Regulation der Genexpression: regulierbare Promotoren, Proteine

Regulation der Genexpression:
regulierbare Promotoren,
Proteine und siRNA
Biochemie Praktikum
Serap Klein, AG Grez
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten
Cytoplasma
Zellkern
DNA
Introns
Exons
Chromatin
Transkription
Gen
RNA-Processing
Cap
AAAAA
mRNA
AAAAA
AAAAA
Protein
RNA-Stabilität
und -Transport
RNAi
Protein-Tuning
Translation
Protein-Reifung/Modifikation
Regulation auf Ebene der
Transkription
Beispiele: 1. Metallothionein-Promoter
2. Tetracyclin-regulierbare Systeme
3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme
und viele mehr….
1. Metallothionein-Promoter
GRE
-260
MRE MRE
-150 -140
MRE GC MRE
-70 -60 -50
TATA
-20 0
MRE: Metal responsive elements
Promoter des Metallothionein1 Gens der Maus
•
wird durch Schwermetalle aktiviert (zu Beginn wurde dafür Cadmium benutzt)
•
Genprodukt dient der detoxifikation
Spätere, modifizierte Varianten des Promoters erlauben die Aktivierung mit Zink
•
Nachteile:
System ist sehr “leaky”
Metalle sind oft entweder toxisch oder beinflussen massiv die Physiologie (Zink)
Meist längere Zeiten bis der Promotor wieder inaktiv wird (besonders in vivo)
2. Tetracyclin regulierbare Systeme
Tn10 Transposon aus E. coli codiert für Tetracyclinresistenz
Promoter
TRE TRE
Tet-Repressor
-Tetracyclin
+Tetracyclin
Promoter
TRE TRE
Tet-Operator
Tet-Repressor System
PCMV
Repressor
Tet-
PCMV
Tet-Repressor
+ Dox
-Dox
tetO
Reporter-Gen
tetO
Gen
Dox: Doxycyclin – ein Tetracyclin-Analogon
Reporter-
- Dox
+Dox
- Dox
+Dox
Tet-Off/On Systeme
Weiterentwicklungen : Der Tet-Repressor ist mit einem Transregulator
fusioniert
Tet-Off
Promoter
TetR
VP16
Transaktivator-Domäne
tTA
Tetracyclin regulierbarer Transaktivator
DNA-Bindedomäne
Tetracyclin-Bindestelle
Tet-Off/On Systeme
Tet-Off
Tet-Off: ist Tet da, keine TK
Tet-On
Tet-On: ist Tet da, dann TK
Vor- und Nachteile von Tet-Regulierbaren Systemen:
•
•
•
•
Relativ hohes Maß an Aktivierung
Einfach und vielseitig, funktioniert in fast allen Zellen und auch in vivo
(Mausmodellen)
Mit Doxycyclin gute Verfügbarkeit im gesamten Organismus (alle Zellen werden
erreicht).
Systeme sind zu “leaky”, um toxische Proteine zu exprimieren.
3. Steroidrezeptor abgeleitete
Systeme
Estradiolrezeptor
Estradiol
Zelle
Zielgen
NNAGGTCANNNTGACCTNN
Estrogen response element
Prinzipieller Aufbau:
Aktivator
Rezeptor
Liganden-Bindung
Transaktivator
Ecdysonrezeptor
Dimerisierung
GAL4- DNABindedomäne
(aus Hefe)
VP16
TransaktivatorDomäne aus
HSV
DNA-Bindung
Retinsäurerezeptor (RXR)
Dimerisierungsdomäne
RheoSwitch-System (New England Biolabs)
Vor- und Nachteile :
Sehr hohes Maß an Aktivierung (10.000X)
•
Sehr geringe basale Aktivität
•
Der Ligand besitzt gute Eigenschaften in Bezug auf Nebenwirkungen,
Stabilität und “Biodistribution – und availability”
•
Regulation auf RNA-Ebene:
RNA-Interferenz (RNAi)
•
natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen
•
wichtige Rolle in der Genregulation und Abwehr von Viren
•
hemmt die Expression einzelner Gene
•
post-transkriptionell oder translationell
•
führt zur Spaltung oder zur Translationsblockade einer Ziel-mRNA
•
reduziert somit die Produktion spezifischer Proteine
•
RNA als Ziel erkennendes Molekül
miRNA
siRNA
shRNA
RNA interference
Dicer
RISC
Dicer: Rnase III Ribonuclease,
RISC: RNA induced silencing complex
•
Spezifität für dsRNA,
•
•
Schnitt alle ~ 22 Nukleotide
•
•
5‘-Phosphat , 3‘-Überhang
250K Precursor Complex
100K aktiver Komplex nach Bindung von ATP
und „unwinding“ von dsRNA zu ssRNA
miRNA
•
micro RNA
•
kleine ssRNA (17-23Nt): biologisch aktive Form
•
ca.1-3% der Gene im Genom höherer Eukaryonten kodieren für
spezielle miRNAs ⇨ endogene RNAs
•
spielen bei der Steuerung einer Vielzahl von zellulären Prozessen
eine entscheidende Rolle
•
wirken hauptsächlich über RNAi, als negative Regulatoren der
Genexpression auf Translationsebene
miRNA
n
Transkription der miRNA-Gene durch RNA Pol II im Kern:
pri-miRNA (primary miRNA):
§
Prozessieren der pri-miRNA durch Drosha (RNase III) im Kern:
pre-miRNA (precursor miRNA):
§
Transport über den Exportin 5 Rezeptor ins Cytoplasma
§
Schneiden der pre-miRNA durch Dicer (RNase III):
ds miRNA:
§
Einbau des „anti-sense“-Stranges in den RISC Komplex:
§
Erkennen und Binden der komplementären mRNA:
a) vollst. Basenpaarung: Abbau der mRNA
b) unvollst. Basenpaarung: Hemmung der Translation
miRNA
miRNAs haben generell keine perfekte Komplementarität zum Target,
daher bildet sich ein Loop aus
typisches Merkmal von miRNAs
siRNA
•
small interfering RNA
•
kurze dsRNA (19-28 Nt) mit Einzelstrangüberhängen
•
Entstehung:
a) herausgeschnitten aus langer dsRNA (z.B durch viralen Befall)
durch das Enzym Dicer
b) synthetisch ⇨ Transfektion von Zellen
•
wirken über RNAi und führen somit zu einer verminderten Expression
spezifischer Proteine (knockdown)
Auswahlparameter für „target sequence“
•
19-23nt unique sequence (max. 15bp matches zu anderen Genen)
•
Bereich der CDS
•
•
•
•
•
Sequenzen sollen nicht im Bereich von 100bp des TK-Starts bzw.
der TK-Termination sein
Base an +1 Position soll ein Purin sein (für POL III Effizienz)
Die Helix-Struktur soll im 5‘-Bereich des „top-strands“ stabiler sein
als in seinem 3`-Bereich
Für bessere Effizienz des Silencing sollten die beiden Bases
unmittelbar upstream der Target-Sequence AA sein
GC-Gehalt zwischen 30% und 70%, möglichst weniger als 50%
Online Tool benutzen
siRNA
siRNA
Vorteile der Transfektion mit siRNA:
Ø
schnell und unkompliziert
Ø
gute Transfektionseffizienz
Ø
kaum toxisch
Nachteile der Transfektion mit siRNA:
Ø
Synthese der RNA: teuer
Ø
nur knockdown, kein knockout → geringe Proteinmengen
reichen z.T. aus, um die normale Proteinfunktion zu erhalten
Ø
transiente Transfektion → Proteinmenge steigt wieder mit
fortlaufender Zellteilung
shRNA:
short hairpin RNA
•
kurzes RNA Transkript (< 23 Nt), das sich zu einer Stammschleife
falten kann
Dicer
§
§
führt über den Mechanismus der RNA-Interferenz zum
knockdown spezifischer Proteine
Einbringen in die Zelle mittels eines Plasmid-Vektors
stabile Transfektion
kontinuierliche Expression der shRNA
kontinuierliche Repression der Translation spezifischer Proteine
Vektorbasierte RNAi
Nebenwirkungen
Endogene miRNAs als Regulatoren
Regulierbare Proteine
Regulierbare Proteine
Beispiel: ProteoTuner von Clontech
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten
Cytoplasma
Zellkern
DNA
Introns
Exons
Transkription
Tet-Off/On
Steroid-Rezeptor-Systeme
Gen
Cap
AAAAA
mRNA
AAAAA
AAAAA
Protein
RNA-Stabilität
RNAi
Translation
Proteinmodifikation
Protein-Tuning
siRNA –Video
Ende