bloed uit hematopoietische stamcellen in het beenmerg.
Kunnen zelfvernieuwing ondergaan (nieuwe stamcellen generatie) of dochtercellen
genereren  differentiatie tot bloedceltypen. Cytokines en receptoren sturen
differentiatie/deling enz.
Leukemie  chronische klachten (vermoeidheid, stollingsproblemen): tekort aan bepaald
type cellen; door mutatie geen maturatie bloedcellen 
ophoping immature cellen.
Jak-Stat pathway: Jak-kinases recruteren extra eiwitten (Stat)
aan de receptoren  actieve signaling. Stat eiwitten werken als
transcriptiefactor. Actief  fosforylatie SH2-domeinen 
stabiele interactie tussen SH2-domeinen: dimeer.
Stat transloceert naar de kern en zet genexpressie aan.
Leukemie  cellen gedragen zich onafhankelijk v groeifactoren.
Bcr-Abl is een tyr kinase die Stat transcriptiefactoren aan kan
zetten.
FLT3-ITDs ook  tyr kinase in cytoplasma die constante
activatie van Stat5 induceren. Door ook verlies van negatieve feedback  continu
genexpressie.
Bij knockouts van Stat5 raakt groei van cellen ernstig verstoord, gepaard met sterke
toename in apoptose.
Is Stat5 een oncogen?  breng een gezonde cel gemuteerd Stat5 in (actief): induceert
continue groei, in vitro transformatiegedrag, veranderde interacties met omgevingscellen
(sterker).
Negatieve feedback  uitschakelen signaaltransductie. Actief Ras zet cascade in: activeert
o.a. Sprouty wat via negatieve signaling Ras-signaling weer uitzet. Sprake van “tijdelijke
activatie”. Speelt veel in TSGs.
Ras-GAP wordt geactiveerd bij activatie van Ras  zorgt voor
inactivatie van Ras. Activatie leidt tot inactivatie.
Positieve feedback  NF1 zorgt ervoor dat een cel in rust bij een beetje Ras-activiteit weer
stilgelegd wordt (meteen inactief). Geen Ras-signaling zonder ligand dus.
Activatie van Ras met een ligand  fosforylatie NF1: valt uit elkaar, dus Ras kan goed
werken. Stopt negatieve feedback.
Hoorcollege biologie van kanker – 19-03-2014 – Kruyt (medische oncologie)
Hoofdstuk 7
Proto-oncogenen en oncogenen sturen proliferatie van cellen.
Producten van proto-oncogenen belangrijk in groeistimulerende signalen  mutaties
leiden dus tot continue groeisignalen en proliferatie van kankercellen (Ras, myc).
Tumor suppressor genen (TSGs) hangen activiteit van proto-oncogenen tegen: spelen ook
een rol in kanker ontwikkeling.
Kankerfenotype  geïdentificeerd met celfusie experimenten.
Fusie normale en tumorcel tot hybride cel: wordt dit normale of tumorcel?
Zonder tumorvirus zou een fenotype van hybride cel recessief zijn: beide allelen van een
TSG moeten dus gemuteerd zijn.
TSG geraakt in beide kopieën  functie totaal defect: kankerontwikkeling. Kans op mutatie
106, kans op dubbele mutatie is dus 1012: laag risico  ander mechanisme?
Loss of heterozygosity (LOH): functioneel gen verloren, dus homozygoot. Bijv. mutant RbTSG gelokaliseerd op 13q14. Door mitotische recombinatie wisselen delen
zusterchromatiden uit waardoor dochtercellen ontstaan met dubbele kopie v/d mutatie. Komt
105/104 keer voor per celgeneratie. Genen vlakbij Rb verliezen ook heterozygotie  worden
homozygoot.
Ook wel allelische deletie genoemd.
Oorzaken LOH:
► Gene conversion  tijdens DNA synthese wordt ene strand verteld in de ene kopie.
Polymerase springt naar ander (homoloog) chromosoom en weer terug naar oude
strand; stukje v/d homologe strand wordt gekopieerd: stuk v/h originele chromosoom
wordt vervangen door stuk v/h homologe chromosoom. Frequenter dan mitotische
recombinatie.
► Breuk in chromosomen  stuk gaat verloren zonder nieuwe kopie: hemizygotie: alle
genen van dit stuk hebben één kopie: maar één allelische versie v/e gen. Netto
resultaat is een niet-functionerend TSG.
►
►
Non-disjunctie  uiteentrekken chromosomen naar dochtercellen gaat mis: één
dochtercel met 1 en één met 3 chromosomen. Nakomeling kan er bijv. 1 krijgen ipv 2:
als hierop het TSG lag, is er inactief TSG  verhoogde kans op kanker.
CpG methylatie  methylatie in promotor v/e gen zorgt voor silencing van
genexpressie: TFs binden slechter. Even effectief als mutatie v/d nucleotidesequentie.
Retinoblastoma gen (Rb)  veroorzaakt tumor in de retina. Kinderen met defecte kopie
van Rb hebben grotere kans op bottumoren als volwassene.
Twee varianten  sporadic (spontaan: 2 defecte kopieën) en familiar (erfelijk: familieleden
al 1 defectekopie: nog één hit nodig!).
Mapping  op regio 13q14 ligt esterase D locus; bij optreden van retinoblastoma vonden ze
dat patiëntjes heterozygoot waren voor dit gen: één allel was al verloren gegaan, dus hebben
LOH ondergaan. Aangedaan bij deze kanker  moet dichtbij Rb-gen liggen!
Tumoren  welke sequenties ontbreken er in de tumor? Zijn potentiële TSGs. Te
identificeren m.b.v. markers die dichtbij liggen op het chromosoom dat steeds LOH
ondergaat tijdens ontwikkeling v/e bepaalde tumor.
Linkage analysis  identificeren van genen aan de hand van genen in de buurt.
APC gen: ontwikkelt darmpoliepen (voorstadium darmkanker) bij afwezigheid. Bepaalde
families waarin ziektes veel voorkomen zijn ideaal voor identificatie van betrokken genen!
Bekende TSGs, bijv. p53 en Rb zijn vaak aangetast in vormen van kanker.
Deze worden ook door virussen aangepakt  genen zijn belangrijk voor overleving v/d cel
en activatie van bepaalde reactiemechanismen op virussen (neutralisatie infectie bijv.).
TSGs  sommige onderdrukken direct celproliferatie op groeiremmende signalen en
differentiatiesignalen. Andere TSGs zijn onderdeel van controlesysteem dat proliferatie
remt door inbalans in metabolisme en DNA schade.
Twee soorten TSGs:
► Gatekeepers  sturen direct biologie v/d cellen door invloed op differentiatie,
proliferatie en celdood.
► Caretakes  verzorgende functie over status v/h genoom: bij beschadigingen moeten
deze gerepareerd worden; ook geen celdeling dan.
Oncogenen zijn niet overerfelijk: worden niet overgegeven in kiembaancellen (lethaal).
TSGs: grote groep genen die normaliter tumorontwikkeling voorkomen in normale
lichaamsweefsels. Er is onderscheid tussen TSGs die vroeg of laat in kankerontwikkeling tot
expressie komen  sommige onderdrukken primaire tumorvorming, andere beperken
metastase.
TSGs kunnen ook miRNAs coderen (naast eiwitten).
Afwezigheid v genexpressie in tumorcellen geeft niet aan dat dit een TSG is  kan ook geval
zijn van normaal genexpressiepatroon in celdifferentiatie.
Genetische criteria TSGs
► Veel LOH van een specifiek gen in tumorcellen  kunnen natuurlijk ook genen zijn die
dichtbij het potentiële TSG liggen.
► Gen is alleen een TSG als het veel LOH in veel tumorcelgenomen ondergaat en de
resulterende homozygote allelen inactiverende mutaties hebben.
► Functioneel  heeft het potentiële TSG eiwitproduct een tumor onderdrukkende
functie? Eiwitten integreren in allerlei signaling pathways in verschillende delen v/d cel
als “negatieve signaling” die de positieve (groeisignalen bijv.) tegenwerken (balans!).
Functionele analyse  Wt-versie van potentiële TSGs inbrengen in tumorcellen zonder
detecteerbare expressie van deze genen. Keert de tumorcel deels/volledig terug naar een
normaal fenotype of gaat het in apoptose?
Ectopische expressie van veel genen (in een gastheercel waar ze normaal niet tot expressie
komen) zorgt er vaak voor dat cellen stoppen met groeien of in apoptose gaan.
Conditionele knock outs potentiële TSGs vormen ook goed model voor identificatie; als dit
in kiembaan wordt gedaan leidt het vaak tot stoppen van embryonale ontwikkeling  dood.
Met induceerbaar systeem gen uitknocken in volwassen muis  muis heeft vectoren al in
genoom, hierin liggen genen die je uit kunt knocken door triggering van bepaalde systemen.
Therapeutische mogelijkheden: terugzetten gezonde kopie v/e gen in een patiënt? Lastig
bij kanker. In lab goed te doen, in vivo moeilijk. Bijwerkingen zijn toxische schade aan
andere, gezonde weefsels.
► Tumoren leiden aan meer problemen dan de gemuteerde TSG.
► Moeilijk met gentherapie alle tumorcellen te raken.
Afwezigheid van TSG functie  cellen gevoeliger voor types low-moleculair-weight-drugs:
tijdens tumorontwikkeling worden bepaalde tumorcellen afhankelijk van signalen van de
(afwezige) TSGs.
Dus: verlies van PTEN (een TSG)  hyperactief Akt/Pkb (continu actief)  tumoren: Akt/Pkb
is wel een kinase dus wel te targeten. TSGs zelf zijn moeilijk te targeten (want, afwezig).
Key concepts:
Op cellulair niveau is het fenotype van tumorcellen recessief, omdat expressie afhangt
van inactivatie van TSGs. Verlies van genetische informatie is dus essentieel voor
ontwikkeling v/d meeste tumoren.
TSGs zijn hierdoor vaak als inactieve allelen aanwezig in genomen van tumorcellen.
Verlies van TSGs heeft invloed op fenotype v/d cel als beide kopieën verloren gaan 
als nul-allelen (inactief) in heterozygote staat in cellen in het lichaam zitten hebben ze
geen invloed op fenotype.
Verlies van TSG functie kan door (1) genetische mutatie of (2) epigenetische silencing
van genen door promotor methylatie.
Inactivatie van één TSG kopie kan leiden tot verlies van andere kopie door LOH:
- Mitotische recombinatie
- Verlies van chromosomaal stuk
- Non-disjunctie
- Genconversie
LOH komt vaker voor dan mutaties of promotor methylatie, verschilt wel per gen.
Veel LOH in een bepaald deel v/e chromosoom geeft vaak een TSG aan.
TSGs reguleren celproliferatie: verlies van een gen kan leiden tot tumorcelformatie.
Mutante, defecte kopieën van TSGs kunnen worden overgeërfd  hogere
gevoeligheid voor ontwikkeling van kanker.
Er zijn binnen TSGs “gatekeepers” en “caretakers”.
Verlies van TSGs komt vaker voor dan mutatie van proto-oncogen  oncogen.
Vaak meerdere geïnactiveerde TSGs binnen één tumorcel.
Hoofdstuk 9
In 50% van alle kankers zitten mutaties; resulteert vaak in functioneel inactief p53 eiwit.
p53  TF: aantal functies, o.a. stoppen van celcyclusprogressie en inductie van apoptose.
Gemuteerd p53 blokkeert mogelijkheid om celcyclus te stoppen of apoptose te induceren.
p53  belangrijk bij activatie celcyclus blokkades/checkpoints. Induceert ook apoptose als
celschade niet gereguleerd kan worden, bijv. DNA schade.
Gevonden met virusonderzoek  interesse in SV40-virus dat bepaald eiwit maakt (Large T).
Expressie van p53 werd gevonden bij SV40+ fibroblasten: bij gelelektroforese kwam een
p53-bandje op bij SV40+ cellen, niet bij controlegroepen.
 Later bleek Large T bindingspartner te zijn van p53  bindt met elke unit p53: onttrekt
het van normale functie.
Experiment p53: inbrengen Ras-oncogenen in fibroblasten + bepaalde variant p53:
Wt p53: geen kolonievorming van groeiende cellen.
Deletiemutant p53: wel kolonievorming van groeiende cellen  p53 kan niet (volledig)
Ras onderdrukken: continue groeistimulatie door Ras.
Puntmutant val-135 p53: veel meer kolonievorming  eis voor TSG.
p53 -/-  slechte prognose voor muizen, niet hebben van p53 zorgt ervoor dat
homozygote muizen vroeg doodgaan aan allerlei tumoren (sarcomen,
leukemieën). Heterozygoot p53 (niet helemaal Wt)  betere overleving.
p53 is een TF  reguleert genexpressie en heeft dus een sequence-specific
DNA-bindingsdomein: bindt specifieke sequenties v/h DNA, vaak promotors.
Tetramerisatiedomein: functioneert alleen als tetrameer! p53-mutaties vaak in DNA-bindend
domein.
Tetrameer: verklaart waarom p53 heterozygoot nog steeds een fenotype heeft; combinatie
Wt-gen en gemuteerd gen. Bij tetrameer verschillende configuraties van interacties  als
mutant subunit p53 in het tetrameercomplex zit is het niet geheel meer functioneel.
Statistisch gezien is er een kleine kans op volledig functioneel complex.
Complete deletie p53-gen met één gezonde kopie  allemaal gezonde complexen: alleen
gezonde kopieën blijven over. Mutatie  niet geheel functionerende complexen (dominantnegatief).
Tetramerisatiedomein mutant  in heterozygote situatie geen consequenties: gezonde
kopie zorgt toch voor tetramerisatie. Eiwit kan niet meer meedoen, geen dominant-negatief
effect.
p53 ontvangt continu signalen van verschillende surveillantiesystemen: als p53 specifieke
signalen krijgt (1) stopt het celproliferatie of (2) induceert het apoptose. Tumorcellen raken dit
p53-systeem dus graag kwijt.
Signalen  te weinig nucleotiden, UV-straling, ioniserende straling, hypoxie.
Effecten  celcyclus arrest of senescence, DNA repair, geen angiogenese of
apoptose.
Expressie van p53 normaliter niet te zien op eiwitniveau: alleen wanneer er iets moet
gebeuren.
Bestraling  verhoogde p53-expressie, later ook p21Cip1.
p53 detecteert celschade en zorgt voor halt in celcyclus. Actineniveaus worden gemeten in
de blot als controlemechanisme: zijn onderdeel v/h cytoskelet en is gebruikt om hoeveelheid
ingebracht eiwit te testen (is wel overal evenveel?).
Overleving  p53 +/+: levensvatbaarheid daalt, bijna alle cellen gaan dood. Straling was zo
hoog dat het niet te repareren was en cellen in apoptose gaan. Bij p53 +/- een flinke afname
in celoverleving, minder apoptose dan bij Wt. Bij p53 -/- blijven cellen leven/delen ondanks
flinke schade!
Regulatie p53: eiwitlevelregulatie d.m.v. afbraak door het proteasoom  soort barrelvormige
structuur; eiwtten gaan erin en komen er in kleine eiwitdeeltjes uit. Proteasoom heeft
proteases die eiwitten kapot knippen; leidt tot snelle afbraak.
Eiwitten gelabeld met ubiquitine (ketens)  vormt een “vlaggetje” wat herkend wordt door
het proteasoom  degradatie.
Mdm2 labelt p53 met ubiquitine: ligase dat dit kan doen. Activatie van Mdm2 zorgt voor
accumulatie van p53. Één v/d targetgenen van p53 is weer Mdm2  negatieve
feedbackloop. Benodigde targetgenen worden geactiveerd door p53, wat weer leidt tot
afbraak van p53.
Apoptose: gereguleerde vernietiging van een cel door genetisch gecodeerd proces, ook wel
programmed cell death (PCD).
Belangrijk proces, vooral bij het immuunsysteem, bijv. eliminatie van zelfreactieve T-cellen of
het doden van viraal geïnfecteerde cellen door NK-cellen. Ook belangrijk bij
weefselhomeostase  grootte van weefsels, verwijdering onnodige cellen.
Disregulatie van apoptose belangrijk bij kankerontwikkeling!
Na apoptose blijft er nog een apoptotisch lichaam over  deze wordt gefagocyteerd door
macrofagen of buurtcellen.
Anoikis  cellen sterven als ze loskomen van hun omgeving. Veel epitheelcellen zitten in
bepaalde structuur (voorwaarde voor overleving): apoptose in werking zodra de cel daarvan
loskomt.
Autofagie/autofagocytose  katabolisch systeem dat vernietiging van onnodige/niet
werkende celcomponenten induceert. Gaat m.b.v. lysosomen.
Bij apoptose komt er cytochroom c vrij vanuit de mitochondriën. Twee eiwitfamilies spelen
een rol: pro-survival eiwitten (Bcl-2) en pro-apoptosis eiwiten (Bax/Bak BH3-only).
Het humane genoom codeert voor 24 Bcl-2 achtige eiwitten: 6 hiervan zijn anti-apoptotisch,
18 zijn pro-apoptotisch.
Pro-apoptotische eiwitten reguleren lek raken van mitochondriën in het apoptotisch proces.
Bak’s  eiwitten die waarschijnlijk een porie maken in het buitenmembraan van
mitochondriën als ze binden. Hebben pro-apoptotische werking: cytochroom c lekt door de
poriën.
Complex aantal interacties, logica  Bax en Bak zijn eiwitten die poriën maken (
apoptose). Alle andere eiwitten (pro-survivals) binden Bax en Bak en remmen porievorming.
Pro-apoptotische eiwitten (BH3-only’s) kunnen door signalen in de cel geactiveerd worden
en ervoor zorgen dat pro-survivals hun werking op Bax/Bak niet meer kunnen doen en
Bax/Bak actief worden.
Noxa, Puma zijn ook pro-apoptotische eiwitten die de Bax-/Bak-remmende eiwitten kunnen
remmen.
Hoorcollege biologie van kanker – 20-03-2014 – Kruyt
Intrinsieke apoptosepathway:
Cel wordt van binnenuit gedemonteerd, tot er kleine stukken over zijn die
gefagocyteerd/verwijderd kunnen worden.
Caspases  proteases die op eiwitniveau alles kapotknippen; kunnen ook andere
mechanismen activeren. Worden geproduceerd als zymogeen (pro-enzym).
Onderverdeeld in 2 soorten:
Initiators  bovenin de pathway: cleaven elkaar bij activatie en activeren effectoren:
inductie “sneeuwbaleffect”. Zijn caspases 2, 8, 9 en 10.
Effectors  knippen substraten kapot. Zijn caspases 3, 6 en 7.
Deze caspases zijn betrokken bij apoptose (vooral 8 en 9). Pro-caspases in de cel zijn
inactief: activatiestappen nodig  verwijdering pro-domein of cleavage van subunits.
Porievorming leidt tot lekken van cytochroom c uit mitochondriën: functioneert als cofactor
voor activatie van procaspase 9  actief caspase 9, samen met eiwit Apaf-1.
Cytochroom c bindt complex van Apaf-1 eiwitten. Procaspase 9 wordt geactiveerd en vormt
met cytochroom c-Apaf-1 complex het apoptosoom: samen met ATP leidt het tot activatie
van effector caspases.
DNA-fragmentatie  DNAse wordt geactiveerd op moment dat een inhibitor (ICAD) geknipt
wordt door effector caspases. ICAD is remmer van DNA en knipt het DNA in stukjes.
Cytoskeleteiwitten zijn ook substraten van effector caspases.
Caspases kunnen geremd worden  regulatiemogelijkheden: gebeurt door inhibitors of
apoptosis (IAPs): als cytochroom c vrijkomt samen met Smac/DIABLO (ander mitochondriaal
eiwit dat IAPs remt) is dit een goede activatie v/d apoptotische route: IAPs worden zo
geremd en door cytochroom c wordt de caspasepathway in gang gezet.
Extrinsieke apoptosepathway
Death receptors  externe signalen die apoptotische route activeren. Voorbeelden zijn Fas,
TNF-receptoren en DR3/4/5.
DR4/5 lijken specifiek apoptose te induceren in kankercellen  interessant voor onderzoek!
Receptoren vormen intracellulair een cluster (trimerisatie)  ligand bindt  trimerisatie 
vorming intracellulair docking platform voor andere eiwitten. Andere eiwitten binden, bijv.
FADD. Caspases kunnen FADD binden  apoptosepathway in gang.
 Externe signalen induceren dus apoptose in de cel!
Procaspase 8 eiwtten worden bijeen gebracht: liggen dicht bij elkaar en kunnen cleaven met
hun caspasedomein. Heet ook wel DISC (Death Initiating Signaling Complex).
Crosstalk: bij activatie procaspase 8/10 of activatie effector caspases  cleavage van Bideiwit tot actief tBid. tBid heft invloed op porievorming door Bax/Bak. Hier komen dus de
extrinsieke (death receptors) en intrinsieke (apoptosoom) bij elkaar.
Cleavage van Bid heet ook wel de amplification pathway.
Granzyme B is een sterke activator van caspases  uitscheiden door CTLs (dus rol van IS).
Rol van p53: kan op verschillende manieren apoptose beïnvloeden. Targetgenen van p53
horen bij Bcl-2 familie. Bax wordt bijv. beïnvloed door p53  verhoogde expressie 
porievorming mitochondrium.
Puma, Nox en andere eiwitten kunnen ook worden beïnvloed door actief p53. Kan ook de
levels van death receptors beïnvloeden  upregulatie door actief p53.
In veel tumoren wordt apoptose gedereguleerd door verschillen in genexpressie:
verschillende eiwitten hebben direct/indirect effect op apoptose.
Therapeutische mogelijkheden  aangrijpen op verschillende componenten van
apoptotische pathways, bijv:
Activatie death receptors door toevoegen van liganden
Remmen Bcl-2 genen  mitochondriale apoptose kan beter
plaatsvinden.
Remmen IAPs  weghalen suppressie op apoptose.
Imaging ratexperiment  expressie p53 in tumorcellen die dat voorheen
niet hadden (zie plaatje 2). Tumorcellen gelabeld met bepaald enzym dat
imaging mogelijk maakt. Alle cellen met het substraat geven fluorescentie
af.
Plaatje 2  geen p53, enorme tumor.
Plaatje 3 + 4  p53 weer aangeschakeld, tumor vermindert aanzienlijk  verdwijnt.
Hoofdstuk 14
Metastase (uitzaaiing)  gevormd door tumorcellen die primaire tumor hebben verlaten en
door bloed-/lymfevaten op zoek zijn naar nieuwe plekken in het lichaam om kolonies te
vormen.
Metastase geeft slechte prognose; chirurgie niet meer mogelijk, alleen bij primaire tumoren.
Afbeelding: CT-scan gekoppeld aan FDG-PET (FDG: vorm van glucose  geel). Gele kleur
geeft tumorcellen weer (hier: Non-Hodgekins Lymphoma). Goed te zien zijn uitzaaiingen
over het lichaam, ook wel secundaire tumoren genoemd.
Micrometastases  te klein om te detecteren op bijv. FDG-PET scans. Gaat om kleine
aantallen cellen. Kunnen al gevormd zijn voor de primaire tumor wordt ontdekt!
Metastasering: primaire tumor induceert angiogenese (voedsel)  tumorcellen komen in
deze vaten (intravasatie): cellen zijn invasief, kunnen door bloedvatwand  cellen
interacteren met bloedcellen, bereiken het hart en gaan circulatie in  zaaien uit in bijv.
longen/brein/beenmerg  extravasatie: van bloed naar weefsel (vaak ander type)  vorming
micrometastase  vorming macrometastase (secundaire tumor): kolonisatie.
Metastatische inefficiëntie  kleine kans dat alle stappen tot kolonisatie goed verlopen;
daarom kleine kans dat tumorcel uitzaait in het lichaam. Kolonisatie  afh. v/d aanpassing
v/d tumorcel aan micro-omgeving van het nieuwe weefsel.
Intravasatie  vanuit primaire tumor naar het bloed. Hulp v stromale cellen is nodig (bijv.
macrofagen).
Anoikis  vorm van apoptose dat wordt getriggerd wanneer een cel van zijn substraat (bijv.
ECM) loskomt.
Erythrocyten zijn elastisch; gaan makkelijk door capillairen. Tumorcellen niet  lopen
gemakkelijk vast; kan gepaard gaan met clustering samen met bloedcellen want ze trekken
bloedplaatjes aan. Tumorcellen worden dus in circulatie gevonden als multicellulaire
aggregaten in een cluster van circulerende tumorcellen (CTCs).
Dit helpt bij in leven houden tumorcellen!
CTCs zijn detecteerbaar in het bloed.
Extravasatie  uittreden tumorcellen van bloedvat naar weefsel.
(1) Tumorcel raakt fysiek vast in capillair.
(2) Grote hoeveelheid bloedplaatjes (blauw) hechten aan de tumorcel  microtrombus.
(3) Tumorcel duwt een epitheelcel opzij en krijgt direct contact met basilair membraan v/h
capillair.
(4) Binnen een dag wordt microtrombus opgelost door proteases gericht tegen stolsels.
(5) Tumorcel gaat prolifereren in het lumen v/h capillair.
(6) Binnen dagen/soms weken dringt tumorcel door het basilair membraan in het
omringende weefsel parenchym.
Kolonisatie  gebeurt niet altijd; snelheidsbepalende stap van het gehele proces. Veel
micrometastases kunnen voorkomen (maandenlang) zonder uit te groeien tot secundaire
tumor.
CTCs  diagnostische marker; effecten van therapie ook te monitoren. Geven ook
informatie over wat er mis is in tumorcellen  identificatie therapeutische targets: want,
komen uit primaire tumor (zelfde genoom).
 Aantal tumorcellen in beenmerg (DTCs) nog betere diagnostische marker dan CTCs
(als ze aanwezig zijn)  aantal DTCs geeft ophoping van
uitzaaiende tumorcellen over bepaalde tijd weer, aantal CTCs
kan worden gestuurd door kinetische processen die hun
overleving in de circulatie aansturen.
Heterogene primaire tumor zaait uit in heterogene
micrometastases door het lichaam v/e kankerpatiënt. Primaire tumor
wordt verwijderd, micrometastases blijven achter; weinig
overblijvende ziekte.
Één micrometastasis groeit uit (later)  macroscopische metastase
 nieuwe micrometastases  meerdere macroscopische
metastases  ziekterelaps.
Primaire tumor behoudt structuur van epitheelcellagen  voor
motiliteit en invasieve eigenschappen moeten carcinoomcellen
epitheeleigenschappen kwijtraken en eigenschappen van
mesenchymale cellen aannemen  EMT (epithelial-mesenchymal
transition). Mesenchymcellen raken los zonder dood te gaan en zijn
migratief.
EMT vindt plaats bij (1) embryonale ontwikkeling en (2) wondgenezing.
Embryonale ontwikkeling  enorme bewegingen van cellen die andere organen gaan
vormen door embryo heen, bijv. vorming neurale buis.
Karakteristieken EMT:
Verlies van:
Cytokeratine expressie (intermediair filament).
Tight junctions en epitheel adherens junctions met E-cadherine (cel-cel contact).
Epitheelcel polariteit (lumenkant etc.).
Epitheel genexpressieprogramma.
Verkrijgen van:
Fibroblastachtige vorm.
Motiliteit en invasieve eigenschappen.
Verhoogde weerstand tegen apoptose.
Mesenchymaal genexpressieprogramma incl. EMT-inducerende TFs.
Mesenchymale adherens junction protein (N-cadherine).
Proteasesecretie (helpt bij afbraak ECM).
Vimentine-expressie (intermediair filament).
Fibronectinesecretie, PDGF receptor expressie en integrine expressie.
Stamcelachtige eigenschappen.
Tumorcellen houden zich aan elkaar vast m.b.v. E-cadherines; zitten tussen cellen en
verbinden cytoskeletten m.b.v. actinebundels. Deze structuren worden verbroken bij
metastasering.
E-cadherine expressie (epitheelmarker) verwacht je bruin bij kleuring met IHC op het
celmembraan.
Resultaat  in centrum tumor lokaliseert E-cadherine naar de celmembranen, geen
expressie aan het invasief front  wel tumorcellen, maar zonder E-cadherine expressie (of
lager).
E-cadherine aan de buitenkant; aan de binnenkant kan β-catenine binden; eiwit zit
gebonden aan binnenkant v/d cel.
Zorgt voor verbinding E-cadherine aan cytoskelet. β-catenine belangrijk bij Wnt-signaling 
TF die genen aan kan zetten. Kan in het cytoplasma loskomen (door verlies E-cadherine) en
signalering activeren.
Staining β-catenine  normaliter meer in de membraan, niet in de kern. Bij invasief front
verandert expressie en zie je het ook terug in de kern (door verlies E-cadherine).
Met moleculaire karakteristieken nagaan of tumorcellen EMT ondergaan  expressie
epitheelmarkers neemt af, expressie mesenchymale markers neemt toe.
EMT wordt gestuurd door externe signalen; reversibel proces. Belangrijk bij kolonisatie van
(secundaire) tumoren.
Metastase mogelijk doordat tumorcellen mesenchymaal worden en kunnen migreren. Na
extravasatie kan het omgekeerde proces (MET) plaatsvinden  cellen worden weer
epitheliaal.
TGF-β is een stimulus  morfologie verandert niet, maar E-cadherine verdwijnt en vimentin
(mesenchymmarker) stijgt. Bij verwijderen van TGF-β stimulus groeien cellen weer als
epitheel.
Wnt-signaling induceert ook ECM. Sommige tumorcellen brengen liganden als TGF-β tot
expressie  induceert ECM. Functie van deze signalen wordt geremd door blokkers als
BMPs, DKK1 en SFRP1.
Cellen ondergaan EMT en remmen productie van deze
blokkers (versterking signaal); ook verhoogde expressie
andere Wnt-signalen.
Deze 3 autocriene loops zorgen voor behoud
mesenchymale staat.
Er zijn ook TFs die EMT reguleren: extracellulaire signalen
worden doorgegeven naar de kern  genexpressie:
induceren EMT.
Zijn o.a. Snail, Slug, Twist en Goosecoid.
Als cellen EMT ondergaan verkrijgen ze stamceleigenschappen  kunnen zelfvernieuwen:
belangrijk voor vormen nieuwe tumorkolonie in ander weefsel.
Transcriptiefactoren spelen een rol: regulatie v genexpressie van
epitheliale/mesenchymale genen. Bijv. Twist  bindt promotors Twist, Snail, Slug en Zeb1
en is afhankelijk van Slug inductie om EMT te induceren.
Slug en Twist vaak samen tot expressie in borstkanker  wanneer Twist expressie uit wordt
gezet raakt Slug ook verloren.
Verschillende TFs binden promotor van E-cadherine gen (CDH1)  repressie E-cadherine.
ZEB1/-2 spelen belangrijke rol in keuze of carcinoma cellen zijn
epitheelcelkenmerken moet behouden of een EMT programma moet
activeren.
Spelen ook een rol in een bistabiele switch tussen epitheliaal ↔
mesenchymaal.
Lage expressieniveaus van deze TFs (Snail, Twist)  betere overleving/prognose kankers.
Seed and soil hypothese  tumorcellen metastaseren alleen naar de juiste ondergrond.
Vb. prostaatkanker metastaseert bijv. veel naar het beenmerg en minder naar
het brein, lever en longen.
Hypothese kan niet alle vormen van metastase verklaren! Ook afh. van de
vaten tussen plek van primaire tumor en plek van metastase.
Plekken die normaliter niet worden gekoloniseerd kunnen wel worden
gekoloniseerd gelocaliseerde wonden. Gebieden van chronische ontsteking
kunnen plekken voor metastase worden  allerlei mitogene/trofische signalen.
CTCs kunnen het stroma v/d primaire tumor zelf de beste plek vinden om uit te zaaien 
tumor self-seeding.
Targetorganen geven chemoattractants (chemokinen) af die CTCs aantrekken.
Bloedvaten kunnen ook weefselspecifieke moleculen tot expressie brengen; kunnen docking
sites vormen voor cellen met bepaalde adhesiemoleculen (bijv. integrines). Dit model heet de
“vascular ZIP code theory”  luminale oppervlakken van vaten dragen een soort “homing
adressen”.
66% van metastases zijn te verklaren door bloedflowpatronen tussen de 2 plekken.
20% van de gevallen te verklaren door micro-omgeving v/d targetweefsels.
14% van de gevallen te verklaren door negatieve interacties  cellen trekken actief CTCs
aan.
Hoorcollege biologie van kanker – 21-03-2014 – Fehrmann
Genomic profiling  hoe ziet het genoom van een tumor eruit? Welke mutaties, deleties,
amplificaties?
Vroeger m.b.v. technieken waarmee je één gen bekeek, nu sequencing.
Genomics  DNA-niveau in kaart brengen: waar zitten mutaties o.i.d.?
Transcriptomics  mRNA-niveau: genexpressie; welke genen hoog/laag tot
expressie?
Epigenomics  methylatie, histonmodificatie?
Sequencing gebeurt dus op meerdere niveaus in de cel. Verkregen data wordt geïntegreerd
en geïnterpreteerd voor beter begrip van kanker en klinische toepassingen.
Doel  analyse van:
Pathofysiologisch gedrag van tumoren: wat kan leiden tot nieuwe therapieën?
Therapierespons: betere selectie mogelijk op optimale behandelingsstrategie voor een
individu.
Stel: altijd chromosoom 11 amplificatie bij bepaalde tumor; reageert niet op chemo  geen
chemotherapie toepassen.
Hoe leidt een afwijking tot kanker die agressief en invasief is?
Genomische instabiliteit  ophoping van somatische genetische veranderingen (mutaties,
CNAs).
Er is een “driver” vs. “passenger” probleem in oncologie  bij een bepaald kanker is een
deel v/e chromosoom gemuteerd/geamplificeerd: niet elk gen op dat deel veroorzaakt
kankerontwikkeling (passengers), dit gebeurt maar door één/enkele genen (drivers).
Bijv.: locus van 10 genen deletie  1 gen veroorzaakt metastase (driver), andere niet
(passengers).
Borstkanker  betrokken gen is HER2/Neu gen.
Zit normaliter op chromosoom 17, maar in 20-30% v/d borstkankerpatiënten is er HER2
amplificatie. Meer HER2  verhoogde genexpressie  meer HER2 eiwit op buitenkant
tumorcel. Geamplificeerd HER2  agressievere tumoren.
Activatie HER2  downstream effecten: tumoreigenschappen; cel gaat groeien en minder
snel dood.
Middel  grijpt aan op HER2 (Traztuzumab).
Er is een duidelijke relatie tussen veranderingen in DNA – genexpressie. Genexpressie
belangrijke factor in tumorontwikkeling?
eQTL  genomische gebieden (loci) die expressie van mRNA reguleren.
Er wordt gekeken naar twee veranderingen in DNA:
SNPs  variatie in DNA v/e enkele nucleotide. Kan germ-line of somatisch.
Copy number variation  deleties, amplificaties: extra/ontbrekende stukjes DNA.
Er wordt gekeken naar hoeveel genomische gebieden nu duidelijk gerelateerd zijn met
genexpressie van bepaalde genen.
Vb. bloed van 1500 individuen  germ-line DNA in kaart brengen. Er werden 300 SNPs
gevonden in die patiënten. Daarnaast ook mRNA microarrays waarmee je genexpressie van
20.000 genen kunt meten in die cellen.
Resultaat  SNPs bekend samen met het genexpressieprofiel van patiëntne.
Je gaat op zoek naar SNPs die zorgen voor hogere expressie v/e bepaald gen.
Cis-eQTL: SNP met invloed op expressie van een gen in de buurt (< 250 kb).
Trans-eQTL: SNP geassocieerd met niveau genexpressie van genen die verder weg liggen
(> 5 mb), of genen op een ander chromosoom.
Afbeelding  op x-as alle gevonden SNPs gesorteerd op
chromosoom, op y-as genexpressie op genomische positie.
Zwarte band geven cis-eQTLs weer: SNPs die significant effect
hebben expressieniveau van genen vlakbij.
Rode stipjes (grootte = significantieniveau) geven trans-eQTLs
weer; SNPs effect op genexpressie, maar op genen over hele
genoom.
 In totaal voor 7,500 genen 50,000 SNPs gevonden die
expressieniveau kunnen beïnvloeden. Trans-eQTLs maar
voor 202 genen.
SNPs dus sterk geassocieerd met genexpressie van veel genen 
is genexpressieverandering belangrijke tussenstap waardoor DNAveranderingen leiden tot kanker?
Genome.gov  database met genome-wide association studies; wordt gekeken naar
associatie van SNPs met bepaalde ziektes.
Statistiek: kijken naar alle SNPs. 17% v/d SNPs hebben effect op genen op hetzelfde
chromosoom (cis). Bij ziekte-geassocieerde SNPs is dit percentage 40,4%: ook sterke
toename in percentage trans-eQTLs.
Verandering in genexpressie is belangrijke tussenstap bij ziektes met oorsprong in het
DNA.
VB – Beta thalassemia/Hb levels (bloedziekte).
3 SNPs die sterk geassocieerd zijn met ziekteontwikkeling.
De twee onderste SNPs hebben ook veel invloed op andere genen (staan eronder): zijn
trans-eQTLs. De bovenste is een cis-eQTL. Allemaal geassocieerd met ziekte, maar ook met
expressieniveau v/h HBG2-gen.
Key concepts:
Kanker is een “DNA-ziekte”: genomische instabiliteit leidt tot somatische mutaties en
CNAs.
DNA afwijkingen hebben downstream effecten: verandering van genexpressie is
belangrijk! Leidt tot tumorgedrag en therapierespons.
Integrative genomics biedt beter inzicht in relevante genen en biologische routes.
Genexpressieniveau is belangrijk  waarom kijk je dan niet alleen naar mRNA?
Data dump biedt veel mRNA expressieprofielen van grote en heterogene sets tumoren.
Naïef experiment  creëren LCL (lymphoblastoid cell line) cellijn met karyotypering.
Voor 5 chromosomen is amplificatie te zien  dus ook meer genafschrijving naar mRNA en
dus verhoogde genexpressie.
Creëren genexpressieprofiel: elk puntje een gen  niet duidelijk hogere genexpressie bij die
gemuteerde chromosomen?!
Fout  genexpressie gereguleerd door allerlei factoren:
Genetisch (SNPs, lesies).
Fysiologisch  hogere genexpressie na maaltijd, nuchter gaan sommige genen
omhoog en andere omlaag. Geldt ook voor dag-nachtritme (effect op 40% v
genexpressie).
Metabolisch (net gegeten bijv.)
Experimentele variatie (groot, maar niet interessant)  ene dag is de andere niet.
Celtype-specifiek
Deze effecten moet je er dus uit zien te filteren als je wil kijken naar verschillen in
genexpressie tussen chromosomen.
Model: zie de cel als een groot regelpaneel met knopjes die genexpressie aansturen: zijn
hoger of lager te zitten. Als knopje 1 omhoog gezet wordt gaat genexpressie van bepaalde
genen omhoog of juist omlaag.
 Hoeveel “knopjes” zijn er? Hoe zijn ze verbonden met genen en wat voor invloed
hebben ze?
Voor elk “knopje” de stand berekenen en dan terugdraaien naar 0  betrokken genen
worden ook naar 0 gedraaid. Zo ook variatie in genexpressie door dag-nachtritme of
experimentele/fysiologische effecten weggenomen.
Experiment opnieuw  nu wel variatie in genexpressie te zien! Toe te schrijven aan
amplificatie van genen. Duidelijk downstream consequenties te zien op genexpressie.
Grote overlap tussen daadwerkelijke DNA-amplificaties en genexpressie. Eerst niet te zien
vanwege ruis.
Publieke dataset  samples van 16,000 tumoren te identificeren aan de hand v
genexpressieprofielen. Onderliggende lesies/amplificaties e.d. dus al bekend.
Bepaalde tumoren zijn enorm genomisch instabiel  erg agressieve kankers.
Tumorcellen gaan niet dood door defecte DNA-reparatieroutes of fouten in DNA  wat
herstelt de balans met genomische instabiliteit?
Hoge genomische instabiliteit  welke genen betrokken? Waarschijnlijk te maken met
herstel v/d balans. Bepaald gen altijd geamplificeerd in zo’n tumor; kan nodig zijn om
überhaupt te overleven met genomische instabiliteit.
Tumorsamples: voor elk gen berekend wat correlatie met genomische instabiliteit is.
Therapie kan dan aangrijpen op die genen  p53 meest gemuteerd in elke tumor.
Hoorcollege biologie van kanker – 24-03-2013 – van Vugt
Hoofdstuk 8
Celcyclus klok: houdt de cel in rust (G0), of kan het laten beginnen met celcyclus. Heeft
externe signalen nodig die de klok aan/uit kunnen zetten:
Groeifactoren  wanneer groei nodig is.
Genoom integriteit monitoren  bij veel schade, geen celdeling.
TGF-β receptoren  geven signaal om niet te delen.
Integrines  kunnen voelen of er contact is met buurtcellen: te druk is geen deling.
Metabolisme sensoren  negatief signaal bij slechte omstandigheden voor deling.
Verder zijn er veel regulatoire stappen tussen G1 en M.
Celcyclus: vanuit G0  G1  S  G2  M(itose).
G1 fase: cellen groeien, worden gezond genoeg om te delen.
Restrictiepunt (R-point): beslissend moment of cellen wel/niet de cyclus ingaan.
S-fase: genoom replicatie.
G2-fase: cellen bereiden voor op deling.
M-fase: deling van de cel en genoom in 2 dochtercellen.
Het doel v/d celcyclus is gelijke verdeling van genomisch materiaal over 2 dochtercellen.
Ideale situatie: 2n  (replicatie): 4n  2 dochtercellen met 2n.
In afwijkende situatie leidt bijv. dubbele replicatie tot 2 dochtercellen met 4n of is er dubbele
mitose met daardoor 4 dochtercellen met 1n. Toch gaat het vaak goed door
veiligheidsmechanismen, en zijn er bijv. ook geen shortcuts van M  G2 of naar G1
zonder mitose.
Cycline  betrokken bij celcyclusregulatie.
Bij mitose wordt cycline snel afgebroken en komt weer langzaam op bij volgende S-fase.
Er is een kinase dat cyclines bindt: Cyclin-dependent kinase (Cdk).
Cyclines zijn niet altijd aanwezig, Cdk’s daarentegen wel. Cdk is dus een kinase (enzym):
deze is alleen actief in complex met cyclines.
Cycline-Cdk voorkomt replicatie: doordat complexen in G2 opkomen (aan einde S-fase),
kan het genoom niet repliceren na de S-fase. Zonder cycline-Cdk ook geen mitose  in G1
geen cycline, dus nooit een shortcut naar M, zonder langs S en G2 te gaan.
 Celcyclus altijd in de juiste volgorde!
Cycline-Cdk regulatie:
1. Cdk begint met 2 remmende fosforgroepen; daarna cyclineproductie.
2. Cycline bindt aan Cdk, Cdk wordt gefosforyleerd (activerend).
3. Cycline fosforylatie (activerend).
4. Complex gaat naar de kern v/d cel.
5. Remmende fosforgroepen worden van Cdk gehaald  actief complex.
Hierna zijn 2 mogelijkheden: (6) een remmer bindt: CKI (Cdk-inhibitor)  complex raakt
inactief en werkt niet meer of (7) cycline degradatie  geen werkend complex meer.
Cycline-Cdk wordt in het cytoplasma geproduceerd en moet actief naar de kern worden
getransporteerd.
Eenvoudige organismen hebben maar één type cycline en Cdk (goed modelorganisme),
mensen hebben er meer:
Cycline B
Nuclear D1
Cycline E
Cycline A
Elke celcyclusfase heeft een eigen profiel van cycline-activiteit:
Het begint met Cdk4/6 gebonden aan Cycline D  cycline E-Cdk2  cycline A-Cdk2 
cyclineA-Cdk1 (Cdc2). De laatste bepaalt mitose.
Restrictiepunt (R-point)  “point of no return”: na dit punt is terugkeer onmogelijk, cel moet
de hele celcyclus doorgaan. Vóór het R-point zijn cellen gevoelig voor groeifactoren en
TGF-β. Op R-point wordt eerst Cdk4/6 geactiveerd  daarna progressie door cyclus.
Groeifactoren hebben dus invloed op Cdk4/6; worden gebonden door cycline D.
Cycline D productie is de key tot activatie v/d celcyclus.
Productie is te beïnvloeden door verschillende externe signalen:
Groeifactoren  binden tyrosine kinasereceptoren, via Ras-pathway  MAPK; kan
ook via binden aan HER2/Neu.
ECM  integrines zorgen voor activatie Ras-pathway  MAPK.
Cytokines  binden cytokinereceptor en activeren zo Jak-STAT pathway.
Ontwikkeling  Wnt-factoren activeren Frizzled en zorgen voor cycline D-productie
via β-catenine.
Immuuncellen reageren op cytokines via andere receptoren: effect is wel hetzelfde; cycline D
productie.
Hedgehog (embryogenese) werkt via Pathed en Smoothened ook op cycline D productie.
VB – stimuleren macrofagen met CSF1 hormoon (GF)  na 2 uur hoge cycline D1
productie. Te zien door hoge aanwezigheid cycline D1 mRNA.
Na de R-point is de celcyclus autonoom  er is cascade van reacties die elkaar activeren,
voornamelijk via cycline-productie. Geen externe signalen meer nodig. Er is nog wel
regulatie, bijv. door CDK remmers.
Bij kanker vaak problemen met veiligheidsmechanismen.
Regulatie celcyclus  CDK remmers (CKIs):
INK4 eiwitten; genen p16 t/m p19: remmen Cdk4/6.
p21, p27, p57: remmen alle andere Cdks.
Remming gebeurt door sterische hinder.
E2F transcriptiefactoren  8-tal transcriptiefactoren die promotorregio binden van
genen die nodig zijn voor celdeling. 1, 2 3 werken stimulerend, 4-8 remmend.
Bij grote aanwezigheid van deze TFs willen cellen graag delen: gevaarlijk om altijd aan te
houden. pRb  binden deze TFs en remmen het hiermee. pRb remt dus celdeling.
Rb wordt gefosforyleerd door actieve cycline-Cdk4/6 complexen: eerst is er
hypofosforylatie (1 fosforgroep  bindt nog steeds E2F). Vervolgens een beetje E-Cdk2
activiteit; zorgen voor hyperfosforylatie van Rb: geen E2F binding meer, E2F wordt actief
en zet genen aan die zorgen voor benodigde eiwitten voor de celcyclus.
Dus:
G1  Rb hypofosforylatie.
Laat G1 (rond R-point)  Rb hyperfosforylatie; geen E2F binding meer.
S-fase  E2F afgebroken.
Cycline-Cdk’s zijn nodig voor hyperfosforylatie: E2F valt eraf en wordt actief: ze zorgen zelf
voor nieuwe cyclineproductie die Cdk’s kunnen binden  meer cycline-Cdk complexen:
amplificatieloop: je kunt dus niet net over de R-point en dan weer terug: point of no return.
Andere amplificatieloop  beetje Cdk-activiteit zorgt voor fosforylatie van p27:
herkenningsteken voor ubiquitine ligase, dus die
zet ubiquitine op p27: “moleculaire barcode” dat
aangeeft dat cel afgebroken moet worden 
proteasoom actief: p27 afgebroken.
Hierdoor worden Cdk’s actief omdat remming op
Cdk’s wegvalt; dit herhaalt zich (amplificatie).
Beetje actief Cdk zorgt er dus voor dat remmer
wordt afgebroken, en signaal versterkt wordt.
Kankers  R-point kritiek moment; op genetisch
niveau veel veranderingen rond R-point. Veel
gemuteerde genen waardoor ze inactief of
hyperactief (door amplificatie) worden, wat leidt tot
vernaderingen in de routes.
Bijv. meer Cdk4/6  meer uitschakeling Rb 
meer cellen in celcyclus.
Key concepts:
Celcyclus is geordende volgorde van celcyclus fases.
Gereguleerd door Cycline-Cdk complexen.
Cycline-Cdk’s zijn sterk gereguleerd.
Cycline D is de 1e cycline die de celcyclus start.
Na R-point  celcyclus kan niet meer terug.
Rb (retinoblastoma) 1 zorgt dat de celcyclus niet zomaar vanzelf start.
Veel oncogenen/TSGs in deze pathway.
Hoofdstuk 10
Cellen kunnen niet eeuwig delen.
Senescence  na een aantal delingen gaan cellen in permanent arrest.
Cellen zijn te zien met een beta galactosidase assay  kijken of beta galactosidase wordt
geknipt; blauw weergegeven in assay. Blauwkeuring geeft senescence weer. In dit soort
assays zijn zulke cellen te zien aan groter cytoplasma.
Er zijn weinig cycline-Cdk’s bij cellen in senescence  remmers van Cdk (p21, p16) allebei
heel hoog na 43 celdelingen (PD): 100% v/d lifespan. p16 is lid van INK4-familie, p21 hoort
bij een ander soort remmers.
Senescence ook te vinden in vivo  proces blijkt te versnellen door stress:
DNA schade
Oxidatieve schade (20% vs. 3% O2)
Defecten in DNA repair
Telomeren  bepalen de beperkte hoeveelheid celdelingen. Bij elke deling wordt het
telomeer DNA korter: na een tijd zo kort dat het een signaal afgeeft dat deling niet meer
veilig is (crisis).
Bestaat uit duizenden TTAGGG-repeats in eukaryoten.
Telomeren worden korter bij deling  tijdens replicatie maakt DNA
helicase het DNA open: resulteert in een leading en lagging strand.
Aan lagging wordt een stukje DNA gemaakt waarvoor een primer
nodig is: aan het eind is de strand te kort  primer valt eraf
(polymerase is groot). Kan geen DNA meer geproduceerd worden
zonder primer, dus wordt het laatste stuk overgeslagen.
Na x aantal delingen  te kort voor normale functie: geen beschermend DNA-einde meer.
Wordt herkend als “breuk” en dus gerepareerd: fusie van chromatide-einden waardoor
chromatiden niet te scheiden zijn in celdeling  worden uit elkaar getrokken: random breuk
wat nieuwe situatie genereert  opnieuw reparatie  fusion-breakage-fusion-cycles.
 Resultaat: chromosomale deleties en amplificaties.
Telomeren worden normaliter niet herkend als breuk:
komt doordat er een lus aan het einde zit. Korte
telomeren hebben te weinig lengte voor een lus.
Repeat is G-rich (TTAGGG), complementair stuk is Crich (AATCCC): single strand blijft over  overhang
van G-rich strand zorgt voor een loop die terugkeert
naar eigen chromosoom
(t-loop). Er is ook een displacement (D-) loop.
Voor vorming v/d loop zijn verschillende eiwitten
nodig: deze eiwitten herkennen en binden telomeer
repeats. Begint met TRF1 en -2 die nucleotiden kunnen herkennen en direct kunnen binden;
zitten alleen op telomeren. Halen andere eiwitten erbij die het DNA in een loop trekken.
Kankercellen kunnen vaker delen dan normale cellen: telomeren worden langer gemaakt
m.b.v. het eiwit hTERT  telomerase enzym bestaande uit DNA polymerase en een RNA
template. Is eigenlijk een “stukje telomeer”; kan repeats toevoegen aan DNA uiteinde.
Bindt het laatste stukje telomeer met binder en verlengt het hiermee.
Niet aanwezig in humane weefsels, behalve stamcellen en embryonale cellen.
Toevoegen hTERT aan normale cellen  meten polymerase-activiteit (TRAP assay): hoge
activiteit. Truc waarbij overexpressie van een eiwit leidt tot omzeilen senescence. Gebeurt
veel in kankers.
Key concepts:
Telomeren worden elke deling korter.
Te korte telomeren stoppen celgroei.
Telomeren worden opgevouwen in T-loops.
Tumoren kunnen oneindig delen door hogere expressie telomerase.
Hoofdstuk 12
DNA schade is de directe oorzaak van kankerontwikkeling, maar wordt ook gebruikt voor
behandeling van kanker (chemo-/radiotherapie). Doel is zoveel mogelijk schade in
tumorcellen. DNA-schade in gezond weefsel zorgt voor bijwerkingen van therapie.
Oorzaken DNA-schade:
Intrinsiek  replicatie: inserties, deleties, mismatches.
Extrinsiek  zonlicht, straling, chemicaliën en chemotherapie.
Chemische stoffen kunnen ook kanker induceren: carcinogenen: zijn onder te verdelen;
Genotoxisch: induceren DNA-schade.
- Direct acting carcinogens  zijn in een “potje” al DNA beschadigend;
intrinsieke activiteit.
- Indirect acting carcinogens  pas DNA beschadigend als ze ingenomen
worden en in maag-/darmkanaal komen: moeten geactiveerd worden.
Niet-genotoxisch: induceren geen DNA-schade.
Sigarettenrook  bevat >60 carcinogenen, veel genotoxische stoffen. Draagt bij aan 8090% van alle gevallen longkanker.
Gezond houden DNA:
Organisatie v/h lichaam
DNA reparatie
Organisatie v/h lichaam  opbouw van organen begint met stamcellen: delen weinig,
kunnen veranderen in alle celtypen. DNA schade komt door veel celdelingen (veel fouten);
weinig celdelingen zorgt dus voor bescherming.
Stamcellen zitten zo ver mogelijk van toxische stoffen.
Stamcellen  (1) transit amplifying cells: delen vaak; mogen in apoptose, want worden
weer aangevuld en (2) gedifferentieerde cellen; delen niet, komen in contact
met toxische stoffen.
Darm: vili steken uit naar lumen v/d darm. Epitheel en vili komen in contact met
langskomende stoffen (ook toxisch!). Gedifferentieerde cellen zitten dus
bovenaan  mogen verloren gaan.
Diep in de darm zitten transit amplifying cells  delen vaker, verder van
toxische stoffen.
Helemaal onderaan stamcellen  vullen andere cellen aan; hier schade =
gevaarlijk!
DNA reparatie  veel soorten schade, elk eigen soort repairmechanism:
Mismatch repair  herstellen replicatiefouten (mismatch).
Replicatievork: DNA-strengen uit elkaar getrokken, polymerase zorgt voor nieuwe basen
eraan. Wanneer een verkeerde match wordt gemaakt, bijv. T-C (mismatch) is reparatie
nodig  anders in volgende ronde een normaal lijkende sequentie maar met één
puntmutatie: moet je voorkomen!!!
Reparatie  G-C was origineel, is T-C van gemaakt. Als je nu de C vervangt door een A in
repairmechanisme krijg je 2 gemuteerde strands  situatie is erger geworden: 2
dochtercellen met mutatie.
Moet dus bekend zijn welke v/d 2 basen fout was  DNA polymerase legt nieuw basen op
oud DNA; door eraf vallen van polymerases ontstaan kleine openingen (nicks), zijn later
ligases voor.
Nicks  onderscheid tussen oude en nieuwe strand: baseparen van nieuwe strand worden
eruit geknipt en later opnieuw opgevuld.
 Repair: (1) m.b.v nicks herkenning van nieuwe strand; (2) basen
rondom mismatch worden verwijderd; (3) opvulling “gat” in nieuwe
strand.
MutSα herkent DNA dat beetje openstaat: MutLα gaat in buurt op zoek
en vindt opengemaakt DNA. Zorgt dat DNA rondom de ‘nick’ in loop komt
en eruit wordt geknipt.
Als nicks binnen seconden opgevuld worden, weet je niet wat nieuwe /
oude strand was: systeem moet snel genoeg zijn om mismatch op tijd te
vinden.
Dubbelstrengs repair  twee mechanismen bij toxische soort schade:
- Non-homologe end joining (G1, NHEJ)
- Homologe recombinatie (S t/m M, HR)
Non-homologe end joining (G1)  einden van de chromatiden worden bij elkaar gebracht.
Tussen nucleotiden zitten fosforgroepen. Als overhang niet gelijk is kun je ze niet zomaar
aan elkaar plakken:
Overhang is niet gelijk, stukje is afgebroken  mechanisme: (1) extra fosforgroep eraan
plakken (bovenste strand), (2) base-verwijdering en (3) plakken.
Wel mist een nucleotide: sequentie klopt niet meer  in intron geen probleem, in exon wel.
Mechanisme is non-homoloog (geen referentiesequentie), niet conservatief (niet
behoudend  sequentie verandert) met base loss  mutatie. Simpelste soort DNA repair
bij ds breuken.
Homologe recombinatie (S t/m M)  je zit al voorbij replicatie, dus ander zusterchromatide
ligt naast de gebroken streng. Sequentie is identiek  intacte streng opengemaakt (m.b.v.
helicase): kapotte streng invaseert  m.b.v. polymerase worden hele stukken DNA
gekopieerd  nieuwe stukken DNA in de kapotte streng gezet en aan elkaar geplakt.
Het is semi-conservatief (uitwisseling  geen mutaties).
HR (voorbij G1-fase)  error-free.
NHEJ (in G1-fase)  error-prone.
In kankers wordt DNA niet gerepareerd  eiwitcomplex betrokken (Mre11, Rad50, Nbs1).
Eiwitcomplex herkent ds breuken: kinase wordt geactiveerd (ATM)  kan veel eiwitten
activeren en zorgen voor verschillende effecten:
Celcyclus arrest (p21, p53, Chk2)
DNA reparative (BRCA2, BRCA1, FANCD2)
Apoptose (PUMA, Noxa, p53)
Activatie van deze eiwitten is gemuteerd in veel ziektes: bijv. ATM (Ataxia Telanciestasia of
Louis-Bar syndroom). Beide kopieën van ATM-gen zijn gemuteerd. Zorgt voor toenemende
moeite met coördinatie van beweging (ataxie) en clusters van vergrote bloedvaten
(telanciestasia). Zorgt voor een verhoogde kans op kanker: 40% kans op kanker voor hun
20e  vooral lymfomen/leukemieën.
Mutaties eerste eiwitcomplex:
Mre11  ziekte lijkt op ATM, maar is milder (ATLD). Beide kopieën Mre11 gemuteerd.
Nbs1  ook beide kopieën gemuteerd. Sterke kans op ontwikkeling lymfomen; niet teveel
bestraling nodig, want dan valt het lichaam uit elkaar.
Mutatie reparatiemechanismen: mutatie in Brca1/-2  hoeft maar één
kopie te zijn! Een dubbele mutatie hierin is lethaal. Hoge kans op
kankerontwikkeling:
Karakteristieken DNA repair:
Extreem gevoelig voor bestraling
Aanleg voor verschillende kankertypes
Laat het belang van onderhouden van DNA zien om ons gezond
te houden
Er is dus een sterke link tussen DNA schade voor kanker: bij schade worden eiwitten
geactiveerd (ATM, Brca)  cellen stoppen met delen, DNA repairmechanismen worden
actief en bij teveel schade wordt apoptose geïnduceerd.
PARP1  gen dat nodig is voor reparatiemechanisme wanneer een base niet helemaal klopt
en de goede wordt teruggezet.
PARP1 knipt slechte base eruit: maakt lange ribosestrengen die ervoor zorgen dat juiste
enzymen actief worden. PARP-inhibitor  zorgt voor niet-gerepareerde ss breuk (één base
kapot).
Remmen PARP in delende cellen  template streng veroorzaakt een ds breuk: een relatief
onbelangrijk gen (PARP) zorgt in inactieve staat dus voor ds breuk in delende cellen.
Kankerpatiënten  naast normale cellen delen tumorcellen vaak: veel mutaties in
tumorcellen, dus in tumorcellen goede repair  ds breuk is toxisch maar wordt in
tumorcellen niet gerepareerd!
Wt-cel (Brca +/+)  cellen krijgen pas last van toxische stof op hoge concentratie.
Brca +/-  iets sneller last, maar scheelt niet veel.
Brca -/-  snel last: PARP inhibitor geeft bij lage concentraties toxische stof al ss breuken,
bij delende cellen omgezet in ds breuken. PARP1-remming is zeer toxisch in Brca1/2 mutant
tumoren. Dit heet synthetic lethality  cellen pas dood bij uitschakelen beide allelen.
Key concepts:
DNA wordt gezond gehouden door organisatie v/h lichaam en door DNA repair.
Verschillende soorten DNA schade hebben eigen soort repair.
Soms foutloos (HR), soms met fouten (NHEJ).
Defecten in DNA repair geeft verhoogde kans op kanker.
Biedt ook mogelijkheden voor gerichte kankerbehandeling.
Hoorcollege biologie van kanker – 26-03-2014 – Terwisscha van Scheltinga
Moleculaire imaging = visualisatie, karakterisatie en meting van biologische processen op
moleculaire en cellulaire niveaus in mensen en andere organismen.
Verschillende vormen:
Anatomische imaging  grootte, vorm, dichtheid, bijv. met CT, MRI en
mammografie; bijv. tumorrespons op verandering van grootte.
Moleculaire imaging  tumorbiologie in vivo, bijv. met PET, SPECT en MRI; bijv.
tumorrespons op veranderingen in moleculaire processen: therapie effectief?
Moleculaire imaging targets bij bekijken van tumoren zijn bijv. celmembraanreceptoren
(HER2, VEGF receptoren)  te targeten met Ab’s. Ab’s remmen één v/d receptoren; werken
nl. als antagonist. Kunnen niet zomaar door membranen, dus targeten alleen receptoren op
het membraan.
Ook groeifactoren zijn te visualiseren: VEGF (uitgescheiden door tumor).
Liganden:
Radioactiviteit (PET, SPECT)
Fluorescentie (optische imaging)
Contrastvloeistof (MRI)
SPECT  gebruik van gammastraling die gemetne wordt. Tracer injectie: verdeelt zich over
het lichaam en gaat bijv. naar de tumor. Camera draait om de patiënt. Vanuit verschillende
vlakken kleine beeldjes, samen een 3D-beeld.
PET  ook gebruik v/e tracer. Positron-uitstralende isotopen worden gebruikt die elektronen
vinden: 2 fotonen worden in tegengestelde richting uitgezonden  gemeten door de camera.
Worden tegelijk uitgezonden, dus is te herleiden waar ze vandaan kwamen.
Radioactieve deeltjes hebben korte halfwaardetijd  radioactiviteit moet gemaakt worden
ter plekke!
SPECT
Gamma-uitstralende epitopen
(111In, 99mTc, 123/125I)
Medium ruimtelijke resolutie
Semikwantitatief
Achtergrondproblemen
Relatief goedkoop
PET
Positron-uitstralende isotopen
(18F, 11C, 15O, 64Cu, 89Zr)
Hoge ruimtelijke resolutie
Kwantitatief
Hoog signaal t.o.v. ruis
Duur (door cyclotron)
18
F  gebruikt voor tumormetabolisme door te labelen aan fluorodeoxyglucose (FDG). Is een
glucose analoog en visualiseert dus glucose metabolisme: vaak toegenomen in tumorcellen.
FLT (fluorothymidine) ook vaak gebruikt met 18F  pyrimidine analoog: opname geeft
proliferatie van tumorcellen weer.
Monoklonale Ab’s  Ab’s met hoogspecifieke targetherkenning en –binding. Lange
halfwaardetijd: halfwaardetijd geeft hier tijd waarin helft v/d targets is gebonden aan.
Hierdoor radioactieve isotoop nodig met ook lange halfwaardetijd  paar geschikte isotopen,
bijv. 111ln (68 uur) en 89Zr (78 uur).
Imaging met Ab’s zorgt voor (1) informatie over de Ab’s (farmacokinetiek in bloed,
orgaandistributie, targetorgaan/tumor accumulatie) en (2) informatie over het target v/d Ab
(targetexpressie in alle lesies, verzadiging v/d target door de Ab, targetexpressie modulatie
door Ab/andere drugs).
 Personalized medicine: verschillen in dosering, andere toedieningsmethode?
89
Zr labeling methode:
(1) Chelatie: binden van een chelaat aan de Ab. Chelaat is kleiner dan het Ab, dus
eigenschappen worden zo min mogelijk of niet veranderd.
(2) Radiolabeling: 89Zr wordt gekoppeld aan het chelaat: bindt aan lysine.
Chelaat mag niet het Ag-bindend deel binden! Dan verandert functie v/d Ab.
HER2-receptor: Human Epidermal Growth Factor receptor 2. Betrokken bij celoverleving en
anti-apoptotische pathways, proliferatie, maturatie, metastase en angiogenese.
Overexpressie in 25% v/d borstkankerpatiënten. Bindt aan Trastuzimab  kan worden
gevisualiseerd; metastases ook zo zichtbaar te maken. Therapieën gericht tegen HER2receptor zijn zo ook te imagen.
Ab bindt aan receptor: receptor zorgt voor internalisatie (opname): Ab komt in de tumorcel.
Belangrijk eigenschap van Zr is dat het niet uitgescheiden kan worden, dus blijft in de
tumorcel. Al het Zr dat naar de tumor is gebracht wordt gemeten  hoeveel v/d drug komt in
de tumor?
Patiëntentesting  doel is: kijken of het werkt: gaat het naar de tumor, is het
visualiseerbaar?
Lage dosis  alleen zichtbaar in maag-/darmkanaal.
Hoge dosis  antilichaam verdeelt zich over het lichaam: grote vaten goed zichtbaar en het
hart (het zit goed in het bloed). Hoe later je scant, hoe minder in het bloed en hoe meer in
bepaalde lesies.
HSP90  moleculaire chaperone, belangrijk voor instandhouding eiwitten en vorming van
die eiwitten:
Behoudt angiogenese
Zorgt voor zelf-voorziening in groeisignalen
O.a. VEGF en HER2 zijn afhankelijk van HSP90. Dus: remming HSP90 = remming van die
receptoren.
MicroPET imaging (muis)  in verloop van tijd neemt relatieve opname van 89Zr
bevacizumab op in de tumor v/d muis.
Het grootste deel van de tracer blijft ook in de buurt v/d tumor; vooral rondom tumorcellen,
niet in de tumor zelf. Na verloop van tijd pas optimale opname v/d Ab.
VGEF-gestuurde therapie
HSP90 remming  minder VEGF productie
mTOR remming  downregulatie VEGF
Sunitinib  upregulatie VEGF
Optische imaging  gebruik van licht; gelimiteerde penetratie van weefsels en dergelijke.
Hiervoor zijn dus nieuwe tracers en verbeterde detectieapparatuur nodig.
Optische fluorescente imaging  elektronen worden in hogere toestand aangeslagen en
vallen terug naar grondtoestand: hierbij stralen ze fotonen uit met hogere golflengte
(emissie). Dit wordt geanalyseerd en gedetecteerd met een machine met 3 camera’s tegelijk.
Probleem is dat licht geabsorbeerd wordt  niet alle organen te visualiseren; daarom rood
licht: hogere golflengte = grotere penetratie door weefsels.
Fluorescentie geeft alleen lokaal beeldvorming: geen 3D; niet verder kijken dan paar cm.
Je gebruikt dus intra-operatieve beeldvorming  chirurg visualiseert tumor tijdens operatie
en kijkt of het positieve snijranden heeft (dat tumor weer kan teruggroeien of er positieve
lymfeklieren zijn; eerst punt v uitzaaiing).
Tijdens endoscopie ook tumoren visualiseren.
Dual imaging: optisch (licht) + fluorescentie (89Zr):
Op de scans zie je ook zichtbaar kleine lesies: techniek is dus gevoelig genoeg om met klein
beetje tracer het zichtbaar te maken. Kleine lesies zijn fluorescent ook te imagen.
Key concepts:
Introductie in moleculaire imaging
2 voorbeelden van Ab-imaging:
o HER2 imaging met Trastuzumab
o VEGF imaging met Bevacizumab
89
Zr imaging
Optische imaging
Hoorcollege biologie van kanker – 26-03-2014 – Wisman
Hoofdstuk 1
Epigenetica = studie van erfelijke verandering in genfunctie zonder verandering in DNAsequentie; regulatie van genexpressie.
Histonmodificatie
DNA methylatie
Nucleosoom remodeling
miRNA
Er moet een grote hoeveelheid DNA verpakt worden in een cel: daarom is er
gecondenseerde structuur van chromosomen in de cel. DNA is omwikkeld om histonen
(eiwitten)  zorgen voor makkelijke verpakking van DNA.
Histonmodificatie
Deacetylatie
Methylatie
Fosforylatie
Ubiquitinilatie
Elke omwikkeling van DNA zit om 8 histonen heen met staarten
 kunnen worden gemodificeerd. Modificaties zorgen ervoor dat
op die plekken een open of juist dichte chromatinestructuur is:
open/dicht voor gentranscriptie. Zo is in bepaalde weefseltype
genexpressie wel/niet actief.
Writers voeren modificatie uit op verschillende aminozuren v/h
eiwit: kunnen ervoor zorgen dat een gen uit/aan komt te staan.
Markers worden herkend door readers (nucleosoom remodeling
complexen); dragen bij aan genexpressie. Erasers verwijderen de markers van writers.
Aanzetten  histone methyl transferase writers.
Uitzetten  histone demethylase erasers.
DNA methylatie  aanzetten methylgroep op 5e positie van cytosine (C). Vindt alleen
plaats bij C die voorafgegaan wordt door G  CpG dinucleotiden.
Een C tussen twee T’s kan niet gemethyleerd worden.
Methylatie gebeurd door DNA methyl transferases (DNMTs); 3 sooten:
De novo methylatie  door DNMT-3a en DNMT-3b.
Maintenance  door DNMT-1.
CpG dinucleotiden zitten vaak in clusters  CpG eilanden:
Regio van tenminste 200 bp.
Een G-C percentage van >50%.
CpG-ratio observed-expected > 0.6
Als alle C’s in een CpG eiland gemethyleerd worden resulteert dit in gene silencing.
DNMT-1  zorgt voor maintenance methylatie.
Tijdens replicatie scheiden twee gemethyleerde strengen: vorming van complementaire
strengen, maar nog niet gemethyleerd: dit gebeurt door DNMT-1; methyleert de nieuwe
strengen.
Carcinogenese  upregulatie DNMT-3b. Naarmate de ontwikkeling van kanker vordert
wordt DNMT-3b meer up gereguleerd. Zorgt ervoor dat er meer de novo DNA methylatie
plaatsvindt.
Normale cel: methylatie begint in
promotorregio waar transcriptie
bindt. Zgn. monitoren (wit) zijn
niet gemethyleerd.
Histonmodificaties zijn zodanig dat
gemodificeerde staarten
euchromatinestructuur vormen zodat transcriptie kan plaatsvinden.
Kankercel: TSGs raken gemethyleerd: histonmodificaties veranderd zodat de structuur dicht
is; geen transcriptie TSGs meer (werking valt weg). CpG eilanden worden gemethyleerd en
gehypermethyleerd, losse CpGs worden gedemethyleerd. Meer open chromatinestructuur
 meer oncogenen tot expressie.
Cervix carcinogenese  basale laag met cellen die kunnen delen rijpen uit naar boven toe.
Als HPV geïntegreerd is in DNA kan het ervoor zorgen dat celcyclus niet meer goed
gereguleerd is  verandering in normale cellen: meer dysplastisch, meer carcinogeen.
CIN-klassificatie  hoger is meer maligne: CIN1 is nog premaligne: als 1/3 v/d laag
dysplastisch is (CN1). Daarna CIN2, CIN3 en echt maligne bij CA  dysplastische cellen
dringen door lagen heen.
Naarmate carcinogeniteit toeneemt, neemt gemethyleerd cytosine af (5mC).
CpG-eilanden methylatie neemt wel toe.
Actieve demethylatie  door TET-enzymen (1, 2 en 3), maar ook door TDG.
DNMT zet een methylgroep aan C: TET-enzymen zetten 5mC om in een 5hydroxymethylatie C, daarna in 5fC en daarna in 5caC. Daarna omzetting door TDG.
Hierdoor gaat BER (repairmechanisme) aan en zorgt ervoor dat C wordt omgezet in een
normale, niet-gemethyleerde C.
Gemethyleerde C kan er ook worden afgeknipt  gevaarlijk, leidt tot mutaties.
In kankers ook mutaties in enzymen die methyleren.
Methylatie-specifieke PCR  er wordt gebruik gemaakt van een bisulfiet
behandeling: gemethyleerde C’s zijn hier beschermd tegen, dus blijven een
C.
Niet-gemethyleerde C’s worden hiermee omgezet in U(racil), met PCR
afgelezen als T: dus PCR conversie van C  T.
Primers die passen op CpGs tonen dus specifiek gemethyleerd of nietgemethyleerd DNA aan. Kan later misschien gebruikt worden als
diagnostische tool.
Streepjes geven CpGs weer op het gen.
Gekeken naar methylatie  dit gen is in tumoren in hele promotorregio gemethyleerd.
Normaal weefsel aanliggend aan tumor heeft ook veel methylatie. Dit is histologisch niet te
zien. Sequencing geeft dus extra informatie.
DNA v/d controlegroep is dus geheel ongemethyleerd.
PAP-klassificatie geeft ook carcinogeniteit aan. Pap V komt overeen met carcinoom.
PAP I is normaal.
Epigenetische therapie invloed op allerlei effecten van epigenetica:
Stamcelachtig gedrag ↓
Weerstand tegen chemotherapie ↓
Immuunresponsen ↑
Metastase of EMT ↓
Celproliferatie en –overleving ↓
Apoptose of gevoeligheid voor chemotherapie ↑
MGMT: gen  als dit gen gemethyleerd is speelt het een rol in glioblastomas. Normaliter
worden deze patiënten behandeld met radiotherapie; actief gen zorgt ervoor dat
Temozolomide wordt omgezet en niet meer kan functioneren als anti-tumor agent.
Key concepts:
DNA promotor hypermethylatie resulteert in transcriptionele silencing.
TSGs zijn vaak aangetast in epigenetische regulatie.
Tijdens carcinogenese ontstaat er meer DNA promotor hypermethylatie van TSGs.
Histonmodificatie/DNA methylatie is reversibel.
DNA methylatie kan gebruikt worden als diagnostische marker.
Hoorcollege biologie van kanker – 27-03-2014 – de Jong
Resistentie tegen chemo is belangrijk. Komt vaak voor dat tumor weer uitgroeit na kuur,
waarna nieuwe therapie nodig is omdat de cellen resistent zijn geworden.
Tumoren kunnen ook onder detectieniveau komen en daardoor ineens uitgroeien.
Als tumor terugkeert binnen aantal maanden vaak sprake van resistentie.
Chemotherapie wel levensverlengend bij uitzaaiingen, bijv. leukemie, multiple myeloma,
niet-kleincellige longkanker, eierstok- of darmkanker.
Chemotherapie grijpt vooral aan op toegenomen proliferatie van tumorcellen: door
optreden van spontane mutaties kunnen paar cellen niet meer gevoelig zijn voor de therapie.
p53  belangrijk voor respons; integreert verschillende signalen als DNA-schade, waarna
groeiarrest kan optreden (inductie p21) of apoptose door aanzetten apoptosegenen.
p53 vaak gemuteerd in kankers; route door DNA schade (chemo) werkt in kankercellen al
überhaupt al niet meer goed: reageert niet zo snel op trigger als DNA schade.
HPV  E6 remt p53: niet meer functioneel; ook in baarmoederhalskanker werkt p53 dus
niet.
Ideale targets voor targeted therapie:
Aanwezig in meeste patiënten met bepaalde ziekte.
Speelt cruciale rol in ontwikkeling v/d afwijking.
Unieke activiteit  (1) waar ziekte van afhankelijk is en (2) die vervangbaar is in
normale cellen.
Oncogenen (bijv. Ras, Src).
Tumoren staan niet op zichzelf: heterotypische structuur. Tumor bestaat uit allerlei
celtypen, is dus moeilijk aan te passen. Begrijpen van interacties is dus handig voor
ontwikkeling van nieuwe middelen.
Stromale cellen gaan ook een interactie aan met tumorcellen  scheiden factoren uit
dat tumorcellen stimuleert te delen.
Interacties tussen epitheelcellen en andere celtypen komt ook veel voor: receptor- en
ligand-interactie is gemedieerd  voorbeeld:
PDGF-A positieve epitheliale cellen en PDGFR-A positieve mesenchymale cellen:
Basalcelcarcinoma  tumor transplanteren van arm naar rug zonder stromacellen. Blijkt
dat tumor ook effectiever groeit met stromale cellen: omgeving is nodig
Normale epitheliale borstcellen transformeren met virus (SV40  groei): tumor groeit
langzaam als ie gewoon ingespoten wordt:
+ fibroblasten (factoren die uitgescheiden worden)  snellere groei.
+ Matrigel (ECM gemaakt door muizen sarcomacellen)  snellere groei.
Deze factoren zorgen voor groter tumorvolume na bepaalde tijd.
Borstkankermetastases passen zich geheel aan aan het orgaan waar het zich dan bevindt.
Darmkankers doen dit niet en behouden structuur.
Small molecules eindigen op –nib en antilichamen op –mab.
Ideale targets voor moleculaire therapie zijn uiteraard de hallmarks of cancer:
Target
Specificiteit
Binding
Dosis
Weefseldistributie
Toxiciteit
ADCC
Locatie
Halfwaardetijd
Small molecule
Tyrosine kinase domein
+++
Meeste snel reversibel
Oraal, dagelijks
Compleet
Uitslag, diarree, pulmonair
Nee
Intracellulair
t1/2 serum kort
Antilichaam
Receptor ectodomein
++++
Receptorinternalisering
Intraveneus, wekelijks
Minder compleet
Uitslag, allergie
Mogelijk
Extracellulair
t1/2 serum lang
Testen nieuwe drugs (fase 1-3): na muistesten blijven aantal varianten over:
(1) Maximaal Tolereerbare Dosis (MTD)  inspuiten dosis bij 3 patiënten, bij geen
toxiciteit verhoging van dosis, enzovoorts.
(2) Welk tumortype/welk stadium  waarvoor drug gebruiken?
(3) Vergelijken met andere (standaard)therapieën  beter dan standaardtherapie?
Bij kanker slechte groep waar je op test: het gaat om voorbehandelde patiënten  altijd
beetje effectiviteit. Daarom worden kankerdrugs snel geregistreerd.
Gleevec  Imatinib mesylate. Het is een kinaseremmer van verschillende kinases als Abl,
Bcr-Abl, PDGFR en c-Kit en heeft daarom een rol bij verschillende tumoren.
Bcr-Abl  heel actief fusie-eiwit door translocatie op chromosomen 9 en 22.
Gleevec grijpt aan op actieve loop. M.b.v. eiwitkristallen is een drug
ontworpen die zo in het molecuul zit dat ATP niet meer kan binden en er
geen downstream fosforylatie is.
Gleevec is een remmer en ook al gaan er wel (veel) cellen dood, de tumor
blijft aanwezig.
Dankzij mutaties in Bcr-Abl werkt Gleevec (imatinib) niet meer: een ander middel,
Ponatinib werkt echter nog wel.
Belangrijk  moet je zodra je eerste mutaties detecteert in het bloed overschakelen naar
andere middelen?
HER-familie : niet actief als receptor, moeten nl. dimeriseren met eigen broertje of ander
familielid van HER-receptoren. Als een ligand bindt worden tyrosine kinasedomeinen actief.
Kinases vaak gemuteerd in kankers  ligand niet meer nodig, pathway altijd hard aan.
Tyrosine kinaseremmers grijpen hierop aan.
TKIs zijn gericht tegen gemuteerde leden v/d HER-familie, bijv. EGFR.
Iressa en Tarceva zijn voorbeelden van small molecules die fungeren als remmer van
tyrosine kinasedomeinen (TKIs): blokkeren actieve eiwitten waardoor de cel stopt met delen
en groeien.
Toxiciteit/effect op de huid is voorspeller van effectiviteit EGFR remmer.
HER2 overexpressie en activatie
Overexpressie in veel tumortypen  borst-, eierstok- en niet-kleincellige longkanker.
Dit wordt veroorzaakt door:
Verhoogd genkopienummer.
Verhoogde mRNA transcriptie.
Verhoogde celmembraan expressie.
Verlies van extracellulair domein.
Antilichamen kunnen ook remmend fungeren.
Alle kinasepathways zijn onderin te remmen, maar remmen doe je liever vroeg in de cascade
dan laat. Er zijn altijd wel andere routes die effect hebben op elkaar. Downstream remmen
ook mogelijk:
mTOR  “mammalian target of rapamycin”: stuurt allerlei processen aan, maar
vooral groei van (tumor)cellen; nodig voor verkrijgen van massa. Belangrijk drug
target met rapamycien  stofje bindt (1) mTOR en (2) FKBP12 binding protein 12 
systeem staat niet meer aan, dus geen signaling op celgroei.
BRAF V600E mutatie  valine vervangen door glutamine op aminozuur 600.
Hoge gevoeligheid voor vemurafenib: effect is dat downstream signaling niet meer
aanwezig is. Gecombineerd in mutante B-Ras-tumor  route gaat niet meer via BRaf, maar via C-Raf gaat veel sneller aan. Als je in normale cellen B-raf remt, gaat Craf sneller aan  risicovol voor normale cellen.
Vemurafenib verbetert ziektevrije overleving bij melanomen en terugkeer van
tumoren wordt voorkomen. Wel snel resistentie.
Probleem targeted therapy is dat het zo specifiek is, dat ontsnapping via
mutaties heel gemakkelijk is.
Aangrijpen op apoptotische routes kan ook: m.b.v. TRAIL  bindt 3 receptoren, die
trimeriseren en zetten de death receptor goed aan. Alleen tumorcellen zijn hier gevoelig
voor.
Chemotherapie zet mitochondriële route aan: samen (crosstalk) met aanzetten extrinsieke
pathway zorgt voor veel en effectieve apoptose.
 Combinatie death receptors + chemotherapie zeer effectief in vitro/vivo.
26S proteasoom  3 enzymatische activiteiten; eiwitknipper. Alleen geubiquitinileerde
eiwitten worden hierin afgebroken.
Multiple myeloma  veel eiwitproductie: is te behandelen met een proteasoomremmer:
omdat er zoveel eiwitproducten zijn, altijd wel een paar verkeerd gevouwen  veel ERstress: als je bortezomic gebruikt wat het proteasoom blokkeert, kunnen deze producten
niet worden afgebroken. Heel erg toxische resultaten, alleen effectief bij multiple myeloma.
Ideale targets moleculaire therapie:
HDAC inhibitors
Chemotherapie  DNA schade
Bcl-2 inhibitors
P53 activators/Mdm2 blokkers
Proteasoom inhibitors
IAP inhibitors  apoptose actief
mABs zijn specifiek. Small molecules minder, maar wel selectieve enzymatische remmers:
zijn soms minder effectieve remmers van interacties tussen eiwitten (p53-Mdm2 lukt wel).
Small peptides hebben mogelijk sterkere/selectievere binding.
Drug die beetje lijkt op Mdm2  p53 niet afgebroken: level hoog = meer apoptose. Met small
molecules wordt geprobeerd eiwit-eiwit interacties na te bootsen.
Stapled peptides  hebben soort “nietje” waardoor ze weinig bewegen.
Key concepts:
Tumoren bestaan uit tumorcellen en micro-omgeving van verschillende normale en
immuuncellen.
Tumorcellen en interactie met omgeving zijn doelwitten van therapie.
Chemotherapie grijpt daar niet (of niet specifiek) op aan.
Veel targeted drugs zijn in de kliniek doorgedrongen.
Opvallende responsen gezien  imatinib (Gleevec), trastuzumab, vemurafenib.
Resistentie tegen targeted drugs treedt snel(ler) op.
Grote uitdaging: welke combinaties voor een tumor(type)?
Hoorcollege biologie van kanker – 27-03-2014 – Poelstra
Hoofdstuk 16
Na de start v/h moleculaire biologietijdperk neemt tumorsterfte nauwelijks af: komt doordat
diagnostiek toegenomen is  tumoren eerder te zien door imaging.
Preventie en vroege diagnostiek vormen de beste therapie, ook al neemt incidentie toe.
Verbetering diagnostiek: stratificatie van patiënten  bekijken genenpatronen en dan
expressie van bepaalde genen.
Hierdoor bekend dat borstkankerpatiënten in 2 groepen uiteenvallen  (1) goed te
behandelen en (2) slecht te behandelen. Genenpakket is prognostische waarde.
Klassieke antitumor therapieën: mosterdgas (alkylerend cytostaticum)  induceert
beenmergsuppressie. Bloedcellen ontstaan uit stamcellen in het beenmerg.
WO I  mensen die mosterdgas overleefden kregen anemie: gas tastte sneldelende cellen
aan; dus ook tumorcellen  geneesmiddel?
Alkylerende cytostatica  verstoring DNA-replicatie door binding aan baseparen.
Bijv. cyclophosphamide: stofje wordt inactief ingespoten, geactiveerd door cytochroom p450 (enzym). Actieve metaboliet ontstaat: vervalt snel in andere structuur, wat vervalt in
fosforamide (mosterdgasachtig, actief) en acrolein (toxisch): toxische stoffen accumuleren in
de nier ( nefrotoxiciteit).
Fosforamide vervalt in een sterk reactief, + geladen product: zoekt het meest negatief
geladen stukje molecuul in de cel  dit is guanylaat (G) in het DNA: de stikstofgroep op G is
het meest elektronenrijk. Reactieve stof bindt aan G  irreversibele crosslinking.
Dit gebeurt in sneldelende, dus tumorcellen!
DNA ontspoort: door binding aan G wordt DNA niet afgelezen en daardoor replicatie
verstoord.
Antimetabolieten  structuur van basen zijn iets te veranderen door bijv. F-groep aan T te
zetten. Wordt wel herkend als base, maar DNA polymerase kan er niets mee en wordt
(irreversibel) geremd. De F-gebonden T bindt aan polymerase, maar polymerase kan het niet
inbouwen en wordt daarmee onschadelijk gemaakt. Antimetabolieten lijken op kleine stukjes
v/h endogeen molecuul, maar blokkeren RNA-/DNA-polymerase.
Topo-isomeraseremmers  krachtig: topo-isomerase essentieel bij transcriptie.
Bij aflezing dubbele helix (celdeling, RNA synthese) raakt alles in de knoop: DNA kan hier
breken  topo-isomerase enzymen (1/2) maken reversibele breuk, werken als swivel en
herstellen de breuk.
I werkt op ss DNA, II op ds DNA. Topo-isomeraseremmers remmen deze enzymen
(irreversibel) door het te binden  gevolg is breuk in DNA  celdood.
Doxorubicine is én een topo-isomeraseremmer en bindt aan het DNA (alkylerende
eigenschap), en genereert zuurstofradicalen (na activatie door Cyt p-450). Remt ook een
hoop enzymen. Zéér krachtig, veel gebruikt cytostaticum.
Plant alkaloïden  binden microtubili die de cel vormen en een belangrijke rol spelen bij
celdeling. Brengen eiwitten/moleculen vanuit kern naar uitlopers v/d cel.
Binden microtubili  vinblastine/-cristine binden waardoor polymeer
niet afgebroken kan worden  stabiele microtubuul: mitose gaat
mis, cel sterft.
Hormonale geneesmiddelen: sommige tumoren hebben
verhoogde expressie van oestrogeen-/testosteronreceptoren 
borstkankers, prostaatkankers. Zijn steroïdgevoelige tumoren:
 Mammacarcinoom  binding aan E receptoren: gebruik
Tamoxifen (E-analoog).
 Prostaat  binding aan T receptoren: gebruik flutamide. Of:
platleggen T-productie m.b.v. Leuprolide & Goserelin.
Tumorresistentie  grootste probleem bij antitumor therapieën: bepaald aantal tumorcellen
blijft over, wordt resistent en groeit weer uit.
P-glycoproteïne (P-gp): pompeiwit  met ATP klapt het aan elkaar en wordt het
geneesmiddel er weer uit gepompt. Coderend gen is MDR1 (Multi Drug Resistant 1).
Meer manieren voor tumorresistentie:
Downregulatie transporters  drug komt niet meer binnen.
Upregulatie van MDR-genen  drug snel weer weg.
Downregulatie van Cyt P-450  geen activatie van drug.
Verhoogde expressie van enzymen die afbraak regelen  versnelde afbraak.
Herstel van schade of inductie beschermende enzymen  DNA repair enzymen,
verhoogde expressie van target enzym (methotrexaat), zuurstofradicaal scavengers
(maken radicalen onschadelijk).
Antistoffen spelen een rol in afweer  zijn in te zetten als nieuwe geneesmiddelen:
ontwikkeling van tumor-specifieke antistoffen, vooral tegen groeifactorreceptoren.
Hoofdstuk 13: Nieuwe therapieën
Tumorcellen zitten in sterk gestructureerd weefsel met tal van celtypen: tumorcel zelf is in de
minderheid. Er is veel communicatie, bijv. m.b.v. PDGF-A producerende cellen voor andere
cellen met receptor hiervoor. De ene cel genereert signaal, ander reageert.
Extracellulaire matrix (ECM)  bevat o.a. collageen type IV, glycoproteïnen (laminine,
peptidoglycaan).
Glycoproteinen zijn – geladen, dus binden H2O. Cellen gaan interactie aan met ECM en
zitten er zo in vast geankerd.
ECM is nodig  hart contraheert en vaten bewegen door ECM, zouden anders losscheuren
bij elke contractie.
Tumorgroei  ontstekingscellen migreren uit bloed naar ontstekingshaard/tumor. Tumor
trekt deze cellen aan als puinruimers. Migreren door ECM naar tumorhaard met uitscheiden
van collegenases (bijv. MMP9)  knippen collageen.
Proteoglycanen  ketens van GAGs, chondroïtine sulfaat of keratan sulfaat. Hiermee vormt
de ECM een “voorraadkast” van groeifactoren (FGF, VEGF) en cytokines. Als er tumorgroei
optreedt worden MMPs actief, breken ze de matrix af en verbreken ze cel-cel contacten. GFs
komen langzaam vrij. Na secretie is er ook direct weer inactivatie van MMPs door TIMPs
(Tissue Inhibitors of MetalloProteinases), maar dit is in tumoren nogal ontregeld.
Dit lijkt op proces van weefselherstel, maar tumor is dan een “never ending wound”.
Tijdens wondheling komen er ook veel groeifactoren vrij, zodat de wond snel dichtgroeit.
Tumorcellen hebben veel groeifactorreceptoren  grote respons.
VEGF induceert neo-angiogenese in tumoren  vorming van nieuwe bloedvaten. Nodig
wanneer tumor groter wordt dan 0.2 mm: nodig voor aanvoer van extra voedingsstoffen voor
groei en metastasering.
Bloedvaten snel aangelegd door VEGF en PDFG, daardoor slordig.
Pericyten bij tumor-geassocieerde bloedvaten niet overal aanwezig; vat wordt niet overal
afgeschermd dus is er grote kans op lekken. Zijn ook niet gestructureerd.
Tumor geeft signaal aan beenmerg  mestcellen/macrofagen delen snel  productie MMP9
 afgifte actief VEGF  veel angiogenese in tumoren.
Angiogenic switch  tumor gaat angiogenese induceren: hierdoor wordt de tumor
agressiever, invasier en gaat dus metastaseren. Slechtere prognose.
Targeting naar bloedvatendotheel  mogelijkheid voor nieuwe therapie. Aanpakken van
neoangiogenese bloedvaten met Ab’s die heel specifiek de VEGF-receptor blokkeert.
Toch zegt onderzoek in muismodellen weinig: humane tumoren zijn ingewikkelder, lijken niet
op muistumoren. Één cellijn is geen tumor en één Ag is geen target.
Hoorcollege Biologie van kanker – 27-03-2014 – van den Berg
Genexpressie  strak gereguleerd proces op verschillende niveaus:
Transcriptie: DNA  mRNA:
- Transcriptiefactoren, activatoren, repressors
- Enhancers
- Epigenetische markers
mRNA niveau
- Splicing
- Transport
- Stabiliteit, degradatie
Eiwitniveau
- Modificatie
- Stabiliteit
Kankerontwikkeling is een multi-step process. In tumor is er sterke selectie op welke cel het
beste apoptose/het IS kan ontsnappen. Bijdragen aspecten zijn (1) veranderde eiwitfunctie
(activerende/inactiverende mutaties) en (2) veranderde genexpressie (bijv. door
chromosomale afwijkingen, epigenetica of non-coding RNAs).
Non-coding RNAs  hoeveelheid coderend DNA is vrij klein, en RNA is misschien veel
belangrijk dan alleen “tussenmolecuul” tussen DNA en eiwit. Ong. 60% v/h DNA wordt
afgeschreven naar RNA, en een klein deel RNA codeert voor eiwitten.
Non-coding RNAs hebben invloed op genexpressie regulatie op verschillende niveaus:
Chromatine  verandering van chromatinestructuur, modificaties.
Gentranscriptie  transcriptionele co-activatie/-repressie, regulatie splicing
machinerie.
Transcript  regulatie stabiliteit van mRNA en andere non-coding RNAs, regulatie
van translatie.
Non-coding RNAs zijn in te delen in klasses: eerst op lengte  ncRNAs <200nt vallen
onder de kleine ncRNAs, daarboven zijn het grote.
Korte ncRNAs  ribosomaal, small nuclear, miRNAs..
Lange ncRNAs  pseudogenen, antisense, lange intronic..
microRNAs  18-22 nucleotiden enkelstreng RNA. Worden
gecodeerd in het humane genoom. Ze hebben een kenmerkende
stem-loop structuur. Kunnen binden aan mRNAs.
Hun belangrijkste functie is remming van eiwittranslatie op twee
manieren.
Kunnen op verschillende plekken voorkomen, naamgeving is
daarvan afhankelijk: gaat aan de hand van belangrijke, bekende
eiwitcoderende genen in de buurt. 4 mogelijkheden:
Poly-cystronic, in een intron v/e niet eiwitcoderend gen.
Mono-cystronic, in een exon v/e niet eiwitcoderend gen.
Poly-cystronic, in een intron v/e eiwitcoderend gen.
Mono-cystronic, in een exon v/e eiwitcoderend gen.
Mono-cystronic  één stem-like loop. Als miRNAs in een exon
liggen heeft dat gen dus twee functionele eiwitproducten.
Processing: primair miRNA transcript wordt geleid tot transcriptie (RNA polymerase).
Eiwitten Drosha en DGCR8 herkennen stem-loop en binden het  knippen flanking
sequenties eraf  precursor miRNA (pre) gevormd.
Exportin-5 en Ran-GTP transporteren precursor miRNA naar het cytoplasma voor verdere
processing. Dicer-TRBP verwijdert de stem-like loop  strengen worden gescheiden  één
van de strengen wordt in een eiwitcomplex ingebouwd met Ago2 (belangrijk)  RISC
complex: het functionele eindproduct.
Andere streng wordt meestal afgebroken. Beiden kunnen ook behouden blijven.
RISC bindt mRNA van eiwitcoderende genen. Homologie is beperkt, niet 100%. Het bindt in
het laatste stukje mRNA (seed sequence); nucleotide 2-8: belangrijkst voor herkenning
target. miRNAs kunnen zo meerdere targets hebben.
miRNAs binden meestal de 3’-UTR region. miRNAs met zelfde seed sequence binden dus
dezelfde genen.
30% van alle genen gereguleerd door miRNAs; elk miRNA heeft meerdere celtype specifieke
targetgenen, en elk gen is getarget door meerdere miRNAs.
Voorspellen targetgenen wordt gebaseerd op:
Algehele homologie / homologie in seed sequence.
Bindingsenergie
Structurele eigenschappen
Veel false positive interacties, en je mist ook makkelijk veel interacties met
computerprogramma’s. Verder wordt er geen rekening gehouden met co-expressie.
In vitro targetgen identificatie: gaat om een gen-voor-gen benadering m.b.v. bijvoorbeeld
een Western Blot of reporter assay.
Precursor transfectie (pre 17)  kan p21 eiwit reguleren. Als we miRNA tot overexpressie
brengen is er relatief minder p21 eiwit, als we het remmen is er meer.
Zo kun je de effecten analyseren, maar is wel een arbeidsintensief en langdurend proces.
Reportersystemen  met een truc bekijken of iets een interactie aangaat, ook gen voor gen.
Alternatieven  high throughput methoden als RISC-IP; inbrengen van een Ab gericht
tegen Abo2 met daaraan een label. Welke genen aanwezig in de fractie?
Proteomics  welke eiwitten komen er verschillend tot expressie?
Lange ncRNAs  >200 nucleotiden; verschillende subklassen op basis van genomische
locatie. Kunnen ook in intronen of exonen liggen.
Paar lncRNAs hebben ook wel eiwitfuncties:
SRA1  codeert voor een eiwit en een lncRNA: komt door alternative splicing; je kunt
een coderend of niet-coderende vorm krijgen. Balans tussen twee splicing varianten
bepaalt functionaliteit.
TBRG1  alternative splicing.
p53  kan ook functioneren als ncRNA: kan gereguleerd worden door Mdm2-eiwit:
bindt aan p53 en wordt dan geubiquitinileerd en afgebroken. Mdm2 kan ook mRNA
transcript van p53 binden waarmee translatie geremd wordt en dus eiwitproductie.
Mdm2 kan ervoor zorgen dat mRNA transcript van p53 niet wordt omgezet in eiwit.
lncRNAs functioneel?  onderscheid tussen transcriptionele ruis/achtergrond transcriptie
en functioneel lncRNA.
Bewijzen voor functionaliteit lncRNAs:
(Beperkte) conservatie.
Specifieke interacties met moleculen die bepaalde, duidelijke functies hebben, bijv.
eiwitten.
Gereguleerde expressie: expressieniveaus verschillen tussen cel-/weefseltypen,
verschillende stadia in genexpressie in o.a. ontwikkeling, differentiatie en
ziektestadia.
4 mogelijke manieren van lncRNA functie:
(1) Recruteren EMC: epigenetische modifier complexen  binden genoom en zorgen
voor activerende/inhiberende markers op het chromatine  genexpressie aan/uit.
(2) Wegvangen transcriptiefactoren: als lncRNA bepaalde structuur heeft die TF kan
binden kan de TF niet meer promotorregio binden en is er geen genexpressie.
(3) Remmen miRNA functie: lncRNA dienen als “spots” voor miRNAs: lncRNAs binden
het RISC-complex waardoor die zijn werk niet meer goed kan doen. Kan ook mRNA
binden voordat zodat het RISC er niet meer aan kan binden.
(4) Inductie post-transcriptionele modificatie: nadat transcript gevormd is
genexpressie reguleren  remming translatie, inductie degradatie of splicing
modulatie.
Er zijn al wel enkele lncRNAs met bekende functie, zoals endo-siRNA, miRNA sponge en
Scaffold.
Aantal
Grootte
Conservatie
Genomische locatie
Expressie
Functie
miRNA
~2,600
~22nt
Hoog
Kanker-geassocieerde loci
Weefselspecifiek
Remming eiwittranslatie
lncRNA
>10,000
>200 nt
Laag
Door het hele genoom
Weefselspecifiek
Verschillende
Key concepts:
ncRNAs dragen significant bij aan regulatie van genexpressie.
miRNAs worden gevormd uit grotere primaire transcripten en remmen eiwittranslatie
door te binden aan 3’-UTR.
lncRNAs hebben beperkte conservatie: stimuleren/remmen genexpressie op
verschillende niveaus met verschillende mechanismen.
miRNAs in kankerontwikkeling:
Teveel miRNAs  eiwitexpressie van TSGs wordt sterk onderdrukt: gaat hier om
oncogene miRNAs die tumor suppressor genen targeten.
Te weinig miRNAs  gaat om tumor suppressor miRNAs die verlaagd tot expressie
komen en dus te weinig oncogenen targeten: teveel aan oncogeen eiwit.
Het is dus een kruislinkse interactie tussen oncogenen en TSGs.
Betrokkenheid van miRNAs in kankerontwikkeling komt op verschillende niveaus terug.
Veranderde expressieniveaus in tumorcellen  bijv. Hodgkin lymfoom (B-cel) zit in
lymfeklieren. 1% v/d tumorcellen zit in de aangedane lymfeklieren.
Cellijnen worden geanalyseerd op een heat map: simpel overzicht van expressie van heel
veel genen in heel veel samples.
Kleur geeft het expressieniveau v/h gen aan in cellijn. Welke miRNAs meest
vergelijkbare expressieniveaus?
Verder met in situ hybridisatie verder kijken  op weefselcoupes gelabelde
probes hybridiseren en aankleuren. Paarse aankleuringen geven tumorcellen weer.
Veranderde expressie niet alleen in cellijnen, maar dus ook in weefsels.
miRNAs op genomische loci betrokken bij kanker  bijv. Burkitt’s lymfoom: snelgroeinde
tumor, verdubbelt in 400 uur.
Veel deleties, translocaties en amplificaties vallen samen met plekken van miRNAs.
Deregulatie van oncogenencluster (miRNA cluster 17~92): amplificatie van chromosomaal
gebied 13q31-32 geeft verhoogde expressie miRNA-17~92.
Translocatie 8-14  verhoogde myc-expressie: myc komt te liggen voor promotor voor BCR
als gevolg van translocatie hoge expressie van myc-gen: belangrijke TF die genen reguleert,
o.a. miR-17~92  verhoogde expressie.
Deregulatie miR-15 en miR-16  13q14 deletie leidt tot downregulatie miR-15/16 omdat dit
in het verloren gebied ligt. Dit zorgt voor ontwikkeling van CLL  er is nog maar één kopie
van dit chromosomaal stuk.
Veranderde miRNA niveaus kunnen ook invloed hebben op proliferatie van kankercellen:
m.b.v. proliferatie-assay testen.
Je reguleert miRNA expressie in cellen (vaak tumor) met retrovirale infectiesystemen: op dit
virus ligt miRNA remmer of overexpressor. Na 21 dagen  oncogen-/tumor suppressor
activiteit meten.
miR-155  groot effect op proliferatie, zorgen ervoor dat cellen nog harder gaan groeien. Er
is ook een 3-tal andere miRNAs die proliferatie juist erg kunnen remmen (26b, 26a, 150).
Muismodellen  voor CLL manipuleren van miRNA 15/16 waar een deletie in zit. Hiermee
ontwikkel je CLL in de muis. Kan ook door upreguleren miRNA-29 (oncogeen).
Myc muismodel  myc is een belangrijk oncogen: overexpressie leidt in muizen tot allerlei
lymfomen. Dicer is belangrijk voor biogenese van miRNAs – knockout van Dicer leidt tot
minder lymfomen en ontwikkeling wordt sowieso uitgesteld.
miRNAs zijn over het algemeen belangrijk bij oncogenese. Er zijn meer oncogene dan
tumor supressor miRNAs.
Upregulatie miR-17~92 én myc  versnelde lymfomagenese.
Gedereguleerde lncRNA expressie door genomische afwijkingen:
GAS5  translocaties met Notch1 en BCL6: 1q gain in borstkanker, en 1q
afwijkingen in melanomen en lymfomen.
Hostgenen van miRNAs, bijv. DLEU2  DLEU2 wordt ook gezien als lncRNA, maar
wordt ook van gedacht dat het andere functies heeft. Verlies van 13q14 incl. DLEU2,
het miRNA-15/16 gen in CLL.
Muismodellen zijn er weinig. Een model is Xist: belangrijk gen voor inactivatie Xchromosoom.
RNA van Xist zorgt voor silencing v/h gen. In bloedcelen ontstaat reactivatie van X waardoor
genome-wide veranderingen plaatsvinden  ontwikkeling agressieve myeloproliferatief
neoplasme en myelodysplatisch syndroom.
 Grote tumoren op lever en nieren; bij homozygoot defect nog erger, maar bij
heterozygoot al sterk aanwezig. Dus niet alleen betrokken bij X-inactivatie.
lncRNAs spelen een rol bij ontwikkeling van de “hallmarks van cancer”: bijvoorbeeld in
regulatie van transcriptie, fungeren als RNA primer of RNA splicer.
Toepassingen ncRNA (klinisch):
Diagnostisch: klassificatie en ziektemarker.
Prognostisch: prognostische waarde en respons op therapie.
Therapeutisch: inductie of remming van miRNAs.
Het is bijv. mogelijk om middelen te ontwikkelen die bepaalde miRNAs remmen:
doxycycline remt bijv. miR-21 waardoor geen lymfomen ontwikkelen.
Key concepts:
Meerdere bewijzen voor een belangrijke rol van ncRNAs in kankerontwikkeling.
Links met de hallmarks of cancer.
De rol van miRNAs in carcinogenese is goed beschreven en breidt nog uit.
De rol van lncRNAs is duidelijk, maar er is nog niet veel over onderzocht.
ncRNAs vormen nieuwe targets voor het ontwerpen van anti-kankertherapieën.
Biologie van kanker – 28-03-2014 – de Jong
Er wordt veel farmaceutisch onderzoek gedaan naar therapie voor verschillende kankers,
maar weinig drugs behalen de kliniek. Trajecten zijn lang, wel tientallen jaren; voor verkorten
traject zijn goede modellen nodig.
Veel gebruik gemaakt van 60 humane tumorcellijnen: testen van toxiciteit en relateren aan
eiwitexpressie; m.b.v. PC-programma COMPARE  uniekheid, werkingsmechanisme.
Tegenwoordig ook veel gebruik van tumor xenograft modellen.
Muisonderzoek  testen van 60 humane cellijnen: implanteren van cellen, tumor laten
groeien analyseren. Cellijnpanel blijkt echter niet voldoende; niet alle tumor(sub)typen zijn
erin vertegenwoordigd, dus geeft niet genoeg informatie.
Cellijnen: voor- en nadelen:
 Pro:
- Makkelijk in gebruik.
- Mechanistische studies: aan-/uitschakelen genen mogelijk.
- Xenograften: humane cellen in muizen te brengen.
 Con:
- Geen stromale cellen enz. aanwezig (nodig voor GFs).
- Geen voorspellend vermogen: door kweken geselecteerd op goed groeiende
cellijnen.
- Beperkt aantal modellen aanwezig per tumortype.
- Homogeen
- Zelfde cellijn als tumor?
- Mycoplasmavrij: cellijn kan besmet zijn met bijv. muiscellen: bacterie die in
cellen metabolisme overnemen. 75% is besmet.
CAM-model (chicken embryo chorioallantoic membrane)  gebruik van bevrucht ei,
zonder kapje. Op membraan laat je tumorcellen groeien (+- 10-15 dagen). Handig
voor vaatonderzoek.
Transplantatie van tumor mogelijk samen met stromacellen.
 Pro:
- 10 dagen levensvatbaar, dan komt embryo tegen de laag aan.
- Studeren van pathway (in)activatie mogelijk.
 Con:
- Tumor micro-omgeving niet intact.
- Alleen korte termijneffecten kunnen gemeten worden.
Ex-vivo onderzoek met Krumdieck slicer  mogelijk om hele dunne plakjes
tumor te snijden en te testen met verschillende drugs. Bijv. kijken naar marker
voor apoptose (geknipt caspase 3). Blijkt dat TRAIL + cisplastin (chemo) het beste werkt (zie
afbeelding).
DR5 samen met TRAIL werkt ook goed.
Krumdieck slices:
 Pro:
- Levensvatbaar >72 uur
- Tumor micro-omgeving intact
- Bestuderen pathway (in)activatie mogelijk.
 Con:
- Heterogeniteit tussen plakjes: niet gelijke weefselstructuur.
- Alleen korte termijneffecten
Verschillende muismodellen:
Syngeneic  getransplanteerde tumor dat ook metastaseert. Voordeel is dat IS nog
inatact is.
GEMM  mutatie leidt tot tumorvorming, geen metastase, maar IS nog wel intact.
Subcutane xenograft  getransplanteerde tumor dat niet metastaseert. Hier is het IS
niet meer intact.
Orthotopische xenograft  getransplanteerde tumor naar orgaan van herkomt: IS ook
niet meer intact.
GEMM  tumorvorming wordt bewerkstelligd door Cre-Lox systeem: Cre knipt de Lox-site.
Inbrengen van Cre in de muis  targetgen zet je tussen twee Lox-sites: deze wordt er dus
vervolgens uitgeknipt. Je creëert een knockout.
Dus: kruisen muizen: (1) heeft Cre-site in genoom en (2) heeft gen van interesse tussen 2
Lox-sites.
Cre is specifiek te maken  promotor ervoor, zodat het alleen actief wordt in bepaalde
weefsels. Erachter is GTP te plaatsen dat actief wordt als het gen eruit wordt geknipt.
Syngeneic/GEMM:
 Pro:
- Immuunsysteem is nog aanwezig
- Orthotopische tumorgroei
 Con:
- Beperkte modellen
- Beperkte genenset
- Antilichamen tegen humane eiwitten doen het niet
altijd.
Tumorimplantaat  heeft in begin moeite met groeien. Met IHC wel te zien dat het nog
steeds erg lijkt op een humane tumor: in verloop van tijd wel verlies van humane cellen
doordat muizencellen ze overgroeien. Stromacellen zijn immers normaal; delen niet zoveel
als tumorcellen.
Kijken naar twee targets  IGF-receptor en VEGF m.b.v. twee fluorescente stains (tegen
antilichamen).
2 markers gebruikt met verschillende golflengte; afhankelijk v/d golflengte zie je verschillende
gebieden oplichten:
Er zijn overlappende, maar ook verschillende gebieden. Één met name in de circulatie,
andere op de tumor: je ziet dat VEGF eerst veel in de tumor zit, maar uiteindelijk wordt
uitgescheiden via de nieren.
Key concepts:
Meer drugs moeten succesvol in de kliniek komen: meer behandelingsopties en
lagere kosten.
Cellijnen blijven nodig als eerste stap voor analyse van functies en xenografts.
CAM model en Krumdieck slices geven inzicht in korte termijneffecten.
Xenografts (GEMM/syngeneic): immuunsysteem aanwezig, maar niet geschikt voor
soortspecifieke drugs.
Xenografts (PDX modellen): goed te gebruiken voor trials in muizen, reflecteren beter
de patiënt dan cellijnen.