Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik
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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Innere Medizin III Kardiologie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. St. Baldus Die Bedeutung des mitochondrialen Proteins UCP2 in der Ausbildung eines Myokardinfarktes im Mausmodell Inaugural- Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Maria Siepen aus Simmerath promoviert am 15. Juli 2015 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln im Jahre 2015. Druck und Bindung Alpha Copy Meckenheimer Allee 178, 53115 Bonn Tel.:0228/694252, Fax: 0228/7669454 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. U. C. Hoppe 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. R. J. Wiesner Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Frau Universitätsprofessor Dr. med. U. C. Hoppe Dr. rer. med. Martin Wolny Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 13.02.2015 Maria Siepen Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau Universitätsprofessor Dr. med. U. C. Hoppe und Herrn Dr. rer. med. M. Wolny von mir selbst ausgeführt worden. Lediglich bei der ROS-Messung und der TTC-Färbung danke ich Dr. rer. med. M. Wolny für die Überlassung der Daten. Danksagung Frau Universitätsprofessor Dr. med. U. C. Hoppe danke ich sehr für die Überlassung des Themas, für das mir entgegengebrachte Vertrauen sowie für die wertvolle Anleitung, Beratung und Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit. Herrn Universitätsprofessor Dr. med. St. Baldus danke ich für die Möglichkeit, die Dissertation in der Klinik und Poliklinik für Innere Medizin III Kardiologie der Universität zu Köln erstellen zu können. Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Herrn Dr. rer.med. M. Wolny für seine Einarbeitung in diverse Methoden sowie die Bereitschaft, mir immer zu helfen, wenn ich nicht mehr weiter wusste. Diese Arbeit ist meinen Eltern, Geschwistern und meinem Verlobten gewidmet, die mich auf meinem Weg stets mit Ihrer Liebe, Ihrer Fürsorge, Ihrem Zuspruch und Ihrem Verständnis begleitet haben. Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Kardiovaskuläre Erkrankungen Seite 19-20 1.2. Struktur und Funktion von Mitochondrien Seite 21-22 1.3. Uncoupling Proteine Seite 22 1.4. Mögliche Struktur des UCP2 Seite 23-24 1.5. Funktion des UCP2 im Rahmen der ROS Regulation Seite 24-25 1.6. Die Bedeutung der Kalziumhomöostase Seite 25-27 1.7. Histomorphologische Veränderungen ischämischer Areale Seite 27-28 2. Zielsetzung Seite 29 3. Material und Methoden 3.1. Mausstämme Seite 30 3.2. Genotypisierung Seite 30 3.2.1. DNA- Aufbereitung Seite 30-31 3.2.2. Polymerase- Kettenreaktion (PCR) Seite 31 3.2.3. PCR- Ansatz Seite 31-32 3.2.4. Gelelektrophorese Seite 33 3.3. Kardiale Maus Operation Seite 33-36 3.3.1. Präparategewinnung für die Histologie und Immunhistochemie Seite 36-37 3.3.2. Entwässerung der Mäuseherzen und Einbettung in Paraffin Seite 37 3.4. Erstellung der histologischen Schnitte Seite 37-38 Inhaltsverzeichnis 3.4.1. Hämatoxylin- Eosin Färbung Seite 38-39 3.4.2. Masson- Goldner Färbung Seite 39-41 3.4.3. Immunhistochemische Färbung Seite 41-43 3.4.4. TTC- Färbung Seite 43-45 3.4.5. Messung des H₂O₂- Gehaltes in den Mitochondrien Seite 45-47 3.4.6. Auswertung der Immunhistochemie und Histologie Seite 47 3.4.7. Digitalisierung der Präparate Seite 47 3.4.8. Statistische Auswertung Seite 48 3.5. Material Seite 48 3.5.1. Arbeitsgeräte Seite 48-50 3.5.2. Computer Software Seite 50 3.5.3. Verbrauchsmaterialien Seite 50-51 3.5.4. Chemikalien/ Reagenzien Seite 51-53 3.5.5. Antikörper Seite 53 3.5.6. Lösungen Seite 53-56 4. Ergebnisse 4.1. Allgemeines Seite 57 4.2. Kaplan- Meier- Überlebenskurve Seite 57-58 4.3. Deskriptive Histologie und histomorphometrische Analyse Seite 59 4.3.1. Deskriptive Histologie Hämatoxylin- Eosin Färbung Seite 59-63 4.3.2. Histomorphometrische Analyse der Hämatoxylin- Eosin Färbung Seite 64-65 4.3.3. Deskriptive Histologie der Masson- Goldner Färbung Seite 65-69 Inhaltsverzeichnis 4.3.4. Histomorphometrische Analyse der Masson- Goldner Färbung Seite 70-72 4.3.5. Deskriptive Histologie der immunhistochemischen Färbung Seite 73-77 4.3.6. Histomorphometrische Analyse der IHC- Färbung Seite 78-79 4.3.7. Deskriptive Analyse der TCC- Färbung Seite 79-80 4.3.8. Histomorphometrische Analyse der TTC- Färbung Seite 80-82 4.3.9. Mitochondriale ROS- Produktion Seite 82-84 5. Diskussion Seite 85-90 6. Zusammenfassung Seite 91-92 7. Literaturverzeichnis Seite 93-100 8. Lebenslauf Seite 101-102 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AAR Area-at- risk Abb. Abbildung ADP Adenosindiphosphat Aqua dest Destilliertes Wasser ATP Adenosin-5`-Triphosphat ATPasen Adenosintriphosphatasen BMPC brain mitochondrial carrier protein bp Basenpaare BPM beats per minute °C Grad Celsius CaCl2 Calciumchlorid cm Zentimeter DAB Diaminobenzidin DANAMI Danish trial in acute myocardial infarction DNS Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. und andere FZ Fibrozyt G Gauge Abkürzungsverzeichnis g Gramm HCl Salzsäure HDL-Cholesterin High-Density-Lipoprotein-Cholesterin HE-Fbg. Hämatoxylin- Eosin Färbung HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl-)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure H2O2 Wasserstoffperoxid ICR Interkostalraum IHC-Fbg. Immunhistochemische Färbung KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton kg Kilogramm KHK Koronare Herzkrankheit KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat KO Knockout LAD left anterior descending LDL-Cholesterin Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin Lsg. Lösung LV linker Ventrikel M. Musculus mCa mitochondrialer Kalziumionenkanal mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid Abkürzungsverzeichnis MG-Fbg. Masson-Goldner Färbung ml Milliliter mm Millimeter mNCx mitochondrialer Natrium- Kalzium Austauscher mPTP mitochondriale Permiabilitätstransitionspore mRNA messenger Ribonukleinsäure mRyR mitochondrialerRyanodin Rezeptor MZ Monozyt NAAR non-area-at -risk NaCl Natriumchlorid NADH Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxid nm Nanometer O2 Sauerstoff OP Operation PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Kettenreaktion PKC Proteinkinase C PMA Phorbol 12-myrstate 13-acetate PTCA Perkutane transluminale Koronarangioplastie PVG pathologisch verändertes Gewebe Abkürzungsverzeichnis REDOX Reduktions-Oxidations Reaktion ROS reaktive oxygen species RV rechter Ventrikel sog. sogenannte tAAR total Area-at-risk TE- Puffer Tris- EDTA Puffer TTC Triphenyl- Tetrazolium- Chlorid UCP Uncoupling Protein U/ml Units per milliliter UPM Umdrehungen pro Minute UV- Licht Ultraviolettes Licht µl Mikroliter (1x10-6Liter) µm Mikrometer V Volt VDAC voltage dependent anion channel VKM vitaler Kardiomyozyt vs versus Vt Ventilation WT Wildtyp ZKV Zellkernverlust Einleitung 1. Einleitung 1.1. Kardiovaskuläre Erkrankungen Laut Statistischem Bundesamt starben in Deutschland im Jahr 2012 knapp eine Millionen Menschen. Sowohl bei Männern, als auch bei Frauen handelte es sich bei der häufigsten Todesursache um eine Erkrankung des Kreislaufsystems. Fast jeder zweite Verstorbene erlag einer derartigen Erkrankung. 92% derer, die an einer Kreislauferkrankung verstarben, waren älter als 65 Jahre. „Die wichtigste spezifische Todesursachengruppe war dabei die der ischämischen Herzkrankheiten (128171 Sterbefälle), darunter insbesondere der akute sowie der rezidivierende Myokardinfarkt mit insgesamt 55425 Gestorbenen.“ (73). An einer chronisch ischämischen Herzkrankheit verstarben 71655 Menschen. An einer Herzinsuffizienz verstarben insgesamt 46410 Menschen (73). Eine chronische ischämische Herzkrankheit entwickelt sich unter anderem durch die Manifestation einer Arteriosklerose in den Herzkranzarterien. Sie gilt in Industrieländern mit hohem Lebensstandard als häufigste Ursache eines vorzeitigen Todes. Als Risikofaktoren für die Entwicklung einer Arteriosklerose wurden vor allem Diabetes mellitus, Nikotinabusus, LDL-Cholesterin-Erhöhung, HDL-Cholesterin-Erniedrigung, arterielle Hypertonie, KHK/ Herzinfarkte bei erstgradigen Familienangehörigen, Lebensalter, Adipositas und körperliche Inaktivität beschrieben (40;49; 63;71;81). Außerdem konnten genetische Faktoren wie zum Beispiel eine familiäre Hypercholesterinämie, aber auch Einflüsse des Immunsystems als Risikofaktoren in der Pathogenese der chronisch ischämischen Herzkrankheit ausgemacht werden (81; 82). Problematisch wird die Arteriosklerose dann, wenn sie das Gefäßlumen drastisch verkleinert, oder sogar zu einem vollständigen Verschluss führt, sodass es im Versorgungsgebiet der entsprechenden Arterie zu einem verminderten Blutstrom kommt. Die Ischämie hat einerseits zur Folge, dass das Myokard nicht ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden kann. Andererseits können schädliche Metabolite des Stoffwechsels nicht adäquat abtransportiert werden (80). Kann die Ischämie nicht behoben werden, ist die Folge eine irreversible Schädigung des Myokards. Diese wird unter anderem durch Prozesse verursacht, die sich in den Mitochondrien der Zelle abspielen (34). Es gibt Mechanismen, die versuchen die Schädigung des Myokards möglichst gering zu halten, indem sie den schädigenden Prozessen entgegenwirken. 19 Einleitung Ein wichtiger Vertreter hierfür ist zum Beispiel das in der inneren Mitochondrienmembran lokalisierte Uncoupling Protein 2 (76). Im schlimmsten Falle kommt es im Rahmen einer Ischämie des Herzens zum Tod des Individuums zum Beispiel durch Kammerflimmern oder Pumpversagen. Bleiben letale Frühkomplikationen aus, können sich Spätkomplikationen (>48h) ausbilden, wie zum Beispiel ein Herzwandaneurysma, eine arterielle Embolie, eine Arrhythmie oder eine Herzinsuffizienz (49; 51; 55; 74). Um die Folgeschäden eines Infarktes so gering wie möglich zu halten, ist es absolut notwendig die Perfusion des Herzens so schnell wie möglich wiederherzustellen. Methode der Wahl zur Reperfusion ist, laut Leitlinie der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie, eine perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA) mit oder ohne Stentimplantation (15). Sollte diese kontrainduziert oder nicht verfügbar sein, so ist die konservative Therapie mit Aktivatoren der Fibrinolyse nächste Therapieoption (27). Im Rahmen der DANAMI-2-Studie wurde belegt, dass die PTCA mit Stenteinlage der Fibrinolyse innerhalb der ersten 30 Tage nach einem Infarkt, bei kombiniertem Endpunkt aus Tod und Reinfarkt, signifikant überlegen ist (21). Auch andere Studien kommen zu dem gleichen Ergebnis (44). Aber auch im Rahmen der Reperfusion kommt es zu einer Schädigung des Myokards. Die pathophysiologischen Mechanismen, die dafür verantwortlich sind, sind noch nicht vollständig geklärt. Bisher wird hierbei immunmodulatorischen Vorgängen eine bedeutende Rolle zugewiesen (28;32). Da Prozesse innerhalb der Mitochondrien im Rahmen von ischämischen Ereignissen einerseits besonders dazu beitragen, schädliche Metabolite zu produzieren, und andererseits einen Anteil daran leisten Mechanismen zu unterhalten, welche die Schäden durch die Ischämie zu begrenzen versuchen, ist es erforderlich, sich im Rahmen dieser Arbeit mit den Mitochondrien als Zellorganell und den auseinanderzusetzten. 20 dort ablaufenden Stoffwechselprozessen Einleitung 1.2. Struktur und Funktion von Mitochondrien Laut der Endosymbiontentheorie handelt es sich bei den Mitochondrien um Mikroorganismen, die wahrscheinlich aus aerob lebenden Bakterien hervorgegangen sind und im Laufe der Evolution von anaeroben Wirtszellen aufgenommen wurden und mit diesen nun in Symbiose leben (45). Zu dieser Theorie kam es aufgrund von vier strukturellen Besonderheiten der Mitochondrien: 1. Mitochondrien sind die einzigen Zellorganellen, die mit einer eigenen, zirkulären DNA ausgestattet sind (45). 2. Mitochondrien sind zu einer von der Zelle unabhängigen Vermehrung befähigt, da sie sich durch Querteilung vervielfachen können (45). 3. Die Ribosomen des Menschen besitzen eine 60S- und eine 40S- Untereinheit. Mitochondrien verfügen über eigene Ribosomen. Sie bestehen jeweils aus einer 70S- und 30S- Untereinheit. Dies ist typisch für Prokaryonten (45). 4. Mitochondrien besitzen eine äußere und eine innere Membran. Besonders ist, dass der Aufbau dieser Membranen nicht einheitlich ist. Sie unterscheiden sich deutlich (45). Die Mitochondrien befinden sich im Zytosol der Zelle und sie werden gerne als das „Kraftwerk der Zelle“ bezeichnet (45). Sie bestehen aus vier Kompartimenten: der äußeren, glatten Mitochondrienmembran, dem Intermembranraum, der inneren, gefalteten Mitochondrienmembran und der mitochondrialen Matrix (45). Die äußere Mitochondrienmembran ist mit Poren durchsetzt und somit für die meisten Stoffe durchlässig. Die innere Mitochondrienmembran hingegen ist die ursprüngliche Bakterienmembran. Sie ist nahezu undurchlässig. Es gibt jedoch einige Transportsysteme, die für einen kontrollierten Stoffaustausch sorgen. Durch die gefaltete Struktur der inneren Membran kommt es zu einer beträchtlichen Oberflächenvergrößerung, sodass zahlreiche Vorgänge parallel ablaufen können. Die Einfaltungen werden als sogenannte CristaeMembranen bezeichnet. Ohne die innere Mitochondrienmembran könnte kein Membranpotential erzeugt werden. Dies ist allerdings unbedingt erforderlich um die oxidative Phosphorylierung zu ermöglichen. Diese wiederum ist unabdingbar für die Atmungskette, 21 Einleitung welche exklusiv in der inneren Mitochondrienmembran abläuft und von hoher Bedeutung für die ATP-Gewinnung des Körpers ist (45). Die Funktion der Mitochondrien kann unter anderem durch sogenannte Uncoupling Proteine (UCPs) beeinflusst werden, welche ebenfalls in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert sind. Sie sind möglicherweise ein potenzielles Ziel für eine therapeutische Behandlung des Myokardinfarktes. 1.3. Uncoupling Proteine Generell werden sogenannte Uncoupling Proteine (UCPs) zur Familie der Anionen- Transportproteine gezählt. Sie sind, wie oben bereits erwähnt, in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert. Mittlerweile sind fünf Homologe in Säugetieren bekannt. Sie werden als UCP1- UCP5 bezeichnet (52). UCP5 taucht in der Literatur auch unter der Bezeichnung „brain mitochondrial carrier protein-1“ (BMPC-1) auf (4). Bereits im Jahr 1976 wurde das erste UCP in braunem Fettgewebe entdeckt. Es wurde seinerzeit als UCP1 bezeichnet. Dieses Uncoupling Protein ist exklusiv in braunem Fettgewebe anzutreffen und ist dort ein wichtiger Regulator der Thermogenese. Erst zwanzig Jahre später, nämlich 1997, wurden weitere Uncoupling Proteine entdeckt, UCP2 und UCP3(16; 26). UCP2 entspricht in seiner Sequenz zu 59% der des UCP1. UCP3 entspricht in seiner Sequenz zu 57% der des UCP1 (31). UCP2 entspricht der Struktur des UCP3 zu 71% (31). Sie kommen nicht wie UCP1 in braunem Fettgewebe vor. UCP2 und UCP3 mRNA konnte in etlichen Organen nachgewiesen werden wie zum Beispiel in Leber, Lunge, Milz, Gehirn, Herz, Niere, Pankreas und Immunzellen (26; 76). Gesicherte Funktionen von UCP2 sind die Regulation des REDOX Status, die Regulation des Fettsäure- und Glukosemetabolismus, sowie die Kontrolle von reaktiven Sauerstoffradikalen, welche in den Mitochondrien der Zelle gebildet werden. Bei diesen Radikalen handelt es sich in erster Linie um reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species = ROS) (1). Ob UCP2 ebenfalls wie UCP1 Einfluss auf die Thermogenese nimmt ist bis heute fraglich (4). UCP3 weist die gleichen Funktionsbereiche wie UCP2 auf. Allerdings zeigt dieses Protein seine stärkste Präsenz in der Skelettmuskulatur. In dieser wurde bis heute kein UCP2 nachgewiesen (4). 22 Einleitung 1.4. Mögliche Struktur des UCP2 Bis heute ist nicht im Detail geklärt, wie genau das UCP2 in seiner Struktur aufgebaut ist. Bei diesem Transporter handelt es sich vermutlich um ein Homodimer, bestehend aus 309 Aminosäuren (54), welches sich in einer Größenordnung von 31-34 kDa bewegt. Die Gene für UCP2 und UCP3 liegen benachbart auf Chromosom 11 des Menschen (71). Es gibt Grund zu der Annahme, dass das UCP2 in seinem Aufbau dem ADP/ATP Transporter entspricht, da es ebenfalls zur Familie der mitochondrialen Anionentransporter zählt (52). Intermembranraum Innere Mitochondrienmembran Mitochondrienmatrix Abb.1: Schematische Darstellung der charakteristischen Strukturelemente eines Uncoupling Proteins (52). Im Rahmen biochemischer Studien konnten einige charakteristische Strukturmerkmale der UCPs identifiziert werden. UCPs besitzen eine dimere Struktur, die aus zwei identischen Strukturelementen bestehen. Jede Untereinheit besteht aus sechs hydrophilen Helices. Diese sechs Helices überspannen Mitochondrienmembran. die Phospholipid- C- und N-Termini Doppelschicht ragen dabei jeweils der inneren immer in den Intermembranraum hinein. Innerhalb jeder Untereinheit gibt es eine lange hydrophile Schleife, die in Richtung der Matrixseite der Membran orientiert ist. Diese hydrophile Schleife verbindet jeweils zwei der befestigten Helices miteinander. Es wird vermutet, dass ein Bündel aus mehreren α- Helices einen hydrophilen Kanal im Kern des Uncoupling Proteins bilden, und dass der Zugang zu diesem Kanal kontrolliert wird. Vermutlich gibt es 23 Einleitung einen Mechanismus, der den besagten Kanal öffnen und schießen kann. Die dafür notwendige bewegliche Struktur wird vermutlich aus den sogenannten Schleifen gebildet (3; 52). 1.5. Funktion des UCP2 im Rahmen der ROS-Regulation UCP2 ist an der Kontrolle des zellulären Energiestoffwechsels beteiligt (48). Im Rahmen der Abläufe in der Elektronentransportkette, die der ATPase zur ATP Synthese vorausgeschaltet ist, werden in erster Linie freie Sauerstoffradikale (reactive oxygen species = ROS) generiert, die eine zytotoxische Wirkung zeigen (1). Die Hauptaufgabe von UCP2 besteht in dem Transport von Protonen aus dem Intermembranraum über die innere Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix (54). Auf diese Weise wird die Oxidation von der Phosphorylierung entkoppelt. Dies bedeutet, dass UCP2 die Protonen, welche mittels der Atmungskette in den Intermembranraum transportiert wurden, wieder zurück in das Mitochondrium schafft. Dadurch kommt es zu einer Herunterregulierung des Protonengradienten, welcher die treibende Kraft für die ATPase ist, sowie zu einer Abnahme des inneren Mitochondrienmembranpotentials. Da nun der Antrieb für die Abläufe der ATPProduktion geringer ist, kommt es zur Abnahme des zellulären ATP-Gehalts und ebenfalls zur Reduktion der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den vorgeschalteten Bereichen der Atmungskette (25; 31; 48; 66). Ein Funktionsverlust von UCP2 führt somit zu einer Zunahme der ROS-Produktion (5). Eine Exprimierung von UCP2 vermittelt hingegen zytoprotektive Effekte, indem es oxidative Schäden limitiert (76). Eben dies konnte in Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Kardiomyozyten mit UCP2 Exprimierung zeigten eine deutlich niedrigere ROS-Produktion als Kardiomyozyten ohne UCP2 (76). Auch in Versuchsmodellen mit Schlaganfall und Hirntrauma konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung von UCP2 die Neuronen vor dem Zelltod schützt, indem UCP2 die ROS-Bildung senkt (53). Laut einiger Quellen kommt es allerdings wegen der verminderten ATP-Bildung zu einer myokardialen Energieineffizienz (48). Andere Quellen hingegen beschreiben, dass es unter der Aktivierung von UCP2 zu einer Zunahme der Mitochondrienzahl kommt, die wiederum zu einem generellen Anstieg in der ATP-Produktion führt (25). Doch nicht nur der Einfluss auf die ATP- und ROS-Produktion innerhalb der Mitochondrien ist für die positiven Effekte des UCP2 verantwortlich. Auch die Einflussnahme auf die Kalziumhomöostase scheint eine nicht unerheblich Rolle bezüglich der 24 Einleitung zytoprotektiven Effekte des UCP2 zu spielen. Wie dieser Mechanismus funktioniert wird zu einem späteren Zeitpunkt detaillierter erläutert. Abb.2:Schematische Darstellung der oben beschriebenenAbläufe in der Atmungskette sowie die Funktion des UCP2 (42). 1.6. Die Bedeutung der Kalziumhomöostase Unter physiologischen Bedingungen gelangen Kalziumionen mittels eines unspezifischen Ionenkanals aus dem Zytosol über die äußere Mitochondrienmembran in den Intermembranraum. Bei diesem unspezifischen Ionenkanal handelt es sich um den sogenannten voltage dependent anion channel (VDAC) (58). Anschließend erfolgt der Transport der Kalziumionen über die innere Mitochondrienmembran, in das Innere des Mitochondriums, hauptsächlich über den mitochondrialen Kalziumionenkanal (mCa), sowie über den mitochondrialen Ryanodin-Rezeptor (mRyR) und den schnellen KalziumAufnahmemodus, welcher als „rapid mode“ bezeichnet wird (58;59). Zusätzlich zu diesen Aufnahmemechanismen scheint sich das UCP2 an der Kalziumaufnahme in das Mitochondrium zu beteiligen (78). 25 Einleitung Der Auswärtstransport von Kalzium aus dem Mitochondrium heraus wird über den mitochondrialen Natrium-Kalzium-Austauscher (mNCx) geregelt, sowie sekundär über die natriumunabhängige mitochondriale Permeabilitätstransitionspore (mPTP) (58). Auch hier scheint das UCP2 Einfluss auf den Kalziumhaushalt zu nehmen, indem es sich ebenfalls an dem Auswärtstransport des Kalziums beteiligt (78). In Folge einer Ischämie kommt es zu Fehlregulationen der Kalziumhomöostase im Kardiomyozyten, bedingt durch einen funktionellen Membranschaden. Dadurch bedingt erhöht sich der Kalziumgehalt im Zytosol der Zelle, da unter anderem der mitochondriale Kalziumkanal in seiner Funktion beeinträchtigt ist. Der Kardiomyozyt reagiert darauf mit einer Kontraktion. Es handelt sich hier um eine Dauerkontraktion die zu einem sehr hohen Energieverbrauch der Zelle führt. Sind die Energiereserven der Zelle aufgebraucht stirbt die Zelle an der eigenen Kontraktion (8; 67). Allerdings gibt es Mechanismen, die dieser Entwicklung entgegenwirken. Um große zytosolische Kalziumspitzen zu vermeiden, können die Mitochondrien als KalziumpufferOrganellen fungieren, indem Kalzium aus dem Zytosol in das Mitochondrium aufgenommen wird (83). Die hierfür zur Verfügung stehenden Mechanismen wurden bereits beschrieben. Neben diesen Mechanismen scheint sich das UCP2 an der Aufrechterhaltung der Kalziumhomöostase in der Zelle zu beteiligen (52).Außerdem führt eine Überexprimierung an UCP2 an isolierten Mitochondrien dazu, dass das Mitochondrium eine gesteigerte Kapazität der mitochondrialen Kalziumaufnahme zeigt (78). Allerdings ist weiterhin die Rolle des UCP2 in der Kalziumaufnahme umstritten (44). Diese Uneinigkeit ist wahrscheinlich methodisch bedingt, da sowohl in vivo als auch in vitro Versuche durchgeführt wurden und diese zu andersartigen Ergebnissen führen. Die Aufnahme von Kalzium in das Mitochondrium ist allerdings nicht unbegrenzt möglich. „Durch einen exzessiven Anstieg der mitochondrialen Kalziumkonzentration kann ein Loslösen des Cytochrom C vom Intermembranraum induziert und schließlich über Aktivierung von Caspase-Proteasen die Apoptose eingeleitet werden“ (58). Wie oben beschrieben wird durch die gesteigerte Kalziumspeicherkapazität, vermittelt durch das UCP2, dieser Prozess verzögert. Kann die Kalziumaufnahme in das Mitochondrium nicht an einem gewissen Punkt beendet werden, muss Kalzium wieder aus dem Mitochondrium heraus geschafft werden. Der Auswärtstransport von Kalziumionen aus dem Mitochondrium 26 Einleitung erfolgt größtenteils über mitochondriale Natrium-Kalzium-Austauscher und sekundär über die mitochondriale Permeabilitätstransitionspore (mPTP) (58). Letztere öffnet sich, wenn es zu einer Kalzium induzierten Veränderung des Membranpotentials kommt (47). Die Öffnung der mPTP führt zur Einleitung der Apoptose, denn sie ermöglicht die Freisetzung von Proteinen, wie zum Beispiel von Cytochrom C, aus dem Mitochondrium. Diese aktivieren ihrerseits wiederum den Tod der Zelle durch die Einleitung der Apoptose (54). UCP2 kann diesem Geschehen entgegensteuern, indem eine Abnahme des Membranpotentials der inneren Mitochondrienmembran durch den Auswärtstransport von Kalziumionen aus der Mitochondrienmatrix heraus induziert wird. Das herabgesetzte Potential führt dazu, dass die Überladung des Mitochondriums mit Kalzium limitiert wird, was wiederum die Öffnungswahrscheinlichkeit für die mPTP verringert (46). Weitere Studien beschäftigten sich mit der Fragestellung, ob das UCP2 auch durch andere Mechanismen zu kardioprotektiven Effekten führt. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass UCP2 im Rahmen ROS-vermittelter Arteriosklerose kardioprotektiv wirkt (26). Außerdem wird diskutiert, ob die Aktivität von UCP2 einen kontrollierenden Einfluss auf die Level der LDL-Oxidation hat, sodass UCP2 auch über diesen Weg an der Kontrolle der Atherogenese beteiligt ist (61). 1.7. Histomorphologische Veränderungen ischämischer Areale Damit sich Myokard kontrahieren kann, benötigt es reichlich Energie in Form von ATP. Zur Bildung des ATPs innerhalb der Mitochondrien wird als Schlüsselkomponente der aeroben Glykolyse Sauerstoff benötigt. Kommt es nun innerhalb des Myokards zu einer absoluten Ischämie, so findet unter anderem, aufgrund des Sauerstoffmangels, eine geringere Energieproduktion im Myokard statt. Anstelle von aerober Glykolyse erzeugt die Zelle nun mittels der anaeroben Glykolyse Energie, wodurch der Adenosin-5`-Triphosphat (ATP)Gehalt der Zelle sinkt (67). Ist ausreichend Sauerstoff im Herzgewebe vorhanden, so ist es möglich, Glukose unter dem Einfluss von Sauerstoff in Energie umzuwandeln. Bilanziert man jegliche Abbauprodukte, die im Rahmen dieser Prozesse entstehen, die unter anderem auch in der Atmungskette der inneren Mitochondrienmembran ablaufen, so ist die Zelle in der Lage im Rahmen der aeroben Prozesse 32 ATPs zu erzeugen. Der anaerobe Abbau liefert im Vergleich nur zwei ATPs. ATP ist allerdings für die Kontraktion des Herzens unabdingbar. 27 Einleitung Bereits innerhalb einer Minute, bei vorliegender Ischämie, sinkt der ATP- Gehalt des Kardiomyozyten so stark ab, dass die Kontraktilität der Zelle verloren geht. Sinkt der ATPGehalt in der Zelle auf nur noch 10% der Norm, was nach etwa 40 Minuten Ischämiezeit der Fall ist, so stirbt die Zelle ab. Daher beträgt auch die Wiederbelebungszeit des Myokards etwa 40 Minuten (8). In der Regel stirbt dennoch bei jeder Ischämiephase immer etwas Gewebe ab. Gewebe, das nicht mehr vor dem Zelltod gerettet werden kann wird nach einiger Zeit vollständig in Nekrosegewebe umgebaut, das nicht zur Kontraktion befähigt ist (8). Eine Altersbestimmung eines Infarktes auf makroskopischer Ebene beim Menschen ist erst nach etwa 8 – 15 Stunden möglich. Erst nach dieser Zeit verschwindet der gewohnte Rot-Ton des Myokards. Das Myokard blasst ab und verändert sich sichtbar ödematös. Nach 36 – 48 Stunden bilden sich ein deutlich sichtbarer hämorrhagischer Randsaum aus, sowie eine zentral lehmgelbe Nekrose. Ungefähr eine Woche nach dem Infarktgeschehen kommt es zu einer Schrumpfung der Nekrose, 3 bis 6 Wochen nach dem Infarkt zu einer rotbraunen Verfärbung des Infarktareals durch Granulationsgewebsbildung. Nach 6-8 Wochen zeigt sich schließlich das typische weißlich- sehnig- glänzende Narbengewebe (8; 20; 22; 39; 77). Mikroskopisch können schon viel früher Veränderungen beobachtet werden. Bereits eine Stunde nach dem Infarkt zeigt sich eine Dilatation der Sarkomere in den Kardiomyozyten. Durch das koagulieren der Zellproteine ist etwa 6- 12 Stunden nach dem Ereignis eine erhöhte Eosinophilie der Zelle zu erkennen. Außerdem kommt es etwa 6 Stunden nach dem Infarkt zur Einwanderung von Granulozyten, die ihre maximale Konzentration zwischen dem 3. – 7. Tag erreichen. In diesem Zeitraum ist die Gefahr der Ausbildung einer Herzbeuteltamponade am größten, da die größte Konzentration an lytischen Enzymen der Granulozyten vorliegt, die zu einer Erweichung des Myokards führt. Auch Kernveränderungen der geschädigten Zellen sind bereits nach 6 Stunden sichtbar. Nach 2-3 Tagen kommt es zum vollständigen Kernverlust in der geschädigten Zelle. Nach 3 – 4 Tagen kann eine Gefäßproliferation beobachtet werden, sowie das einwandern von Makrophagen und Fibroblasten ab dem 4. Tag nach Infarkt. Kollagen kann mikroskopisch ab dem 9. – 10. Tag beobachtet werden (8; 39; 77). 28 Zielsetzung 2. Zielsetzung In diversen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass das vorliegen von UCP2 im Rahmen eines Apoplex, eines Hirntraumas oder einer Epilepsie eine protektive Wirkung auf die Neuronen zeigt, sodass geschädigte Hirnareale deutlich reduziert werden (24; 25; 53; 54). Auch im Rahmen von Studien an kultivierten neonatalen Kardiomyozyten wurde belegt, dass eine Expremierung von UCP2 den Zelltod in ischämischen Arealen reduziert, sodass auch hier geringere Schäden verzeichnet werden konnten (76). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu untersuchen, ob UCP2 auch eine kardioprotektive Eigenschaft im Rahmen eines induzierten Herzinfarktes im Mausmodell zeigt. Daher wurden die Infarktgrößen von Wildtyp (WT) Mäusen gegenüber von UCP2 Knockout (KO) Mäusen verglichen. Zu diesem Zweck wurde mittels einer Operation, ein LAD- Infarkt induziert, durch das Abbinden des Gefäßes. Anschließend wurden die Herzen verschiedenen histologischen Färbungen zugeführt, um die Größe des pathologisch veränderten Areals oder des Infarktareals zu analysieren. Desweiteren sollen die möglichen Wirkmechanismen des UCP2 näher untersucht werden. Schwerpunktmäßig wurde hierbei die Beeinflussung der ROS Synthese durch das UCP2 behandelt. 29 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1. Mausstämme Alle Versuchstiere wurden von „The Jackson Laboratory“ bezogen. Die Bezeichnung des WT lautet: C57Bl/6J, die der KO Maus: B6.129S4-Ucp(tm1Lowl)/J. In den Versuchsreihen wurden ausschließlich männliche Versuchstiere, im Alter von acht Wochen, verwendet. Bei den KO Mäusen handelt es sich um homozygote Tiere, die in Herz, Niere, Milz, weißem Fettgewebe sowie den Inselzellen des Pankreas nicht die volle Länge der mRNA für UCP2 exprimieren. Der Knock-Out wurde mittels eines Vektors kreiert, der die Exons drei bis sieben im endogenen Gen, durch eine PGK-Neo „expressing cassette“, ersetzt. Dieses Konstrukt wurde anschließend in embryonale Stammzellen von 129S4/Sv Jae- derived J1 elektroporiert. Korrekt veränderte embryonale Stammzellen wurden in C57Bl/6J Blastozyten injiziert und chimärische C57Bl/6J Mäuse gezüchtet. Die resultierenden heterozygoten Mäuse wurden anschließend mit C57Bl/6J Mäusen über mindestens zehn Generationen rückgekreuzt. 3.2. Genotypisierung 3.2.1. DNA-Aufbereitung Um sicherzustellen, dass während der Versuche nur Mäuse mit dem gewünschten Genotyp zum Einsatz kommen, wurde vorab jedes Tier mittels einer Gewebeprobe genotypisiert. Das Verfahren wurde angelehnt an das Arbeitsprotokoll: „Preparation of genomic DNA from Mouse Tails and other small samples” (70). Als Gewebeprobe dient ein circa 2mm kleines Stück der Schwanzspitze. Diese wurde gemeinsam mit 4ml SNET Lyse-Puffer und 400 µg/ml Proteinase K in einem Falcon Tube über Nacht bei 55°C lysiert. Anschließend wurden im gleichen Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol hinzugefügt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt, gefolgt von einer 5- minütigen Zentrifugation bei 1800 Upm. Der dabei entstandene Überstand wurde, in einem neuen Falcon Tube, mit der gleichen Menge an eiskaltem Isopropanol vermischt. Nach gründlichem Mischen wurde das Tube bei-20°C für 30 Material und Methoden 20 Minuten gelagert, um eine Ausfällung der DNA zu erreichen. Nach einer weiteren Zentrifugation über 25 Minuten bei 3500 Upm wurde der Überstand verworfen und das Pellet zwei Waschschritten mit je 1ml 80%igem Ethanol unterzogen. Nach Lufttrocknung des Pellets wurde es, je nach Größe, mit 150-300 µl TE-Puffer gelöst und bei -20°C aufbewahrt. 3.2.2. Polymerase- Kettenreaktion (PCR) Die PCR ist ein in der Wissenschaft etabliertes Verfahren um einen bestimmten DNAAbschnitt zu amplifizieren. Voraussetzung ist, dass die Nukleotidsequenz am Anfang und am Ende des zu vervielfältigenden DNA- Abschnitts bekannt ist. Diese Oligonukleotide werden als sogenannte Primer bezeichnet. Sie sind kurze, einzelsträngige Oligonukleotidsequenzen, die zu bestimmten Bereichen der DNA – Matrize komplementär sind. Genauere Angaben über die hier verwendeten Primer können im Kapitel 3.5.4. entnommen werden. Damit die Primer an die DNA binden können, müssen die Doppelstränge bei circa 95°C denaturiert werden. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst und die Primer können beim abkühlen an den entsprechenden Stellen der DNA binden. Nun synthetisiert die DNA- Polymerase ein komplementäres DNA-Fragment aus Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) in Richtung 5´ Ende. Um das DNA-Fragment exponentiell zu vervielfältigen muss der Vorgang mehrfach wiederholt werden. Die DNA wird dabei mehrfach bis zur Denaturierung erhitzt und für die Aktivität der DNA Polymerase auf eine niedrigere Reaktionstemperatur herunter gekühlt. Die Zyklen werden solange wiederholt, bis eine ausreichende Menge DNA erzeugt wurde. 3.2.3. PCR- Ansatz Für einen Reaktionszyklus benötigt man folgende Bestandteile und Mengen: DNA 2,00µl 10x AB PCR Puffer II 1,20µl 25mM MgCl2 0,96µl 31 Material und Methoden 2,5mM dNTP 0,96µl 20µM WT-Primer (Forward) 0,60 µl 20µM WT-Primer (Reverse) 0,60 µl 20µM Mutant (Forward) 0,60µl 20µM Mutant (Reverse) 0,60µl 5U/µl Taq DNA Polymerase 0,06µl 5mM DNA Loading Dye 1,66µl Destilliertes H2O 2,76µl Folgendes Programm wurde für die PCR verwendet: Schritt 1 3Minuten bei 94°C Schritt 2 30 Sekunden bei 94°C Schritt 3 1 Minute bei 61°C Schritt 4 1 Minute bei 72°C Schritt 5 2 Minuten bei 72°C Schritt 6 ∞ bei 10°C Die Schritte zwei bis vier werden über 35 Zyklen wiederholt. 32 Material und Methoden 3.2.4. Gelelektrophorese Das Produkt, der oben beschriebenen PCR, wurde zusammen mit 10µl DNA-Marker auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und bei einer Spannung von 150V über 45 Minuten aufgetrennt. Entsprechend der Größe der DNA- Fragmente kam es zu einer Auftrennung des aufgetragenen Gemischs. Dabei wandern kleine DNA- Stücke schneller als große. Laut „The Jackson Laboratory“ sollte unter UV-Licht die Knock-out Bande bei 280 bp und die WildtypBande bei 156 bp auftreten. Bei heterozygoten Mäusen sind beide Banden zu beobachten. 3.3. Kardiale Maus Operation Die Methode wurde modifiziert nach: „Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies“(75). Anästhesie Zur Narkoseeinleitung wurden Ketamin/Xylazin (150mg/kg/10mg/kg) in einer U-40 Insulinspritze mit einer G26 Kanüle, entsprechend des Körpergewichtes der Maus, intraperitoneal appliziert. Diese Dosierung ermöglichte eine Narkosedauer von 40-55 Minuten. Zur Detektierung einer ausreichenden Narkosetiefe wurde der „Zeh-Quetsch-Reflex“ geprüft. Endotracheale Intubation und Ventilation Nach eintreten einer ausreichenden Narkosetiefe erfolgte die Intubation in Rückenlage auf dem bereits auf 37,5 °C vorgewärmten Heizpad. Zur besseren Orientierung während des Intubationsvorgangs wurde der Kehlkopf der Maus von ventral mit einer Lampe bestrahlt. Anschließend wurde mittels Pinzette die Zunge der Maus ergriffen und aus dem Sichtfeld gezogen. Unter Zuhilfenahme eines Spatels konnte, durch das Maul, der Blick auf die Trachea eingestellt werden. Nun folgte das Vorschieben einer Sicherheitsvenenverweilkanüle der Größe 20G x 1 1/4, die als Tubus fungierte. Das Lumen der Verweilkanüle sollte dem Lumen der Trachea in etwa entsprechen, um eine Aspirationsgefahr zu minimieren. Die 33 Material und Methoden Sicherheitsvenenverweilkanüle wurde mittels Dreiwegehahn mit dem Beatmungsgerät verbunden. Die Ventilation erfolgte mit 100%igem O2 über ein Maus-Beatmungsgerät der Serie „687“ ( Harvard Apparatus), das bereits vor der Intubation, dem Mausgewicht entsprechend, eingestellt wurde. Das korrekte Atemzugvolumen, sowie die Atemfrequenz, können den Herstellerangaben entnommen werden. Ventilation Parameters Mammals with < 70g Body Mass Body Mass (g) Vt (ml) Rate (BPM) 15 0.1 159 20 0.12 148 30 0.18 133 40 0.24 123 50 0.30 117 60 0.36 111 70 0.42 107 Abb.3: Tabellarische Auflistung der korrekten Beatmungsparameter. Entnommen aus der Gebrauchs -anweisung „Mouse Ventilator, Model `687`, Harvard Apparatus, S.8. Lagerung und finale OP-Vorbereitungen Für den chirurgischen Eingriff wurde die Maus in Rechtsseitenlage gebracht. Die Rotation wurde durch anbringen von Klebebändern an Pfoten und Schwanz stabilisiert (Abb.: 4). Diese Lagerung hatte eine Erweiterung der Interkostalräume zur Folge, sowie ein Hervortreten der linken Thoraxwand. 34 Material und Methoden Abb. 4: Schema zur optimalen Fixierung der Maus vor Operationsbeginn, sowie Markierung des operativen Zugangs als durchgezogene schwarze Linie (75). Um ein auskühlen der Maus während des operativen Eingriffs zu vermeiden, erfolgte eine rektale Temperaturmessung mittels einer elektrischen Temperatursonde, die über ein Modul mit dem Heizpad verbunden war. Desweiteren wurden die Augen der Maus mit Bepanthen® Augen- und Nasensalbe feuchtgehalten. Zur Überwachung der Vitalparameter wurde zusätzlich ein EKG nach Goldmann angeschlossen. Hierzu wurde jeweils in beide Vorderpfoten und in eine Hinterpfote eine Nadelelektrode unter der Haut positioniert. Für die anschließende Vorbereitung des OP-Feldes erfolgte sowohl eine Rasur als auch eine Desinfektion des Thorax. Operation Auf Höhe des 4. ICR erfolgte, entlang des Rippenverlaufes, zunächst ein etwa 1,5cm großer Hautschnitt. Durch stumpfes Ablösen des Bindegewebes unter der Haut, wurde diese von dem darunterliegenden M. pectoralis major gelöst und nach lateral und medial durch Haken fixiert. Der M. pectoralis major wurde vorsichtig vom M. pectoralis minor gelöst und ebenfalls nach lateral fixiert. Um eine vollständige Sicht auf den 4. ICR zu erhalten wurde zum Schluss der M.pectoralis minor ebenfalls stumpf von den Rippen abpräpariert und nach medial fixiert. Der Intercostalraum wurde mit einer stumpfen Pinzette stumpf und in Längsrichtung eröffnet um einen Zugang zum Pleuraspalt zu schaffen. Um die Lunge vor Beschädigung zu schützen wurde sie mittels Tupfern nach lateral verlagert. Anschließend erfolgte das Durchtrennen der Intercostalmuskulatur mittels Elektrokauter. 35 Material und Methoden Um das Operationsfeld übersichtlicher zu gestalten wurde die 4.Rippe mit einem Haken nach kranial gezogen und die 5.Rippe nach kaudal. Um die LAD besser sehen zu können und ein eventuelles Einbluten in das Perikard zu vermeiden, wurde dieses eröffnet. Zum Abbinden der LAD wurde diese mit einer 8er Nadel und einem nicht resorbierbaren Polyprolenfaden, so nah wie möglich an der Oberfläche, umstochen. Durch knüpfen eines chirurgischen Knotens wurde der Blutfluss durch die LAD unterbunden. Um den operativen Zugang zu verschließen wurden zwei Knoten um die 4. und 5. Rippe gelegt, wobei sich die Rippen einander näherten. Auf diese Weise wurde der Thorax dicht verschlossen. Vor dem Anziehen des zweiten Knotens wurde, zum vermeiden eines Pneumothorax, die Lunge kurz überbläht. Nach Reponierung der Muskulatur wurde die Haut mittels Einzelknopfnähten mit nicht resorbierbaren Polypropylenfäden verschlossen. Sobald die Maus ein ausreichendes Reflexniveau erreicht hatte, konnte zunächst die O2 Zufuhr verringert werden und anschließend die Extubation erfolgen. Vor Abklingen der Betäubung wird den Mäusen subkutan Buprenorphin (0,1 mg/kg) zur Schmerzlinderung und 5 ml isotone Elektrolytlösung zur Flüssigkeitssubstitution appliziert. Zur weiteren Analgesie wird dem Trinkwasser für vier Tage Novalgin (2mg/ml) zugesetzt. Die Kontrolltiere wurden gleichartig operiert. Nur auf die LAD Ligatur wurde verzichtet. 3.3.1. Präparategewinnung für die Histologie und Immunhistochemie Am vierten postoperativen Tag wurde die Maus durch einen Genickbruch getötet. Nach Fixierung in Rückenlage wurde zunächst das Abdomen der Maus mit Schere und Pinzette eröffnet. Die Innereien wurden zunächst nach kaudal verdrängt, sodass das Zwerchfell und das Sternum sichtbar waren. Das Zwerchfell wurde entlang des Rippenbogens, und die Rippen rechts und links in ihrem lateralen Anteil, mit der Schere durchtrennt. Der Thorax wurde nach kranial aufgeklappt und mit einer Nadel fixiert. Nach erfolgreicher kompletter Freilegung des Herzens wurde dieses mit einer Pinzette umschlossen, vollständig von den es fixierenden Strukturen gelöst und vollständig entnommen. Das entnommene Herz wurde zunächst in Tris-Puffer gegeben und Bindegewebs- und Lungenreste wurden entfernt. Dann wurde das Herz gewogen und in einer Fixierungsschale für 24 Stunden in Roti-Fix fixiert. Im 36 Material und Methoden Anschluss an die Fixierung wurde das Herz eine Stunde lang unter fließendem Leitungswasser gewaschen und über eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert. 3.3.2. Entwässerung der Mäuseherzen und Einbettung in Paraffin Zur Entwässerung der Präparate wurde ein automatisierte Entwässerungsapparatur verwendet. Folgendes 24h Programm wurde dabei eingestellt: 1. 70%iges Ethanol 2 Stunden 2. 80%iges Ethanol 2 Stunden 3. 90%iges Ethanol 2 Stunden 4. 90%iges Ethanol 2 Stunden 5. 100%iges Ethanol 4 Stunden 6. 100%iges Ethanol 3 Stunden 7. 100%iges Ethanol 3 Stunden 8. Xylol 1 1 Stunde 9. Xylol 2 1 Stunde 10. Paraffiin 1 2 Stunden 11. Paraffin 2 2 Stunden Nach Abschluss der Entwässerung wurden die Präparate an der Paraffinausgießstation vollständig in einen Paraffinblock eingebettet. Dabei wurde auf die stets gleiche Ausrichtung der Präparate geachtet. 3.4. Erstellung der histologischen Schnitte Paraffin hat die Eigenschaft, sich bei höheren Temperaturen auszudehnen, was zu einer 37 Material und Methoden Reduzierung der Schneidfähigkeit führt. Die Blöcke wurden deshalb vor dem Schneiden, sowie zwischen den einzelnen Schneidevorgängen, auf einer Kühlplatte gekühlt. Nach abkühlen des Paraffinblockes wurde das Präparat auf dem Schlitten des motorischen Hochleistungsmikrotoms eingespannt. Zunächst wurden 500µm des Präparates verworfen, um in eine für die Histologie relevante Ebene vorzudringen. Anschließend wurde die Schnittdicke des motorischen Hochleistungsmikrotoms von 5µm auf 3,5µm verringert. Es wurden 12 3,5µm dicke, unmittelbar aufeinander folgende Schnitte, erzeugt. Diese wurden in einem 60°C warmen Wasserbad gestreckt und anschließend einzeln auf Objektträger aufgenommen. Die Präparate auf den Objektträgern wurden zum trocknen für zwei Tage bei 37°C in einen Brutschrank gegeben. Nach Anfertigung der 3,5µm dicken Präparate wurden erneut 500µm verworfen, bevor die nächsten 12 Serienschnitte in einer Dicke von 3,5µm entnommen wurden. Dieser Ablauf wiederholte sich, bis die Ventilebene des Herzens erreicht war. Um die Folgen des Infarktes bezüglich Gewebeanordnung, Gewebeveränderung und Monozytenzahlen sichtbar zu machen wurden die verschiedenen Schnittebenen mit drei verschiedenen Färbemethoden behandelt: Hämatoxylin-Eosin Färbung, Masson-Goldner Färbung und einer Immunhistochemischen Färbung. 3.4.1. Hämatoxylin- Eosin Färbung Bei der Hämatoxylin- Eosin Färbung (HE- Färbung) handelt es sich um ein Färbungsverfahren in der Histologie, das heutzutage routinemäßig eingesetzt wird. Sie dient im Rahmen dieser Arbeit dazu, die Anordnung der verschiedenen Gewebebestandteile in den histologischen Schnitten der Mausherzen darzustellen. Dabei werden die Kerne der Zellen mittels Hämatoxylin, je nach Einwirkdauer der Hämatoxylinlösung, dunkelblau bis hin zu schwarz dargestellt. Weitere Bestandteile der Präparate, die im Rahmen der HE- Färbung sichtbar werden sind das Zellplasma, das Keratin, das Kollagen und die Erythrozyten. Dies gelingt mittels Eosin G, welches zur Familie der Xanthenfarbstoffe gezählt wird. Nach der Anwendung von Eosin G erscheinen die oben aufgelisteten Strukturen unter dem Mikroskop in verschiedenen Rottönen. Die Wirkprinzipien der Substanzen können der Färbeanleitung entnommen werden. Das Färbeprotokoll wurde zum größten Teil, wie von der Firma MERCK vorgeschlagen, übernommen. Lediglich kleine Änderungen wurden vorgenommen. 38 Material und Methoden Färbeprotokoll der Hämatoxylin-Eosin Färbung Da es sich bei den zu färbenden Präparaten um Paraffinschnitte handelte, musste in einem ersten Arbeitsschritt zunächst eine Entparaffinierung und Rehydratisierung erfolgen. Die Entparaffinierung erfolgte durch komplettes Eintauchen der Präparate in Xylol. Die Rehydratisierung erfolgte mittels eintauchen der Präparate in eine Alkoholreihe absteigender Konzentration und destilliertes Wasser. Durchführung der Hämatoxylin-Eosin Färbung: 1. Entparaffinieren in Xylol für 2 x 10 Minuten 2. Rehydrieren 2 x 100 -96-80-70 % Alkohol und Aqua dest. für je 2 Minuten 3. Färben in Hämatoxylinlösung für 3 Minuten 4. Spülen in HCL für 2 Sekunden 5. Differenzieren unter fließendem Leitungswasser 6. Färben in Eosin 0,1% für 3 Minuten 7. Spülen in Aqua dest. für 30 Sekunden 8. Entwässern in 70 - 80 und 3 x 96 % Alkohol für 30 Sekunden 9. Entfetten in Xylol für 2 x 10 Minuten 10. Eindeckeln mit Neo-Mount® für 5 Minuten 3.4.2. Masson-Goldner Färbung Durch Infarkt geschädigtes Muskelgewebe wird im Rahmen der Heilung durch Bindegewebe ersetzt. Dieses kann mittels der Masson- Goldner Färbung (MG- Färbung) sichtbar gemacht werden, um einen Eindruck vom Ausmaß der Schädigung durch den Myokardinfarkt zu bekommen. Auch bei dieser Färbung handelt es sich um eine etablierte Methode in der Histologie. Es wurde das Färbekit der Firma MERCK verwendet.Mittels der MG- Färbung ist es möglich in den Präparaten Zellkerne, Muskelfasern, Fibrin, Kollagenfasern als Bestandteil des Bindegewebes, und Erythrozyten selektiv darzustellen. Die Zellkerne erscheinen, je nach 39 Material und Methoden Einwirkzeit des Hämatoxylins nach Weigert, dunkelbraun bis schwarz. Muskulatur, Zytoplasma und Erythrozyten werden durch Azophloxin und Orange-G-Lösung angefärbt. Die Muskulatur und das Zytoplasma erscheinen danach ziegelrot und die Erythrozyten leuchtend Orange. Durch das Auftragen von Lichtgrün SF-Lösung wird schließlich das Bindegewebe als grünliche Struktur sichtbar. Genau wie bei der HE- Färbung bedarf es zunächst der Entparaffinierung und Rehydratisierung der Paraffinpräparate. Welche Mechanismen genau zu der Anfärbung der Strukturen führen, kann der Färbeanleitung der Firma MERCK entnommen werden. Der Ablauf der MG- Färbung wird im folgenden Textabschnitt näher beschrieben. Durchführung der Masson-Goldner Färbung: 1. Entparaffinieren in Xylol für 2x10 Minuten 2. Rehydrieren 2x100-96-80-70%Alkohol und Aqua dest. für je 2 Minuten 3. Färben in Hämatoxylin nach Weigert für 5 Minuten 4. Differenzieren unter fließendem Leitungswasser 5. Spülen in Essigsäure 1% für 30 Sekunden 6. Färben in Azophloxin-Lösung für 10 Minuten 7. Spülen in Eisessig 1% für 30 Sekunden 8. Färben in Phosphorwolframsäure-Orange-G- Lösung für 1 Minute 9. Spülen in Eisessig 1% für 30 Sekunden 10. Färben in Lichtgrün SF für 2 Minuten 11. Spülen in Eisessig 1% für 30 Sekunden 12. Entwässern in 70-96 und 3x100% Alkohol für je 30 Sekunden; für 5 Minuten beim letzen Durchgang 100% Alkohol für 2 Minuten 13. Entfetten in Xylol für 2x10 Minuten 40 Material und Methoden 14. Die Präparate wurden nach Abschluss der Dehydratisierung mittels Neo-Mount® und Deckglas auf dem Objektträger versiegelt. 3.4.3. Immunhistochemische Färbung Bereits die Bezeichnung dieser Färbung gibt Aufschluss darüber, aus welchen Bausteinen sie sich zusammensetzt. Die Silbe „Immun“ lässt darauf schließen, dass im Rahmen der Färbung das Prinzip der Antigen- Antikörperreaktion Anwendung findet. „Histo“ verdeutlicht, dass es sich bei dem verwendeten Material um Gewebe handelt. „Chemie“ beschreibt die histochemische/enzymatische Reaktion, die man sich zur Sichtbarmachung bestimmter Strukturen zu nutzen macht. Um nur bestimmtes Gewebe sichtbar zu machen muss dieses gezielt markiert werden. Dies gelingt, indem bestimmte Antigene dieses Gewebes durch unkonjugierte Primärantikörper markiert werden. Diese unkonjugierten Primärantikörper reagieren exklusiv mit diesem Antigen. Dieser sogenannte Antigen-Antikörper-Komplex ist jedoch für das menschliche Auge nicht sichtbar. Zu diesem Zweck wird zusätzlich ein biotinylierter (biotinmarkierter) Sekundärantikörper hinzugegeben. Dieser erkennt die Oberfläche des primären Antikörpers und bindet an diesen. Wurden die Primärantikörper beispielsweise aus einem Kaninchen gewonnen, so müssen die Sekundärantikörper gegen die Immunglobuline des Kaninchens gerichtet sein. Damit das Verfahren eine möglichst hohe Sensitivität aufweist, wurde zusätzlich der Sekundärantikörper gekoppelte Avidin- BiotinEnzymkomplex hinzugefügt. Bei Avidin handelt es sich um ein Protein, das aus Hühnereiweiß gewonnen wird. Die Struktur des Avidins weißt vier Bindungsstellen für Biotin auf, es hat also eine hohe Affinität bezüglich des Biotins. Folglich bindet das Biotin und es entsteht der Avidin-Biotin-Enzymkomplex. Dieser wiederum bindet seinerseits an den biotinylierten Sekundärantikörper. Das Enzym des Komplexes ist an das Biotin gebunden. In unserem Fall handelte es sich dabei um Peroxidase. Nach Zugabe eines farblosen Substrates, hier DAB, welches durch die Peroxidase in eine farblich in Erscheinung tretende Substanz umgewandelt wird, wird das Gewebe, welches von Interesse ist, sichtbar und kann quantitativ bestimmt werden. 41 Material und Methoden Abb 5.: Schematische Darstellung der ABC-Methode (62). Die Immunhistochemische Färbung (IHC- Färbung) wurde zur Untersuchung hinsichtlich der Präsenz von Zellen in unserem Modell gewählt, die am Remodeling der geschädigten Areale beteiligen sind. Durchführung der Immunhistochemischen Färbungen: 1. Entparaffinieren in Xylol 2x10 Minuten 2. Rehydrieren 96-80-70%Alkohol je 2 Minuten 3. Rehydrieren mit Leitungswasser für 5 Minuten 4. Umfahren der Präparate mit einem Fettstift 5. Demaskieren mit Trypsin über 20 Minuten bei 37°C in feuchter Kammer 6. Waschen in Leitungswasser für 5 Minuten 7. 3% H₂O₂ in Leitungswasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur 50µl pro Präparat zum Blockieren der endogenen Peroxidaseaktivität 8. Waschen in PBS für 5 Minuten 9. Blocken der unspezifischen Bindungsstellen mit Normal Serum über 20 Minuten 50µl pro Präparat 42 Material und Methoden 10. Serum vom Schnitt abklopfen, nicht waschen 11. Primärer Antikörper für 60 Minuten bei 37°C 50µl pro Präparat 12. Waschen in PBS für 5 Minuten 13. Biotinylierter Sekundärantikörper für 60Minuten bei 37°C 50µl pro Präparat 14. ABC Reagenz ansetzten und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen 15. Waschen in PBS für 5 Minuten 16. Peroxidase-Substrat unter Sicht 2 bis 10 Minuten entwickeln 17. Waschen in PBS für 5 Minuten 18. Entwässern in 70 - 80 und 3 x 96 % Alkohol für jeweils 30 Sekunden 19. Entfetten in Xylol 2 x 10 Minuten 20. Eindeckeln mit Neo-Mount® 3.4.4. TTC- Färbung Die Abkürzung TTC steht stellvertretend für Triphenyltetrazoliumchlorid. Die TTC- Färbung ist ein Verfahren, welches es in Kombination mit Evans Blue Lösung möglich macht, die non- area- at- risk (NAAR), die area- at- risk (AAR) und das nekrotische Gewebe, in einem von einem Myokardinfarkt betroffenen Herzen, voneinander zu differenzieren. Vitales Gewebe erscheint blau, Gewebe, welches geschädigt wurde, jedoch noch nicht abgestorben ist erscheint rot. Infarktgewebe erscheint weiß. Nach Tötung der Maus und Eröffnung des Thorax, wie bereits in Kapitel 3.3.1. beschrieben, wurde eine 2%ige Evans Blue Lösung in das noch schlagende Herz (LV) injiziert. Durch die noch vorhandene Herzaktion gelangt der blaue Farbstoff über die Aortenklappe in die Aorta, von dort aus weiter in die Koronargefäße, und somit in das noch perfundierte Myokard. Perfundiertes Myokard entspricht vitalem 43 Material und Methoden Myokard und somit Gewebe, welches von der Ischämie nicht betroffen ist. Da sich die Evans Blue Lösung durch das Gefäßsystem des Herzens verteilt gelangt es lediglich in die vitalen Bereiche mit regelrechtem Gefäßstatus. Ischämisches Infarktareal bleibt ausgespart. Dadurch kann nach einer gewissen Zeit das blaue, vitale Gewebe vom nicht angefärbten Risikoareal ganz klar abgegrenzt werden. Abb.6: „Injektion von „Evans Blue“ bei okkludierter LAD mit Unterscheidung der NAAR (blau gefärbt) von der AAR (rot)“ (64). In vitalen Kardiomyozyten kommt Nikotinamid- Adenin- Dinukleotid (NADH) reichlich vor, das mit dem Tetrazoliumsalz reagiert und in der Atmungskette zu Formazan reduziert wird, das für eine Rotfärbung verantwortlich ist. In Zellen, die durch den Infarkt irreversibel geschädigt wurden kommt es zu einem Abfall von NADH. Aus diesem Grund ist hier eine Reduktion des Tetrazoliums nicht möglich. Die Rotfärbung dieser Zellen findet nicht statt, das Infarktareal erscheint weiß. Gebiete die allerdings noch eine Restaktivität aufweisen erscheinen rot, sodass die rote Färbung die area- at- risk wiederspiegelt (19; 64). Durch diese zweite Färbung wird es möglich eine Aussage über das Ausmaß der Schädigung in Relation zum Versorgungsgebiet der LAD zu machen. 44 Material und Methoden Durchführung der Immunhistochemischen Färbung: Zunächst wurden alle Tiere der oben beschriebenen kardialen Maus Operation unterzogen, um einen Herzinfarkt der LAD zu induzieren. Drei Tage nach dem operativen Eingriff wurden die Tiere via Genickbruch getötet. Anschließend wurde das Herz wie im Kapitel „Entnahme der Mausherzen“ freipräpariert. Durchführung der Färbung: 1. Injizieren der 2%igen Evans Blue Lösung in den noch schlagenden linken Ventrikel 2. Entnahme des Herzens aus dem Thorax 3. Spülen in 1%igem PBS Puffer über 5 Minuten 4. Erstellung 1mm dicker Herzscheiben 5. Inkubation in Triphenyltetrazoliumchlorid- Lösung über 30 Minuten bei 37°C 6. Fixierung in Formalin 7. Platzieren der einzelnen Scheiben zwischen zwei Objektträgern 3.4.5. Messung des H₂O₂- Gehalts in den Mitochondrien Wie bereits in anderen Arbeiten beschrieben kommt es im Rahmen eines ischämischen Ereignisses zu einer vermehrten Produktion an ROS innerhalb der Mitochondrien (4; 53). Die reaktiven Sauerstoffspezies entfalten ihrerseits schließlich eine zytotoxische Wirkung. UCP2 ist durch Protonenverschiebungen dazu in der Lage die ROS- Bildung zu vermindern. Da das meiste ROS, mittels der in der Mitochondrienmatrix gelegenen Superoxiddismutase, in H₂O₂ umgewandelt wird, kann man mit dem Nachweis der Menge an H₂O₂ indirekt die produzierte Menge an ROS nachweisen. Im Rahmen dieses Versuches wurden sowohl Mitochondrien aus WT-Tieren als auch aus KO-Tieren mit und ohne LAD-Ligatur isoliert. 45 Material und Methoden Mitochondrienisolierung: 1. Homogenisierung des Myokards in MSEGTA- Puffer 2. Myokard+ MSEGTA-Puffer zentrifugieren mit 2000Upm über 10 Minuten 3. Überstand abpipettieren und zentrifugieren mit 12000Upm über 10 Minuten 4. Überstand abpipettieren und verwerfen 5. Pallet resuspendieren mit 25% Percoll/MSEGTA und zentrifugieren mit 30000Upm über 10Minuten 6. Überstand abpipettieren und verwerfen 7. Pellet (gereinigte Mitochondrienfraktion) mit MSEGTA resuspendieren 8. Waschgang mit MSEGTA und Zentrifugation mit 12000Upm über 10 Minuten 9. Waschgang mit MSEGTA und Zentrifugation mit 12000Upm über 10 Minuten 10. Pellet in MS-Puffer resuspendieren 11. Lagerung auf Eis 12. Proteingehalt Bestimmung mittels BCA-Assay Bestimmung des H₂O₂- Gehalts 1. Bestimmung der Grundfluoreszenz des Inkubationspuffers inklusive 50µM Amplex UltraRed und 0,1U/ml Meerrettich- Peroxidase ohne Mitochondrien mittels des „Infinite®M1000 PRO der Firma TECAN“ bei einer Exzitations-/ EmissionsWellenlänge von 565/581 nm über 10 Minuten. 2. In einem neuen Ansatz werden gleichzeitig 10µg intakter Mitochondrien sowie 50µM Amplex UltraRed und 0,1U/ml Meerrettich- Peroxidase im Inkubationspuffer 46 Material und Methoden inkubiert und die Exzitation 10 Minuten bei einer Wellenlänge von 565/581 nm gemessen. 3. Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz von den Messwerten der mitochondrialen ROS- Messung 3.4.6. Auswertung der Immunhistochemie und Histologie 3.4.7. Digitalisierung der Präparate Um die histologischen und histochemischen Präparate objektiv auswerten zu können, wurden alle Präparate digital eingelesen. Hierzu diente ein Hochleistungsmikroskop, welches mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet war, sowie einem beweglichen Objekttisch, sodass die Präparate ideal platziert werden konnten. Alle Präparate der HE- Färbung, der MG- Färbung und der IHC- Färbung wurden bei 4facher, 10-facher und 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Präparate der TTCFärbung wurden bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen. Alle Präparate wurden mittels des Programms Olympus cell in ihrer Schärfe- und Farbabstimmung optimiert. Aufgrund der Vergrößerung war es nicht möglich die Schnitte mit einem Bild zu erfassen. Daher wurde ein Präparat in vielen kleinen Einzelbildern aufgenommen, die anschließend durch das sogenannte „Stichen“ wieder zu einem einzigen Bild, mit sehr hoher Auflösung, vereint wurden. Im Anschluss konnten mittels des Grafikprogramms, durch Umfahren der entsprechenden Grenzen, die Größe des linken Ventrikels, die Größe des Lumens des linken Ventrikels und die Größe des pathologisch veränderten Areals bestimmt werden. Die Präparate der IHC- Färbung wurden nach dem „Stichen“ mit JMicroVision 1.2.7. ausgewertet. Mittels dieses Programms konnten die Größe des linken Ventrikels abzüglich seines Lumens sowie der prozentuale Anteil der Monozyten am Gewebe des linken Ventrikels, durch vorheriges Markieren der entsprechenden Areale, bestimmt werden. 47 Material und Methoden 3.4.8. Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der erhobenen Daten erfolgte mittels Open Office.org Calc sowie SPSS 12 (SPSS GmbH Software, Deutschland). Die zuvor erhobenen statistischen Daten der Kaplan-Meier Überlebenskurve wurden mittels SPSS grafisch dargestellt. Die Balkendiagramme, bezüglich der histomorphometrischen Daten, wurden mittels Open Office.org Calc erstellt. Jedes Balkendiagramm beinhaltet neben den errechneten Mittelwerten stets den Standardfehler. Auch signifikante Unterschiede sind stets mit entsprechenden Symbolen markiert. 3.5. Material 3.5.1. Arbeitsgeräte Entwässerung LEICA ASP300S, Deutschland Heiz-Magnetrührer Monotherm, Variomag, USA Kühlplatte für LEICA EG 1150C das modulare Einbettsystem, Deutschland Mikroskop Olympus BX51, Japan Motorisches Hochleitungsmikrotom, LEICA RM 2255, Deutschland Paraffinausgießstation,LEICA EG 1150H, Deutschland pH-Elektrode Typ pH525, WTW, Deutschland Pipettierhilfe Reference variabel, Eppendorf AG, Deutschland Waagen Analytic AC 2105, Sartorius-Werke GmbH, Deutschland Wasserbad MEDITE Tissue Flotation Bath TFB 45, Deutschland Zentrifuge Centrifuge 5415 R, Eppendorf AG, Deutschland 48 Material und Methoden Kardiale Mausoperation: ADInstruments Powerlab 26T, Neuseeland Bepanthen®, Augen-und Nasensalbe, 5g, Bayer, DeutschlandBODE Sterillium®Virugard, Hände- Desinfektionsmittel, BODE Chemie Hamburg, Deutschland Elektro-Kauter FST, 18000-00, Deutschland Greifhaken, Eigenbau Heizplatte Panlab, Havard, Temperature control unit HB 101/2, USA Ketavet® 100mg/ml, Injektionslösung für Hunde und Katzen, Wirkstoff: Ketaminhydrochlorid, 1Injektionsflasche zu 20ml, Pfizer,Deutschland Kodan®Tinktur forte farblos, Alkoholisches Hautantiseptikum, Schülke, Deutschland Linde-Gas O₂ 100%, Deutschland Metzenbaum Scissors, ToughCut Curved 14,5cm, FST, USA Mikroskop Nikon SMZ 645 Mouse Ventilator, Model 687, Harvard Apparatus, USA Pinzette gebogen, Spitzenabmessung 0,17mmx0,1mm, Länge 11,5cm, FST,USA Pinzette gerade, Spitzenabmessung 0,1mmx0,06mm, Länge 11cm, FST,USA Rompun® 2% , Injektionslösung für Tiere: Rinder, Pferde, Hunde, Katzen, Wirkstoff: Xylazin, Injektionslösung 25ml, Bayer, Deutschland Schott Lampe KL200 Waage, Acculab sartorius group, Acculab Analysenwaage ATL-153-V interne Kalibrierung, geeicht, USA 49 Material und Methoden Färbekits Hämatoxylin-Eosin Färbung, Merck, Deutschland Masson-Goldner Färbekit zur Bindegewebsdarstellung mit der Trichromfärbung, Merck, Deutschland VECTASTAIN® Elite ABC KIT, Vector Laboratories, USA; Vectastain® Elite ABC Kit (Rabbit IgG), PK-6101, Vector Laboratories, Inc. 2008, USA Weigerts Eisenhämatoxylin Kit, Merck, Deutschland 3.5.2. Computer Software EndNote, Bibliographies made easy JMicroVision 1.2.7. Microsoft Office Excel 2007 Microsoft Office Word 2007 Microsoft Paint 2007 Olympus cell, Imaging software for Life science Microscopy Open Office.org Calc SPSS 12, SPSS GmbH Software, Deutschland 3.5.3. Verbrauchsmaterialien BD Microlance™3 Kanüle 26G, USA BD Plastipak ™, U-40 Insulinspritze, USA Deckgläser, Marienfeld, Stärke Nr.1 0,13-0,16mm, LxB 15x15mm, Deutschland Dreiwegehahn, pub Medizintechnik, Deutschland 50 Material und Methoden Falcon Tube 15ml, 50ml, Becton Dickinson, Deutschland Med comfort, Wilkinson sword, Einweg-Rasierer, zweischneidig, Deutschland Objektträger, Marienfeld, LxBxH 76x26x1mm, DeutschlandProlene ATRALOC, Polypropylen, blau, monofil, chirurgisches Nahtmaterial nicht resorbierbar, 6-0, ETHICON, USA Prolene, Polypropylen ATRALOC, blau, monofil, chirurgisches Nahtmaterial nicht resorbierbar, EH7470E, 24 Stück 8-0 (0,4 Ph.Eur.), ETHICON, USA Rotilabo®-Einbettkassette Macro extra hoch (12mm), 250Stück, Roth, Deutschland Sicherheitsvenenverweilkanüle, BRAUN, Deutschland Introcan Safety®, 20Gx1¹/₄ (1.1x32mm), Wägepapier, 100 Blatt 9x11,5cm, MACHEREY-Nagel, Deutschland 3.5.4. Chemikalien/Reagenzien Primer für UCP2¯/¯/WT PCR: WT-Primer 5`- GCG TTC TGG GTA CCA TCC TA- 3´ 5´- GCT CTG AGC CCT TGG TGT AG- 3´ Mutant (Forward) 5´- CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC- 3´ Mutant (Reverse) 5´- AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC- 3´ Azophloxin-Lösung, Merck, Deutschland CaCl₂ (Calciumchlorid), Merck, Deutschland 51 60ml/min, Material und Methoden Chloroform (Trichlormethan),Roth,Deutschland dNTP Mix (Nukleosidtriphosphate), Roche, Deutschland EDTA (Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraessigsäure), Sigma-Aldrich, Deutschland Eosin G-Lösung 0,1%, Merck, Deutschland Essigsäure 10%, Merck, Deutschland Ethanol 70% vergällt, Carl Roth®, Deutschland Ethanol 96% vergällt, Carl Roth®, Deutschland Ethanol, Roth, Deutschland HCl (Salzsäure), Merck, Deutschland HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-ethansulfon-Säure), Sigma-Aldrich, Deutschland Isopropanol (2-Propanol),Roth, Deutschland KCl (Kaliumchlorid), Merck, Deutschland KH₂PO₄ (Kaliumdihydrogenphosphat), Merck, Deutschland Lichtgrün SF-Lösung, Merck, Deutschland Mayers Hämalaunlösung, Merck, Deutschland MgCl₂ (Magnesiumchlorid), Promega, Deutschland Na₂HPO₄ (Dinatriumhydrogenphosphat), Merck, Deutschland NaCl (Natriumchlorid), Merck, Deutschland NaOH (Natriumhydroxid), Merck, Deutschland Neo-Mount®, Merck, Deutschland Phenol, Roth, Deutschland Phosphorwolframsäure Orange G-Lösung, Merck, Deutschland 52 Material und Methoden Roti®Histofix 4%, säurefrei (pH7) phosphatgepuffert, Formaldehydlösung 4%, 10l, Carl Roth®, Deutschland SDS (Natriumdodecylsulfat), Serva, Deutschland Sucrose (Saccharose), Sigma-Aldrich, DeutschlandTaq DNA Polymerase, 5U/µl, Promega, Deutschland Tris (Tris-(hydroxymethylen)-aminomethan), Roth, Deutschland Trypsin, Roth, Deutschland Tween 20 (Polyoxyethylensorbitolmonolaurat), Fluka Chemica, Schweiz Weigerts Lösung A alkoholische Hämatoxylin Lösung, Merck, Deutschland Weigerts Lösung B salzsaure Eisen(III)nitrat Lösung, Merck, Deutschland Xylol, Merck, Deutschland 3.5.5. Antikörper Primärer Antikörper: Abcam CD11a/b (Rabbit IgG) Sekundärer Antikörper: Biotinylierter Anti-Rabbit IgG (H+L) made in goat, Vector Laboratories, Inc. 2008, USA 3.5.6. Lösungen Agarose Gel 2%: Agarose 2,5g 1x TBE-Puffer 125ml Ethidiumbromid 5µl (10mg/ml) 53 Material und Methoden SNET Lyse-Puffer: Tris HCL (pH 8,0) 20mM NaCl 400mM EDTA (pH 8,0) 5mM SDS 1%(w/v) Gelöst in Aqua bidest und sterilfiltriert mittels Sterifix®-Filter 0,2µm Porengröße. Mitochondrienisolationslösung: Sucrose 250mM KCl 5mM HEPES 5mM CaCl₂ 1mM Gelöst in Aqua bidest und pH mit KOH auf 7,2 eingestellt MSEGTA Puffer: 225mM Mannitol 75mM Saccharose 20mM HEPES pH mit KOH auf 7,4 eingestellt 1mM EGTA und 0,2% BSA 54 Material und Methoden Percoll: 225mM Nannitol 75mM Saccharose 20mM HEPES 1mM EGTA pH mit KOH auf 7,4 eingestellt MS-Puffer: 225mM Mannitol 75mM Saccharose 20mM HEPES- NaOH pH auf 7,4 eingestellt Inkubationspuffer: 125mM KCI 4mM KH2PO4 14mM NaCl 20mM HEPES- NaOH pH Einstellung auf 7,2 1mM MgCl2 0,2% BSA 0,020mM EGTA 55 Material und Methoden PBS: NaCl 137mM KCl 2,7mM KH₂PO₄ 1,5mM Na₂HPO₄ 8,1mM In Aqua bidest. gelöst Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Lösung: Chloroform:Isoamylalkohol 24:1 Wassergesättigtes Phenol wurde mit 20µl/ml Tris-HCl (pH 8,2) 2,5M frisch angesetzt und beide Lösungen zu gleichen Teilen gemischt. TBS-Tween Waschpuffer: Tris, pH 7,6 50mM NaCl 150mM Tween-20 1% Mit Aqua bidest. gelöst TE-Puffer: (= Tris-EDTA-Puffer) 1M Tris pH 8,0 5ml 0,5M EDTA pH 8,0 1ml dH2O 496ml 56 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1. Allgemeines Für die deskriptiven histologischen sowie die histomorphometrischen Untersuchungen gingen insgesamt 84 Versuchstiere in die Auswertung ein. Hierbei zählten 42 Tiere zur Gruppe der WT- Tiere und 42 Versuchstiere zur Gruppe der KO-Tiere. Innerhalb der Gruppe der KOTiere wurde die Hälfte der Tiere einer LAD-Ligatur unterzogen, die zweite Hälfte wurde SHAM operiert. In der Gruppe der 42 WT-Tiere wurden 23 Tiere einer LAD-Ligatur zugeführt. Die restlichen 19 Tiere wurden SHAM operiert. Alle Tiere wurden am vierten postoperativen Tag getötet. Alle operierten Tiere konnten in die histologische Auswertung einfließen. Zur Erstellung der Kaplan-Meier Überlebenskurve wurden sowohl von der Gruppe der WTTiere als auch von der Gruppe der KO-Tiere jeweils 42 weitere Tiere einer LAD-Ligatur unterzogen. Alle operierten Tiere, egal zu welcher Gruppe diese zählten, wurden unmittelbar nach der Operation in den gewohnten Käfig zurückgesetzt. Unter einer Schmerzmedikation mittels Novalgin (2mg/ml) über das Trinkwasser sowie ausreichend Nahrungsangebot konnten sich die Tiere, wie üblich, frei in ihrer gewohnten Umwelt bewegen. 4.2. Kaplan- Meier- Überlebenskurve Wie die folgende grafische Aufarbeitung zeigt sind deutliche Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen hinsichtlich des Überlebens nach einem Myokardinfarkt zu beobachten. In der Gruppe der WT-Tiere mit LAD- Ligatur starben nach dem operativen Eingriff am ersten postoperativen Tag 11,9% der Tiere. Das bedeutet wiederum, dass 37 Tiere den ersten postoperativen Tag überlebten. Die Überlebenswahrscheinlichkeit für den ersten Tag beträgt also 37/42 = 0,881, also 88,1%. Todesfälle in dieser Versuchsgruppe ereigneten sich lediglich am ersten postoperativen Tag. In der KO-Gruppe mit LAD- Ligatur ist hingegen ein anderes Bild zu beobachten. Ähnlich wie in der WT-Gruppe versterben am ersten 57 Ergebnisse postoperativen Tag 14,3% der Versuchstiere. 36 Versuchstiere überleben also den ersten postoperativen Tag. Die Überlebenswahrscheinlichkeit für den ersten Tag beträgt somit 36/42 = 0,857, also 85,7%. Nachdem es am zweiten und dritten postoperativen Tag nicht zu Todesfällen kommt setzt das Sterben am vierten postoperativen Tag wieder ein. Neun Tiere der KO Gruppe mit LAD- Ligatur versterben, also 21,43%. Somit beträgt die Überlebenswahrscheinlichkeit für den vierten postoperativen Tag 27/36 = 0,75 und somit 75%. Am fünften postoperativen Tag versterben schließlich alle übrigen 27 Tiere der KOGruppe mit LAD- Ligatur. Dies entspricht 64,29%. Die Gesamtwahrscheinlichkeit den 5.Tag zu überleben beträgt somit 0% in der Gruppe der KO-Tiere. Es kann beobachtet werden, dass alle KO-Tiere mit einer LAD-Ligatur die Operation auf längere Sicht nicht überleben. Das Versterben der Versuchstiere ab dem vierten postoperativen Tag wird, laut der durchgeführten Obduktionen, durch eine Myokardruptur hervorgerufen. Abb.7: Die Kaplan-Meier Überlebenskurve zeigt die Überlebenszeit der 42 Versuchstiere jeweils aus der WT- und KO- Versuchstiergruppe in Tagen, nachdem operativ ein Verschluss der LAD induziert wurde. Es wird die Wahrscheinlichkeit gezeigt, mit der ein Tier diesen Eingriff überlebt. 58 Ergebnisse 4.3. Deskriptive Histologie und histomorphometrische Analyse 4.3.1. Deskriptive Histologie Hämatoxylin- Eosin Färbung Mittels der HE- Färbung ist es möglich das durch die Operation entstandene pathologisch veränderte Gewebe sichtbar zu machen. Die Lokalisation des pathologisch veränderten Gewebes entspricht dem bekannten Versorgungsgebiet der LAD, deren Durchblutung im Rahmen der Operation unterbunden wurde. Wie zu erwarten war, zeigen sich in den histologischen Schnitten kleinere pathologische Areale in der Vorderwand des rechten Ventrikels, im vorderen und mittleren Anteil des Ventrikelseptums, sowie in anteroapikalen Anteilen des linken Ventrikels. In der HE- Färbung zeigen sich das geschädigte Gewebe und das homogen gefärbte vitale Herzgewebe. Zu erkennen ist das vitale Gewebe an meist einkernigen Kardiomyozyten, deren Kern rundlich geformt und meist zentral gelegen ist. Er tritt als dunkel violette Struktur in Erscheinung. Innerhalb des Kernes liegen häufig die rundlichen Nukleoli, die als tiefdunkelviolette Struktur in Erscheinung treten. Umgeben ist der Zellkern durch rosafarbenes Zytoplasma. Der Kardiomyozyt an sich ist, je nach Anschnitt, unterschiedlich geformt. Liegt ein Längsschnitt des Präparates vor, so wirkt der Kardiomyozyt länglich. Es zeigt sich im Gesamtbild die typische netzartige Struktur des Myokards. Innerhalb eines Querschnittes wirken Kardiomyozyten rundlich. Man spricht in diesem Fall von der typischen CohnheimFelderung des Myokards. Im vitalen Gewebe finden sich gelegentlich, vor allem in Gebieten mit Gefäßanschnitten und im Infarktareal, massenhaft Fibrozyten in unmittelbarer Nachbarschaft zum interstitiellen Bindegewebe. Ihre Kerne erscheinen länglich bis spindelförmig und ebenfalls dunkel violett. Wie in den unteren Fotografien zu erkennen ist, kann das pathologisch veränderte Gewebe vor allem dadurch optisch abgegrenzt werden, dass die Zellkerne der geschädigten Zellen verschwinden und die Eosinophilie zunimmt. Der Eindruck der Eosinophilie entsteht durch das koagulieren der Proteine der Zelle. In pathologischen Arealen finden sich außerdem vermehrt Zellkerntrümmer, Fibrozyten, Bindegewebe und Zellkerne der Kardiomyozyten. Die typische Struktur des Myokards, die bereits oben beschrieben wurde, ist hier aufgehoben.Um sicherzustellen, dass die in der Färbung auffälligen Bereiche auf den operativen Eingriff zurückzuführen sind, wurde jeweils ein Teil der WT-Mäuse ohne eine Ligatur der LAD (WT SHAM; n=6) nur operativ eröffnet. Bei den operierten Tieren wurde neben der operativen Eröffnung des Thorax auch die LAD 59 Ergebnisse abgebunden und somit ein Infarkt erzeugt (n=8). Innerhalb der Gruppe der KO-Tiere (KO SHAM; n=7; KO Infarkt; n=7) wurde ebenso verfahren. Abb.8: Repräsentatives Herz eines WT-Tieres, Myokardgewebe im Längsschnitt, keine Ligatur der LAD (=SHAM). a) Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, RV= rechter Ventrikel, LV= linker Ventrikel; b) linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung mit vitaler Kardiomyozytenanordnung in der typischen netzartigen Struktur; 60 Ergebnisse c) Ausschnitt aus der 20-fachen Vergrößerung des vitalen Herzgewebes der linksventrikulären Aufnahme. Typische netzartige Struktur, zentrale Zellkerne in vitalen Kardiomyozyten. Abb.9: Repräsentatives Herz eines KO-Tieres, Myokardgewebe im Längsschnitt, SHAM operiert a) Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung. b) linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung mit vitaler Kardiomyozytenanordnung mit der typischen netzartigen Struktur. c) Aufnahme bei 20-facher Vergrößerung des vitalen Herzgewebes der linksventrikulären Aufnahme. Deutlich zu erkennen ist die netzartige Struktur sowie die typischen Kardiomyozyten mit zentral gelegenem violettem Zellkern. Zudem zeigt sich ein Gefäßanschnitt mit Erythrozyten. 61 Ergebnisse Abb. 10:Repräsentatives Herz eines WT-Tieres, welches einer LAD- Ligatur unterzogen wurde, Myokardgewebe im Längsschnitt. a)Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung; pathologisch veränderte Areale sind in den typischen Bereichen des LADVersorgungsgebietes anzutreffen, b)linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung, c)Aufnahme des pathologisch veränderten Areals des linksventrikulären Ausschnitts bei 20facher Vergrößerung. Deutlich zu erkennen sind die chaotische Anordnung der Zellen, der Zellkernverlust und die erhöhte Eosinophilie. 62 Ergebnisse Abb. 11: Repräsentatives Herz einer KO-Maus mit LAD-Ligatur, Myokardgewebe im Querschnitt mit typischer Cohnheim-Felderung. a)Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, b)linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung, c)linksventrikuläre Aufnahme pathologisches und vitales Gewebe im Vergleich bei 20-facher Vergrößerung. Es zeigt sich ein typischer Kardiomyozyt mit lateralisiertem, rundem Zellkern, in ihrer Form noch erkennbare Kardiomyozyten allerdings bereits mit Zellkernverlust sowie bereits hochpathologisches, chaotisches Gewebe unter anderem mit erhöhter Eosinophilie. 63 Ergebnisse 4.3.2. Histomorphometrische Analyse der Hämatoxylin-Eosin Färbung In die angeschlossene Auswertung der histologischen Daten flossen die Werte von sechs SHAM operierten WT-Tieren, sieben SHAM operierten KO-Tieren, sowie acht WT-Tieren und sieben KO-Tieren mit LAD-Ligatur ein. Von jedem Tier wurde ein Hämatoxylin-Eosin gefärbter Schnitt jeder Herzebene in die Analyse mit einbezogen. Die untenstehende Grafik zeigt, dass sich auch bei SHAM operierten WT-Tieren kleine pathologisch veränderte Bereiche finden lassen. Im Mittel macht das pathologische Gewebe 1,63% des betrachteten Areals aus. Es ist vereinzelt an der Vorderwand des linken Ventrikels lokalisiert. Auch bei den SHAM operierten KO-Tieren tritt pathologisch verändertes Gewebe mit im Mittel 3,71% in einer ähnlichen Größenordnung und mit ähnlicher Lokalisation auf. Hinsichtlich der Größe des pathologisch veränderten Gewebes ergibt sich rechnerisch kein signifikanter Unterschied betrachtet man SHAM operierte WT-Tiere mit SHAM operierten KO- Tieren im Vergleich (1,63%±0,29%, n=6; 3,71%±1,19%, n=7; p>0,05). Bei dem Vergleich von WT-Tieren mit LAD-Ligatur und KO-Tieren mit LAD-Ligatur stehen sich pathologisch veränderte Arealgrößen im Mittel von 30,18% und 32,52% gegenüber. Rechnerisch kann somit keine Signifikanz verzeichnet werden (30,18%±2,56%, n=8; 32,52%±4,51%, n=7; p>0,05). 64 Ergebnisse HE- Färbung Die Größe pathologisch veränderter Areale im Vergleich 40 Infarktgröße [%] des LV 35 30 WT SHAM 25 KO SHAM 20 WT 15 KO 10 5 0 Abb.12: Infarktgröße [%] des LV der SHAM operierten KO- und WT- Tiere sowie der mit LAD- Ligatur operierten KO- und WT- Tiere im Vergleich. 4.3.3. Deskriptive Histologie der Masson-Goldner Färbung Auch mittels der Masson- Goldner Färbung können pathologisch veränderte Strukturen sichtbar gemacht werden. Wie oben bereits beschrieben erwartet man pathologisch verändertes Gewebe im Bereich des Versorgungsgebietes der LAD. Vitales Myokard erscheint im Rahmen der Färbung ziegelrot. Die regulär zentral gelegenen, rundlichen Zellkerne variieren zwischen einer bräunlichen bis schwarzen Färbung. Außerdem ist im vitalen Gewebe je nach Anschnitt, wie auch in der HE-Färbung, die typische netzartige Struktur oder die Cohnheim- Felderung sichtbar. Pathologisch veränderte Areale erkennt man deutlich daran, dass das geschädigte Myokard nicht mehr ziegelrot gefärbt ist. In den betroffenen Bereichen wirkt das Zytoplasma der Zellen abgeblasst rosa. Hat sich bereits Kollagen in geschädigten Arealen gebildet, stellen sich die betroffenen Bereiche grünlich dar. Pathologische Bereiche zeichnen sich durch Zellkernverlust aus, sowie dadurch, dass die Zahl der Fibrozyten und des Bindegewebes stark zunimmt, außerdem ist die gewohnte geordnete Struktur des Gewebes verschwunden. Durch die Verwendung zweier Färbungen soll 65 Ergebnisse sichergestellt werden, dass die Ergebnisse der HE-Färbung reproduzierbar sind. Außerdem sollen auf diese Weise weitere Informationen über Veränderungen, welche im Rahmen des Remodelings entstehen, erhalten werden. Abb. 13: Repräsentatives Herz eines WT-Tieres, Myokardgewebe im Längsschnitt, keine Ligatur der LAD (SHAM). a) Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, LV= linker Ventrikel, RV= rechter Ventrikel b) linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung mit vitaler Kardiomyozytenanordnung in der typischen netzartigen Struktur, c) Ausschnitt der 20- fachen Vergrößerung des vialen Herzgewebes der linksventrikulären Aufnahme. 66 Ergebnisse Abb. 14: Repräsentatives Herz eines KO-Tieres, Myokardgewebe im Längsschnitt, keine Ligatur der LAD (SHAM). a)Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, b) linksventrikuläre Aufnahme in 10-facher Vergrößerung mit vitaler Kardiomyozytenanordnung in der typischen netzartigen Struktur, c) Ausschnitt der 20-fachen Vergrößerung des vitalen Herzgewebes der linksventrikulären Aufnahme. Es zeigen sich zentral im Kardiomyozyten gelegene Zellkerne , Fibrozyten sowie ein Gefäß im Längs- und im Querschnitt mit im Lumen gelegenen Erythrozyten. 67 Ergebnisse Abb. 15: Repräsentatives Herz eines WT-Tieres nach einer LAD-Ligatur, Myokardgewebe im Längsschnitt. a)Übersichtsaufnahme in 4-facher-Vergrößerung, b) 10-fache Vergrößerung eines linksventrikulären Ausschnitts; typische netzartige Struktur eines Längsschnitts, deutlich sichtbares abgeblasstes Infarktgewebe, c) Ausschnitt aus der 20-fachenVergrößerung, vitales und pathologisch verändertes Gewebe in unmittelbarer Nachbarschaft, VKM= vitaler Kardiomyozyt, FZ= Fibrozyt, PVG= pathologisch verändertes Gewebe mit chaotischer Zellkernanordnung und Abblassung des Gewebes. 68 Ergebnisse Abb.16: Repräsentatives Herz eines KO-Tieres nacheiner LAD-Ligatur, Myokardgewebe teilweise im Längs-und Querschnitt. a)Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, abgeblasstes Gewebe entspricht dem Infarktgewebe, b) 10-fache Vergrößerung eines linksventrikulären Areals, c) Ausschnitt aus der 20-fachen Vergrößerung , VKM= vitale Kardiomyozyten mit zentralem Zellkern, PVG= Pathologisch verändertes Gewebe mit chaotischer Zellkernanordung und Abblassung des Gewebes sowie Verlust der geordneten Struktur, KMZ mit ZKV= Kardiomyozyt mit Zellkernverlust. 69 Ergebnisse 4.3.4. Histomorphometrische Analyse der Masson-Goldner Färbung In die angeschlossene Auswertung der histologischen Daten flossen die Werte von sieben SHAM operierten WT-Tieren, acht SHAM operierten KO-Tieren, sowie sieben WT-Tieren und sechs KO-Tieren mit LAD-Ligatur ein. Von jedem Tier wurde ein Masson-Goldner gefärbter Schnitt jeder Herzebene in die Analyse mit einbezogen. Um auch hier die histologischen Ergebnisse objektivieren zu können, wurden erneut mittels eines Grafikprogrammes die verschiedenen Größen der pathologisch veränderten Areale ermittelt. Auch hier wurde in Erfahrung gebracht, welchen prozentualen Anteil das pathologisch veränderte Gewebe am linken Ventrikel, abzüglich seines Lumens, hat. Bei SHAM operierten WT-Tieren finden sich im Mittel 3,66% pathologisches Gewebe, welches vereinzelt an der Vorderwand des linken Ventrikels anzutreffen ist. Auch bei den SHAM operierten KO-Tieren tritt pathologisch verändertes Gewebe mit im Mittel 4,35% in einer ähnlichen Größenordnung und mit ähnlicher Lokalisation auf. Die Berechnungen, vergleicht man die beiden Gruppen SHAM operierter Tiere untereinander, ergeben keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Arealgrößen des geschädigten Gewebes (3,66%%±1,94%, n=7; 4,35%±1,38%, n=8; p>0,05). Vergleicht man die Größe der pathologischen Areale zwischen den WT- und den KO-Tieren mit LAD-Ligatur, stehen sich pathologisch veränderte Areale im Mittel von 33,96% und 40,23% gegenüber. Rechnerisch kann somit keine Signifikanz verzeichnet werden (33,96%±1,36%, n=7; 40,23%±10,41%, n=6; p>0,05). 70 Ergebnisse MG- Färbung Die Größe pathologisch veränderter Areale im Vergleich Infarktgröße [%] des LV 60 50 40 WT SHAM KO SHAM 30 WT KO 20 10 0 Abb.17:Infarktgröße [%] des LV der SHAM operierten KO- und WT-Tiere sowie der mit LAD-Ligatur operierten KO- und WT-Tiere im Vergleich. Da die MG-Färbung neben den Strukturen, welche auch die HE-Färbung zeigt, Bindegewebe darstellen kann, wurde zusätzlich eine Auswertung bezüglich des Bindegewebsanteiles am LV vorgenommen. Innerhalb keiner Vergleichskonstellation konnte eine Signifikanz bezüglich des Bindegewebsanteils am Infarktgewebe verzeichnet werden. SHAM operierte WT- Tiere zeigen im Mittel einen Bindegewebsanteil am Infarktgewebe von 1,78%. WT-Tiere mit LAD-Ligatur zeigen einen Bindegewebsanteil von im Mittel 3,97%. Somit ergibt sich rechnerisch keine Signifikanz zwischen diesen beiden Vergleichsgruppen (1,78%%± 0,40%, n=7; 3,97±0,47%, n=7; p>0,05). Ebenso fällt das Ergebnis aus vergleicht man den Anteil von Bindegewebe am LV zwischen den WT- und den KO- Tieren mit LAD- Ligatur. Es stehen sich Bindegewebsanteile im Mittel von 3,97% und 3,44% gegenüber. Rechnerisch kann somit ebenfalls keine Signifikanz verzeichnet werden (3,97%±0,47%, n=7; 3,44%±0,38%, n=6; p>0,05). 71 Ergebnisse MG- Färbung Bindegewebsanteil [%] am Infarktgewebe 5 Bindegewebe [%] des Infarktes 4 WT SHAM 3 KO SHAM WT KO 2 1 0 Abb.18:Bindegewebsanteil [%] am LV der SHAM operierten KO- und WT-Tiere sowie der mit LAD-Ligatur operierten KO- und WT-Tiere im Vergleich 72 Ergebnisse 4.3.5. Deskriptive Histologie der Immunhistochemischen Färbung Aufgrund der Beobachtung, dass alle einer LAD- Okklusion unterzogen KO-Tiere im Zeitraum zwischen dem vierten und fünften postoperativen Tag an einer Myokardruptur versterben, wurde die immunhistochemische Bestimmung der Monozyten/Makrophagen Infiltration als weitere Analysemethode herangezogen. Monozyten und Makrophagen setzen im Rahmen des Remodelings ROS frei, das seinerseits einen negativen Effekt auf das Myokardgewebe zeigt, sodass eine Ruptur des Myokards begünstigt wird. Bei Unterschiedlichen Monozyten/Makrophagen Anteilen wäre eine Erklärung für die Beobachtung gegeben, weshalb KO- Tiere vollständig versterben, WT-Tiere hingegen zu einem Großteil überleben. Im Rahmen der IHC- Färbung werden Monozyten sichtbar, die sich im Gewebe befinden. Monozyten gelangen über die Blutbahn zum Herzen und differenzieren sich nach der Einwanderung in das Myokard in Makrophagen und beginnen damit die Gewebetrümmer zu phagozytieren und somit wieder eine Ordnung herzustellen. Monozyten/Makrophagen werden durch die Färbung sowohl zwischen den einzelnen Kardiomyozyten, als auch im Lumen des Ventrikels und in Gefäßlumina sichtbar. Typisch ist auch, dass Monozyten/Makrophagen gehäuft in Arealen angetroffen werden, in denen es zu einem Verlust der typischen Gewebestruktur gekommen ist. Die Areale wirken chaotisch und durch die Anhäufung der bräunlich gefärbten Zellen heben sich die Areale durch eine dunklere Grundfärbung optisch ab. Monozyten sind allerdings auch im vitalen Gewebe anzutreffen. Durch den Transport der Monozyten im Gefäßsystem kommt es vor, dass Monozyten eben dieses System innerhalb von vitalem Gewebe verlassen, dieses durchwandern um schließlich in die geschädigten Areale zu gelangen. Im Rahmen der IHCFärbung erscheinen Monozyten/Makrophagen als dunkel-braune bis schwarze, rundliche Struktur. Nicht zu verwechseln sind sie mit den Zellkernen der vitalen Kardiomyozyten, welche sich ebenfalls als bräunliche, rundliche Struktur darstellen. Der Zellkern ist allerdings deutlich kleiner als die Monozyten/Makrophagen. Außerdem liegt der vitale Zellkern deutlich sichtbar innerhalb eines Kardiomyozyten und nicht in seiner Nachbarschaft. Im Rahmen der Erfassung der Monozyten wurden nur jene berücksichtigt, die sich im Gewebe des linken Ventrikels und nicht im Blut, oder im rechten Ventrikel befanden. 73 Ergebnisse Abb.19: Repräsentatives Herz eines WT-Tieres ohne LAD-Ligatur, IHC- Färbung, Längsschnitt eines Areals. a)Übersichtsaufnahme bei 4-facher Vergrößerung, b)10-fache Vergrößerung eines Areals innerhalb des linken Ventrikels, c)Ausschnitt der 20-fachen Vergrößerung innerhalb des linken Ventrikels, typische netzartige Struktur, zentral im Kardiomyozyten gelegene Zellkerne. 74 Ergebnisse Abb.20: Repräsentatives Herz eines SHAM operierten KO-Tieres, Myokard im Längs- und Querschnitt. a)Übersichtsaufnahme bei 4-facher Vergrößerung, b) 10-fache Vergrößerung eines linksventrikulär gelegenen Areals, c) Ausschnitt der 20-fachen Vergrößerung eines linksventrikulär gelegenen Areals. Es zeigt sich vitales Myokardgewebe. 75 Ergebnisse Abb.21: Repräsentatives Herz eines WT-Tieres mit LAD-Ligatur, Myokard im Längs- und Querschnitt a)Übersichtsaufnahme in 4-facher Vergrößerung, b) 10-fache Vergrößerung eines linksventrikulären Areals, c) Ausschnitt der 20-fachen Vergrößerung eines linksventrikulären Areals. Es zeigen sich MZ= Monozyten, sowie Kardiomyozyten mit Zellkernverlust sowie lateralisiertem Zellkern. 76 Ergebnisse Abb.22: Repräsentatives Herz eines KO-Tieres mit LAD-Ligatur, Myokard im Längsschnitt. a)Übersichtsaufnahme bei 4-facher Vergrößerung, b) 10-fache Vergrößerung eines linksventrikulär gelegenen Areals, c) Ausschnitt der 20-fachen Vergrößerung des linksventrikulär gelegenen Areals; das Myokard in seiner typischen Struktur ist aufgehoben, es sind keine vitalen Kardiomyozyten anzutreffen (Zellkernverlust), MZ=Monozyten. 77 Ergebnisse 4.3.6. Histomorphometrische Analyse der Immunhistochemischen Färbung In die angeschlossene Auswertung der histologischen Daten flossen die Werte von sechs SHAM operierten WT-Tieren, sechs SHAM operierten KO-Tieren, sowie acht WT-Tieren und acht KO-Tieren mit LAD-Ligatur ein. Von jedem Tier wurde ein immunhistochemisch gefärbter Schnitt jeder Herzebene in die Analyse mit einbezogen. Um auch hier die histologischen Ergebnisse objektivieren zu können wurde mittels eines Grafikprogramms die Fläche der Monozyten am Gewebe des linken Ventrikels ermittelt. Die Monozyten im Lumen, und somit im Blut, wurden dabei nicht berücksichtigt. Anschließend wurde die Größe des Gewebes des linken Ventrikels abzüglich der Größe des Lumens erfasst, um den prozentualen Anteil der Monozyten am linken Ventrikel zu berechnen. Bei SHAM operierten WT-Tieren machen die Monozyten im Mittel 4,79% des Gewebes des linken Ventrikels, abzüglich des Lumens, aus. Bei SHAM operierten KO-Tieren sind es rund 4,64%. Rechnerisch kann somit keine Signifikanz ermittelt werden (4,79%±1,81%, n=6; 4,64%±1,19%, n=6; p>0,05). Im Vergleich von WT- Tieren mit LAD-Ligatur, sowie KO-Tieren mit LAD-Ligatur kann ebenfalls keine Signifikanz detektiert werden. Der Monozytenanteil am Gewebe beträgt bei den WT-Tieren im Mittel 9,02% und bei den KO-Tieren 7,52%, sodass sich rechnerisch keine Signifikanz ergibt (9,02%±1,79%, n=8; 7,52%±1,23%, n=8; p>0,05). 78 Ergebnisse IHC- Färbung Monozytenanteil am LV Monozytenanteil [%] des LV 12 10 8 WT SHAM KO SHAM 6 WT KO 4 2 0 Abb. 23: Monozytenanteil [%] des LV abzüglich des Lumens. Verglichen werden SHAM operierte WT- und KO-Tiere sowie WT- und KO-Tiere mit LAD-Ligatur. 4.3.7. Deskriptive Analyse der TTC- Färbung Mittels der TTC- Färbung ist es möglich drei verschiedene Arten von Gewebe nach einem Infarkt zu unterscheiden. Zum einen färbt sich jenes Gewebe, welches nicht von dem Infarkt in Mitleidenschaft gezogen wurde, also vital ist, blau. Gewebe, in dem es im Rahmen des Infarktes zu einer Ischämie gekommen ist, das aber noch nicht abgestorben ist, verfärbt sich rot. Man spricht von der sogenannten Area-at-risk. Gewebe, welches hingegen unwiderruflich abgestorben ist erscheint in dieser Färbung weiß. Dieses Gewebe ist das eigentliche Infarktgewebe. Mittels der TTC- Färbung sollte untersucht werden, ob es zwischen WTTieren und KO-Tieren nach einer LAD-Ligatur zu einer unterschiedlichen Größenausprägung der verschiedenen Areale kommt. 79 Ergebnisse Abb 24: Links: Repräsentative Übersichtsaufnahme eines mit der TTC- Färbung behandelten Herzens einer WT-Maus nach LAD-Ligatur bei 4-facher Vergrößerung. Rechts: Repräsentative Übersichtsaufnahme eines Herzschnittes einer KO-Maus nach LAD-Ligatur und TTC- Färbung bei 4-facher Vergrößerung. (Herstellung der Fotographien und Färbungen durch Dr. rer. med. Martin Wolny). 4.3.8. Histomorphometrische Analyse der TTC- Färbung In die angeschlossene Auswertung der histologischen Daten flossen die Werte von zehn WTTieren und elf KO-Tieren mit LAD-Ligatur ein. Von jedem Tier wurden alle Ebenen von der Herzspitze bis zum Beginn der Ventilebene in die Analyse mit einbezogen. Um die histologischen Beobachtungen objektivieren zu können, wurden, mittels eines Grafikprogrammes, das Infarktareal, Area-at-risk und das vitale Areal, einzeln vermessen. Hierbei wurde lediglich das Gewebe des linken Ventrikels berücksichtigt. Der rechte Ventrikel wurde ausgespart. Die Größe der Area-at-risk und des Infarktareals wurden addiert und als 100% des zu beurteilenden Gewebes betrachtet, da sie gemeinsam das Versorgungsgebiet der LAD repräsentieren (tAAR= total Area-at- risk). Das Infarktgebiet wurde in Bezug zur tAAR berechnet. Im Rahmen der Auswertung der Daten der TTCFärbung zeigte sich, der Größenvergleich der Non-Area-at-risk zwischen WT-Tieren und KOTieren mit LAD-Ligatur keinen signifikanten Größenunterschied (39,47%±1,39%, n=10; 35,46%±1,05%, n=11; p>0,05). Somit ist das Versorgungsgebiet der LAD bei WT-Tieren und KO-Tieren in etwa gleich groß. Bei dem Größenvergleich der Area-at-risk zwischen WT80 Ergebnisse Tieren und KO-Tieren kann hingegen eine Signifikanz beobachtet werden (23,37%±0,79%, n=10; 15,29%±0,64%, n=11; *p<0,05). Das Herzgewebe, welches potenziell noch zu retten ist, ist in der Gruppe der WT-Tiere signifikant größer, als in der Gruppe der KO-Tiere. Auch im Bezug auf die Größe des Infarktgewebes bezogen auf die tAAR gibt es einen signifikanten Unterschied zwischen WTTieren und KO-Tieren zu verzeichnen (58,85%± 1,14%, n=10; 78,01%± 1,11%, n=11; #p< 0,05). KO-Tiere haben im Durschnitt ein 19% größeres Infarktareal als WT-Tiere. Dies bedeutet, dass KO-Tiere mehr Gewebe haben, das auch durch adäquate therapeutische Maßnahmen nicht mehr gerettet werden kann. Abb.25: Mittelwerte [%] der verschiedenen Areale (Non-area-at-risk/vitales Gewebe, Area-atrisk, Infarktgewebe) des LV in der TTC- Färbung im Vergleich (Datenerhebung durch Dr. rer. med. Martin Wolny). 81 Ergebnisse Abb. 26: Darstellung des prozentualen Anteils des Infarktgewebes an der Area- at- risk. Verglichen werden die WT-Gruppe und die KO-Gruppe mit LAD- Ligatur (Grafik erstellt von Dr. rer. med Martin Wolny). 4.3.9. Mitochondriale ROS-Produktion Wie bereits beschrieben konnte in mehreren wissenschaftlichen Arbeiten gezeigt werden, dass ROS eine schädigende Wirkung auf verschiedenste Gewebe zeigt, und dass UCP2 die ROS- Konzentration zu beeinflussen vermag. Um die Konzentration an ROS ermitteln zu können, welches innerhalb des Gewebes sehr rasch in H₂O₂ umgewandelt wird, wurde die Fluoreszenzmessung von Amplex Ultra Red an isolierten Mitochondrien von insgesamt 42 Versuchstieren herangezogen, das ROS in H₂O₂ umsetzt. Anhand der Fluoreszenzmessung ergab sich, dass es keinen signifikanten Unterschied in dem H₂O₂- Gehalt der Gewebe von WT- und KO- Tieren zu verzeichnen gibt. 82 Ergebnisse Wird die Bildung von ROS, und somit die Bildung von H₂O₂, mittels der Zugabe von PMA stimuliert, so kann eine deutliche Zunahme mittels der Fluoreszenzmessung in beiden Gruppen beobachtet werden. Unter maximaler Stimulation der ROS- Produktion wird in der Gruppe der KO-Tiere signifikant mehr ROS gebildet, als in der Gruppe der WTTiere. Weitere Messungen zeigen sogar, dass KO-Tiere mit LAD-Ligatur und ohne zusätzlich stimulierendes Substrat der ROS- Bildung bereits eine ähnliche Menge an H₂O₂ aufweisen, wie WT-Tiere, deren H₂O₂ -Produktion durch PMA angeregt wurde. Als Lösungsmittel für PMA wurde DMSO verwendet. Gruppe n Mittelwert- Standardabweichung Standardfehler Slope (10min) WT 6 0,1354 0,0085 0,0035 KO 6 0,1403 0,0104 0,0042 WT+PMA 6 0,1943 0,0095 0,0039 WT+Infarkt 6 0,1566 0,0121 0,0049 KO+PMA 6 0,3080 0,0150 0,0087 KO+Infarkt 6 0,1830 0,0137 0,0079 6 0,1280 0,0131 0,0076 (Tag 4) (Tag 4) WT+DMSO Abb. 27: Tabellarische Auflistung der Messdaten bezüglich des Fluoreszenzanstiegs durch die Präsenz von H₂O₂ im Gewebe. ( Datenerhebung durch Dr. rer. med. Martin Wolny). 83 Ergebnisse Slope Amplex UltraRed fluorescence 0,35 0,30 0,25 Kontrolle UCP2 -/- 0,20 Kontrolle+PMA UCP2 -/- +PMA 0,15 UCP2 -/- +Infarkt WT+DMSO 0,10 0,05 0,00 Abb.28: Grafische Darstellung des Fluoreszenzanstiegs innerhalb der verschiedenen Gruppen. (Datenerhebung durch Dr. rer. med. Martin Wolny). 84 Diskussion 5. Diskussion In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des UCP2 auf die Infarktgewebsgröße, beziehungsweise auf die Größe pathologisch veränderten Gewebes, im Rahmen eines LADInfarktes am Herzen von WT-Mäusen und KO-Mäusen ermittelt werden, um einen eventuellen Vorteil der Präsenz von UCP2 aufzuzeigen. Desweiteren sollte gezeigt werden, durch welchen Mechanismus UCP2 die Größe von pathologisch veränderten Bereichen beeinflusst. Nach bisherigen Erkenntnissen ist das UCP2 in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert. Seine Struktur ist bis heute auf molekularer Ebene nur ansatzweise entschlüsselt. Die ersten Untersuchungen bezüglich seiner Funktion erfolgten bereits im Jahre 1997 nach seiner Entdeckung (30).Die erste Publikation nach der Entdeckung des UCP2 beschäftigte sich mit der Frage auf welche Prozesse des Körpers das UCP2 Einfluss nimmt. Die erste Studie zu diesem Thema wurde 1997 von der Arbeitsgruppe um Fleury veröffentlicht. Sie beschäftigte sich vor allem mit der Frage, welchen Einfluss UCP2 auf Fettleibigkeit und den Insulinhaushalt zeigt (30). Weitere Publikationen zu diesem Thema folgten zum Teil mit Ausweitung auf das Thema Thermogenese (9; 63; 71). Bereits 1997 wurde durch die Arbeitsgruppe um Negre-Salvayre beschrieben, dass das UCP2 Einfluss auf die Generierung von freien Radikalen in Mitochondrien nimmt (61). Dies gelingt durch die Modulierung der Kopplung zwischen der Atmungskette und der ATP-Synthese. Auf diesem Weg beeinflusst das UCP2 auch das Ausmaß von oxidativen Schäden, Inflammation oder Apoptose. Um zu dieser Erkenntnis zu gelangen, blockierte die Arbeitsgruppe um Negre-Salvayre das UCP2 in frakturierten Mitochondrien, zum Beispiel aus dem Thymus oder der Milz, mittels GDP. Die Folge der Blockierung des UCP2 war ein deutlicher Anstieg der H₂O₂ Konzentration (61). 1998 wurden dann die mRNA des UCP2 zum ersten Mal mittels Nothern blot im Herzen einer Ratte nachgewiesen (41). 2003 wurde schließlich die erste Studie veröffentlicht, in der eine kardioprotektive Wirkung des UCP2 beschrieben wird, dadurch, dass es die Einleitung der Apoptose, unter Beeinflussung der ROS- Produktion und des Kalziumhaushaltes, verhindern kann. Die Versuche wurden an kultivierten neonatalen Kardiomyozyten vorgenommen (76). Eine Reihe weiterer Studien an anderen Gewebearten, zum Beispiel am Gehirn, unterstützen die Vermutung des protektiven Effektes des UCP2. Hierbei wurden Messungen an Gehirnen vorgenommen, welche durch einen Schlaganfall (53; 85 Diskussion 54), durch epileptische Anfälle (25) oder aber durch neurodegenerative Erkrankungen geschädigt wurden (11). Es konnte gezeigt werden, dass das Überleben von Hirngewebe mit der Zunahme der UCP2 Exprimierung korreliert, denn umso mehr UCP2 vorhanden ist, desto weniger Gewebe wird geschädigt. Außerdem kommt es zu einer besseren Erholung des Gewebes nach einer eingetretenen Schädigung, wenn mehr UCP2 vorhanden ist (53). Der protektive Effekt im Rahmen des Schlaganfalls wird dadurch hervorgerufen, dass das UCP2 eine Überladung der Mitochondrien mit Kalziumionen verhindert, und somit die Wahrscheinlichkeit für die Einleitung der Apoptose verringert. Außerdem sorgt es durch die Abnahme des Membranpotentials der inneren Mitochondrienmembran für die Abnahme der ROS- Produktion, welche potenziell zu einem Zellschaden führen kann (10; 53; 54). Da die Regulierung des Kalziumhaushaltes eine wichtige Rolle im Aufgabenfeld des UCP2 zu spielen scheint, wurden etliche Studien durchgeführt, die sich speziell mit dem Zusammenhang der Kalziumregulierung und der Aktivität des UCP2 beschäftigten. Ergebnis dieser Studien war, dass das UCP2 nicht alleine für die Regulierung des Kalziumhaushaltes verantwortlich ist, sondern das es andere Mechanismen der Kalziumregulation unterstützt, indem es eine vermehrte Aufnahme von Kalziumionen in die Mitochondrien ermöglicht und somit zytotoxische Effekte durch zu hohe zytosolische Kalziumkonzentrationen verhindert (6; 7; 18; 52; 61). Andererseits wirkt es aber auch einer Überladung der Mitochondrien mit Kalziumionen entgegen, die ihrerseits ebenfalls die Apoptose einleiten kann. Basierend auf den oben beschriebenen Arbeiten, sollte am Mausmodell, mit einem histologischen Ansatz untersucht werden, ob das Ausmaß der Myokardschädigung bei einer bestehenden Ischämie durch die An- oder Abwesenheit von UCP2 beeinflusst wird. Daher wurde das Outcome von KO-Tieren mit dem von WT-Tieren nach einem LAD-Infarkt verglichen. Im Rahmen der HE- Färbung und der MG- Färbung ergaben sich, wie bereits beschrieben, keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Ausmaßes des pathologisch veränderten Areals betrachtet man die KO-Tieren mit den WT-Tieren nach einem LAD-Infarkt im Vergleich. Dieses Ergebnis war zum einen zu erwarten, aufgrund der Funktionsweise der beiden Färbungen (36; 56; 57), zum anderen aufgrund der Tatsache, dass der Mechanismus der Infarkterzeugung derselbe war, und somit ein ähnlich großes Infarktareal zu erwarten ist (37; 68). Durch die Verwendung der beiden Färbungen konnte bestätigt werden, dass sich das 86 Diskussion Versorgungsgebiet der LAD in keinem der Versuchstiere signifikant unterscheidet, sodass die Ergebnisse der im Anschluss durchgeführten TTC- Färbung, nicht aufgrund verschieden großer LAD- Versorgungsgebiete verfälscht werden. Die MG- Färbung diente, anders als die HE-Färbung, zusätzlich der Darstellung von Bindegewebe, welches nach den abgeschlossenen Umbauprozessen den Hauptbestandteil des Infarktareals ausmacht, und somit mit der Infarktgröße korreliert. Auch hier fanden sich, wie bereits beschrieben, keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist die Tatsache, dass das Bindegewebe erst neun bis zehn Tage nach einem Infarkt nahezu vollständig mikroskopisch darstellbar ist (8; 39; 77). Da die Versuchstiere allerdings bereits vier Tage post operationem getötet und untersucht wurden, sind die Umbauprozesse des Infarktareals noch nicht abgeschlossen, sodass in unserem Falle der Bindegewebsanteil noch nicht mit der Größe des Infarktareals korreliert. Die TTCFärbung wurde als ergänzende Färbung im Rahmen dieser Arbeit verwendet, da sowohl die HE- Färbung, als auch die MG- Färbung eine Schwäche haben. Sie sind dazu in der Lage pathologisch verändertes Gewebe von vitalem Gewebe abzugrenzen. Allerdings sind beide Färbemethoden nicht dazu in der Lage, das geschädigte Gewebe nochmals differenzierter aufzuzeigen. Im Rahmen dieser Färbungen kann nicht unterschieden werden, ob das Gewebe bereits unwiderruflich zugrunde gegangen ist, oder ob es durch adäquate Maßnahmen potenziell noch zu retten ist. Die TTC- Färbung hingegen ist dazu in der Lage das pathologisch veränderte Gewebe weiter zu differenzieren in Area-at-risk und das tatsächliche Infarktgewebe (37; 84). Bei dieser Färbung ergab sich, dass KO-Tiere einen signifikant höheren Anteil an Infarktgewebe aufweisen als WT-Tiere. WT-Tiere hingegen zeigen eine signifikant größere Area-at- risk. Anhand dieses Ergebnisses ergibt sich die Theorie, dass Tiere, welche über UCP2 verfügen mehr Gewebe aufweisen, welches durch die richtigen und rechtzeitigen Interventionen potenziell noch gerettet werden kann, wodurch sich dann die Schwere und die Folgen des Myokardinfarktes verringern würden. Etliche Studien konnten bereits zeigen, dass durch Interventionen wie zum Beispiel, Stenteinlagen, Bypässe oder ähnliches die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt verbessert werden kann (37; 72). Somit lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass das UCP2 tatsächlich eine protektive Wirkung auf das Myokard zeigt. Unsere Untersuchungen zeigen, dass das UCP2 zwar keinen Einfluss auf die Gesamtgröße des pathologisch veränderten Gewebes an sich nimmt, da es nicht das Versorgungsgebiet der 87 Diskussion LAD beeinflussen kann, aber es ist, wie bereits andere Studien zeigten, dazu in der Lage den Kalzium- und ROS- Haushalt derartig zu beeinflussen, dass die Apoptose nicht unmittelbar eingeleitet wird. Bis zu einem bestimmten Punkt kann die Apoptose zumindest verzögert werden, sodass die Chance entsteht Gewebe zu retten, welches sonst nicht mehr zu retten gewesen wäre. Desweiteren haben die Versuche dieser Arbeit gezeigt, dass die Sterberate, im Rahmen eines Myokardinfarktes, in der Gruppe der KO- Tiere signifikant höher ist als die der WTTiere. Dieses Phänomen wurde bereits in mehreren Dissertationen ebenfalls beschrieben (1; 17; 33). Die Anzahl der verendeten Tiere ist am ersten postoperativen Tag nicht signifikant, vergleicht man die Gruppe der KO- Tiere mit jener der WT- Tiere. Die Tiere versterben, wie auch der Mensch, an den sogenannten Frühkomplikationen eines Infarkts. Die häufigste Todesursache hierbei ist der Tod durch Herzrhythmusstörungen. Zweithäufigste Todesursache ist ein Pumpversagen (12; 35; 40; 65). Desweiteren wurde beobachtet, dass die Sterberate der KO- Tiere am vierten und fünften postoperativen Tag am höchsten und signifikant zu den WT- Tieren, ist. Unsere Theorie ist, dass diese Beobachtung unter anderem in Verbindung mit der Tatsache steht, dass die Monozyten am vierten und fünften Tag das Maximum ihrer Aktivität erreichen (8). In der IHC- Färbung sollte untersucht werden, ob nach dem Infarktgeschehen unterschiedlich viele Monozyten das betroffene Areal infiltrieren. Im Rahmen dieser Färbung konnte allerdings keine Signifikanz detektiert werden, weder im Vergleich der Kontrollgruppe mit der Infarktgruppe noch innerhalb der einzelnen Versuchsgruppen. Die Arbeiten anderer Gruppen lassen den Schluss zu, dass diese Beobachtung darauf zurückzuführen ist, dass gleichartige Eingriffe zu gleichartigen Anstiegen in der Anzahl der Monozyten führt, da ähnliche chirurgische Eingriffe zu einem ähnlichen Maß an operativem Stress führen (2; 50). Außerdem haben alle Tiere durch das abbinden der LAD ein ähnlich großes pathologisch verändertes Gewebsareal. Daher ist es naheliegend, dass im Rahmen des Remodelings auch eine ähnliche Anzahl an Makrophagen benötigt wird. Auf der einen Seite werden durch die Makrophagen, zur Beseitigung der Zelltrümmer, lytische Enzyme freigesetzt, die zu einer Aufweichung des Gewebes beitragen, andererseits sind Makrophagen dafür bekannt, dass sie in ihrem aktiven Zustand reichlich zur ROSProduktion beitragen, welches die bekannte gewebeschädigende Wirkung zeigt (5;13). Doch ist eine gleiche Zahl an Monozyten/Makrophagen nicht gleichbedeutend mit einer identischen 88 Diskussion Bildung und Freisetzung von zum Beispiel ROS oder lytischen Enzymen. So kann eine gleiche Anzahl an Monozyten bei Fehlen von UCP2 einen massiven Anstieg der ROSProduktion zur Folge haben und somit zu einem schlechteren Outcome der betroffenen Gruppe führen. Eine derartige Analyse ist allerdings mittels der IHC-Färbung nicht möglich, da diese lediglich eine Aussage über die Monozytenanzahl erlaubt, jedoch nicht über ihre Stoffwechselaktivität. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich die ROS-Produktion im Gewebe von KO-Tieren und WT-Tieren ermittelt. Auch andere Arbeiten konnten bereits zeigen, dass auch die Bildung von ROS in Makrophagen abhängig ist von der Exprimierung von UCP2, konnte doch gezeigt werden, dass Makrophagen aus KO- Tieren deutlich mehr ROS generieren, als aus WT- Tieren (5). Das Zusammenspiel aus lytischen Enzymen und vermehrter Schädigung des Gewebes durch ROS, aus Makrophagen und Mitochondrien, führt dann zum Tod der Tiere durch die Ruptur der Herzwand. Der Tod durch Herzwandruptur konnte durch eine Obduktionen der verendeten Tiere bei allen Versuchstieren, die nach dem vierten Tag post operationem verstarben, nachgewiesen werden. Als Vorbote der Spätkomplikation des Infarktes bildete sich zunächst ein Herzwandaneurysma aus. Dies hat eine Verdünnung der linksventrikulären Wand zur Folge. Wirken nun die gewöhnlichen diastolischen und systolischen Drücke auf die Herzwand ein, so kann die Herzwand im Verlauf diesen Drücken nicht mehr standhalten und es kommt zur Ruptur (60; 79). Zur Sicherung der Theorie, dass unterschiedliche ROSKonzentrationen zu einer unterschiedlichen Mortalitätsrate führen kann, kann die Fluoreszenzmessung unserer Arbeit herangezogen werden, da diese dazu dient den ROSAnstieg in den Mitochondrien der verschiedenen Versuchsgruppen zu detektieren. Im Rahmen des Versuchsaufbaus sorgte PMA für die unspezifische Aktivierung der PKC. Diese wiederum bewirkt unter anderem eine Öffnung der mitochondrialen Kaliumkanäle, was wiederum das Gleichgewicht der Atmungskette stört, und somit auf diese Weise zu einer maximalen Produktion an ROS in den Mitochondrien führt. Die Aktivierung mitochondrialer Kaliumkanäle verringert das mitochondriale Membranpotential. Die KO- Tiere mit LADLigatur zeigten den höchsten Anstieg in der ROS- Konzentration. Zahlreiche andere Publikationen bestätigen den Anstieg von ROS unter der Abwesenheit von UCP2 im Mitochondrium (10; 26; 53). Somit kann passend zu unseren Ergebnissen angenommen werden, dass die Abwesenheit von UCP2 und die dadurch folgende Zunahme der ROS Konzentration ursächlich mitverantwortlich ist für die hohe Sterblichkeit der KO Tiere. 89 Diskussion Doch nicht nur der Einfluss der Radikale führt zum Untergang der Zellen. Auch die Veränderungen im Kalziumhaushalt der Zelle tragen dazu bei. Wie neuere, allerdings umstrittene, Studien belegen, ermöglicht das UCP2 einerseits eine vermehrte Aufnahme von Kalzium in die Mitochondrien und verhindert so zytotoxische Effekte durch zu hohe zytosolische Kalziumkonzentrationen (78). Andererseits schleust das UCP2 zu viel Kalzium in den Mitochondrien wieder aus, um ein Öffnen der mPTP zu verhindern, damit keine Botenstoffe zur Aktivierung der Apoptose aus den Mitochondrien freigesetzt werden können (54). Es muss also eine Balance gefunden werden zwischen dem Absterben des Kardiomyozyten an seiner eigenen Kontraktion, die dann eintritt, wenn das Kalzium im Zytosol der Zelle auf Dauer zu hoch ist und zu einer Verarmung des Kardiomyozyten an ATP führt (8), und zwischen der Überladung der Mitochondrien mit Kalzium, welche eine Veränderung des Membranpotentials zur Folge hat, das seinerseits dann wiederum in die Freisetzung von Botenstoffen der Apoptose über die mPTP, und somit zum Tod des Kardiomyozyten führt. Genauer formuliert gilt, dass die Präsenz der ROS zu einer Hemmung der Ca²+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums führt (29) und „über eine Aktivierung des „reverse mode“ Na+/Ca+ Austauschers zu einer cytosolischen Ca²+-Überladung, welche ebenfalls zu einer erhöhten Ca²+-Konzentration im Mitochondrium führt“(23; 85). Als Folge dieser Vorgänge kommt es zu einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials mit Induktion einer mitochondrialen Schwellung. Diese Schwellung führt schlussendlich über die Öffnung der mPTP zur Apoptose (38). Somit scheint das UCP2 innerhalb dieses Regelkreises neben all den anderen bereits bekannten Kalziumtransportern eine bedeutende regulatorische Funktion einzunehmen. 90 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Mitochondrien haben eine wesentliche Bedeutung bei der Protektion verschiedener Gewebe gegen eine Zellschädigung sowie einen Zelluntergang durch Apoptose oder Nekrose zum Beispiel im Rahmen einer Ischämie oder im Rahmen von degenerativen Prozessen. Es gibt Hinweise, dass das mitochondriale Protein UCP2 durch Einfluss auf den zellulären Kalziumhaushalt sowie auf die ROS- Produktion an den Pathomechanismen, die Apoptose und somit den unwiderruflichen Zelltod einleiten, beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit sollte am Mausmodell mit einem histologischen Ansatz untersucht werden, ob das Ausmaß der Myokardschädigung bei einer bestehenden Ischämie durch die An- oder Abwesenheit von UCP2 beeinflusst wird, und ob hierbei die ROS- Produktion als ursächlicher Faktor des Zelluntergangs eine nachweisliche Rolle spielt. Hierzu wurde bei WT- Mäusen sowie bei UCP2 KO- Mäusen ein Vorderwandmyokardinfarkt, mittels eines operativen Verfahrens durch Ligatur des Koronargefäßes (LAD), induziert. Nach Entnahme der Herzen am vierten postoperativen Tag erfolgte eine histologische Aufarbeitung des Myokards mittels unterschiedlicher Färbemethoden. Zudem erfolgte eine Fluoreszenzmessung zum Nachweis der Intensität der ROS-Produktion in Mitochondrien aus WT- und KO- Mäusen mit und ohne LAD-Ligatur. Die histologische Aufarbeitung des Myokardgewebes zeigte mittels Hämatoxylin- Eosin Färbung, dass sich die Größe des Ischämieareals zwischen WT-Mäusen und UCP2 KOMäusen nicht unterschied, was eine vergleichbare Operationstechnik und ein vergleichbares Perfusionsareal der LAD in beiden Gruppen bestätigte. In SHAM operierten Tieren fand sich kein Ischämieareal als Nachweis einer korrekten Durchführung der HE-Färbung. Mittels Masson-Goldner Färbung ergab sich kein Unterschied des Bindegewebsanteils im Ischämieareal zwischen WT- und UCP2 KO-Mäusen. Auch die Infiltration durch Monozyten war nicht unterschiedlich. Die TTC-Färbung zeigte jedoch bei gleicher „Area-at-risk“ einen signifikant größeren Anteil avitalen Myokards in UCP2 KO-Mäusen im Vergleich zu WTTieren. Die Anwesenheit von UCP2 reduzierte somit den Anteil an Kardiomyozyten, die unwiderruflich untergehen und verminderte das definitive Infarktareal. Zudem wurde in der Gruppe des Knockouts eine deutlich höhere Mortalität zwischen dem vierten bis fünften postoperativen Tag durch Myokardruptur beobachtet. 91 Zusammenfassung Es konnte gezeigt werden, dass in vitalen Kardiomyozyten, ohne Einflussnahme auf den Stoffwechsel der Mitochondrien, kein signifikanter Unterschied in der ROS- Produktion zwischen den KO- und WT- Tieren bestand. Stimulierte man jedoch die ROS- Produktion der Mitochondrien z.B. durch die Hinzugabe einer Chemikalie (PMA) oder die Erzeugung einer Ischämie, so zeigte sich, dass Kardiomyozyten unter der Präsenz von UCP2 eine signifikant geringere Menge an ROS produzierten als UCP2 KO-Kardiomyozyten. Durch histologische Färbungen konnte gezeigt werden, dass WT-Tiere signifikant weniger Myokardinfarktgewebe nach einem ischämischen Ereignis zeigen als UCP2 KO-Tiere und eine deutlich bessere Überlebenschance im Rahmen eines Myokardinfarktes aufweisen. Es gibt Anhalte dafür, dass UCP2 über mehrere Mechanismen an der Protektion von Zellen beteiligt ist und hierbei u.a. die Regulation der ROS-Produktion eine Rolle spielt. UCP2 scheint somit ein vielversprechendes Zielprotein für die zytoprotektive Wirkung im Rahmen von ischämischen Geschehen zu sein, auch wenn bis heute noch nicht geklärt ist, wie UCP2 genau aufgebaut ist. 92 Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis 1. Andrews, Z.B., and Horvath, T.L. (2009). Uncoupling protein-2 regulates lifespan in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 296, E621-627. 2. Aosasa, S., Ono, S., Mochizuki, H., Tsujimoto, H., Osada, S., Takayama, E., Seki, S., and Hiraide, H. (2000). Activation of monocytes and endothelial cells depends on the severity of surgical stress. World J Surg 24, 10-16. 3. Arechaga, I., Ledesma, A., and Rial, E. (2001). The mitochondrial uncoupling protein UCP1: a gated pore. IUBMB Life 52, 165-173. 4. Argiles, J.M., Busquets, S., and Lopez-Soriano, F.J. (2002). 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