Industrie-Applikationen

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BIOSPEKTRUM • 2.00 • 6. JAHRGANG
Ein neuer Ansatz für die
DNA-Sequenzanalytik
Uwe Mohr, Promega GmbH, Mannheim,
쑺 In der Grundlagenforschung, aber auch in der medizinischen
Diagnostik spielt die Analyse von Sequenzvariationen, wie etwa
SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), Insertionen oder Chromosomale Translokationen, eine zunehmend wichtige Rolle. Große Anstrengungen bei der Entschlüsselung der DNA des Menschen
haben das Wissen über Defekte in der DNA und deren ursächlichen Zusammenhang mit Krankheiten stetig wachsen lassen. Aus
diesem Grund werden heute mehr denn je auch Untersuchungen
auf veränderte DNA-Bereiche hin vorgenommen.
In der Nahrungsmittelindustrie spielt die DNA-Untersuchung
von Lebensmitteln seit der Einführung von GMO (Genetic Modified Organism) eine immer wichtigere Rolle. Hier beschränkt sich
die DNA-Untersuchung in erster Linie auf den spezifischen Nachweis und die Quantifizierung genetischer Elemente, die bei transgenen Pflanzen eingesetzt werden.
In beiden Analysenbereichen werden DNA-Proben auf das Vorhandensein spezifischer DNA-Abschnitte überprüft, das heißt, die
Zielsequenz, nach der gesucht wird, ist bekannt. Bisher oft eingesetzte Analysenverfahren stützen sich auf sehr zeitaufwendige, semiquantitative und schlecht automatisierbare Gel-basierende Methoden oder auf Verfahren mit fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden.
Abb. 2: Die Spezifität der Sonde ist für die erhaltenen Ergebnisse entscheidend. Im dargestellten Beispiel links bindet die DNA-Sonde vollständig an
die Ziel-DNA. Dies erlaubt der READase™ Polymerase den biochemischen
Umsetzungsprozeß, an dessen Ende die Freisetzung von Lichtsignalen steht,
zu starten. Im Beispiel rechts kann sich die DNA-Sonde nicht vollständig an
die Ziel-DNA anlagern, da am 3‘ Ende keine vollständige Übereinstimmung
aufgrund einer Punktmutation in der Ziel-DNA vorliegt. Die READase™
Polymerase kann nicht mit der biochemischen Umsetzung beginnen,
letztlich wird kein Lichtsignal freigesetzt.
Die Alternative
Die neue Plattform-Technologie von Promega, READIT™, bietet eine Alternative zu den bereits existierenden Verfahren, da DNAProben schnell und in automatisierbarer Form bearbeitet werden
können, es keiner Gel-basierenden Analyse bedarf und zudem keine teuren Spezialgeräte für die Analyse benötigt werden.
READIT™ (Reversed Enzyme Activity DNA Interrogation
Test) ist ein neues molekularbiologisches Analysenverfahren für die
von der READase™ Kinase benutzt um aus den energiereichen
Phosphatgruppen der dNTPs und ADP energiereiches ATP aufzubauen.
ATP ist ein Molekül, daß in vielen enzymatischen Prozessen als
Energielieferant dient. Bei READIT™ setzt das Enzym Luciferase
ATP um und produziert dabei Licht. Die freigesetzte Lichtmenge
ist proportional zu der von der DNA-Sonde gefundenen Ziel-DNA.
Was sich als komplizierter biochemischer Prozeß darstellt ist eine
robuste enzmyatische Reaktion, die sich innerhalb von 15 Minuten
abspielt (Abb. 1). Nach der biochemischen Umsetzung wird das
Lichtsignal binnen Sekunden in einem Luminometer bestimmt. Da
die verwendeten DNA-Sonden für das Freisetzen von Licht nicht
erst mit einer definierten Lichtquelle angeregt werden müssen, sondern Licht als Folge einer biochemischen Umsetzung freigesetzt
wird, sind für die Bestimmungen keine speziell auf die Sonden abgestimmte Geräte notwendig. Dies erlaubt den Untersuchungslabors ihre Geräteausstattung flexibel zu gestalten. Durch die Verwendung eines Standardluminometers ist das Labor auch nicht auf
spezifische DNA-Sonden angewiesen und kann somit auf zukünftige Projekte mit großer Flexibilität reagieren.
Die DNA Sonde ist der wichtigste Faktor für die Analyse
Abb. 1: Funktionsprinzip von READIT™.
Bei der Analyse laufen zwei biochemische Prozesse ab. In einer ersten
Reaktion setzt die READase™ Polymerase von einem DNA-Doppelstrang
(DNA-Sonde/Ziel-DNA-Hybrid) dNTP frei, die von der READase™ Kinase für
den Aufbau von ATP genutzt wird. In der zweiten Reaktion wird das
gebildete ATP von dem Enzym Luciferase umgesetzt und hierbei ein
Lichtsignal freigesetzt.
Mit dem Design der DNA-Sonde wird festgelegt, ob nur eine
spezifische DNA-Sequenz quantifiziert oder ob eine Punktmutation in einer bereits bekannten Sequenz identifiziert werden soll.
Für den Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz genügt es,
DNA-Sonden zu verwenden, die exakt der gesuchten Ziel-DNA
entsprechen. Die Sonde bildet dann mit der Ziel-DNA einen Doppelstrang und dient somit als Startpunkt für die biochemischen Prozesse (Pyrophosphorolyse und Kinase) an deren Ende die Quantifizierung des Lichtsignals steht (Abb. 2).
Bei der Untersuchung von Punktmutationen werden zwei verschiedene DNA-Sonden verwendet. Eine Sonde paßt genau zur
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Wildtyp-DNA, eine zweite Sonde ist so aufgebaut, daß Sie nur mit
der DNA mit Punktmutation (mutierte DNA) einen Doppelstrang
ausbilden kann. Beide Sonden unterscheiden sich nur in der Basenpaarabfolge am 3'-Ende. Testet man DNA getrennt mit beiden Sonden wird nur bei völliger Übereinstimmung der Sequenz von DNA
und DNA-Sonde ein Lichtsignal freigesetzt. Da das System eine
Quantifizierung des Lichtsignal erlaubt, kann bei vermischten DNAProben, die sowohl Wildtyp- als auch mutierte DNA enthalten, eine
Quantifizierung von Wildtyp- und mutierter DNA vorgenommen
werden. Es sind somit z.B. in populationsbiologischen Untersuchungen Bestimmungen von Allelverteilungen innerhalb einer Population möglich. Einzige Voraussetzung ist die Kenntnis über Sequenzunterschiede der Allele.
Auf dieser Kenntnis aufbauend wurden bei Promega verschiedene Anwendungen der READIT™-Technologie durchgeführt, bei der
sowohl Untersuchungen für die Detektion von GMO als auch SNPAnalysen und Chromosomentranslokationen einbezogen wurden.
Anwendungsbeispiele
Genetisch modifizierte Nahrungsmittel
Für den Nachweis von GMO in Nahrungsmitteln werden z.B. bei
Promega DNA-Sonden eingesetzt, mit denen man die sehr häufig
benutzten genetischen Elemente, den 35S Promotor des BlumenkohlMosaik-Virus und den NOS Terminator des bodenbürtigen Bakteriums Agrobacterium tumefaciens, detektiert. Beide Elemente dienen der
Expression fremder Gene in Pflanzen und können deshalb als Marker für genetisch modifizierte Pflanzen verwendet werden. Nahrungsmittel, die aus genetisch veränderten Pflanzen hergestellt wurden, tragen diese genetischen Marker und können so mittels DNA-Analyse
detektiert werden. Bei der Untersuchung mittels READIT™ konnten sowohl in Soja- als auch Maisproben einwandfrei GMO-haltige
Proben von GMO-freien unterschieden werden (Abb. 3).
SNP-Analysen in einem Reis-Züchtungsprogramm
In einer weiteren Studie wurde READIT™ für die Bestimmung
Abb. 4: SNP Analyse des Reis Stärke Synthase Gens.
In der oberen Abbildung sind die Analysenergebnisse einer konventionellen
Methode und mit READIT™ gegenübergestellt. Bei der konventionellen
Methode wird DNA zuerst mit dem Restriktionsenzym AccI verdaut und dann
gelelektrophoretisch aufgetrennt (helle Banden auf dunklem Grund). Bei
READIT™ wird je eine spezifische Probe für die Bestimmung von Wildtyp und
Mutante eingesetzt (Balkendiagramm).
Der Korrelationskoeffizient von 0,99 zeigt eine hervorragende Übereinstimmung beider Analysen.
Die untere Abbildung zeigt die Möglichkeit der Qualitätsprüfung der
erhaltenen READIT™-Daten für die Allelbestimmung. Die geringe Streuung
der Einzelwerte und die großen Unterschiede der Allele bei den erhaltenen
Meßwerten machen eine eindeutige Zuordnung sehr einfach.
Abb. 3: GMO Analyse.
Die Detektion der genetischen Elemente 35S und NOS wurden für den
Nachweis von GMO Kontamination in Lebensmitteln verwendet. Es wurden
bei den untersuchten Mais und Sojaproben sowohl Einzelbestimmungen als
auch eine Duplexbestimmung beider genetischen Elemente vorgenommen.
Bei starken Lichtsignalen ist der Nachweis der genetischen Elemente
erfolgt, so daß, wie in der Graphik sichtbar, eine einwandfreie Zuordnung
der Proben in GMO-kontaminiert oder GMO-frei möglich ist.
von Punktmutationen im agronomisch wichtigen Stärke-Synthase
Gen im US-Züchtungsprogramm für Mais verwendet. Da der Stärkegehalt für die Verarbeitungsqualität des Reises eine überragende Rolle spielt, sind viele Züchtungsprogramme auf die Detektion
von Variationen in diesem Gen abgestimmt. Traditionell wurde das
Auftreten einer wichtigen Punktmutation im Stärke-Synthase Gen
mittels eines AccI-Restriktionsenzymverdaus und der anschließenden gelelektrophoretischen Analyse der verdauten DNA durchgeführt. Beim Vorhandensein des „G“-Allels (einer spezifischen Variation des Gens) treten nach Enzymverdau zwei gleich große Banden beim „T“-Allel hingegen nur eine Bande im Agarosegel auf.
Die Methode ist zeitaufwendig und semiquantitativ. Das
READIT™ System verwendet zwei allelspezifische Interrrogati-
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Abb. 5: Medizinische Diagnostik mit READIT™
Bei der Untersuchung von Chromosomentranslokationen konnten mittels
READIT™ noch 10 Zellen mit einer Translokation aus einer Population von
100.000 Zellen ohne Translokation bestimmt werden. In der linken Abbildung ist die konventionelle Analyse mittels gelelektrophoretischer
Auftrennung der DNA und eine parallel durchgeführte radioaktive Detektion
durchgeführt worden. Rechts abgebildet die bei der READIT™ Analyse
erhalten quantitativen Werte der Lichtsignale beim Einsatz einer translokationsspezifischen Sonde.
onsproben (T‚, G‚) für die Bestimmung der beiden möglichen Variationen (Allele). So kann das Vorhandensein des Allels durch die
Quantifizierung des Lichtsignals bestimmt werden. Die ermittelten Rohdaten wurden in eine Analysensoftware eingespielt und die
graphische Ausarbeitung der analysierten Daten zeigt die eindeutige Zuweisung der Proben zu dem entsprechenden Allel. Mischexperimente mit Proben, welche beide Allele beinhalten, zeigen die
quantitative Bestimmungsmöglichkeit mit der READIT™ Technologie beim direkten Vergleich mit einer konventionellen Agarosegel-Bestimmung (Abb. 4)
Medizinische Diagnostik
In der medizinischen Diagnostik wurde READIT™ unter anderem
für die Bestimmung von Chromosomentranslokationen entwickelt.
Translokationen im bcr und abl Gen werden z.B. ursächlich mit Leukämie in Verbindung gebracht. Bei dieser Krankheit werden drei
Translokationen als besonders wichtig erachtet. Sie werden als P1,
P2 und P3 bezeichnet. In einem ersten Schritt werden mittels einer
Reversen Transkriptions-Reaktion die gesuchten DNA-Abschnitte
amplifiziert und mit translokationsspezifischen Sonden werden positive Proben für P1 oder P2/P3 gesucht. In einem zweiten Schritt
werden die Translokationen in P1, P2 und P3 bestimmt. Mischexperimente haben gezeigt, daß mit der READIT™ Technologie bereits 10 Zellen mit einer solchen Translokation in einer Population
von 100000 gesunden Zellen nachgewiesen werden können (siehe
Abbildung 5a, b).
Fazit
Mit der READIT™ Technologie wurde eine neue Plattform
geschaffen, die Forschern ein breites universell einsetzbares Mittel
für die Untersuchung von DNA-Sequenzanalysen bereitstellt. Der
Einsatz einer robusten Chemie und das Verwenden einfacher DNASonden ohne spezifische Markierungen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe) ermöglicht eine breite und flexible Anwendung. Da keine spezifischen teuren Analysengeräte notwendig sind, ist der Einstieg in
diesen Bereich auch für kleinere Institute möglich. Der Grad der
Automatisierung kann dem Probendurchsatz angepaßt werden, so
daß Formate von Einzeluntersuchungen bis hin zu Multiwellplatten (96 oder 384 well Format) möglich sind. Dies erlaubt die
READIT™ Technologie auch in Hochdurchsatzscreenings einzubauen. Die automatisierte Datenanalyse ergänzt und rundet das ganze Konzept zusätzlich ab.
Weitere Informationen zu READIT™ finden sie auf der Internetseite www. promega.com/readit
Korrespondenzadresse
Dr. Uwe Mohr
Promega GmbH
Schildkrötstraße 15
D-68199 Mannheim
Tel. 0621-8501-100,
Fax. 0621-8501-222,
eMail: [email protected]
Internet: www.promega.com