• Dabei ist [D] 1/2 ist der Faltungsmittelpunkt und m wird oft als Ko

• Dabei ist [D]1/2 ist der Faltungsmittelpunkt und m wird oft als Kooperativität bezeichnet, was eigentlich nicht korrekt ist, auch wenn ein
großes m eine große Kooperativität anzeigt
1.0
0.8
Nativ
Entfaltet
Anteil
0.6
0.4
0.2
0.0
0
20
40
60
80
Denaturanzkonzentration (bel. Einh.)
100
120
• Experimentell misst man oft eine Größe, die (in gewissen Grenzen)
proportional zum Anteil einer Spezies (nativ oder entfaltet) ist
• Dabei kann diese Größe von der Denaturierungsmittelkonzentration abhängen
9.2.4
Ursprung der Kooperativität
• Im Zusammenhang mit der Proteinfaltung ist gemeint, dass bereits
gefaltete Bereiche die Faltung der anderen Bereiche erleichtern
• Diese Tatsache wir mit dem Reißverschlussmodell beschrieben
n
GRV =
GHK sonst
GHK wenn N achbar gef altet
• Für die Beschreibung des Übergangs vom entfalteten in den gefalteten
Zustand bedient man sich bei der Beschreibung von Phasenübergängen
• In dem Zusammenhang spielt der Begriff des Ordnungsparameters eine
zentrale Rolle:
39
bnisse und Diskussion
– Dies ist ein makroskopischer Parameter wie z.B. die Dichte bei
einem Phasenübergang flüssig - gasförmig
• Bei der Faltung kann man zum Beispiel den Anteil der Aminosäuren
in der nativen Konformation als Ordnungsparameter verwenden
• Dieser Anteil ist oft experimentell zumindest näherungsweise zugänglich, zum Beispiel durch optische Messungen
60
• Die Kooperativität zeigt sich in einem sigmoidalen Verlauf des Ordnungsparameters bei Änderung zum Beispiel der Temperatur oder der
Konzentration eines chemischen Entfaltungsmittels wie Harnstoff
• Je steiler der Verlauf der Entfaltungskurve, desto größer die Kooperativität
9.2.5
Kinetik der Faltungsreaktion
• lineare Abhängigkeit der Energiebarriere von der Denaturierungsmittelkonzentration, damit exponentielle Abhängigkeit der Rate von der
Konzentration
GT S,U = mU ([D]1/2 [D])
ng 4.5. Vergleich der mit Ensemble- und Einzelmolkülspektroskopie detektierten
DA
mU wird schlicht
m-Wert
genannt, ist
ein Maß für die Kooperativität
f- und GdmCl-induzierten Entfaltung.•Übergangskurven
von pWT
aufgenommen
mittels
SS
fluoreszenz im Ensemble (weiß) (I), mittels Einzelmolekülspektroskopie und [4.1] (II) sowie aus
• Sprung von Nativ bzw. Denaturiert in einen Puffer einer bestimmten
Konzentration, muss auf der jeweils “anderen Seite” des Faltungsmit(D). Alle Messungen
g von pWTSSDA in Harnstoff (C) und GdmCltelpunktes
liegen wurden in Standardpuffer in
ven Flächen der FRET-Histogramme (III) in Harnstoff (A) und GdmCl (B). Freie Enthalpien der
rt von 0,01 % (w/v) Tween 20 bei 25°C durchgeführt. Die Proteinkonzentration betrug im
• Ergibt Chevron plot
e-Experiment 0,5 !M und im Einzelmolekülexperiment 130 pM.
40
gs sind die über die relativen Flächen der Verteilungen in den FRET-Histogrammen
ten Stabilitäten systematisch niedriger (Tab. 4.2, Abb. 4.5.). Eine mögliche Erklärung
n Effekt ist, dass entfaltete Moleküle aufgrund ihrer Größe langsamer durch das fokale
n diffundieren als native Moleküle. Die Anzahl der von einem entfalteten Molekül
nden Photonen ist deshalb größer als die von einem nativen Molekül stammenden. Aus
Grunde ist die Verteilung entfalteter Moleküle im FRET-Histogramm überrepräsentiert.
gs sollte sich dieser Effekt auch im Falle der über [4.1] bestimmten Übergangskurven
hlagen. Um Stabilitäten aus dem Ensemble-Signal wie auch dem nach [4.1]
9.3
Dynamik und Funktion
• Proteine haben sehr vielfältige Funktionen:
– Enzyme katalysieren chemische Reaktionen
– Signalproteine wirken als molekulare Schalter
– Transportproteine transportieren Stoffe, die beim Stoffwechsel wichtig sind
– Hormone dienen als Botenstoffe, Proteine können aber auch Toxine sein
– Motorproteine verrichten mechanische Arbeit
– Kanalproteine bilden (schaltbare) Kanäle
– Strukturproteine bilden z.B. Haare, Nägel etc.
• Proteine treten bei Ihrer Funktion stets in Wechselwirkung mit anderen
Molekülen
• In vielen Fällen ändert sich die Struktur dynamisch, man spricht von
Konformationsänderungen
• Diese Dynamik kann im Computer simuliert und mit verschiedenen
experimentellen Methoden untersucht werden
• Es hat sich herausgestellt, dass Dynamik auf verschiedenen Längenund Zeitskalen stattfindet
10
10.1
Nukleinsäuren
Aufbau
• Die Monomere der Nukleinsäuren sind die Nukleotide
• Diese bestehen aus einem Zuckermolekül, einer Base, sowie einem Phosphatrest
41
• Zwei Purinbasen
• Drei Pyrimidinbasen
• Zwei Zuckerarten: In der DNA Desoxyribose, in der RNA Ribose
• Nukleotide: Beispiel: Adenosinmonophosphat (Baustein der RNA)
42
• Es gibt sowohl einfachsträngige als auch doppelsträngige DNA/RNA
(z.B. einzelsträngige RNA in bestimmten Viren)
• In doppelsträngiger DNA Paarung der Basen mittels Wasserstoffbrücken
• Doppelsträngige DNA bildet eine sogenannte Doppelhelix, wobei nach
43
etwa 10 Basenpaaren eine komplette Drehung erfolgt
• Ein solcher Gang ist etwa 3,4 nm
10.2
Mechanische Eigenschaften
• Die Persistenzlänge doppelsträngiger DNA beträgt etwa 50 nm (150
bp)
• Bei einer Konturlänge von 5 cm (menschliches Chromosom) würde das
bei einer WLC einem Gyrationsradius von etwa 30 µm entsprechen
• Ein menschliches Chromosom ist jedoch wesentlich kleiner, woraus man
schließen kann, dass die DNA eine spezielle Struktur haben muss
• In diesem Zusammenhang wird die Topologie der DNA interessant
• Die Verwindungszahl L gibt an, wie oft sich eine Seite des Bandes um
die andere windet
• Die Verdrehungszahl T gibt an, wie oft sich die Ränder um die Helixachse winden
• Die Windungszahl W schließlich gibt an, wie oft sich die Helixachse um
die Achse der Superhelix dreht
• Es gilt:
L=W +T
• Basierend auf verschiedenen Annahmen über das Potential bei der Verdrehung und Verdrillung der DNA, kann man die Gesamtenergie für die
Bildung gewisser Superstrukturen berechnen
• Beim Ablesen der Information von der DNA muss diese teilweise entwunden werden
• In der Zelle liegt die DNA zusammen mit verschiedenen Proteinen, u.a.
Histonen vor
• Die Untersuchung der Topologie und mechanischen Eigenschaften ist
Gegenstand intensiver Forschung, und es gibt noch erstaunlich viele
offene Fragen
44
• Die tatsächliche Struktur der DNA in einem Chromosom ist noch nicht
vollständig aufgeklärt
• Eine andere interessante Fragestellung ist die Faltung der tRNA, das
ist die RNA, die bei der Proteinsynthese die entsprechende Aminosäure
anliefert
10.3
Thermodynamische Eigenschaften
• Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen können thermisch aufgebrochen werden
45
• Da wie bei der Faltung der Proteine die Energie, die dafür benötigt
wird, davon abhängt, ob die benachbarte Base gepaart oder ungepaart
vorliegt, ist dieses Aufbrechen ein hoch kooperativer Prozess
• Man spricht vom Schmelzen der DNA
• Dieses Schmelzen wird bei der polymerase chain reaction (PCR) ausgenutzt, um DNA zu vervielfältigen
• Dabei wird die zyklisch in Einzelstränge geschmolzen, die nach Abkühlung durch ein Enzym, die Polymerase, wieder komplementiert werden
46
Teil IV
Biomembranen und Zellen
11
11.1
Membranen
Aufbau und Struktur
• Bestehen aus amphiphilen (oder: amphipatischen) Molekülen: Hauptsächlich Phospholipide, aber auch andere Lipide wie Sphingolipide
• Die Fettsäurereste R1 und R2 und die Kopfgruppe weisen eine große
Variabilität auf, hier Phosphatidylcholin aus Hühnerei
• Im Vergleich PC aus Soja
• Die Kopfgruppe X ist in beiden Fällen Cholin
• Diese ordnen sich in einer flüssig kristallinen Phase an, das heisst, es
gibt eine gewisse Ordnung, aber die einzelnen Lipidmoleküle können
ihre Plätze tauschen
47
• Die polaren Kopfgruppen zeigen dabei in Richtung Wasser, während
die apolaren Fettsäureketten sich unter der Wirkung von van-der-Waals
Kräften zusammenlagern
• Verschiedene Proteine sind in oder an den Membranen verankert
• Je nach Konzentration bilden Lipide verschiedene Agglomerate in wässriger Umgebung: z.B. Mizellen, Vesikel oder Röhren
48
• An solchen Agglomeraten können Membraneigenschaften untersucht
werden
11.2
Phasenumwandlungen und Dynamik
• Die Entstehung der Agglomeratstrukturen wird durch den hydrophoben Effekt getrieben
• Die Verteilung von Lipidmolekülen zwischen der Membran und in Lösung wird durch das Nernstsche Verteilungsgesetz, das die Form der
Boltzmann-Verteilung hat, bestimmt:
x⇤ = x 0 e
µ
kB T
• Hierbei ist x⇤ der Molenbruch des Lipids in Wasser und x0 der Molenbruch in der Lipidphase, und µ die chemische Potentialdifferenz des
Lipids in den beiden Phasen
– Bei 25°C gilt für Fettsäuren die empirisch gefundene Abhängigkeit
der Potentialdifferenz von der Kettenlänge
µ⇡
• mit
✓
µ0
kJ
3nCH2
mol
◆
µ0 ⇡ 11 kJ/mol
• In Abhängigkeit von der Temperatur kann die Membran verschiedene
Phasen annehmen
• Die Umwandlung der Phasen ineinander kann anhand der damit verbundenen latenten Wärmen (wie beim Phasenübergang fest/flüssig)
durch Kalorimetrie untersucht werden
• Trägt man die spezifische Wärme gegen die Temperatur auf, so erhält
man Peaks bei den Temperaturen der Phasenumwandlungen
49
• Die beiden Tieftemperaturphasen besitzen Gel-Struktur, während die
Hochtemperaturphase eine fluide Phase ist
• Eine biologische Membran ist ein hoch dynamisches Gebilde, das Bewegungen auf verschiedenen Längen- und Zeitskalen erfährt:
– Bindungsschwingungen mit Relaxationszeiten von 1012 s
– laterale Diffusion der Kettensegmente der Fettsäureketten mit Relaxationszeiten von 1010 10 8 s
– laterale Diffusion der Ketten insgesamt in der Membran mit Diffusionskoeffizienten von 10 12 m2 /s
– Biegefluktuationen der Membran auf einer Sekunden-Zeitskala ähnlich dem WLC-Modell für Polymere:
∗ Die dynamische Rauhigkeit hu2 i, das ist der Mittelwert des
Quadrats der Auslenkung aus der Ebene, ist dabei von der
Persistenzlänge der Membran abhängig:
mit  als Biegemodul
⌦ 2 ↵ kB T 2
u =
⇣
16 P
50
∗ Die Persistenzlänge ⇣P ⇡100 nm ist dabei die Längenskala, auf
der die Information über die Auslenkung aus der Ebene verschwindet
∗ Man kann sich die Membran als aus quadratischen Kissen der
Kantenlänge ⇣P aufgebaut denken, die gegeneinander Zufallsbewegungen ausführen
12
12.1
Zellen
Grundlegender Aufbau
• Eine Zelle ist generell ein von der Außenwelt durch eine Membran getrennter Raum, der vom Zytoplasma erfüllt ist, und der verschiedenene
funktionale Einheiten enthält
• Der Aufbau der Prokaryoten ist recht einfach, sowohl die DNA als auch
die verschiedenen enzymatischen Systeme liegen frei im Zytoplasma vor
• Eukaryoten sind wesentlich komplexer im Aufbau, es gibt zahlreiche
abgegrenzte Unterräume, sogenannte Organellen
51
• Aus physikalischer Sicht gibt es eine ganze Reihe interessanter Prozesse
von Zellen:
– Transportprozesse
– Reizleitung in Nervenzellen
– Organisation der Zellteilung
– Formveränderung (z.B. Muskelkontraktion)
– Sensorfunktion
• Die Biophysik der Zelle ist der Physiologie verwandt
• Wir wollen nur auf einige mechanische Eigenschaften eingehen
12.2
Zellmechanik
• Wir wollen hier nur einen Aspekt beleuchten, nämlich die gelartige
Struktur des Zytoskeletts
• Das Zytoskelett ist ein dreidimensionales Netzwerk eindimensionaler
Strukturen, der Mikrotubuli und der Aktinfilamente, die über Knoten
miteinander verbunden sind
52
• Allgemein bezeichnet man eine solche Struktur als Gel
• Ein solches Gel wird durch charakteristische Größen beschrieben:
53
DB
Lc
– mittlere Maschenweite ⇠
– Dichte von Verbindungen zwischen jeweils zwei Knoten Mc : ⌫c =
Mc /V
– Die Konturlänge Lc zwischen den Knoten, bestehend aus Nc Monomeren
– Die Dichte freier Enden (DB: dangling bonds)
• Auch Gummi ist im Prinzip ein Gel
• Der Schermodul G0 mit der Einheit N/m2 = J/m3 eines solchen Gels
folgt einem sehr einfachen Zusammenhang:
G0 = g⌫c kB T = g
c
kB T
kB T = g 3
Nc
⇠
• Hier ist g eine Konstante, die von der Topologie des Netzwerkes abhängt
• Das besondere an den Netzwerken in der Zelle ist, dass die Vernetzungsdichte dynamisch kontrolliert werden kann
• Die Vernetzung geschieht unter anderem durch molekulare Motoren
(ein weiteres Gebiet der Biophysik, das wir hier nicht betrachten)
54
• Der Entstehungsprozess der Gele kann mit der Perkolationstheorie beschrieben werden: Sie untersucht die Bildung zusammenhängender Strukuren bei zufälliger Befüllung von z.B. Gittern
• Wenn p die Wahrscheinlichkeit darstellt, dass zwei Knoten verbunden
sind, so ist die Perkolationsschwelle pc so definiert, dass für p > pc die
gesamte Struktur einmal komplett durchverbunden ist
• Aktin-Netzwerke können je nach Vernetzung ganz verschiedene mechanische Eigenschaften aufweisen
• Dadurch können Zellen die verschiedensten mechanischen Eigenschaften haben
55