Biopur® – Der Maßstab für biologische Reinheit

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Note 23 | November 2007
Technical Report
Biopur® – Der Maßstab für biologische Reinheit
Natascha Weiß, Eppendorf AG, Hamburg
Zusammenfassung
Der zertifizierte Standard Biopur® wurde entwickelt, um höchstmögliche Reinheit für Einmalartikel im Labor zu
gewährleisten, die für Zellkultur, IVF, Diagnostik und andere Bereiche, in denen der Schutz vor Kontaminationen
von großer Bedeutung ist, eingesetzt werden. In diesem Bericht werden Hintergrundinformationen zu den für die
Reinheit dieser Einmalartikel entscheidenden Parametern gegeben.
Einleitung
Mit den Biopur-Produkten hat Eppendorf einen einzigartigen Reinheitsstandard für Einmalartikel definiert. Pipettenspitzen, Safe-Lock Tubes und Combitips, die das BiopurSiegel aufweisen, werden in einem aufwändigen automatisierten Produktionsprozess hergestellt, so dass eine Kontamination mit Nukleinsäuren, Proteinen oder Mikroorganismen durch menschlichen Kontakt oder andere Quellen
ausgeschlossen wird. Die Reinheit aller Biopur-Produkte
wird von Eppendorf durch ein Zertifikat garantiert. In diesem Zertifikat (Abb. 1) sind die Grenzwerte für Sterilität,
Pyrogene (Endotoxine), DNA, RNase und ATP aufgeführt.
Alle Artikel, die das Biopur-Siegel tragen, sind garantiert:
Steril (Bestrahlung mit energiereichen Elektronen, SAL von 10-6)
Pyrogen-frei (< 0,001 EE/ml, kinetisch-turbidimetrischer LAL-Test, FDA Richtlinie)
RNase-frei (< 1,0 x 10-9 Kunitz Einheiten)
Human-DNA-frei (< 2 pg; weniger als eine menschliche Zelle)
Bakterien-DNA-frei (< 50 fg; weniger als 10 E. coli Zellen)
ATP-frei (< 5,5 fg)
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Chargen-spezifische Zertifikate sind unter
www.eppendorf.de/zertifikate erhältlich.
Abbildung 2: Biopur-Siegel
Abbildung 1: Biopur-Zertifikat
Biopur-Produkte werden durch ein externes Labor geprüft und zertifiziert.
Das Biopur-Siegel (Abb. 2) steht nicht nur für Sicherheit,
sondern auch für das Einsparen von Zeit und Geld, da
diese Produkte direkt einsetzbar sind.
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Sterilität
In Übereinstimmung mit einer Initiative des Europäischen
Dachverbandes der Medizinprodukteindustrie (EUCOMED)
wurde eine Kontaminationswahrscheinlichkeit von 10-6 mit
lebenden Mikroorganismen nach einem Sterilisierungsprozess als Grad für die zuverlässige Sterilisierung spezifiziert.
Dieses entspricht einem SAL-Wert (Sterility Assurance
Level) von 10-6 und bedeutet: Ein Mikroorganismus überlebt in einer Probe von 106 oder in einer Menge von 106
Gegenständen befindet sich nach der Sterilisation ein
nicht-steriler Gegenstand.
Die Amöbozyten werden aus dem Blut von Pfeilschwanzkrebsen gewonnen, die glücklicherweise hierfür nicht getötet werden müssen. Seit 1987 hat die Ph. Eur. (Europäisches
Arzneibuch) und seit 1988 die FDA (Federal Drug Administration, USA) Richtlinien zur Verwendung von Geltests und
kinetisch-turbidimetrischen Tests mit LAL aufgestellt.
Für Biopur-Produkte wird Sterilität mit einem SAL von 10-6
durch Beta-Bestrahlung erreicht. Dabei wird die notwendige Sterilisationsdosis experimentell über die Verkeimungsrate und durch Sterilitätstests ermittelt. Sie spiegelt die
Qualität des Produktionsprozesses wieder.
Nach Tabelle 5 der DIN EN ISO 11137-2:2006 wird ein
SAL von 10-6 erreicht, wenn bei einer durchschnittlichen
Verkeimung von 1,0 Mikroorganismen pro Gegenstand
eine Dosis von 14,2 kGy eingesetzt wird. Nach der Validierung des Sterilisationsverfahrens und der Produktsterilität
mit geeigneten bakteriellen Indikatoren (Bacillus pumilus)
wird der weitere Prozess mit Dosimetern gemäß der USP
XXII (United States Pharmacopoeia), DAB 10 (Deutsches
Arzneibuch) und Ph. Eur. (Europäisches Arzneibuch) überwacht.
Biopur-Produkte werden nicht mit Ethylenoxid (EtO) sterilisiert, da EtO in einer Menge von mehreren tausend ppm
(parts per million) von Plastikartikeln aufgenommen wird.
Das absorbierte EtO sowie dessen Reaktionsprodukte lassen sich von diesen Gegenständen nur schwer wieder entfernen. Es sind jedoch nur sehr geringe Rückstandsmengen
an Ethylenoxid und Ethylenchlorhydrin tolerierbar, da selbst
geringste Spuren dieser Substanzen in Einmalartikeln sensitive Zellen oder Enzyme erheblich beeinflussen können.
Abbildung 3: Nordamerikanischer Pfeilschwanzkrebs
Limulus polyphemus
Der LAL-Test für Biopur-Produkte wird mit EndotoxinStandards (d.h. WHO-Standard 84/650 oder Endotoxin
BRS) oder Kontrollstandard-Endotoxinen durchgeführt.
ATP
ATP kann als genereller Indikator für die Anwesenheit biologischer Kontaminationen verwendet werden, da dieses
energiereiche Molekül in allen lebenden Zellen vorkommt.
Biopur-Produkte sind frei von ATP, was über die Verkeimungsrate nachgewiesen wird und sind damit optimal für den
Einsatz mit ATP Quantifizierungs-Kits geeignet. In diesen Kits
wird für gewöhnlich das Enzym Luziferase verwendet, das
in Organen des Leuchtkäfers vorkommt. Dieses katalysiert
die Entstehung und Oxidation von Adenyl-Luciferin unter
Aussendung von Licht. Die Biolumineszenz dient als Indikator für Stoffwechselaktivitäten oder für die Anwesenheit
von biologischem Material.
Pyrogene
Pyrogene (a. d. Griechischen: pyr, pyros = Feuer, genes
= erzeugen) sind Substanzen, die bei parenteraler Verabreichung Fieber verursachen. Endotoxine als wichtigste
Pyrogen-Klasse werden für Biopur-Produkte über den kinetisch-turbidimetrischen LAL-Test kontrolliert. LAL ist die
Abkürzung für Limulus-Amöbozyten-Lysat. Dieses Lysat
aus Amöbozyten der Hämolymphe von Limulus polyphemus
(Pfeilschwanzkrebs, Abb. 3) reagiert sehr empfindlich auf
geringste Mengen von LPS (Lipopolysacchariden) aus Zellwänden gram-negativer Bakterien (bakterielle Endotoxine).
Wird endotoxinhaltige Lösung zu dem Lysat gegeben, wird
die Mischung trübe, zeigt Ausfällungen oder geliert.
DNA und RNase
Verunreinigungen durch Nukleinsäuren und Enzyme, die
DNA oder RNA schneiden, sind sehr kritisch, da sie molekularbiologische Experimente wie die PCR oder andere
Amplifikationstechniken erheblich beeinflussen können.
Während des Produktionsprozesses wird die Kontamination
von Kunststoffeinmalartikeln mit DNA und RNasen meist
durch menschlichen Kontakt oder durch Verunreinigung
aus der Luft verursacht. Für den gesamten Biopur-Herstellungsprozess kann dieses ausgeschlossen werden.
DNasen sind zu instabil, um als Verunreinigung eine Rolle
zu spielen.