StuerhofDissertationOPUS

Veränderung der Spiegel der freigesetzten und intrazellulären
thrombozytären Zytokine PDGF-AB und VEGF in
Thrombozytapheresekonzentraten während der Lagerung
aus der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung
in der Chirurgischen Klinik
des Universitätsklinikums Erlangen
Leiter: Prof. Dr. med. R. Eckstein
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Anna Maria Stürhof
aus
Eichstätt
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 22.04.2015
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. Robert Zimmermann
Prof. Dr. Reinhold Eckstein
Meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG UND SUMMARY
1
1.1
Zusammenfassung
1
1.2
Summary
3
2
EINLEITUNG
5
2.1
Historische Entwicklung der Thrombozytentransfusion
5
2.2
Eigenschaften und Funktionen der Thrombozyten
5
2.2.1
Gerinnung und Heilung
5
2.2.2
Thrombozytäre Wachstumsfaktoren
7
2.2.2.1
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
7
2.2.2.2
Platelet Derived Growth Factor (PDGF)
2.2.3
Wechselwirkung von Thrombozyten mit malignen Neubildungen 13
2.3
Therapie mit Thrombozytenkonzentraten
15
2.4
Einflüsse auf die Qualität von Thrombozytenkonzentraten
16
2.5
Fragestellung der Arbeit
18
3
MATERIALIEN UND METHODEN
19
3.1
Studiendesign
19
3.2
Spender
20
3.3
Zellseparatoren
20
3.3.1
Zellseparator Trima Accel
20
3.3.2
Zellseparator Amicus
21
3.4
In-vitro Untersuchungen
21
3.4.1
Allgemeine Separationsparameter
21
3.4.2
Probengewinnung
22
11
3.4.2.1
Herstellung von CTAD-Überstand
22
3.4.2.2
Herstellung von Triton-X-100-Lysat
23
3.4.3
Bestimmung von VEGF und PDGF-AB mittels ELISA
23
3.4.4
Bestimmung des intrazellulären Gehalts an VEGF
und PDGF-AB
25
3.5
Statistische Auswertung
25
4
ERGEBNISSE
26
4.1
Allgemeine Separationsparameter
26
4.2
Wachstumsfaktorengehalt
27
4.2.1
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
27
4.2.2
Platelet Derived Growth Factor AB (PDGF-AB)
33
4.3
Zusammenfassung aller Werte
40
5
DISKUSSION
43
6
LITERATURVERZEICHNIS
60
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
73
8
DANKSAGUNG
75
9
LEBENSLAUF
76
-1-
1
ZUSAMMENFASSUNG UND SUMMARY
1.1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Verschiedene Zytokine, die sich in thrombozytären α-Granula befinden, werden
während der Lagerung von Thrombozytenkonzentraten in den Überstand freigesetzt. Dazu gehören auch Zytokine, die explizit als angiogen und onkogen
gelten. Diese Freisetzung führte zu Spekulationen, ob dadurch ein Überlebensnachteil für Patienten entstehen könnte, wenn sie mit gelagerten Thrombozytenkonzentraten behandelt werden, während die zugehörige Zytokinmenge intrazellulär während der Lagerung noch nicht erforscht ist. Die vorliegende Arbeit
untersucht, wie viel von den angiogenen und onkogenen Zytokinen Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF) und Platelet Derived Growth Factor - AB
(PDGF-AB) ex vivo während der Lagerungszeit von Thrombozytenkonzentraten
in den plasmatischen Anteil freigesetzt wird, welcher intrazelluläre Verlust mit
der Freisetzung einhergeht, ob es Hinweise auf Neusynthese dieser Proteine
gibt und ob verschiedene Apheresemaschinen die Zytokinfreisetzung beeinflussen.
Materialien und Methoden
Aus 32 Thrombozytapheresekonzentraten, von denen jeweils 16 mit dem Zellseparatoren Trima Accel und Fenwal Amicus gewonnen wurden, wurden unter
Verwendung des Detergens Triton-X-100 Lysate sowie unter Verwendung des
Antikoagulans CTAD zellfreie Überstände hergestellt. In diesen Proben wurden
die Zytokine VEGF und PDGF-AB gemessen. Probenentnahme und Zytokinmessungen erfolgten am Herstellungstag sowie an den Tagen +1, +3 und +5
der Lagerung.
Ergebnisse und Beobachtungen
Zusammenfassend waren, bedingt durch die höhere Thrombozytenkonzentration in den Konzentraten vom Zellseparator Amicus, die Konzentrationen von
VEGF und PDGF-AB in den Lysaten dieser Konzentrate höher als in denen
vom Zellseparator Trima Accel. Bezogen auf 10 5 Thrombozyten bestanden kei-
-2ne wesentlichen Unterschiede. Während der Lagerung bleibt der Gehalt beider
Zytokine in den Lysaten weitgehend konstant. In den Überständen steigen die
Konzentrationen beider Zytokine während der Lagerung an, wobei der überwiegende Anteil beider Zytokine bis zum Tag +5 intrazellulär verbleibt, wenngleich
immerhin 20 bis 25 Prozent der Gesamtmengen im Überstand zu finden sind.
Schlussfolgerungen
Die zwei in dieser Studie eingesetzten Zellseparatoren Trima Accel und Amicus
arbeiten unterschiedlich, was zu einer etwas stärkeren Thrombozytenaktivierung in Präparaten vom Zellseparator Amicus führt. Dieser Effekt beeinflusst die
nachweisbaren Konzentrationen der Zytokine VEGF und PDGF-AB in den Lysaten kaum. Im Wesentlichen sind die geringen und nicht signifikanten Unterschiede auf die unterschiedliche Konzentration der Thrombozyten in den Präparaten zurückzuführen. In den Überständen sind zu Beginn der Lagerung in den
Präparaten vom Zellseparator Amicus etwas größere Anteile beider Zytokine
bereits extrazellulär zu finden. Dagegen nimmt der intrazelluläre Gehalt an
VEGF und PDGF während der fünftägigen Lagerung um etwa 20 bzw. 10 Prozent ab. Inwieweit diese Befunde tatsächlich klinische Signifikanz für die Empfänger von Thrombozytapheresekonzentraten haben, müssen künftige klinische
Studien zeigen.
-31.2
Summary
Background and Objectives
Different cytokines, which are stored in α-granules of platelets, are released into
the supernatant during storage of platelet concentrates. This includes angiogenic and oncogenic cytokins, too. The release of such cytokines gave reason to
consider whether it might result in a survival disadvantage for patients when
treated with stored platelet concentrates. However, the corresponding intracellular amount of these cytokins has not yet been explored. The present study examines how much of the angiogenic and oncogenic cytokines vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet derived growth factor - AB (PDGF-AB) is
released into the cytoplasmic fraction during storage of platelet concentrates, by
which intracellular loss the release is accompanied, whether there is evidence
of de novo synthesis of these proteins and whether different apheresis-devices
influence the release of these cytokines.
Materials and methods
The amount of VEGF and PDGF-AB was examined in 32 apheresis platelet
concentrates, of which 16 were obtained with the cell separator Trima Accel and
16 with the cell separator Fenwal Amicus. The levels of these growth factors
were measured in lysates prepared by addition of Triton X-100 and in supernatants prepared by addition of the anticoagulant CTAD on the donation day and
subsequently on days +1, +3, and +5 of storage.
Results and observations
Due to the higher platelet concentration in platelet concentrates from the Amicus cell separator, the concentrations of VEGF and PDGF-AB in the lysates of
these concentrates was higher than in those from the Trima Accel cell separator. Relating to 105 platelets there were no significant differences. During storage, the content of both cytokines in the lysates remained substantially constant. In the supernatants of the concentrations of both cytokines increased during storage, with the majority of both cytokines remaining intracellularly until day
+5, although at least 20 to 25 percent of the total amounts are found in the supernatant on day +5.
-4Conclusion
The two cell separators Trima Accel and Fenwal Amicus, which were used in
this study, work technically different, which leads to a slightly stronger platelet
activation in preparations from the cell separator Amicus. However, this effect
influences the detectable concentrations of the cytokines VEGF and PDGF-AB
in the lysates hardly. Essentially, the small and not significant differences in
VEGF and PDGF-AB concentrations are due to the different concentration of
platelets. In the supernatants of preparations from the cell separator Amicus,
slightly greater proportions of both cytokines are already released at the beginning of storage. In contrast, the intracellular content of VEGF and PDGF decreases during the five days of storage at about 20 or 10 percent. To what extent these findings actually have clinical significance for the recipients of platelet
concentrates, remains unknown so far.
-5-
2
EINLEITUNG
2.1
Historische Entwicklung der Thrombozytentransfusion
Vor beinahe 150 Jahren, im Jahre 1865, wurden Thrombozyten erstmals von
Max Schulze beschrieben [14,76]. 1882 entdeckte Giulio Bizzozero eine wichtige Funktion der auch Blutplättchen oder Plättchen genannten kleinsten Blutzellen: ihre Beteiligung bei Blutstillung und Gerinnung. Er zeigte in seinen Experimenten in vivo und in vitro, dass die Thrombozyten die ersten Blutbestandteile
sind, die sich bei einer Gefäßverletzung an die beschädigte Stelle anheften, und
dass sie anschließend mit Fibrin bedeckt werden [10,14]. Anfang des 20. Jahrhunderts wurden die AB0-Blutgruppen und der Zitratpuffer zur Antikoagulation
entdeckt, was den Weg für die Verwendung von Blutkonserven zum Ersatz von
Erythrozyten ebnete. Erst Jahrzehnte später ergab sich zunehmend der Bedarf
zur Thrombozytensubstitution: Mit dem Einsatz von Zytostatika gegen Krebserkrankungen gingen Blutungskomplikationen als Nebenwirkung einher, die üblicherweise mit einer Thrombozytopenie vergesellschaftet waren und einer der
Hauptgründe für den Tod betroffener Patienten waren. Diese Beobachtung führte auch zu der Entdeckung, dass sinkende Thrombozytenzahlen mit einem
steigenden Blutungsrisiko verknüpft sind. Zunächst wurden die mangelnden
Thrombozyten durch die Transfusion von Frischblut ersetzt, bis in den 1960er
Jahren die Entwicklung der Thrombozytenspende den selektiven Ersatz der
Blutplättchen ermöglichte. Die Thrombozytentransfusion stellt damit einen großen medizinischen Fortschritt dar, der hochaggressive Krebstherapien ermöglicht, die ohne Thrombozytenersatz aufgrund von schwersten Blutungskomplikationen kaum durchführbar wären [30,97].
2.2
Eigenschaften und Funktionen der Thrombozyten
2.2.1
Gerinnung und Heilung
Thrombozyten besitzen viele wichtige Funktionen beim Menschen. Sie dienen
der Blutstillung und der Wundheilung, außerdem spielen sie bei Entzündungsprozessen und Krebserkrankungen eine wichtige Rolle. Sie sind kernlose
Fragmente, die als Abschnürungen aus Megakaryozyten im Knochenmark entstehen. Ihre Lebenszeit beträgt eine gute Woche. Ihre lebenswichtige Aufgabe
-6besteht in der Stillung
von Blutungen, der Hämostase.
fließen
Im
Blutstrom
Plättchen
nahe
am Endothel, aber heften
sich nur selten an, denn
unter
physiologischen
Bedingungen hindern Endothelzellen die Plättchen
daran. Wenn am Ort eines Gewebedefekts hingegen die Endothelzellschicht beschädigt ist und
Komponenten der extra-
Abbildung 1: Aktivierter Thrombozyt
zellulären Matrix freiliegen,
Ein aktivierter Thrombozyt zwischen einem
werden die Thrombozyten
Erythrozyten links und einem Leukozyten
durch
Von-
rechts, ein weiterer ruhender Thrombozyt am
Willebrand-Faktor und an-
unteren Bildrand. Elektronenmikroskopische
dere extravasale und sub-
Abbildung, erstellt und zur freien Reproduktion
endotheliale Proteine über
freigegeben von [25].
ihre
Kollagen,
Membranrezeptoren
aktiviert. Sie binden daraufhin an die Strukturen der extrazellulären Matrix, verändern ihre Form (vgl. ruhender und aktivierter Thrombozyt in Abbildung 1) und
schütten Proteine aus ihren Granula aus [22,40]. Von den Granula besitzen die
Thrombozyten drei Arten: α-Granula, elektronendichte Granula und Lysosomen.
Diese enthalten eine Reihe an Proteinen mit verschiedenen Funktionen, die je
nach Aktivierung ausgeschüttet werden. Einerseits dienen die freigesetzten Moleküle der Rekrutierung und Aktivierung weiterer Plättchen, dem Auslösen der
plasmatischen Gerinnungskaskade und zusammen mit plasmatischen Gerinnungsfaktoren der Bildung eines Thrombus, der die Verletzung abdeckt. Andererseits lassen die enthaltenen Wachstumsfaktoren und Proteine den Heilungsprozess anlaufen. Sie fördern die Angiogenese und die Wund- und Knochenheilung [9,34,44,50,71,72,82,92,93,98].
-72.2.2
Thrombozytäre Wachstumsfaktoren
Thrombozyten enthalten eine Reihe von Wachstumsfaktoren, die u.a. die Angiogenese stimulieren oder bremsen. Die Wachstumsfaktoren werden in α-Granula gespeichert, von denen verschiedene Subpopulationen existieren. So löst
z.B. Aktivierung des PAR-1-Rezeptors eine Ausschüttung von Granula mit Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und eine Hemmung der Ausschüttung
von Endostasin-haltigen Granula aus. Umgekehrt führt eine Aktivierung des
PAR-4-Rezeptors zur Freisetzung von Endostasin und nicht von VEGF [45,71].
Im Folgenden wird gesondert auf VEGF und Platelet Derived Growth Factor
(PDGF) eingegangen, da sie typische Zytokine in den α-Granula von Thrombozyten sind. Zudem wird diesen Proteinen eine Rolle in der Pathogenese von
Krebserkrankungen zugeschrieben [17,84,91]. Beide gehören zu einer Familie
strukturell und funktionell verwandter Wachstumsfaktoren. Alle Proteine der
PDGF- und VEGF-Gruppe sind Dimere, die aus zwei über Disulfidbrücken verbundenen Polypeptidketten bestehen [4].
2.2.2.1
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein Wachstumsfaktor, der zusammen mit seinen Rezeptoren eine Schlüsselrolle bei der physiologischen,
aber auch bei der pathologischen Angiogenese einnimmt. Sowohl bei der
Wundheilung als auch im weiblichen Zyklus hat VEGF eine wichtige Bedeutung.
Es wird als einer der Hauptstimulatoren der Gefäßneubildung in Krebserkrankungen gesehen und trägt mit der Herstellung der Blutversorgung zu Persistenz
und Wachstum von Tumoren bei. Deshalb ist VEGF in den vergangenen Jahrzehnten stark in den Fokus der Krebsforschung gerückt [43,49,84,91].
Strukturell besteht VEGF aus zwei Monomeren (vgl. Abbildung 2), von denen
es mehrere Isoformen gibt. Sie lassen sich beim Menschen in fünf Gruppen
einteilen: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D und Placental Growth Factor
(PlGF). Zusätzlich gibt es mehrere alternative Splicevarianten dieser Proteine.
-8-
Abbildung 2:
Molekulare Struktur von VEGF. Zwei VEGF-Monomere
(rose und blau) bilden antiparallele Dimere [52,54].
VEGF-A ist das am besten untersuchte Zytokin der Gruppe, da es die stärkste
Rolle bei der Angiogenese spielt. Es wird auch allgemein als VEGF bezeichnet
[17,84,91]. Von VEGF-A sind sieben Splicevarianten bekannt, von denen
VEGF165 in der größten Menge vorkommt und auch die höchste biologische
Aktivität zeigt. Eine zusätzliche Isoform entsteht durch proteolytische Spaltung.
Die verschiedenen VEGF-Monomere bilden Homo- oder Heterodimere mit unterschiedlichen Funktionen, welche im Wesentlichen von der Bindung an verschiedene Rezeptoren abhängen. Von diesen VEGF-Rezeptoren gibt es drei
Typen: den VEGF-Rezeptor 1, 2 und 3. VEGF-A bindet an den VEGF-Rezeptor
1 und 2, VEGF-B und PlGF binden nur an den VEGF-Rezeptor 1. VEGF-C und
VEGF-D binden an den VEGF-Rezeptor 3. Daneben bindet VEGF165 an den
Neuropilin-1- und den Neuropilin-2-Rezeptor. Letztere agieren als CoRezeptoren für den VEGF-2-Rezeptor und erhöhen so die Bioaktivität des Liganden. Auch Heparansulfat-Proteoglykane interagieren mit den VEGFRezeptoren 1 und 2: Sie können VEGF165 binden und haben eine Reihe von
Funktionen wie die Lagerung oder die Verstärkung der Aktivität von VEGF165
[17,43,69,84,91].
Die VEGF-Rezeptoren selbst sind strukturell verwandt mit den PDGF-Rezeptoren. Extrazellulär besitzen sie sieben Immunglobulin-ähnliche Domänen und
intrazellulär eine Tyrosinkinase. Nach Binden eines Liganden bilden sie Dimere
und entfalten ihre Tyrosinkinaseaktivität, woraufhin intrazellulär verschiedene
Signalkaskaden ausgelöst werden. Dies führt als Resultat bei Stimulation des
-9VEGF-Rezeptors 2 zu einer Stimulation der Angiogenese. Er hat eine weitaus
höhere Kinaseaktivität als der VEGF-Rezeptor-1 und ist hauptverantwortlich für
die Antwort von Endothelzellen auf VEGF sowohl unter physiologischen als
auch unter pathologischen Bedingungen. Er stimuliert Migration, Wachstum und
Schlauchbildung der Endothelzellen. Daneben erhöht er die Gefäßpermeabilität. Wie der VEGF-Rezeptor 1 befindet er sich auf Gefäßendothelzellen, hämatopoetischen Stammzellen und manchen Tumoren. Der VEGF-Rezeptor 1 ist
zusätzlich auf Monozyten und Makrophagen exprimiert, die nach Rezeptoraktivierung wiederum VEGF-A und VEGF-C ausschütten. Somit werden die
VEGF-Rezeptoren 2 und 3 aktiviert, was zu einer proangiogenetischen Spirale
in manchen Tumoren beiträgt. Der VEGF-3-Rezeptor schließlich ist wichtig für
die Lymphgefäßbildung [17,43,84,91].
Auf embryonaler Ebene dient der VEGF-Rezeptor 1 der Hemmung und der
VEGF-Rezeptor 2 der Stimulation der Angiogenese. Knockout-Mäuse, denen
einer der beiden Rezeptoren fehlt, sterben als Embryo und bezeugen damit die
Wichtigkeit beider Rezeptoren in der Entwicklung [84].
VEGF-A selbst wird beim Erwachsenen in vielen Geweben exprimiert. Darunter
sind die Lunge, Niere und Nebenniere, Herz, Leber, Milz und Magenmucosa.
Daneben wird es im Wundheilungsprozess von Thrombozyten, Keratinozyten,
Monozyten, Perizyten und Endothelzellen ausgeschüttet, wo es sowohl parakrin
aus auch autokrin wirkt. Es stimuliert Proliferation, Migration und Überleben von
Endothelzellen. Das weniger aktive VEGF-B wurde in der Bauchspeicheldrüse,
im Herz- und im Skelettmuskel gefunden und dient auch der Angiogenese.
VEGF-C wird beim Erwachsenen überwiegend im Herz, Ovar, Plazenta, Dünndarm und Schilddrüse und beim Embryo beim Aussprießen von Lymphgefäßen
aus Venen synthetisiert. VEGF-D befindet sich beim Erwachsenen vor allem in
Herz, Lunge, Skelettmuskel, Dünn- und Dickdarm. Embryonal spielt es eine
Rolle in der Lungenentwicklung. Die VEGF-C- und VEGF-D- Funktion von Stimulation der Migration, Mitose, Differenzierung und Überleben von lymphatischen Zellen ergibt sich aus ihrer Bindung an den VEGF-Rezeptor-3 [43].
Schließlich können manche Tumoren sowohl VEGF wie auch VEGF-Rezeptoren synthetisieren und durch solche autokrinen Spiralen ihre eigene Blut- und
Lymphgefäßversorgung herstellen, was wiederum die Grundlage für Tumor-
-10wachstum, -progression und -metastasierung darstellt [17]. Welche Rolle Plättchen mit ihrem VEGF beim Tumorwachstum spielen wird in Abschnitt 2.2.3 beschrieben.
Abbildung 3:
VEGF-A (mittig, rosa und orange) gebunden an zwei synthetische Antikörper (blau-grün, blau-braun) [31,52].
Therapeutisch wird solch eine tumorigene Überexpression gehemmt durch einen Antikörper gegen VEGF, Bevacizumab. Er ist zugelassen in verschiedenen
Therapieschemata zur Behandlung von fortgeschrittenem Kolonkarzinom, fortgeschrittenem Mammakarzinom, fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom und
fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom [49,70]. Abbildung 3
zeigt zwei synthetische Antikörper, die ähnlich wie Bevacizumab an VEGF binden. VEGF kann auch von Aflibercept neutralisiert werden, einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne der VEGF-Rezeptoren 1 und 2 und dem
Fc-Stück von Immunglobulin G.
Ebenso existieren Hemmstoffe der VEGF-Rezeptoren. Zu diesen gehören Sunitinib und Sorafenib, die die Tyrosinkinaseaktivität der VEGF-Rezeptoren und
anderer Rezeptoren wie dem PDGF-Rezeptor hemmen [84]. Trotz vielversprechender Hoffnungen und Errungenschaften zeigt die antiangiogenetische Therapie bis jetzt noch suboptimale Erfolge [17,39,49,91].
-112.2.2.2
Platelet Derived Growth Factor (PDGF)
Platelet Derived Growth Factor (PDGF) ist ein Wachstumsfaktor mit einem breiten Wirkspektrum von der Organogenese bis zur Reparatur von Geweben [26].
Es besteht aus zwei Monomeren, von denen es mehrere Isoformen gibt: PDGFA, PDGF-B, PDGF-C und PDGF-D [4]. PDGF-B ist in Abbildung 4 als Monomer
und Abbildung 5 als Dimer (PDGF-BB) dargestellt. Von den gebildeten Dimeren
PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB und PDGF-CC ist bekannt, dass sie
potente Stimulatoren der Angiogenese in vivo sind
[85]. Sie binden mit unterschiedlicher Affinität an zwei verwandte Tyrosinkinase-Rezeptoren: an den PDGF-αund PDGF-β-Rezeptor.
Diese Rezeptoren sind je
nach Gewebe unterschiedlich stark exprimiert und
auch in einigen Tumoren
hochreguliert, wie z.B. im
Abbildung 4: Proteinstruktur des PDGF-BMonomers [52,58]
hochgradigen Astrozytom
[26,38]. An den PDGF-α-Rezeptor binden PDGF A, B und C, an den PDGF-βRezeptor binden PDGF B und D. Abhängig vom Liganden formen die beiden
Rezeptoren Homo- oder Heterodimere und entwickeln dann nach Autophosphorylierung Kinaseaktivität, die der Auslöser intrazellulärer Signalwege ist
[4,26,38].
PDGFs und PDGF-Rezeptoren sind essenziell für die Entwicklung des Lebens
von Säugetieren. Dies wird dadurch deutlich, dass Tiere mit Knockout von
PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C oder den PDGF-Rezeptoren embryonal oder früh
postpartal sterben. Der PDGF-α-Rezeptor spielt eine wichtige Rolle von der
Gastrulation hin zur Entwicklung von ZNS, Neuralleiste, Haut, Lunge, Darm,
Skelett und Gonaden. Der PDGF-β-Rezeptor ist in die Bildung von Blutgefäßen
und in die frühe Hämatopoese involviert [4]. Beim Erwachsenen dient PDGF
unter anderem der Wundheilung [38]. Auf den Thrombozyten selbst befinden
sich PDGF-α-Rezeptoren, die einen negativen Feedbackmechanismus haben.
-12-
Abbildung 5:
Quartärstruktur des Homodimers PDGF-BB [52,58].
VEGF und PDGF sind sich strukturell ähnlich, wobei das Nterminale Ende von VEGF eher spiralförmig ist [54].
Ebenso besitzen die Vorläuferzellen der Plättchen, die Megakaryozyten, PDGFRezeptoren, die ihre Proliferation fördern [78]. Auch in vielen anderen gesunden
Zelltypen ist PDGF exprimiert, seine physiologische Funktion dort ist aber noch
nicht vollständig geklärt [4].
Daneben wird PDGF auch mit einer Reihe von pathologischen Prozessen inerbindung gebracht, die mit erhöhter Zellbildung einhergehen, namentlich mit Gefäßentzündungen, fibrosierenden Krankheiten und Krebs [4,38]. So findet sich
in arteriosklerotischen Plaques eine erhöhte Menge an PDGF, das dort neben
vielen anderen Faktoren von Immunzellen freigesetzt wird. PDGF lockt glatte
Muskelzellen an, die in die Plaques einwandern und sie größer werden lassen.
Bei fibrosierenden Krankheiten wie Lungenfibrose, Leberzirrhose, Glomerulosklerose, Sklerodermie und Herzfibrose spielt PDGF zwar nicht die Haupt-,
aber eine wichtige Nebenrolle. Es wird von Makrophagen im Entzündungsprozess ausgeschüttet und regt Mesenchymzellen bzw. Fibroblasten zur Proliferation an, womit der Fibrosierungsprozess unterhalten wird [4]. Schließlich zeigen
gewisse Tumortypen die Fähigkeit, PDGF und PDGF-Rezeptoren zu synthetisieren und so sowohl sich selbst als auch gesundes angrenzendes Gewebe
zum Wachstum anzuregen. Dies wurde bei etwa 30% der Gliome, außerdem
bei Sarkomen, dem Karposi-Sarkom, Meningeomen, bestimmten Leukämiefor-
-13men und dem Wilms-Tumor beobachtet. Dabei steht die Synthesemenge dieser
Faktoren im Zusammenhang mit dem Malignitätsgrad. Nur beim Wilms-Tumor
geht PDGF und PDGF-Rezeptor-Expression mit einer günstigen Prognose einher [38]. Eine Untergruppe von gastrointestinalen Stromatumoren trägt sogenannte gain-of-function Mutationen des PDGF-α-Rezeptors, sodass der Rezeptor ununterbrochen aktiv ist. Der seltene Hautkrebs Dermatofibrosarcoma protuberans hat in 95% der Fälle die Fähigkeit zur Überexpression von PDGF-B
[4]. Auch beim hypereosinophilen Syndrom wurde eine Mutation des PDGF-αRezeptors beobachtet [57].
Solche Überexpressionen von PDGF und seinen Rezeptoren können therapeutisch mit verschiedenen Tyrosinkinase-Inhibitoren behandelt werden. Zu diesen
gehört zum Beispiel Imatinib, das auch andere Rezeptor-Tyrosinkinasen wie die
Bcr-Abl- und die Kit-Tyrosinkinase hemmt [57]. Die Pharmaka Sorafinib und
Sunitinib hemmen ein noch breiteres Spektrum von Tyrosinkinasen [38]. Beim
gastrointestinalen Stromatumor, der bcr-abl-positiven chronischen myeloischen
Leukämie, dem hypereosinophilen Syndrom und dem Dermatofibrosarcoma
protuberans zeigt Imatinib positive Effekte. Beim Gliom jedoch konnten keine
Vorteile einer Imantinib-Therapie beobachtet werden [38]. Bei der ganzen Diskussion um PDGF in Malignomen darf man auch nicht vergessen, dass die
Überexpression eines Gens nicht beweisend für seine Rolle in der Krankheitsentwicklung ist, da ein anderes Gen im gleichen amplifizierten Abschnitt verantwortlich für den pathologischen Prozess sein kann [4].
2.2.3
Wechselwirkung von Thrombozyten mit malignen Neubildungen
Die folgenden Beobachtungen lassen darauf schließen, dass sich Tumorzellen
und Thrombozyten gegenseitig beeinflussen: Einerseits beobachtet man bei
Tumorpatienten häufig pathologische Blutwerte wie erhöhte Plättchenzahl, erhöhten Plättchenumsatz und erhöhte Fibrin-Spaltprodukte. Andererseits gehen
viele Krebserkrankungen mit erhöhtem Thromboembolierisiko einher [34,71,78].
Auch korreliert die Fähigkeit mancher Tumoren, Thrombozyten zur Aggregation
anzuregen, mit ihrem Potenzial zur Metastasenbildung [43]. Da Plättchen physiologischerweise Haupttransporter von VEGF und vielen anderen Wachstumsfaktoren sind, liegt die Überlegung nahe, dass sie zur Angiogenese in Tumoren
beitragen. Diese Überlegung wird durch die Ergebnisse diverser Arbeiten unter-
-14stützt. So wachsen Krebszellen bei thrombozytopenischen Mäusen langsamer
und sterben schneller ab [41,71,78]. Innerhalb der Blutzirkulation scheinen
Thrombozyten sogar Krebszellen vor Elimination durch Immunzellen zu schützen und ihnen zu Anhaftung am Endothel zu verhelfen. Thrombozyten unterstützen sozusagen Krebszellen bei der Metastasierung [34]. Plättchenhemmung
führt bei manchen Krebsarten zu vermindertem Tumorwachstum, geringerem
Rückfallrisiko und Reduzierung thromboembolischer Ereignisse. Wegen des
erhöhten Blutungsrisikos bringt Antikoagulation in bisherigen Studien beim
Großteil der Krebspatienten keinen Überlebensvorteil mit sich. Dennoch stellt
die Hemmung bestimmter thrombozytärer Signalwege in der Therapie von
Krebserkrankungen und Prävention der Metastasierung ein vielversprechendes
Forschungsziel dar [2,3,34,41,71].
Von Seite der Tumoren wurde beobachtet, dass sich ihre Gefäße und Endothelzellen von gesundem Gewebe unterscheiden. Sie sind chaotischer, löchriger und weisen vermehrt Plättchen-aktivierende Faktoren wie Tissue Factor,
ADP und Thrombin auf. So geht beispielsweise erhöhte Exprimierung von
Tissue Factor mit einer höheren Gefäßdichte und höheren VEGF-Konzentrationen im Tumor einher. Tissue Factor löst nach Bindung an von-WillebrandFaktor die Gerinnungskaskade aus. Das resultierende Thrombin aktiviert wiederum Thrombozyten, die dann ihre Wachstumsfaktoren ausschütten und damit
gesundes und malignes Gewebe zur Proliferation anregen. Daneben gibt es
Hinweise, dass auch VEGF Endothelzellen in Tumorgefäßen zur Expression
von Tissue Factor anregt. Somit entsteht ein Kreislauf, der das Krebswachstum
fördert. Obwohl Thrombozyten auch anti-angiogenetische Faktoren enthalten,
scheint ihre Wirkung im Karzinom am Ende proangiogenetisch zu sein, da je
nach aktiviertem Rezeptor verschiedene Subpopulationen an α-Granula ausgeschüttet werden können [71].
Dass die Angiogenese eine Grundvoraussetzung für Progression, Wachstum
und Metastasierung von Krebs ist, wurde bereits im Abschnitt über VEGF erwähnt. Therapeutisch kann nun das angiogenetisch hochaktive VEGF durch
Bevacizumab gehemmt werden. An den Wirkmechanismen dieser Therapie
sind Thrombozyten in folgender Weise beteiligt: Nach Injektion von Bevacizumab bindet dieses über 97% des VEGF im Serum, welches wiederum hauptsächlich von Thrombozyten stammt. Die Plättchen können Bevacizumab in ihre
-15Granula aufnehmen. Wenn diese Thrombozyten nun auf einen Endothelschaden treffen - und diese sind wie oben beschrieben in Tumorgefäßen vermehrt - schütten sie ihre Granula mit Bevacizumab und dem bereits an Bevacizumab gebundenem VEGF aus. Auf diese Weise gelangt das Pharmakon in
recht hohen Konzentrationen direkt an den Zielort [49,86]. Auch im Tiermodell
wurde deutlich, dass die Verteilung von Bevacizumab vor allem auf Krebsgefäße beschränkt ist. Bei der szintigrafischen Darstellung von radiomarkiertem Bevacizumab fand man den Antikörper erstens mehr im Tumorgewebe als im gesunden Gewebe, zweitens nahm gesundes Gewebe im Zeitverlauf weniger Bevacizumab auf. Andererseits ist die Blockade des VEGFs der Plättchen wohl
eine der Hauptursachen für schwere Nebenwirkungen der Bevacizumabtherapie, da das VEGF nicht mehr für seine physiologische Aufgabe in der Wundheilung zur Verfügung steht. Zu diesen schweren Nebenwirkungen gehören
Wundheilungsstörungen, Blutungen, Bluthochdruck und gastrointestinale Perforationen [49,70].
2.3
Therapie mit Thrombozytenkonzentraten
Die Hauptempfänger von Thrombozytenkonzentraten sind Krebspatienten, die
zu einem großen Teil Kinder oder jüngere Erwachsene sind. Wegen aggressiver Chemotherapien oder der Krebserkrankung selbst können sie eine hyporegenerative Thrombozytopenie entwickeln. Neben hämatologisch-onkologischen Patienten gehören Patienten mit Leberinsuffizienz und akuten Blutungen
zu den Empfängern von Thrombozytenkonzentraten. Vor bestimmten Operationen und bestimmten Eingriffen ist je nach Blutungsgefahr ebenfalls eine
Thrombozytensubstitution erforderlich [15,97]. Eine Thrombozytopenie gilt im
Allgemeinen ab unter 10.000 Thrombozyten pro Mikroliter Blut als transfusionsbedürftig, da dann die Blutungsgefahr massiv ansteigt. Jüngste Studien zur
Frage, ob man in dieser Situation anstelle der prophylaktischen auf nur therapeutische Thrombozytensubstitution übergehen kann, haben dies eindrucksvoll
bewiesen. Bei der rein therapeutischen Thrombozytengabe sind die Patienten
sogar bedroht, vermeidbare tödliche Hirnblutungen zu erleiden [80,81,89]. Besondere Risikofaktoren oder Eingriffe erfordern gegebenenfalls noch höhere
Thrombozytenzahlen[15].
-16Neben diesem klassischen Einsatzgebiet der Thrombozytenkonzentrate werden
sie auch zur Verbesserung der Heilung verschiedener Gewebe lokal eingesetzt.
Hierzu wird meist autologes plättchenreiches Plasma verwendet. Es ist ein einfaches und kosteneffektives Verfahren, um hohe Konzentrationen von Wachstumsfaktoren in Wunden applizieren zu können. Die Methode ist unterschiedlich
effektiv: Zur Verbesserung der Knochenheilung zeigte lokal eingebrachtes plättchenreiches Plasma keine oder geringe Effekte. Bei der Therapie chronischer
Hautwunden und anderen Gewebereparaturen bringt der Einsatz jedoch gute
Erfolge [5,12,21,72,83,92,93].
2.4
Einflüsse auf die Qualität von Thrombozytenkonzentraten
Humane Thrombozyten können noch nicht künstlich hergestellt werden, sondern müssen aus menschlichem Blut eines Spenders gewonnen werden.
Einerseits werden Thrombozytenkonzentrate durch Apherese von einem Einzelspender gewonnen, andererseits durch Poolen des aus so genannten BuffyCoats von vier bis sechs Vollblutspendern gewonnenen plättchenreichen Plasmas [16]. Über die Gleichwertigkeit der beiden Verfahren wird zur Zeit heftig
diskutiert [74,97].
Schon länger bekannt ist, dass die Qualität eines Thrombozytenkonzentrats
wesentlich von der Lagerungsdauer abhängt: Je länger die Lagerungszeit ist,
desto mehr Plättchen werden aktiviert [6,7,20,65,66,98]. Mit zunehmendem
Thrombozytenalter verschlechtern sich Parameter wie Glucosekonzentration,
pH-Wert und Lactatkonzentration im Plasmaanteil. Außerdem nimmt der Corrected Count Increment (CCI) ab, ein Maß für die therapeutische Wirksamkeit
einer Thrombozytentransfusion im Patienten [1,51,55,97]. Der CCI-Wert wird
aus dem Thrombozytengehalt des transfundierten Thrombozytenkonzentrats,
dem Thrombozytenanstieg beim Empfänger und der kalkulierten Körperoberfläche des Empfängers berechnet [97]. Daneben wird die Thrombozytenqualität
während der Lagerung wesentlich vom hinzugefügten Lösungsmedium (Platelet
Additive Solution bzw. PAS oder Plasma) beeinflusst [97]. Der Lagerungsschaden von Thrombozyten, der bei der üblichen Lagerung bei +22±2°C eintritt, ließe sich weitgehend vermeiden, wenn man Thrombozytenkonzentrate wie Erythrozytenkonzentrate bei +4±2°C lagern würde [64]. Allerdings werden kalt gela-
-17gerte Thrombozyten, obwohl sie nach Transfusion gut funktionieren, sehr rasch
aus der Zirkulation eliminiert. Die Aktivierung der Thrombozyten und damit die
Entleerung der α-Granula ist außerdem von der Herstellungsmethode der
Thrombozytenkonzentrate abhängig [51,63,98]. Unterschiedliche Apheresegeräte aktivieren schon während der Spende die Thrombozyten unterschiedlich
stark. So sind beispielsweise die mit der Apheresemaschine Amicus gewonnenen Plättchen nach 90 min stärker aktiviert als die mit den Zellseparatoren
Spectra oder MCS+ gewonnenen [36].
Ebenfalls während der Lagerung werden aus den α-Granula der Thrombozyten
Wachstumsfaktoren in den plasmatischen Anteil freigesetzt [6,7,23,24,32,59,87,
88]. Die Freisetzung von Wachstumsfaktoren hängt dabei eng mit dem Aktivierungsgrad der Thrombozyten zusammen [35]. Jüngst wurde die Freisetzung
einiger Zytokine mit dem Auftreten febriler Transfusionsreaktionen bei Empfängern von Thrombozytenkonzentraten assoziiert [37,56]. Auch onkogene und
angiogene Zytokine reichern sich während der Lagerung im plasmatischen Anteil an [24,48]. Dieser Befund führte zu Spekulationen, ob die Therapie mit gelagerten Thrombozytenkonzentraten mit einem Überlebensnachteil für Krebspatienten einhergeht [48]. Diese Frage wird umso heikler, seit bei Patienten mit
akuter myeloischer Leukämie ein geringeres Überleben mit steigender Zahl von
Thrombozytentransfusionen beobachtet wurde [11].
Es ist auch noch nicht ganz klar, ob mit dem Anstieg der genannten Zytokine im
Plasmaanteil des Thrombozytenkonzentrats ein intrazellulärer Verlust einhergeht. Dies ist der Fall in den Messungen von Cognasse et al., wo sich während
der Lagerung mehr Zytokine im Überstand anreichern als sich noch intrazellulär
befinden [24]. Zur Messung des Gesamtgehalts enthaltener Zytokine verwendeten Cognasse et al. jedoch Frieren und Tauen, eine Methode, die nicht zur Freisetzung aller intrazellulären Zytokine geeignet ist. Mittel der Wahl zur Herstellung von Lysat ist 0,5-prozentige TritonX-100-Lösung, weil mit diesem Detergens am meisten Wachstumsfaktoren freigesetzt werden [96]. Auch bei der Untersuchung von Zytokinen im Überstand von Thrombozyten ist es von essenzieller Bedeutung, das richtige Probenmaterial zu verwenden: Am effektivsten
kann die nach Probenziehung fortlaufende Freisetzung von Wachstumsfaktoren
in den Überstand verhindert werden durch die Antikoagulantienkombination
Natriumcitrat-Theophyllin-Adenosin-Dipyridamol (CTAD) [99,102].
-18Obwohl Thrombozyten keinen Zellkern besitzen, können sie dank mRNA
(messenger ribonucleic acid) und des Weiteren zur Proteinsynthese notwendigen Syntheseapparates Proteine selbst synthetisieren. Dies ist für manche Proteine gesichert und verändert sich in Abhängigkeit von der Plättchenaktivierung
[90]. Grundsätzlich ist also auch die Neusynthese angiogener und onkogener
Zytokine durch Plättchen vorstellbar, aber noch nicht nachgewiesen.
2.5
Fragestellung der Arbeit
Wie dargestellt, werden verschiedene Zytokine in den α-Granula von Thrombozyten während der Lagerung in den Überstand freigesetzt. Weniger klar ist,
ob intrazellulär nachsythetisiert wird und was das klinisch bedeutet. Vor dem
Hintergrund der nicht auszuschließenden Überlebensbeeinflussung von Krebspatienten wird diese Frage noch brisanter.
Die vorliegende Arbeit untersucht daher, wie viel von den angiogenen und onkogenen Zytokinen VEGF und PDGF-AB ex vivo während der Lagerungszeit
von Thrombozytenkonzentraten am Herstellungstag und an den Tagen +1, +3
und +5 nach dem Herstellungstag in den plasmatischen Anteil freigesetzt wird
und welcher intrazelluläre Zytokin-Verlust mit der Freisetzung einhergeht. VEGF
und PDGF wurden in dieser Studie zur Messung ausgewählt, da sie einerseits
typische Zytokine in den α-Granula von Thrombozyten sind und da ihnen andererseits die oben skizzierte wichtige Bedeutung in der Pathogenese und Therapie von Krebserkrankungen zukommt. Thrombozyten enthalten vor allem die
PDGF-Isoform PDGF-AB in großer Menge [38], weshalb diese Isoform zur
Messung von PDGF herangezogen wurde. Daneben ist wie schon erwähnt die
richtige Verwendung des Probenmaterials von entscheidender Bedeutung: Zur
Messung der von Thrombozyten freigesetzten Zytokine in den Überstand sollte
CTAD-Plasma [99], zur Messung des Gesamtgehalts thrombozytärer Zytokine
sollte ein Lysat verwendet werden, das mit dem Detergens Triton-X-100 hergestellt wird [96].
Da die Aktivierung der Plättchen wie vorher beschrieben auch von der Herstellungsmethode abhängt, wird außerdem untersucht, ob verschiedene Zellseparatoren die Freisetzung von Zytokinen beeinflussen.
-19-
3
MATERIALIEN UND METHODEN
3.1
Studiendesign
Von 31 freiwilligen, gesunden Blutspendern aus dem normalen Spendebetrieb
der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen wurden 32 Thrombozytapheresekonzentrate für
diese Studie verwendet. 16 der Spenden erfolgten am Zellseparator Trima Accel der Firma Caridian BCT, weitere 16 Spenden am Zellseparator Amicus der
Firma Fenwal Baxter. Sie waren gemäß den aktuellen Richtlinien zur Gewinnung von Blut und von Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten
(Hämotherapie) der Bundesärztekammer hergestellt [16]. Ein von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg genehmigter Ethikantrag lag vor. Der Studientyp war offen
(unverblindet).
Die Studienpräparate lagerten unter kontinuierlicher Agitation bei 22°C auf einem Flachbett-Agitator. Zur jeweiligen Probenentnahme wurde die Agitation für
etwa 20 Minuten unterbrochen. An den Tagen 0 (Herstellungstag), +1, +3 und
+5 wurden Aliquots entnommen. Daraus wurde einerseits ein Lysat mittels des
Detergens Triton-X-100 hergestellt, andererseits wurde durch Zentrifugation
von
Natriumcitrat-Theophyllin-Adenosin-Dipyridamol-Röhrchen
(CTAD-Röhr-
chen) ein Überstand gewonnen. Danach lagerten diese Proben bei -70°C. Die
Sterilität aller Thrombozytenkonzentrate wurde nach Abschluss der Probenentnahmen im Mikrobiologischen Institut des Universitätsklinikums Erlangen bestätigt.
Nach Ende der Probensammlung erfolgte die Messung von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Platelet-derived growth factor AB (PDGF-AB) mittels ELISA.
Die statistische Auswertung erfolgte mit IBM SPSS Statistics Version 19 (IBM
Deutschland GmbH, Ehningen).
-203.2
Spender
Von den 31 freiwilligen, gesunden Spendern waren 21 männlich und zehn weiblich (je Zellseparator 5 Frauen und 11 Männer). Einer der Männer spendete
zweimal (einmal an jedem Zellseparator). Die Spende erfolgte nach Aufklärung
über die Studie und Einwilligung. Alle Spender wurden negativ auf HIV, HBV
und HCV getestet.
3.3
Zellseparatoren
Bei jeder Thrombozytenspende berechneten die beiden verwendeten Apheresemaschinen die Separationsdauer und das zu entnehmende Blutvolumen automatisch nach Eingabe folgender Parameter des Spenders: Größe, Gewicht,
Geschlecht, Blutgruppe, Hämatokrit und Thrombozytenzahl im Vollblut. Die letzten beiden Werte wurden zu Beginn jeder Spende mit dem automatischen Analysegerät Sysmex KX-21N (Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) aus Vollblut bestimmt. Zielvolumen einer jeden Thrombozytenspende waren 250 Milliliter. Als Antikoagulans diente ACD (Acid Citrat Dextrose)-Lösung. Beim Zellseparator Amicus wurde zusätzlich noch physiologische Natrium-Chlorid-Lösung
eingesetzt.
3.3.1
Zellseparator Trima Accel
Während der Probengewinnung arbeitete der Zellseparator Trima mit der Programmversion 3.1. Die Trima gewinnt Thrombozytenkonzentrate nach folgendem Prinzip: Vollblut fließt in einem Kanal in eine Richtung (vergleiche Abbildung 6). Je nach spezifischem Gewicht trennen sich die Blutbestandteile durch
Zentrifugation. Dann verlassen die einzelnen Komponenten das System jeweils
über einen eigenen Kanal: Durch den äußersten Kanal fließen die Blutzellen,
durch den mittleren das Plasma und durch den inneren die Plättchen ab. Nun
durchfließen die Thrombozyten eine konische Kammer, eine sogenannte
LRS®-Kammer [103,104]. Durch die Fließdynamik einerseits und die Zentrifugalkraft andererseits bleiben unerwünscht vorhandene Leukozyten zurück. Die
Thrombozyten in autologem Plasma erreichen das Ende der LRS®-Kammer,
von dem aus sie weiter in den Lagerungsbeutel außerhalb der Zentrifuge fließen [18,19,42,63].
-21-
Abbildung 6:
Die Separationskammer des Zellseparators Trima Accel, Abbildung
von Ringwald et al. [68]. Die kegelförmige graue Kammer auf der linken
Bildseite
ist
die
LRS®-
Kammer. Der Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses an.
3.3.2
Zellseparator Amicus
Während der Probengewinnung arbeitete der Zellseparator Amicus mit der Programmversion 2.1. Zur Zellseparation hat der Amicus eine Kammer mit zwei
Fächern, die sich gürtelförmig um eine Spule winden. Im ersten Fach, dem Separationsfach, werden rote und weiße Blutzellen vom plättchenreichen Plasma
durch Zentrifugation getrennt. Das plättchenreiche Plasma gelangt ins zweite
Fach, in dem die Thrombozyten gesammelt werden, während Plasma abgepumpt wird. Die Plättchen verbleiben hochkonzentriert während des gesamten
Spendevorgangs in der Zentrifuge, bis sie schließlich am Ende der Spende manuell in plättchenarmes Plasma resuspendiert werden [18,19,42,63].
3.4
In-vitro Untersuchungen
3.4.1
Allgemeine Separationsparameter
Die Thrombozytenkonzentration in den Thrombozytenkonzentraten wurde mithilfe des Fluoreszenz-Durchflusszytometers Sysmex XE 5000 (Sysmex
Deutschland GmbH, Norderstedt) automatisch bestimmt. Das Volumen der
Thrombozytenkonzentrate und die Separationsdauer wurden von der Apheresemaschine automatisch nach der Spende angezeigt. Die Konzentration an Leukozyten wurde mithilfe einer Nageotte-Kammer gemessen. Die Zählung in der
Nageotte-Kammer ist ein Verfahren, bei dem sehr kleine Konzentrationen von
-22Leukozyten erfasst werden können, die für automatische Zählautomaten zu
gering sind. In dieser Kammer befindet sich ein relativ hohes Volumen, welches
durch visuelle Auszählung unter dem Mikroskop die Erfassung von Konzentrationen ab einem Leukozyten pro zehn Mikroliter ermöglicht. Hierzu gibt ein medizinisch-technischer Laborassistent 100 µl des Thrombozytenkonzentrats zu 400
µl dreiprozentiger Essigsäure und inkubiert diese Mischung für fünf bis zehn
Minuten. Dann wird die Nageotte-Kammer damit befüllt und für weitere fünf bis
zehn Minuten in einer feuchten Kammer stehen gelassen. Im anschließenden
Zählvorgang werden 40 Reihen mikroskopiert, was einem Volumen von 50 µl
entspricht. Die insgesamt gezählten Leukozyten in diesen 50 µl müssen anschließend durch zehn dividiert werden, um die ursprüngliche Konzentration an
weißen Blutzellen pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat zu erhalten [103,104].
3.4.2
Probengewinnung
Am Tag der Thrombozytenspende (Tag 0) und am ersten, dritten und fünften
Lagerungstag (Tag +1, +3 und +5) wurden aus den Thrombozytenkonzentraten
Aliquots entnommen. Die Probengewinnung erfolgte über sampling site coupler
spike (Baxter S.A., Lessines, Belgien) nach Desinfektion mit Cutasept F Haut
Desinfiziens (Bode Chemie, Hamburg).
Zwischen den Entnahmen wurden die Thrombozytenkonzentrate bei 22°C und
60 Kreisbewegungen pro Minute auf einem Flachbettagitator (Linear Platelet
Reciprocator, Type LPR1, Melco Engineering Corp., San Fernando RD.,
Glendale, CA, 91204 USA) in einem Inkubatorschrank (Platelet Incubator, Model PC 2200, Helmer) gelagert.
Nach Abschluss der Probengewinnung wurden die Thrombozytenkonzentrate
zur Sterilitätstestung in das Mikrobiologische Institut des Universitätsklinikums
Erlangen geschickt. In allen 32 untersuchten Einheiten war nach 14 Tagen kein
Keimwachstum nachweisbar.
3.4.2.1
Herstellung von CTAD-Überstand
Um eine möglichst geringe Aktivierung der Thrombozyten zu erreichen, wurden
zur Gewinnung des Überstandes CTAD als Antikoagulanz genutzt. Das CTADRöhrchen enthält neben Natriumcitratlösung zusätzlich Theophyllin, Adenosin
-23und Dipyridamol. Es wurden CTAD-Monovetten (Firma Sarstedt, Nümbrecht)
mit 2,9 ml Fassungsvolumen und 0,29 ml enthaltener CTAD-Lösung eingesetzt.
Nach Befüllung der Monovetten wurden diese 10 Minuten bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert (Rotina 35 R, Hettich-Zentrifugen, Tuttlingen). Anschließend wurde je Monovette zweimal ein Milliliter abpipettiert und in 1,3 ml
Polypropylen-Röhrchen mit Deckel bei -70°C tiefgefroren.
3.4.2.2
Herstellung von Triton-X-100-Lysat
Zur Erzeugung von Thrombozyten-Lysat wurde zuerst eine Lösung mit dem
Detergens Triton X-100 (Serva Electrophoresis, Heidelberg) hergestellt. Dazu
wurden zu 995 ml Aqua ad iniectabilia (Baxter S.A., Lessines, Belgien) 5 ml
Triton X-100 hinzugegeben und gemischt. Um nun die einzelnen Proben anzufertigen, wurden 9 ml dieser Lösung, abgemessen mit einer 10 ml Einwegspritze, in ein beschriftetes 15 ml Plastikreagenzglas (Sarstedt, Nümbrecht) gegeben. Anschließend wurde mithilfe einer sterilen 2 ml Einwegspritze 1 ml Thrombozytenkonzentrat zugegeben und vorsichtig durch Hin- und Herkippen gemischt. Vom gewonnenen Lysat wurde viermal 1 ml (zwei Proben pro zu messendem Faktor) jeweils in 1,3 ml Polypropylen-Röhrchen mit Deckel bei -70°C
tiefgefroren.
3.4.3
Bestimmung von VEGF und PDGF-AB mittels ELISA
Zur Messung der Mengen an VEGF und PDGF-AB kamen Quantikine®-ELISAs
(R&D Systems, Minneapolis, USA) zum Einsatz. Die 96-well-Mikrotiterplatten
waren mit monoklonalen Maus-Antikörper gegen VEGF bzw. PDGF-BB vorbeschichtet. Vor Beginn des Tests tauten die Proben bei Raumtemperatur auf.
Nach Zugabe der Proben im Doppelansatz, Binden des entsprechenden Zytokins an die befestigten Antikörper und Waschen wurde ein zweiter polyklonaler
„Sandwich“-Antikörper zugegeben, der an VEGF bzw. PDGF-AA band und an
Meerrettichperoxidase gekoppelt war. Nach weiterer Inkubation und Waschen
setzte dieses Enzym die hinzugegebenen Substrate Wasserstoffperoxid und
Tetramethylbenzidin um, was proportional zur gebundenen Zytokinmenge zu
einem gelben Farbumschlag führte. Dieser wurde mit einem Photometer gemessen (DYNEX MRXe tc, Magellan Biosciences, Denkendorf; Software Revelation, Version 4.25, DYNEX, Denkendorf). Bei jedem ELISA lief eine Stan-
-24dardreihe mit rekombinantem VEGF bzw. PDGF-AB mit. Der Messbereich lag
bei 31.2 pg/ml bis 2000 pg/ml. Bei Messergebnissen über 2000 pg/ml wurde der
ELISA mit einer verdünnten Probe wiederholt, wobei kein bereits einmal aufgetautes Material wiederverwendet wurde. Die VEGF Proben mussten vor ELISABeginn nicht zusätzlich verdünnt werden. Die PDGF Proben dagegen wurden
bis zu 20-fach (Überstand) oder 50-fach (Lysat) verdünnt. Die gemessene Konzentration an PDGF im Lysat musste also unter Berücksichtigung der Verdünnung bei Lysatherstellung noch mit dem Faktor 500 multipliziert werden, um die
ursprüngliche PDGF-Menge im Thrombozytenkonzentrat zu erhalten. Tabelle 1
zeigt eine Übersicht der einzelnen Schritte.
Tabelle 1:
ELISA-Testablauf
VEGF-ELISA
PDGF-AB-ELISA
Füllen der Mikrotiterplatte mit 100 µl Assaydiluent
Zugabe von 100 µl Standard oder Probe (ggf. verdünnt)
2 Stunden Inkubation
3 Stunden Inkubation
3 mal Waschen
4 mal Waschen
Zugabe von 200 µl Konjugatantikörpern
2 Stunden Inkubation
1 Stunde Inkubation
3 mal Waschen
4 mal Waschen
Zugabe von 200 µl Substrat
25 Minuten Inkubation
30 Minuten Inkubation
Stoppen der Reaktion mit 50 µl 2N Schwefelsäure
Photometrische Messung innerhalb von 30 min bei 450 nm,
Korrekturwellenlänge bei 570 nm
-253.4.4
Bestimmung des intrazellulären Gehalts an VEGF und PDGF-AB
Der intrazelluläre Gehalt der untersuchten Zytokine wurde durch Subtraktion
der jeweilig gemessenen Konzentration im Überstand von der zugehörigen
Konzentration im Lysat berechnet.
3.5
Statistische Auswertung
Die Werte der Photometrischen Messung beim ELISA wurde mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor der jeweiligen ELISA-Messung und die Lysatwerte
zusätzlich mit Faktor 10 multipliziert, um die ursprüngliche Zytokinmenge im
Thrombozytenkonzentrat zu erhalten.
Diese Ergebnisse wurden mit dem Programm Microsoft Office Excel 2003 erfasst und mit IBM SPSS Statistics Version 19 (IBM Deutschland GmbH, Ehningen) ausgewertet. Mittels Lillefors- und Shapiro-Wilks-Test wurden die Daten
auf Normalverteilung untersucht. Für normalverteilte Daten kam der MannWhitney-U-Test zum Gruppenvergleich zum Einsatz. Für nicht-normalverteilte
Daten wurde der t-Test für verbundene und unverbundene Stichproben verwendet. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant erachtet.
Die Grafiken wurden in Microsoft Excel 2010 und Microsoft Word 2010, Abbildungen von Proteinen mit Cn3D Version 4.3 (National Center for Biotechnology
Information, Bethesda, USA) erstellt.
-26-
4
ERGEBNISSE
4.1
Allgemeine Separationsparameter
Tabelle 2:
Allgemeine Separationsparameter
Maschine 1 (Trima)
Maschine 2 (Amicus)
6
Thrombozytenkonzentration (10 /ml)
1244,50 ±
143,78 *
Thrombozyten * 10
3,117 ±
1513,81 ±
11
0,356 *
272,20 †
pro TK
3,733 ±
0,681 †
5
Thrombozyten * 10 pro ml
12445,00 ±
1437,83 *
15138,13 ±
2721,97 †
Volumen des TKs (ml)
250,56 ±
3,74 *
246,50 ±
4,27 †
Separationsdauer (min)
43 ±
3,95 *
48,94 ±
9,57 †
Leukozytenkonzentration (1/µl)
0,03 ±
*
†
0,06
0,39 ±
1,37
p < 0,05 versus Amicus
p < 0,05 versus Trima
Die Trima-Thrombozytenkonzentrate enthielten mit 3,117 ± 0,356 x 1011 Thrombozyten signifikant weniger Plättchen als die Amicus-Thrombozytenkonzentrate
mit 3,732 ± 0,681 x 1011. Zugleich hatten die Trimakonzentrate (250,56 ±
3,74 ml) ein signifikant höheres Volumen als die Amicuskonzentrate (246,50 ±
4,27 ml). Entsprechend war die Thrombozytenkonzentration der 16 TrimaThrombozytenkonzentrate mit 1244,50 ± 143, 78 x 106 Thrombozyten pro ml
signifikant niedriger als diejenige der 16 Amicus-Präparate mit 1513,81 ±
272,20 x 106 Thrombozyten pro ml. Die Separationsdauer bei Trima-Thrombozytenkonzentraten war mit 43 ± 3,95 min signifikant kürzer als diejenige bei
Amicus-Thrombozytenkonzentraten mit 48,94 ± 9,57 min. Beim Leukozytengehalt ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Maschinen (Trima: 0,03 ± 0,06 1/µl, Amicus: 0,39 ± 1,37 1/µl).
-274.2
Wachstumsfaktorengehalt
4.2.1
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Der Gehalt an VEGF intrazellulär, im Lysat und im Überstand ist in folgender
Tabelle zusammengefasst. Neben der VEGF-Konzentration (pg/ml TK) ist für
VEGF intrazellulär und im Lysat auch die Menge pro 105 Thrombozyten dargestellt. Unterteilt sind die Werte jeweils nach Apheresemaschine und Lagerungstag.
Tabelle 3:
VEGF Werte aufgeteilt nach Maschinen und Lagerungstag
Maschine 1 (Trima)
Tag
Maschine 2 (Amicus)
VEGF intrazellulär (pg/ml)
0
1
3
5
438,48
454,84
341,42
305,73
±
±
±
±
591,82
617,01
459,85
404,58
439,43
417,82
463,15
393,47
±
±
±
±
460,11
463,36
463,43
428,42
5
Tag
VEGF intrazellulär pro 10 Thrombozyten (pg)
0
1
3
5
0,0347
0,0360
0,0268
0,0241
±
±
±
±
Tag
0,0456
0,0472
0,0346
0,0303
0,0296
0,0284
0,0307
0,0259
±
±
±
±
0,0310
0,0314
0,0308
0,0271
±
±
±
±
466,02
479,34
504,46
481,17
VEGF im Lysat (pg/ml)
0
1
3
5
439,20
466,19
384,22
386,50
±
±
±
±
592,54
637,11
513,65
521,52
477,33
472,05
566,04
526,02
5
Tag
VEGF im Lysat pro 10 Thrombozyten (pg)
0
1
3
5
0,0348
0,0369
0,0302
0,0305
±
±
±
±
Tag
0,0457
0,0489
0,0389
0,0393
0,0321
0,0321
0,0377
0,0351
±
±
±
±
0,0318
0,0331
0,0339
0,0317
±
±
±
±
95,90 ‡ §
114,53 §
117,65 *
128,88 * †
VEGF im CTAD-Überstand (pg/ml)
0
1
3
5
0,72
11,35
42,80
80,77
*
†
‡
§
±
±
±
±
2,87 §
24,28 §
69,96
132,54 * †
37,90
54,23
102,89
132,55
p < 0,05 versus Tag 0 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 1 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 3 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 5 der gleichen Maschine
-28Nachfolgend sind die Ergebnisse für VEGF im Überstand pro ml Thrombozytenkonzentrat graphisch dargestellt (Abbildung 7). Die Zytokinmenge an Tag
fünf ist signifikant höher als an Tag null und Tag eins. Bei den Amicuspräparaten ist auch an Tag drei signifikant mehr VEGF im Überstand als an Tag null.
Sowohl die Mittel- als auch die Maximalwerte sind bei Amicus-Präparaten höher
als bei Trima-Präparaten am gleichen Messtag. Letztgenannte Unterschiede
sind jedoch nicht signifikant.
Abbildung 7:
VEGF im Überstand pro ml Thrombozytenkonzentrat.
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median. Die Whisker
stellen Minimum und Maximum dar.
Die nachfolgende Tabelle beschreibt das prozentuale Verhältnis von VEGF im
Überstand im Vergleich zu Tag null derselben Maschine und im Vergleich von
Trima und Amicus, wobei Trima Tag null als 100 Prozent gesetzt wurde.
Abbildung 8 zeigt den intrazellulären VEGF-Gehalt pro 105 Thrombozyten. Beim
Vergleich der Maschinen bzw. der Tage untereinander ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Die Mittelwerte beider Maschinen pendeln um etwa
0,029 pg VEGF pro 105 Thrombozyten. Wie in der Boxplot-Grafik ersichtlich
sind einzelne intrazelluläre Werte von VEGF negativ. Dies dürfte auf die Messungenauigkeit bei sehr kleinen Konzentrationen zurückzuführen sein: Der intrazelluläre VEGF-Gehalt wurde indirekt bestimmt durch Subtraktion der Menge im
Überstand von der im Lysat. Bei Lysatherstellung wurde jede Probe zehnfach
verdünnt. Wenn nun von Anfang an wenig VEGF insgesamt in der Thrombozy-
-29tenprobe vorhanden war, konnte es passieren, dass die im ELISA zu messende VEGF-Konzentration unter die Detektionsschwelle geriet, während die korrespondierende VEGF-Menge im unverdünnten Überstand noch messbar war.
Tabelle 4:
Prozentualer Anstieg des Mittelwerts von VEGF im Überstand
VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
5291%
Tag 1
1585%
143%
7570%
Tag 3
5975%
271%
14362%
Tag 5
11275%
350%
18503%
Abbildung 8:
VEGF intrazellulär pro 105 Thrombozyten
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median. Die Whisker
stellen Minimum und Maximum dar.
-30Das intrazellulär vorhandene VEGF bleibt bei Trima-Thrombozytenkonzentraten
von Tag null auf Tag eins fast konstant und sinkt dann auf 77% an Tag drei und
69 % an Tag fünf (verglichen mit dem Ausgangswert an Tag null). Dieser Abfall
ist jedoch nicht signifikant. Bei Amicus bleibt das intrazelluläre VEGF von Tag
null bis drei recht konstant und sinkt nicht signifikant an Tag fünf auf 88%. In
Amicus-Präparaten ist von Anfang an weniger VEGF intrazellulär vorhanden,
dafür ist der weitere VEGF-Abfall schwächer ausgeprägt als in TrimaPräparaten. Die beschriebenen Veränderungen sind in folgender Tabelle zu
sehen:
Tabelle 5:
Prozentuale Veränderung des Mittelwerts von VEGF intrazellulär
pro 105 Thrombozyten
VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
85%
Tag 1
104%
96%
82%
Tag 3
77%
104%
89%
Tag 5
69%
88%
75%
In Abbildung 3 ist die VEGF-Menge im Triton-Lysat pro 105 Thrombozyten dargestellt. Wie beim intrazellulären Gehalt waren hierbei die Unterscheide zwischen den Maschinen bzw. den Tagen nicht signifikant. Die Mittelwerte liegen
im Bereich von 0,034 pg VEGF pro 105 Thrombozyten.
-31-
Abbildung 9:
VEGF im Lysat pro 105 Thrombozyten
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median.
Die Whisker stellen Minimum und Maximum dar.
Beim Blick auf die Abbildung als auch auf die Prozentwerte in der folgenden
Tabelle ist ersichtlich, dass die VEGF-Gesamtmenge während der Lagerungszeit recht konstant bleibt.
Tabelle 6:
Prozentuale Veränderung des Mittelwerts von VEGF im Lysat pro
105 Thrombozyten
VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung VEGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
92%
Tag 1
106%
100%
92%
Tag 3
87%
117%
108%
Tag 5
88%
109%
101%
Abbildung 11 zeigt eine Fotografie zweier VEGF-ELISA-Tests der vorliegenden
Arbeit. Der ELISA-Test der rechten Platte wurde etwa 5 Minuten und der linke
Test etwa 30 Minuten vor der Fotoaufnahme gestoppt und photometrisch ge-
-32messen. Je intensiver der gelbe Farbumschlag ausfällt desto höher ist die
VEGF-Konzentration. Das Pipettierschema beider Platten ist exakt gleich:
Abbildung 10:
Pipettierschema der beiden unten abgebildeten ELISAPlatten. S bedeutet Spender. Die einzelnen Messtage wurden wie im kleinen Kasten rechts dargestellt im Doppelansatz pipettiert.
Abbildung 11:
Zwei ELISA-Platten der VEGF-Messung. Auf der linken
Platte wurde VEGF im Lysat in zehnfacher Verdünnung und
auf der rechten Platte das zugehörige VEGF im unverdünnten Überstand bestimmt.
Rein optisch ist auf dieser Aufnahme erkennbar, dass die VEGF-Gesamtmenge
eines einzelnen Spenders während der Lagerungsdauer recht konstant, also
gleichintensiv gelb, bleibt, während die in den Überstand freigesetzte Menge
ansteigt. Dabei weisen die verschiedenen Individuen sichtbar unterschiedliche
Gesamtmengen an VEGF auf.
-33In der folgenden Abbildung ist die Konzentration von VEGF aller drei Kompartimente (intrazellulär, Überstand und Gesamtmenge) in einer Abbildung nach
Zellseparatoren getrennt zusammengefasst. Die insgesamt geringe Konzentration von VEGF nahe der Messgrenze und die großen interindividuellen Unterschiede der VEGF-Gesamtmenge erklären die etwas stärkeren Schwankungen
der VEGF-Lysatwerte im Vergleich zu den stabilen PDGF-Lysatwerten.
Abbildung 12:
Zusammenfassende
Grafik
von
VEGF
pro
105
Thrombozyten (Mittelwerte)
4.2.2
Platelet Derived Growth Factor AB (PDGF-AB)
Die nachfolgende Tabelle zeigt die PDGF-Werte intrazellulär, im Lysat und im
Überstand. Neben der PDGF-Konzentration (pg/ml TK) ist auch die Menge pro
105 Thrombozyten aufgeführt. Unterteilt sind die Angaben nach Apheresemaschine und Lagerungstag.
An Tag null und Tag eins befindet sich signifikant mehr PDGF im CTADÜberstand bei den Amicus-Präparaten im Vergleich zu den Trima-Präparaten.
An Lagerungstag drei und fünf gibt es diesbezüglich keinen signifikanten Unterschied mehr.
-34Tabelle 7:
PDGF-Werte aufgeteilt nach Maschine und Lagerungstag
Maschine 1 (Trima)
Tag
Maschine 2 (Amicus)
PDGF intrazellulär (pg/ml)
0
1
3
5
63211,83
61889,07
53998,56
52574,18
±
±
±
±
13470,74 ‖¶
11595,27 ¶
10968,34 ‡
10916,26 ‡§
67019,40
66304,51
63023,60
60166,39
±
±
±
±
19891,97
21166,10
20975,30
20128,16
5
Tag
PDGF intrazellulär pro 10 Thrombozyten (pg)
0
1
3
5
5,09
4,98
4,35
4,24
±
±
±
±
0,94 ‖¶
0,80 ‖¶
0,74 ‡§
0,77 ‡§
Tag
4,48
4,41
4,18
3,98
±
±
±
±
1,09
1,10
1,09
0,89
±
±
±
±
17007,17
18462,84
19634,50 †
20766,76
PDGF im Lysat (pg/ml)
0
1
3
5
64151,22
65013,91
64618,03
67549,75
±
±
±
±
13691,89
12348,27
13878,13 *
14427,46
72288,19
74476,75
77657,41
78071,31
5
Tag
PDGF im Lysat pro 10 Thrombozyten (pg)
5,16
5,23
5,20
5,44
0
1
3
5
±
±
±
±
Tag
0,95
0,85
0,94
1,06
4,82
4,95
5,15
5,15
±
±
±
±
0,88
0,91
0,94
0,90
PDGF im CTAD-Überstand (pg/ml)
0
1
3
5
939,39
3124,83
10619,47
14975,57
*
†
‡
§
‖
¶
±
±
±
±
509,70 *§‖¶
1219,09 *‡‖¶
7256,64 द
6319,29 ‡§‖
5268,79
8172,24
14633,81
18606,81
±
±
±
±
7308,60 †§‖¶
9125,02 †‡¶
10157,22 ‡§
7817,71 ‡§
p < 0,05 versus Amicus
p < 0,05 versus Trima
p < 0,05 versus Tag 0 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 1 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 3 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 5 der gleichen Maschine
Bei Betrachtung des Anstiegs der PDGF-Menge im Überstand während der Lagerungszeit
bestehen
folgende
Korrelationen:
In
Trima-Thrombozyten-
konzentraten bestehen signifikante Unterschiede beim Vergleich der Tage untereinander.
Ebenso
ist
der
Zytokinanstieg
in
Amicus-Thrombozyten-
konzentraten zwischen allen Tagen - außer dem Anstieg von Tag drei auf Tag
fünf - signifikant. Abbildung 11 veranschaulicht den Anstieg.
-35-
Abbildung 13:
PDGF im Überstand pro ml Thrombozytenkonzentrat, n =
16, an Tag 5 bei Amicus ist n = 15.
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median. Die Whisker
stellen Minimum und Maximum dar.
Der signifikante Unterschied wird auch prozentual betrachtet deutlich (vergleiche folgende Tabelle). PDGF ist im Überstand bei Trima an Tag fünf 15-fach
höher als an Tag null. Verglichen damit steigt der gleiche Wert bei Amicus nur
um den Faktor 3,5. Bei Amicus jedoch ist schon am Herstellungstag mehr als
die fünffache Menge an PDGF im Vergleich zu Trima freigesetzt. Während der
Lagerung bleibt der Amicus-Wert immer um ca. 4000 pg/ml höher als derjenige
bei Trima. Der relative Unterschied nimmt aber kontinuierlich von 5,6-facher
Menge an Tag null auf 1,2-fache Menge an Tag fünf ab. Die Schwankungsbreite der Einzelwerte ist bei Amicus-Präparaten von Anfang an groß, während sie
bei Trima erst ab Tag drei stark zunimmt.
Der intrazelluläre PDGF-Gehalt pro 105 Thrombozyten ist in Abbildung 6 dargestellt. Während zwischen den Amicus-Werten keine signifikanten Unterschiede
bestehen, enthalten die Trima-Thrombozyten an Tag null und eins signifikant
mehr PDGF als an Tag drei und fünf.
-36Tabelle 8:
Prozentuale Veränderung des Mittelwerts von PDGF im Überstand
PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
561%
Tag 1
333%
155%
870%
Tag 3
1130%
278%
1558%
Tag 5
1594%
353%
1981%
Abbildung 14:
PDGF intrazellulär pro 105 Thrombozyten, n = 16, an Tag 5
bei Amicus ist n = 15.
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median. Die Whisker
stellen Minimum und Maximum dar.
-37Die intrazellulären PDGF-Werte nehmen kontinuierlich ab. Von Tag null auf Tag
fünf sinken bei Trima die Werte um 17% (signifikant), bei Amicus um 12% (nicht
signifikant), wobei die intrazelluläre PDGF-Menge bei Amicus von Anfang an
niedriger ist als bei Trima. In nachfolgender Tabelle sind die genauen prozentualen Verhältnisse dargestellt.
Tabelle 9:
Prozentuale Veränderung des Mittelwerts von PDGF intrazellulär
pro 105 Thrombozyten
PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
88%
Tag 1
98%
98%
87%
Tag 3
86%
93%
82%
Tag 5
83%
88%
78%
Wie schon bei VEGF im Lysat, so bestehen auch bei PDGF im Lysat (bezogen
auf 105 Thrombozyten) keine signifikanten Unterschiede zwischen Tagen oder
Maschinen (vgl. Abbildung 13 und Tabelle 10). Die Gesamtmenge an PDGF
während der Lagerung steigt jedoch geringfügig an. Dieser Anstieg ist nicht signifikant und könnte zufällig sein, der homogene Anstieg der Mittel- und Medianwerte lässt dennoch einen Zusammenhang vermuten, der aufgrund des Fehlers der hohen fünfhundertfachen Verdünnung und des geringen Anstiegs nicht
signifikant sein könnte. Die Mittelwerte der PDGF-Menge liegen um den Wert
von 5,14 pg pro 105 Thrombozyten.
-38-
Abbildung 15:
PDGF im Lysat pro 105 Thrombozyten
Die Box zeigt das obere und untere Quartil, die zentrale Linie ist der Median.
Die Whisker stellen Minimum und Maximum dar.
Tabelle 10: Prozentuale Veränderung des Mittelwerts von PDGF im Lysat pro
105 Thrombozyten
PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung PDGF-Veränderung
bei Trima
bei Amicus
bei Amicus
Trima Tag 0 entspricht 100%
Amicus Tag 0 entspricht 100%
Trima Tag 0 entspricht 100%
Tag 0
100%
100%
93%
Tag 1
101%
103%
96%
Tag 3
101%
107%
100%
Tag 5
105%
107%
100%
-39In der folgenden Abbildung ist die Konzentration von PDGF aller drei Kompartimente (intrazellulär, Überstand und Gesamtmenge) in einer Abbildung nach
Zellseparatoren getrennt zusammengefasst.
Abbildung 16:
Zusammenfassende
Grafik
Thrombozyten (Mittelwerte)
von
PDGF
pro
105
-404.3
Zusammenfassung aller Werte
In Tabelle 11 sind die gemessenen Werte und Testergebnisse gesammelt aufgeführt.
Tabelle 11: Zusammenfassung aller Werte
Maschine 1 (Trima)
Maschine 2 (Amicus)
6
Thrombozytenkonzentration (10 /ml)
1513,81 ± 272,20 †
1244,50 ± 143,78 *
Thrombozyten * 10
11
pro TK
3,733 ± 0,681 †
3,117 ± 0,356 *
5
Thrombozyten * 10 pro ml
15138,13 ± 2721,97 †
12445,00 ± 1437,83 *
Leukozytenkonzentration (1/µl)
0,03 ± 0,06
0,39 ± 1,37
Volumen des TKs (ml)
246,50 ± 4,27 †
250,56 ± 3,74 *
Separationsdauer (min)
48,94 ± 9,57 †
43 ± 3,95 *
Tag
0
1
3
5
Tag
0
1
3
5
VEGF intrazellulär (pg/ml)
438,48
454,84
341,42
305,73
±
±
±
±
439,43
417,82
463,15
393,47
±
±
±
±
460,11
463,36
463,43
428,42
5
VEGF intrazellulär pro 10 Thrombozyten (pg)
0,0347
0,0360
0,0268
0,0241
±
±
±
±
Tag
0
1
3
5
591,82
617,01
459,85
404,58
0,0456
0,0472
0,0346
0,0303
0,0296
0,0284
0,0307
0,0259
±
±
±
±
0,0310
0,0314
0,0308
0,0271
±
±
±
±
466,02
479,34
504,46
481,17
VEGF im Lysat (pg/ml)
439,20
466,19
384,22
386,50
±
±
±
±
592,54
637,11
513,65
521,52
477,33
472,05
566,04
526,02
-41-
5
Tag
VEGF im Lysat pro 10 Thrombozyten (pg)
0
1
3
5
0,0348
0,0369
0,0302
0,0305
±
±
±
±
Tag
0,0457
0,0489
0,0389
0,0393
0,0321
0,0321
0,0377
0,0351
±
±
±
±
0,0318
0,0331
0,0339
0,0317
VEGF im CTAD-Überstand (pg/ml)
0
1
3
5
0,72
11,35
42,80
80,77
±
2,87 ¶
± 24,28 ¶
± 69,96
± 132,54 ‡ §
Tag
37,90
54,23
102,89
132,55
± 95,90 ‖ ¶
± 114,53 ¶
± 117,65 ‡
± 128,88 ‡ §
PDGF intrazellulär (pg/ml)
0
1
3
5
63211,83
61889,07
53998,56
52574,18
±
±
±
±
13470,74 ‖¶
11595,27 ¶
10968,34 ‡
10916,26 ‡§
67019,40
66304,51
63023,60
60166,39
±
±
±
±
19891,97
21166,10
20975,30
20128,16
5
Tag
PDGF intrazellulär pro 10 Thrombozyten (pg)
0
1
3
5
5,09
4,98
4,35
4,24
±
±
±
±
0,94 ‖¶
0,80 ‖¶
0,74 ‡§
0,77 ‡§
Tag
4,48
4,41
4,18
3,98
±
±
±
±
1,09
1,10
1,09
0,89
±
±
±
±
17007,17
18462,84
19634,50 †
20766,76
PDGF im Lysat (pg/ml)
0
1
3
5
64151,22
65013,91
64618,03
67549,75
±
±
±
±
13691,89
12348,27
13878,13 *
14427,46
72288,19
74476,75
77657,41
78071,31
5
Tag
PDGF im Lysat pro 10 Thrombozyten (pg)
5,16
5,23
5,20
5,44
0
1
3
5
Tag
±
±
±
±
0,95
0,85
0,94
1,06
4,82
4,95
5,15
5,15
±
±
±
±
0,88
0,91
0,94
0,90
PDGF im CTAD-Überstand (pg/ml)
0
1
3
5
939,39
3124,83
10619,47
14975,57
± 509,70 *§‖¶
± 1219,09 *‡‖¶
± 7256,64 ‡§¶
± 6319,29 ‡§‖
5268,79
8172,24
14633,81
18606,81
Fußnoten:
*
†
‡
§
‖
¶
p < 0,05 versus Amicus
p < 0,05 versus Trima
p < 0,05 versus Tag 0 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 1 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 3 der gleichen Maschine
p < 0,05 versus Tag 5 der gleichen Maschine
±
±
±
±
7308,60 †§‖¶
9125,02 †‡¶
10157,22 ‡§
7817,71 ‡§
-42In folgender Grafik ist der Anteil von PDGF und VEGF im Überstand im Vergleich zum Gesamtgehalt dargestellt. Daneben wird deutlich, dass beide
Wachstumsfaktoren zu etwa gleichen Anteilen in den Überstand gelangen,
wenn sie aus Konzentraten der gleichen Apheresemaschine stammen. Erst gegen Ende der Lagerungsdauer nähern sich die Werte von Trima (hell- und dunkelblau) denen von Amicus (gelb und rot) an.
Abbildung 17:
Anteil von VEGF und PDGF im Überstand am Gesamtgehalt dieser Faktoren (Mittelwert der Menge im Überstand
geteilt durch Menge im Lysat)
-43-
5
DISKUSSION
Thrombozytenkonzentrate bieten die einzige Möglichkeit, schwere lebensbedrohliche Thrombozytopenien bei Patienten zu behandeln. Erst die Verfügbarkeit von Thrombozytenkonzentraten hat die Tür für höchstaggressive knochenmarkschädigende Chemotherapien geöffnet, die vor den Zeiten des Thrombozytenersatzes wegen schwerer Blutungen nicht möglich waren. Die Lagerungsdauer gespendeter Thrombozyten ist auf wenige Tage beschränkt: Einerseits
wegen der an sich kurzen Lebensdauer von Plättchen, andererseits wegen der
unphysiologischen Lagerung außerhalb des Körpers, die mit einer Verschlechterung der Thrombozytenfunktion einhergeht, und zudem wegen der Gefahr von
bakterieller Kontamination von Thrombozytenkonzentraten. In Deutschland betrug die maximal erlaubte Lagerungsdauer bis vor kurzem fünf Tage, in den
USA beträgt sie sieben Tage. Aufgrund einer Empfehlung des Arbeitskreises
Blut beim Robert-Koch-Institut wurde in Deutschland die Verwendbarkeit von
Thrombozytenkonzentraten vor kurzem sogar auf maximal 4 dem Tag der
Spende folgende Tage verkürzt, um das Risiko der transfusionsassoziierten
Sepsis weiter zu reduzieren [8]. Ausgenommen davon sind lediglich pathogeninaktivierte Thrombozytenkonzentrate.
Dass sich während dieser Lagerung verschiedene Parameter ändern, die die
Thrombozytenqualität reflektieren, wurde mehrfach beschrieben. Zum einen
verschlechtern sich Stoffwechselparameter wie Glucose, pH oder Lactat und
zum anderen auch die Transfusionseffektivität in vivo [51,55]. Daneben weisen
einige Arbeiten darauf hin, dass auch Zytokine, Wachstumsfaktoren und andere
bioaktive Moleküle, die sich in den α-Granula von Thrombozyten befinden, während der Lagerung in den Überstand freigesetzt werden [6,23,24,32,35,87,88,
95]. Welche Rolle diese Freisetzung von Zytokinen für die Transfusion in vivo
spielt, ist noch nicht hinreichend geklärt, erlangt jedoch aktuelle Brisanz, da
auch angiogene und onkogene Zytokine in den Überstand freigesetzt werden
und spekuliert wird, ob diese Zytokine in Thrombozytenkonzentraten einen
Überlebensnachteil für Krebspatienten mit sich bringen [48]. Diese Spekulationen rühren daher, dass bei Patienten mit akuten Leukämien mit steigender Zahl
an Plättchentransfusionen ein schlechteres Überleben beobachtet wurde [11].
Außerdem werden diverse Krebserkrankungen erfolgreich mit dem Antikörper
-44Bevacizumab gegen das als onkogen und angiogen angesehene VEGF behandelt, und eine Transfusion von freigesetztem VEGF in Thrombozytenkonzentraten könnte diese teure Antikörpertherapie ineffektiv machen oder sogar negativ
beeinflussen, zumal da Bevacizumab auch thrombozytäres VEGF und nicht nur
VEGF aus Tumorzellen bindet [48]. Verheul et al. konnten zeigen, dass Plättchen den Antikörper Bevacizumab aufnehmen und auch intrazelluläres VEGF
dadurch neutralisiert wird, dies würde also auch für das VEGF in Thrombozytenkonzentraten gelten [86].
Was jedoch bei diesen Spekulationen um einen Überlebensnachteil für Patienten unberücksichtigt bleibt, ist die Frage, ob der Anstieg angiogener und onkogener Zytokine im Überstand von Thrombozytenkonzentraten mit einem intrazellulären Verlust einhergeht oder ob der intrazelluläre Verlust sogar noch höher ist als die freigesetzte Menge. Letzteres war der Fall bei den Messungen
von Cognasse et al. [24], wobei diese das Plättchenlysat mittels Frieren und
Tauen gewannen. Durch diese Methode werden aber nicht die gesamten enthaltenen Zytokine freigesetzt [96]. Wenn onkogene Zytokine zwar während der
Lagerung freigesetzt werden, aber dadurch intrazellulär verloren gehen, wäre
die insgesamt transfundierte Menge an Zytokinen unabhängig von der Lagerungsdauer gleich und würde somit zu einer immer gleichen Neutralisierung von
beispielsweise Bevacizumab führen. Ebenfalls wäre ein Abfall der absolut enthaltenen Zytokine in Thrombozytenkonzentraten denkbar. Daneben ist eine
thrombozytäre Neusythese, wie sie für viele thrombozytäre Proteine bereits gezeigt wurde [90], für angiogene und onkogene Zytokine durchaus vorstellbar,
aber noch nicht experimentell bestätigt.
Aus diesen Gründen wurde die vorliegende Studie geplant. Es wurde untersucht, wie viel von den angiogenen und onkogenen Zytokinen VEGF und
PDGF-AB ex vivo während der Lagerung von Thrombozytenkonzentraten in
den plasmatischen Anteil freigesetzt wird und welcher intrazelluläre Verlust mit
der Freisetzung einhergeht. Da außerdem schon länger bekannt ist, dass die
Freisetzung von Zytokinen von der Herstellungsmethode abhängt, wurden auch
zwei verschiedene Apheresemaschinen diesbezüglich miteinander verglichen.
Zur genauen Bestimmung der Zytokinkonzentrationen spielt hierbei wie bereits
erwähnt die richtige Wahl des präanalytischen Probenmaterials eine entscheidende Rolle [96,99,102].
-45In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die thrombozytären Zytokine VEGF und PDGF-AB während der Lagerung in den Überstand von
Thrombozytenkonzentraten freigesetzt werden und die freigesetzte Menge einerseits mit der Lagerungsdauer steigt, andererseits zu Lagerungsbeginn bei
PDGF auch von der verwendeten Apheresemaschine abhängt.
Für PDGF geht die Freisetzung in den Überstand mit einem intrazellulären Verlust einher, der jedoch ein wenig geringer ist als die in den Überstand freigesetzte Menge. Die Gesamtmenge an PDGF während der Lagerung steigt also
geringfügig an. Auch wenn der kleine Anstieg der Gesamtmenge nicht signifikant ist, was wie bereits erwähnt auf die fünfhundertfache Verdünnung zurückzuführen sein könnte, deutet die Tendenz der Ergebnisse darauf hin, dass
PDGF intrazellulär nachsynthetisiert wird. Die Halbwertszeit von PDGF in vivo
beträgt weniger als zwei Minuten [13], in vitro ist sie noch unbekannt [94]. Ohne
Neusynthese dürfte die PDGF-Menge in Thrombozyten jedoch tendenziell fallen, wenn man bedenkt, dass in thrombozytären Granula auch abbauende Enzyme wie Proteasen vorhanden sind [34]. Andererseits gibt es Arbeiten, wo
PDGF im Lysat während der Lagerung sinkt und parallel im Überstand steigt,
wobei hier die untersuchten Thrombozyten nicht mithilfe eines Detergens lysiert
wurden, wodurch das gemessene Gesamt-PDGF falsch-niedrig gefunden wird
[24]. Künftige Studien zur Untersuchung der PDGF-Synthese durch Plättchen
sollten Proben mit geringerer Ausgangs-Thrombozytenkonzentration als in der
vorliegenden Arbeit oder Tests mit einem höheren Messbereich verwenden,
weil dann nicht so stark verdünnt werden muss, dieser Fehler und die resultierende Streubreite wären dann geringer und eine PDGF-Anstieg oder Abfall
dadurch eher signifikant.
Die Synthese von VEGF durch Plättchen wurde durch die vorliegende Arbeit
weder bewiesen noch ausgeschlossen, da die VEGF-Gesamtmengen in TrimaThrombozytenkonzentraten mit der Zeit sinken und in Amicus-Konzentraten
steigen. Beide Veränderungen sind nicht signifikant - für die Aussage, dass der
Wert im Zeitverlauf gleichbleibend wäre, schwankt er aber zu stark. Das entscheidende Problem für die Interpretation der Daten sind hier die großen intraindividuellen Konzentrationsunterschiede von VEGF bei dafür zu kleiner Studienpopulation. Wenn man die Konzentrationen von VEGF in Thrombozytapheresekonzentraten von den Zellseparatoren Trima und Amicus zusammen im Ver-
-46lauf betrachtet, ergeben sich konstante Konzentrationen für VEGF, was dann
wiederum eher für eine Synthese von VEGF spräche, da ohne Neusynthese
wieder mit einem Abfallen der Konzentration zu rechnen wäre. Um die Synthese von VEGF in zukünftigen Studien zu untersuchen, sollte stärker konzentriertes Ausgangsmaterial oder ein empfindlicherer Test verwendet werden, oder es
sollte schon bei der Lysatherstellung weniger verdünnt werden, um mehr
VEGF-Werte in noch messbaren Bereichen zu erhalten. Beim Vergleich von
VEGF-Konzentrationen in verschiedenen Gruppen sollten nicht zu kleine Studienkohorten gewählt werden, da die großen interindividuellen Unterschiede bei
zu kleiner Gruppengröße einen Unterschied vortäuschen oder verdecken können.
Bei der intrazellulären VEGF-Menge gibt es keine signifikante Veränderung
während der Lagerung und es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen
den Maschinen. Dieses Resultat ist an sich positiv, denn es deutet darauf hin,
dass die Thrombozytenqualität konstant bleibt und man beide Maschinen zur
Spende verwenden kann, ohne mit einem schlechteren Produkt bei einer Maschine rechnen zu müssen. Trotzdem scheint der Zellseparator Trima, wenn
man die PDGF-Messungsergebnisse beziehungsweise andere Faktoren betrachtet, qualitativ etwas überlegene Thrombozytenkonzentrate zu liefern
[46,51,79]. Die im Zellseparator Trima angewendete sogenannte Buffy-CoatMethode erhält die Thrombozytenqualität besser als die bei Amicus angewendete Methode, bei der die gesammelten Plättchen hoch konzentriert in einem
engen Beutel während der ganzen Spende in der Zentrifuge Scherkräften ausgesetzt sind und mehr Kontakt zu Plastikoberflächen haben [51,79]. Dass die
Buffy-Coat-Methode besser ist als die Platelet-Rich-Plasma- und die TubeMethode, wurde auch in anderem Zusammenhang für die Herstellung lokal anwendbarer Thrombozytenkonzentrate beschrieben [79,98,101].
Bei Betrachtung der zwei Maschinen wurde in der hier vorliegenden Studie bezüglich der untersuchten Zytokine einzig eine signifikant höhere PDGF-Freisetzung an den Tagen null und eins der Lagerung bei Amicus-Thrombozyten im
Vergleich mit Trima-Thrombozyten gefunden. Folgende nicht-signifikanten Tendenzen ließen sich noch beobachten, die Anhalt für eine etwas bessere Qualität
von Trima-Thrombozytenkonzentraten geben:
-47In Amicus-Präparaten ist von Anfang an weniger PDGF und VEGF intrazellulär
vorhanden und der intrazelluläre Abfall ist schwächer ausgeprägt als in TrimaPräparaten, weil in Amicus-Präparaten schon zu Lagerungsbeginn ein viel größerer Anteil der gesamt enthaltenen Zytokine ausgeschüttet ist (sieben bis acht
Prozent) als in Trima-Präparaten (null bis ein Prozent; vergleiche Tabelle 11 in
Kapitel 4.3).
Während der Lagerung bleibt die durchschnittliche Zytokinmenge im Überstand
in Konzentraten vom Zellseparator Amicus immer höher als in Konzentraten
vom Zellseparator Trima, der Unterschied nimmt aber kontinuierlich ab. Die
Schwankungsbreite der Einzelwerte ist bei Amicus-Präparaten von Anfang an
groß, während sie bei Trima erst ab Tag drei stark zunimmt.
An Tag null und Tag eins befindet sich signifikant mehr PDGF im CTAD-Überstand bei den Amicus-Präparaten im Vergleich zu den Trima-Präparaten. An
Lagerungstag drei und fünf ist immer noch weniger PDGF bei Trima-Thrombozyten im Überstand, der Unterschied ist aber nicht mehr signifikant. Für VEGF
sind die Werte im Überstand der Konzentrate von den Zellseparatoren Amicus
und Trima zwar nicht signifikant verschieden, dennoch werden beim Betrachten
der Einzelwerte (veranschaulicht im Boxplot) deutliche Parallelen zu den PDGFErgebnissen sichtbar (p = 0,34 an Tag null, p = 0,16 an Tag eins, p = 0,07 an
Tag drei und p = 0,08 an Tag fünf). An Tag null lag VEGF meistens unterhalb
des Messbereichs, galt also als null: an Tag null waren von 16 Werten in Konzentraten vom Zellseparator Trima nur ein Wert und in Konzentraten vom Zellseparator Amicus vier Werte größer als „null“. Außerdem weisen die VEGFMengen sehr große interindividuelle Unterschiede auf (Standardabweichung
etwa 100 Prozent), was bei der Stichprobengröße von n = 16 das Finden signifikanter Unterschiede erschwert, während PDGF zwischen Individuen eine viel
geringere Streubreite aufweist (Standardabweichung etwa 20 Prozent). Dies
entspricht publizierten Messungen von Peterson 2010 [61]. Er bestimmte bei 8
Personen das VEGF über 5 Wochen. Er fand 88 ng VEGF/10 5 Thrombozyten,
wobei eine größere Intersubjekt-Variabilität (SD 38 ng) und eine geringere Intrasubjekt-Variabilität (SD 15 ng) vorhanden war. Das passt wiederum zur Beobachtung in der hier vorliegenden Studie, dass die VEGF-Werte eines einzelnen Individuums im Verlauf wenig schwanken.
-48Angefangen bei der Betrachtung der technischen Daten und des Spenderkomforts bestehen gewisse Unterschiede zwischen den beiden Apheresegeräten. In
der vorliegenden Arbeit sind die Thrombozyten in Konzentraten vom Zellseparator Amicus signifikant höher konzentriert und enthalten bei ähnlichem Volumen wie in Konzentraten vom Zellseparator Trima fast 20 Prozent mehr Thrombozyten pro Konzentrat. Diese Lagerung auf engerem Raum könnte auch ein
Grund für die höhere Aktivierung dieser Plättchen sein. Daneben ist die Separationsdauer beim Zellseparator Trima signifikant kürzer. Bei Fontana et al. zeigte
der Zellseparator Trima eine signifikant höhere Sammelrate, eine kürzere Apheresedauer, einen etwas höheren Leukozytengehalt in den Konzentraten und
mehr Citrat-assoziierte Nebenwirkungen [29]. Der Spendekomfort und die
Spenderpräferenz für eine Maschine waren dagegen vergleichbar. In der Untersuchung von Flesch et al. mit einer dreimal so großen Studienpopulation (je 91
pro Maschine) wies der Zellseparator Trima etwas mehr Spenderkomfort auf,
da beim Zellseparator Amicus mit zwei Nadeln gearbeitet wurde und der Zellseparator Amicus etwas langsamer und lauter war [27]. Der Zellseparator Trima
sammelte auch hier etwas mehr Leukozyten. Sammelrate, Ertrag und Thrombozytenextraktionskoeffizient waren gleich. 2011 stellten Fontana et al. beim
Vergleich von Trima und Amicus folgendes fest:
„Beide Verfahren lösten eine Rekrutierung von Thrombozyten aus, die mit Trima Accel ausgeprägter war und einen höheren Ertrag an Thrombozyten lieferte
- trotz vergleichbarer Plättchendepletion der Spender. Diese Rekrutierung unterstützt die Gewinnung von mehreren Einheiten aus einer einzelnen Spende
und scheint vom eingesetzten Verfahren abhängig zu sein. Der unterschiedliche
Anstieg der Leukozyten der Spender muss weiter untersucht werden.“ [28]
Die vorgelegte Arbeit bestätigt wie frühere Studien, dass mit dem Zellseparator
Amicus gewonnene Thrombozyten etwas schlechtere Qualitätsmerkmale in vitro aufweisen als mit dem Zellseparator Trima gewonnene. So untersuchten
Skripchenko et al. die Aktivierung von Thrombozytenkonzentraten anhand der
Marker CD40L, CD62P und ihrer löslichen Formen sCD40L und sCD62L während siebentägiger Lagerung [79]. Im Vergleich zu Thrombozyten vom Zellseparator Trima wiesen Thrombozyten vom Zellseparator Amicus eine höhere
sCD40L Sekretion während der ersten drei Tage, einen höheren Prozentsatz
CD62-positiver Zellen während der ersten fünf Lagerungstage und eine höhere
-49sCD62P-Sekretion während der gesamten Lagerungsdauer auf. Bei Picker et
al. wurden die Zellseparatoren Trima, Amicus und Haemonetics MCS+ verglichen [63]. Es stellte sich bei kleinen Gruppengrößen (n = 9) kein Apparat als
weit überlegen heraus. Thrombozytenkonzentrate vom Zellseparator Trima hatten jedoch zu den Messzeitpunkten Tag eins und fünf der Lagerung signifikant
höhere pH-Werte und einen höheren Glucosegehalt als Thrombozytenkonzentrate vom Zellseparator Amicus. Die Arbeitsgruppe von Macher et al. untersuchte während siebentägiger Lagerung in vitro-Parameter von Thrombozytenkonzentraten von den Zellseparatoren Amicus und Trima, wobei Amicus-Präparate
signifikant schlechtere Werte in Bezug auf Glucose, pH, Laktat, LDH, die Aktivierungsmarker CD62P und CD63, die In-vitro-Funktion und die Erythrozytenkontamination aufwiesen [51]. Macher et al. stellten die Hypothese auf, dass
sich die Unterschiede gegen Ende der Lagerungszeit ausgleichen, weil die
Thrombozyten in den Lagerbeuteln der Sets des Zellseparator Amicus geringer
konzentriert seien, wovon die Zellen profitieren würden. In der hier vorliegenden
Arbeit gleichen sich die Unterschiede zwischen Präparaten von den Zellseparatoren Trima und Amicus im Laufe der Lagerung qualitativ auch an, obwohl in
unserer Messserie die Thrombozytenkonzentration in Präparaten vom Zellseparator Amicus signifikant höher lag (sie enthielten fast 20 Prozent mehr Thrombozyten). Man kann also eher die zweite von Macher et al. aufgestellte Hypothese bestätigen, nämlich dass Plättchen, die bereits stärker aktiviert sind, weniger auf kommende Aggregationsstimuli ansprechen. Hierfür sprechen auch
die Ergebnisse von Jilma-Stohlawez et al. [46]. Sie maßen am ersten Lagerungstag eine signifikant geringere Aktivierbarkeit der Thrombozyten vom Zellseparator Amicus im Vergleich zu denen von den Zellseparatoren Trima oder
MCS+ und bestätigen damit eine geringere funktionale Kapazität der AmicusThrombozyten.
Zum generellen Zusammenhang zwischen in vitro gemessenen Parametern für
Metabolismus und Aktivierung und deren Auswirkungen in vivo kann gesagt
werden, dass stärker aktivierte Thrombozyten eine schlechtere Transfusionseffektivität aufweisen [77,97]. Gründe für die Aktivierung sind neben der Herstellungsmethode vor allem eine verlängerte Lagerungsdauer, der Zusatz von additiven Lösungen statt Plasma und eine eventuelle Pathogeninaktivierung
[1,75,97]. Aktivierte Plättchen können sich in vivo teilweise regenerieren [65],
-50werden jedoch auch von neutrophilen Granulozyten phagozytiert [53] und werden möglicherweise auch apoptotisch [62].
Zur konkreten Transfusionseffektivität von Thrombozytenkonzentraten in vivo,
die entweder mit Trima Accel oder Fenwal Amicus hergestellt waren, liegen nur
wenige Arbeiten vor. Julmy et al. stellten fest, dass die Thrombozyten vom Zellseparator Amicus einen viel schlechteren CCI bewirken als die vom Zellseparator Trima [47]. Dies liegt allerdings nicht nur an der maschinellen Herstellungsmethode des Zellseparators Amicus, sondern wohl zum größeren Anteil an der
Tatsache, dass hier die Thrombozyten vom Zellseparator Amicus in der additiven Lösung PAS-II und die vom Zellseparator Trima in Plasma suspendiert
wurden, wobei schon länger bekannt ist, dass PAS-II die Thrombozytenqualität
deutlich negativ beeinflusst [97]. Die Arbeitsgruppe von Fontana fand bei
Thrombozytapheresekonzentraten von den Zellseparatoren Trima und Amicus
einen nicht signifikant unterschiedlichen CCI (19,9 versus 11,8) bei im Schnitt
gleicher Lagerungsdauer (3,85 Tage) [29]. Hierbei waren Amicus-Thrombozyten zu neun Prozent häufiger AB0-identisch transfundiert worden, jedoch waren sie genauso wie bei Julmy et al. in additiver Lösung und Trima-Thrombozyten in Plasma gelagert worden [29,47]. Im Grunde kann man daher sagen,
dass beide Arbeitsgruppen Äpfel mit Birnen verglichen.
Da Thrombozytenkonzentrate vom Zellseparator Amicus in der vorliegenden
Arbeit mit knapp 20 Prozent signifikant mehr Thrombozyten enthielten als solche vom Zellseparator Trima, könnte die höhere Aktivierung der Thrombozyten
dadurch vom Effekt her in vivo wieder ausgeglichen sein, zumal da die Unterschiede ab Lagerungstag drei nicht mehr signifikant sind. In der Literatur befinden sich jedoch einmal in den Produkten vom Zellseparator Amicus, ein andermal in den Produkten vom Zellseparator Trima signifikant mehr Thrombozyten
[19,27,29,51,63,79]. Summa summarum enthalten die Konzentrate von beiden
Maschinen also wohl gleich viele Thrombozyten.
Auch beim Vergleich der Konzentrationen von Wachstumsfaktoren in Thrombozyten zeigt sich, dass sich die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte
gut in bereits publizierte Ergebnisse einfügen. Diese Studien sind in den folgenden Tabellen übersichtlich zusammengefasst.
-51Tabelle 12: Zusammenfassenden Darstellung der thrombozytären PDGF-AB Konzentrationen verschiedener Studien
Tag
0
Tag
1
Tag
3
Tag
5
Tag
7
Ausgangsmaterial
Methode
Stürhof
Trima - TK
0,5% Triton X-100
5,2 ± 0,95
5,2 ± 0,85
5,2 ± 0,94
5,4 ± 1,06
0,5% Triton X-100
4,8 ± 0,88
4,9 ± 0,9
5,2 ± 0,9
5,2 ± 0,9
Peterson 2012 [60]
Amicus - TK
Citrat-Vollblut, ggf. nicht
PDGF-AB
nicht beschrieben
2,1
Tag
1
65,0 ± 12,3
Tag
3
64,6 ± 13,9
Tag
Tag
5
7
67,5 ± 14,4
74,5 ± 18,5
77,7 ± 19,6
78,1 ± 20,8
PDGF-AB im Lysat
5
(pg/10 Thrombozyten)
Zimmermann 2003 [96]
Schmieger 2011 [73]
Graff 2002 [35]
PDGF-AB im Lysat
(ng/ml)
COM.TEK - TK
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, Colon-CA,
vor OP
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, Colon-CA, 6
Monate nach OP
0,5% Triton X-100
0,5% Triton X-100 +
Citrat-Vollblut, PRP, n = 6 3x Gefrieren + Tauen
47,7 ± 13,6
6,7 ± 7,4
2 ± 0,7
Trima - TK
0,5% Triton X-100
13,1
Tag
0
64,2 ± 13,7
Amicus - TK
0,5% Triton X-100
72,3 ± 17,0
Cognasse 2008 [24]
Amicus - TK
nicht beschrieben
28,3 ± 3,5
Zimmermann 2003 [96]
COM.TEC - TK
0,5% Triton X-100
602,8 ± 127,3
Zimmermann 2001 [98]
COBE - TK
2x Gefrieren + Tauen
189,9 ± 201,8
Schmieger 2011 [73]
Buffy-Coat (aus Vollblut)
2x Gefrieren + Tauen
Citrat-Vollblut, Colon-CA,
vor OP
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, Colon-CA, 6
Monate nach OP
0,5% Triton X-100
Stürhof
229,1 ± 88,6
20,1 ± 21,9
6,4 ± 2,1
25,2 ± 3,6
192,5 ± 184,7 108,4 ± 70,4
23,2 ± 4,0
-52-
PDGF-AB im Überstand
von TKs (ng/ml)
Stürhof
Tag
3
Tag
5
CTAD-Überstand
0,94 ± 0,51
3,12 ± 1,22 10,62 ± 72,57 14,98 ± 6,32
Amicus - TK
CTAD-Überstand
Antikoagulans nicht
beschrieben
Antikoagulans nicht
beschrieben
5,27 ± 7,31
8,17 ± 9,13 14,63 ± 10,16 18,61 ± 7,82
Trima - TK
Cognasse 2008 [24]
Amicus - TK
Überstand-/Plasmawerte
Vollblut (ng/ml)
7,0 ± 1,2
14,5 ± 3,5
Tag
0
Peterson 2012 [60]
Vollblut, heparinisiert
CTAD-Vollblut, vor Apherese
CTAD-Vollblut, nach Apherese
Citrat-Vollblut, ggf. nicht
PDGF-AB
Graff 2002 [35]
Citrat-Vollblut, PPP
Zimmermann 2005 [100]
Tag
1
Trima - TK
Kanter 2008 [48]
Kanter 2008 [48]
Tag
0
Plasma-Überstand
0,10 ± 0,01
Plasma-Überstand
0,071 ± 0,038
Plasma-Überstand
0,121 ± 0,121
PPP (Median)
0,292 ± 0,319
15,0 ± 1,9
24,8 ± 2,7
17,7 ± 2,4
Tag
1
4 ± 1
TK = Thrombozytenkonzentrat, CA =Carcinom, PPP = Platelet Poor Plasma, PRP = Platelet Rich Plasma
Tag
3
Tag
7
36,6 ± 4,0
18 ± 2,1
Tag
5
Tag
7
-53Tabelle 13: Zusammenfassende Darstellung der thrombozytären VEGF Konzentrationen verschiedener Studien
VEGF
(pg/ml)
im
Ausgangsmaterial
Methode
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 5
Trima - TK, n = 16
0,5% Triton X-100
439 ± 593
466 ± 637
384 ± 514
387 ± 522
0,5% Triton X-100
0,5% Triton X-100 +
Proteaseinhibitor
477 ± 466
472 ± 479
566 ± 504
526 ± 481
Tag 7
Lysat
Stürhof
Amicus - TK, n = 16
Peterson 2010 [61]
Citrat-Vollblut, n = 8
Peterson 2012 [60]
Citrat-Vollblut
nicht beschrieben
Citrat-Vollblut, Colon-CA, vor OP
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, Colon-CA, 6 Monate
nach OP
0,5% Triton X-100
Schmieger 2011 [73]
VEGF
im
Lysat
5
(pg/10 Thrombozyten)
Trima - TK, n = 16
Peterson 2010 [61]
Amicus - TK, n = 16 0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, n = 0,5% Triton X-100 +
50
Proteaseinhibitor
0,5% Triton X-100 +
Citrat-Vollblut, n = 8 Proteaseinhibitor
Schmieger 2011 [73]
437,1 ± 233,3
1033,1 ± 200,7
Tag 0
Stürhof
Peterson 2012 [60]
351 ± 519,0
53 ± 64
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut
nicht beschrieben
Citrat-Vollblut, Colon-CA, vor OP
0,5% Triton X-100
Citrat-Vollblut, Colon-CA, 6 Monate
nach OP
0,5% Triton X-100
Tag 1
Tag 3
Tag 5
0,035 ± 0,046
0,037 ± 0,049
0,030 ± 0,039
0,031 ± 0,039
0,032 ± 0,032
0,032 ± 0,033
0,038 ± 0,034
0,035 ± 0,032
0,074 ± 0,37
0,088 ± 0,38
0,06
0,18 ± 0,12
0,35 ± 0,09
Tag 7
-54VEGF im Überstand
von TKs (pg/ml)
Stürhof
Kanter 2008 [48]
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Trima - TK, n = 16
CTAD-Überstand
0,72 ± 2,87
11,35 ± 24,28
Amicus - TK, n = 16
CTAD-Überstand
Antikoagulans nicht
beschrieben
37,9 ± 95,9
54,23 ± 114,53 102,89 ± 117,65
Trima-TK, n = 5
Überstand- / Plasmawerte
Vollblut
(pg/ml)
173,5 ± 2,6
Tag 0
Kanter 2008 [48]
Vollblut,
siert
Zimmermann [99]
Citrat-Vollblut
Überstand
Zimmermann [99]
CTAD-Vollblut
Peterson 2010 [61]
Citrat-Vollblut
Überstand
PPP, "Normal ranges"
Peterson 2010 [61]
Citrat-Vollblut
PPP, ANOVA
Peterson 2012 [60]
Citrat-Vollblut
PPP, Median
Tag 1
hepariniPlasma
8,9 ± 1,4
22,47 ± 11,42
8,87 ± 10,71
50 ± 20
351 ± 519
53 ± 64
TK = Thrombozytenkonzentrat, CA =Carcinom, PPP = Platelet Poor Plasma, PRP = Platelet Rich Plasma
42,8 ± 69,96
204,1 ± 25,6
Tag 3
Tag 5
Tag 7
80,77 ± 132,54
132,55 ± 128,88
304,3 ± 67,1
Tag 5
405,6 ± 47,9
Tag 7
-55Peterson et al. 2010 maßen vergleichbare Werte von VEGF (von PDGF wurde nur die Isoform PDGF-BB bestimmt): Sie stellten Thrombozyten-Pellets
aus Citrat-Vollblut her und lysierten sie mit Triton-X-100 unter Zugabe von
Proteaseinhibitor [61]. In diesem Lysat fanden sie im Schnitt 11 pg VEGF/µl,
95%-Konfidenzintervall 0 bis 22 pg/µl. In der vorliegenden Arbeit wurden im
Schnitt 0,4 pg, minimal 0 pg und maximal 2 pg VEGF/µl gefunden, es wurde
hier aber auch kein Thrombozyten-Pellet gemessen, welches stärker konzentrierte Thrombozyten enthält. Auf die Thrombozytenzahl bezogen fanden
Peterson et al. mit 74 ng VEGF/105 Thrombozyten in etwa doppelt so viel
VEGF wie wir in der vorliegenden Arbeit. Einerseits könnte die Zählung der
Thrombozytenzahl jeweils unterschiedlich gut sein. Peterson et al. verwendeten nämlich einen Aktin-ELISA und berechneten aus der Aktinkonzentration
die Thrombozytenzahl im Pellet, nachdem sie die Korrelation von Aktin zur
Thrombozytenzahl mithilfe von 27 Testpersonen ermittelt hatten. Oder ihre
Lysatherstellung mit dem Proteaseinhibitor und kräftigem Pipettieren, bis das
Lysat durchscheinend ist, lysierte effektiver als das von uns angewendete
mehrmalige Hin- und Herkippen. Daneben könnte der von Peterson et al.
verwendete Proteaseinhibitor zu höheren Messergebnissen führen, da Plättchen Proteasen in ihren Granula enthalten und denkbar ist, dass dadurch
auch Zytokine während der Probenverarbeitung abgebaut werden. Ein wesentlicher Störfaktor könnte auch die Kontamination des Plättchen-Pellets mit
weißen Blutzellen sein, denn diese enthalten ebenfalls Wachstumsfaktoren
[98,101]. Der Gehalt an weißen Blutzellen ist in der Arbeit von Peterson et al.
leider nicht beschrieben [61]. Zudem wäre es möglich, dass Peterson et al.
wegen ihres höher konzentrierten Ausgangsmaterials seltener Werte im nicht
mehr messbaren Bereich hatten; in der hier vorliegenden Arbeit wurde in 14
Prozent der Messungen kein VEGF im Lysat detektiert. In einer neueren Arbeit von 2012 fanden Peterson et al. im Lysat mit 2,1 pg pro 105 Thrombozyten knapp halb so viel PDGF wie wir, wobei bei nicht genau beschrieben ist,
welche PDGF-Isoform untersucht wurde [60]. Von VEGF detektierten sie mit
0.06 pg pro 105 Thrombozyten so wie in ihrer Studie 2010 etwa doppelt soviel VEGF wie wir. Daneben stellten sie fest, dass Patienten mit kolorektalem
Karzinom höhere Konzentrationen an VEGF und PDGF im Blut haben als
gesunde Kontrollpersonen.
-56Bei Cognasse et al. steigen in Amicus-Thrombozytenapheresekonzentraten
die gemessenen Zytokine im Überstand und sinken parallel intrazellulär [24].
PDGF im Lysat lag bei 28,3 ng/ml an Tag 0, also bei etwas weniger als der
Hälfte der in der hier vorgelegten Studie gemessenen Konzentration. Die
verwendeten Reagenzien für Lyse und Antikoagulation der Einzelproben sind
in dieser Arbeit aber nicht beschrieben. Im Überstand waren 14,5 ng/ml
PDGF, wir fanden 4,8 ng/ml bei Amicus-Thrombozyten. Bei Cognasse et al.
befindet sich zu allen drei Messzeitpunkten über die Hälfte des gemessenen
PDGFs im Überstand, wohingegen in der hier vorgelegten Arbeit maximal 25
Prozent des PDGFs im Überstand gemessen wurden (vgl. Abbildung Kapitel
4.3). Wenn Cognasse et al. kein Detergens zur Lysatherstellung verwendeten, sondern z.B. Gefrieren und Auftauen wie in ihrer Publikation 2006 [23]
und wenn bei der Messung der PDGF-Konzentrationen im Überstand kein
CTAD-Plasma verwendet wurde, kann man die niedrigeren Konzentrationen
im Lysat und die höheren Konzentrationen im Überstand erklären. Bei ihnen
nimmt die gesamte PDGF-Konzentration auch im Laufe der Lagerung signifikant ab, was in meiner Arbeit nicht der Fall ist. Auch bei Zimmermann et al.
2001 nahm die PDGF-AB-Menge während fünftägiger Lagerung tendenziell
ab, wobei auch hier mit Gefrieren und Tauen lysiert wurde [98]. Fraglich
bleibt, ob die abnehmende Gesamtmenge von PDGF bei Cognasse et al.
und Zimmermann et al. tatsächlich sinkt. Die angewendete Methode setzt
nicht alle intrazellulär vorhandenen Zytokine frei und theoretisch wäre es
auch denkbar, dass Thrombozyten mit steigender Lagerungsdauer aufgrund
einer Änderung ihres chemisch-physikalischen Verhaltens weniger anfällig
für Lyse durch Gefrieren und Tauen werden. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit mit besserer Freisetzungsmethode sprechen gegen eine Abnahme des Gesamt-PDGFs mit zunehmender Lagerungsdauer.
Zimmermann et al. fanden 2003 im methodisch gleich hergestellten TritonLysat von Thrombozytenkonzentraten zehnmal soviel PDGF-AB wie wir in
der hier vorgelegten Arbeit [96]. Die plausibelste Erklärung für dieses Ergebnis wäre, dass hier eine Kommastelle verrutscht ist.
Schmieger fertigte mit exakt gleicher Methodik wie in der hier vorgelegten
Arbeit aus Citrat-Vollblut von Krebspatienten Lysate in Triton X-100 und er-
-57hielt Messwerte in ähnlicher Größenordnung [73]. Er stellte fest, dass sich in
Folge von Tumorresektion die Beladung von Thrombozyten mit Wachstumsfaktoren verändert. PDGF sinkt sechs Monate nach Entfernung eines kolorektalen Karzinoms und VEGF steigt.
Graff et al. fanden einen engen Zusammenhang zwischen Plättchenaktivierung gemessen an der CD62P-Expression und der PDGF-AB- und PDGFBB-Freisetzung [35]. Außerdem beobachteten sie, dass Veränderungen der
CD62-Expression durch Clopidogrel oder durch Diabetes mit einer parallelen
Änderung des PDGF-Gehaltes einhergehen. Sie fanden bei einer Gruppengröße von n = 6 gesunden Probanden im Vergleich zu den Daten der hier
vorgelegten Arbeit etwa doppelt so viel PDGF-AB im plättchenreichen Plasma von Citrat-Vollblut im 0,5-prozentigen Triton-Lysat, welches bei ihnen
noch dreimal aufgetaut und wieder eingefroren wurde. Gegebenenfalls ist
ihre Freisetzungsmethode noch besser. Ebenfalls könnte ihr plättchenreiches
Plasma Zytokin-freisetzende Leukozyten enthalten, wobei der Leukozytengehalt der Proben in der Arbeit nicht erwähnt wird. Die Stichprobengröße von
sechs ist auch zu klein, um daraus Normwerte abzuleiten oder die verwendete Methode als überlegen bezeichnen zu können.
In der Arbeit von Kanter et al. wurde der Anstieg von VEGF, PDGF-AB, TFGβ1 und FGF-2 im Überstand von Trima-Thrombozytapheresekonzentraten
untersucht und diese Werte wurden mit dem jeweiligen Gehalt im Plasma
aus Vollblut verglichen [48]. In Gruppe 1 (n=5) wurde der Anstieg der genannten Faktoren während der Lagerung gemessen (Tage +1, +3, +5 und
+7). Sowohl VEGF als auch PDGF und TGF-β waren an Tag 1 im Überstand
der Thrombozytenkonzentrate höher konzentriert als im Plasma und stiegen
bei jeder weiteren Messung signifikant an. Die Werte sind jedoch nur als
Menge pro Milliliter und nicht als Menge pro 10x Thrombozyten angegeben.
Da Thrombozyten Haupttransporter von VEGF und PDGF sind, ist es zu erwarten, dass diese Zytokine im Überstand von Thrombozytenkonzentraten
höher konzentriert sind als in thrombozytenarmem Plasma. Das von Kanter
et al. verwendete Antikoagulans Heparin ist allerdings mit Thrombozytenaktivierung assoziiert, der Plasmawert könnte also von dieser Arbeitsgruppe
falsch-hoch sein [33]. Die Thrombozytenkonzentrate der Gruppe zwei (n = 5)
-58wurden an Tag +7 gewaschen und dann wurden die gleichen Faktoren nochmals gemessen. Waschen an Tag +7 reduzierte den PDGF und VEGFGehalt signifikant mit gleichzeitigem Verlust von 10-14% der Thrombozyten.
Der Wachstumsfaktorengehalt entsprach dann dem von Tag +3. In anderen
Studien wird von bis zu 30% Wachstumsfaktorenverlust durch Waschen berichtet [48]. Bezüglich des Waschens von Thrombozytenkonzentraten berichteten Ringwald et al., dass Waschen mit neuen Platelet Additive Solutions
(Composol-PS oder modifizierte PAS-III) eine brauchbare Methode bezüglich
der Thrombozytenqualität ist [67]. Blumberg et al. stellten fest, dass gewaschene Thrombozytenkonzentrate zwar 20 bis 30 Prozent weniger Plättchen
enthalten, aber damit behandelte Patienten weniger Transfusionen benötigen
[11]. Das Waschen von Thrombozytenkonzentraten wäre also eine durchaus
denkbare Methode zur Prävention einer „Zytokin-Transfusion“ bei Krebspatienten. Kanter et al. beobachteten außerdem in einem In-vitro-Modell, dass
das VEGF im Überstand sieben Tage gelagerter Thrombozytenkonzentrate
das gesamte Bevacizumab band, das ein 70 kg schwerer Patient bei der
niedrigsten angewendeten Dosierung erhalten würde. Deshalb diskutieren
Kanter et al. den Effekt, dass Transfusion von VEGF im Überstand von
Thrombozytenkonzentraten mit schlechterem Ansprechen von Patienten auf
eine Therapie mit Bevacizumab assoziiert sein könnte, da das Bevacizumab
durch das transfundierte VEGF geradezu neutralisiert wird [48]. Allein schon
wegen der nachgewiesenen Rolle von VEGF bei der Tumorangiogenese
leuchtet es ein, dass eine Transfusion von VEGF mit Nachteilen für Krebspatienten verbunden sein könnte. Was Kanter et al. in ihrer Arbeit jedoch unberücksichtigt ließen, war die Entwicklung der Gesamtmenge der untersuchten
Zytokine in Thrombozytenkonzentraten - diese Lücke konnte durch die vorgelegte Arbeit für PDGF und VEGF geschlossen werden.
Die Frage, ob die Transfusion von gelagerten Thrombozytenkonzentraten mit
einem Nachteil für Krebspatienten einhergeht, lässt trotz allem bezüglich der
untersuchten Onkogene nicht bejahen oder verneinen. Ältere Thrombozytenkonzentrate zeigen schlechtere Parameter und wie in dieser und anderen
Arbeiten gezeigt reichern sich auch angiogene und onkogene Zytokine im
Überstand an. Der Gesamtgehalt an Wachstumsfaktoren bleibt jedoch konstant, die transfundierte Menge und die nur damit verbundenen möglichen
-59negativen Effekte dürften somit bei frischen und gelagerten Thrombozytenkonzentraten gleich sein. Generell sind aber jüngere Thrombozytenkonzentrate zu bevorzugen, weil bekannt ist, dass die Therapie mit gelagerten
Thrombozytenkonzentraten weniger effektiv ist und solche Patienten mehr
Transfusionen benötigen, was wiederum ein höheres Risiko für den Patient
und nicht zuletzt für die Spender bedeutet [1,11,75,97]. Rein rechnerisch
ergibt sich, dass Patienten, die mehr Transfusionen benötigen, weil sie mit
gelagerten oder stärker aktivierten Thrombozytenkonzentraten behandelt
werden, auch mehr Wachstumsfaktoren transfundiert bekommen. Auf der
anderen Seite muss man sagen, dass die mit einer Thrombozytopenie einhergehende Blutungsgefahr akut sicher lebensbedrohlicher ist als die mit
einer Transfusion einhergehende Infusion von Wachstumsfaktoren - von der
noch nicht geklärt ist, wie genau sie das Überleben von Krebspatienten beeinflusst. Dies sollten zukünftige Studien untersuchen und dabei den klinischen Effekt der Anzahl der transfundierten Thrombozytenkonzentrate, des
Alters der Konzentrate bei Transfusion, unterschiedlicher Herstellungsmethoden und eventuellen Waschens prüfen.
Zusammenfassend waren, bedingt durch die höhere Thrombozytenkonzentration in den Konzentraten vom Zellseparator Amicus, die Konzentrationen
von VEGF und PDGF-AB in den Lysaten dieser Konzentrate höher als in denen vom Zellseparator Trima Accel. Bezogen auf 10 5 Thrombozyten bestanden keine wesentlichen Unterschiede. Während der Lagerung bleibt der Gehalt beider Zytokine in den Lysaten weitgehend konstant. In den Überständen steigen die Konzentrationen beider Zytokine während der Lagerung an,
wobei der überwiegende Anteil beider Zytokine bis zum Tag +5 intrazellulär
verbleibt, wenngleich immerhin 20 bis 25 Prozent der Gesamtmengen im
Überstand zu finden sind.
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-73-
7.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ACD-A
Acid-Citrate-Dextrose-A
ADP
Adenosindiphosphat
CCI
Corrected count increment
CD
Cluster of differentiation
CTAD
Citrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridamol
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
et al.
et alii
Fc
Kristallisiertes Fragment
FGF
Fibroblast growth factor
HBV
Hepatitis-B-Virus
HCV
Hepatitis-C-Virus
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
LDH
Laktatdehydrogenase
LRS
Leukoreduktionssystem
PAS
Platelet additive solution
PDGF
Platelet derived endothelial growth factor
PPP
Plättchenarmes Plasma
PRP
Plättchenreiches Plasma
RNA
Ribonukleinsäure
SD
Standardabweichung
TGF
Transforming growth factor
VEGF
Vascular endothelial growth factor
-74Vorsätze:
k
Kilo (103)
m
Milli (10-3)
μ
Mikro (10-6)
n
Nano (10-9)
p
Piko (10-12)
f
Femto (10-15)
Einheiten:
°C
Grad Celsius
Da
Dalton
g
Gramm
l
Liter
m
Meter
M
Molarität
N
Stoffmenge
pH
pondus hydrogenii
-75-
8.
DANKSAGUNG
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater und Betreuer Herrn Prof. Dr.
Robert Zimmermann ganz herzlich danken. Das Anfertigen dieser Dissertation hat mir dank seiner ansteckenden Begeisterung in wissenschaftlichen
Fragestellungen, seiner Hilfsbereitschaft, Freundlichkeit und Anleitung große
Freude bereitet. Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Reinhold Eckstein für
die Möglichkeit, die Arbeit in seiner Abteilung durchführen zu können.
Großer Dank gilt auch den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern im Spendebereich und im Labor, die mir stets hilfsbereit zur Seite standen und immer offen für Fragen waren. Meiner Laborkollegin und Freundin Melinda Vajko
danke ich für die anregenden Gespräche und die gegenseitige Unterstützung.
Allen Blutspendern, die durch ihre Teilnahme diese Studie erst ermöglichten,
danke ich sehr.
Abschließend möchte ich besonders meinen Eltern, meinem Bruder und
meinem Freund Thomas für die stetige herzliche Unterstützung während des
gesamten Studiums und darüber hinaus danken.