Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2
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Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen Lymphom des Hundes THESE Zur Erlangung des Grades eines Philosophical Doctor -Ph.D.im Fachgebiet Kleintierkrankheiten durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Katja Culmsee aus Köln Hannover 2004 2 Supervisor: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek Univ.-Prof. Dr. W. Löscher Univ.-Prof. Dr. I. Nolte 1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik, Universität Bremen Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere, Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. M. Reinacher, Institut für Veterinärpathologie, Justus Liebig Universität Giessen Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2004 3 MEINEN ELTERN 4 5 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ..................................................................................................................... 11 2 LITERATURÜBERSICHT................................................................................................ 13 2.1 MALIGNES LYMPHOM DES HUNDES ................................................................................ 13 2.2 P-GLYKOPROTEIN ........................................................................................................... 16 2.3 MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN (MRP) ................................................. 21 2.3.1 MRP1....................................................................................................................... 21 2.3.2 MRP2....................................................................................................................... 22 2.4 APOPTOSE UND ZYTOSTATIKARESISTENZEN ................................................................... 23 2.4.1 Survivin.................................................................................................................... 24 2.5 WEITERE MECHANISMEN ................................................................................................ 26 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ........................................................................ 27 3.1 TIERE .............................................................................................................................. 27 3.2 DIAGNOSE UND KLINISCHE STADIENEINTEILUNG ............................................................ 29 3.3 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 30 3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges ........................................................................... 32 3.4 ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN ...................................................................... 33 3.5 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG ............................................................................................. 33 3.6 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON P-GLYKOPROTEIN ....................................... 35 3.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN ............................................................... 37 3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA.................................................................................... 37 3.7.2 DNase-Behandlung ................................................................................................. 38 3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA .................................................................................... 38 3.7.4 Reverse Transkription (RT)..................................................................................... 39 3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ........................... 40 3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe ................................................ 45 3.8 STATISTISCHE AUSWERTUNG .......................................................................................... 46 3.9 REAGENZIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................... 47 3.9.1 Probenentnahme und Lagerung .............................................................................. 47 6 3.9.2 Immunphänotypisierung.......................................................................................... 47 3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung...................................................................... 48 3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen .................................................................. 49 4 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 50 4.1 ALLGEMEINE PATIENTENCHARAKTERISTIKA .................................................................. 50 4.2 KLINISCHE STADIENEINTEILUNG ..................................................................................... 51 4.3 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG ............................................................................................. 52 4.4 KALZIUMPLASMASPIEGEL ............................................................................................... 52 4.5 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 53 4.5.1 Initiale Chemotherapie............................................................................................ 53 4.5.2 Zweite Chemotherapie............................................................................................. 55 4.6 REAL-TIME RT-QPCR..................................................................................................... 56 4.6.1 Sensitivität der qPCR .............................................................................................. 56 4.6.2 MDR1-Genexpression ............................................................................................. 57 4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression .......................................................................... 67 4.7 RT-PCR ZUM NACHWEIS VON SURVIVIN MRNA............................................................ 76 4.8 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER P-GLYKOPROTEINEXPRESSION .............. 77 5 DISKUSSION ...................................................................................................................... 79 6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 88 7 SUMMARY.......................................................................................................................... 90 8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 92 9 ANHANG ........................................................................................................................... 126 9.1 RASSE UND ALTER DER AN LYMPHOM ERKRANKTEN HUNDE........................................ 126 9.2 REZEPTUREN DER VERWENDETEN LÖSUNGEN UND GELE .............................................. 128 9.3 VERWENDETE FORMELN UND GLEICHUNGEN................................................................ 129 9.4 ERGEBNISSE DER RT-QPCR-MESSDURCHGÄNGE ......................................................... 130 7 Abkürzungsverzeichnis ® ...................................................eingetragenes Warenzeichen A ...................................................Adenin ADM .............................................Doxorubicin AP .................................................Antisense-Primer Art.-Nr. .........................................Artikelnummer bp ..................................................Basenpaare C ...................................................Cytosin ca ..................................................kanine CD ................................................cluster of differentiation cDNA ...........................................komplementäre DNA CR .................................................komplette Remission Ct ..................................................cycle threshold CTX ..............................................Cyclophosphamid CV ................................................Variationskoeffizient DAB .............................................3,3 Diaminobenzidin DEPC ............................................Diethylpyrocarbonat dest. ..............................................destilliert DNA .............................................Deoxyribonukleinsäure DNase ...........................................Deoxyribonuclease dNTP ............................................Desoxynucleotidtriphosphat dR .................................................Grundlinien korrigierte Fluoreszenz dRn ...............................................Grundlinien korrigierte normalisierte Fluoreszenz dt.....................................................deutscher DTT ..............................................Dithiothreitol Fa. .................................................Firma FAM .............................................6-Carboxy-Fluorescein FITC .............................................Fluoreszeinisothiocyanat FNA ..............................................Feinnadelaspirat g ....................................................Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²) 8 G ...................................................Guanin GSH ..............................................Gluthation h ....................................................Stunde HPRT ............................................Hypoxanthinphosphoribosyltransferase i.v. .................................................intravenös kDa ...............................................Kilodalton kg ..................................................Kilogramm KGW ............................................Körpergewicht KOF ..............................................Körperoberfläche kum. ..............................................kumulativ L-Asp ............................................L-Asparaginase LCS ................................................Lymphonodus cerficalis superficialis dexter LCSS ............................................Lymphonodus cerficalis superficialis sinister LJ ..................................................Lymphonodus jejunalis LMD .............................................Lymphonodus mandibularis dexter LMS ..............................................Lymphonodus mandibularis sinister LPD ..............................................Lymphonodus popliteus dexter LPS ...............................................Lymphonodus popliteus sinister MDR .............................................multidrug resistance mg .................................................Milligramm MGB .............................................minor groove binder MRP .............................................Multidrug Resistance Associated Protein MTX .............................................Methotrexat MW ...............................................arithmetischer Mittelwert n ....................................................Anzahl an Tieren / Proben Nr. .................................................Nummer OD ................................................optische Dichte p ....................................................Irrtumswahscheinlichkeit PBS ...............................................Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PCR ..............................................Polymerase-Kettenreaktion PE .................................................Phycoerythrin 9 PerCP ............................................Peridin-Clorophyll-a-Prpteinkomplex PR .................................................partielle Remission Pred ...............................................Prednisolon qPCR ............................................quantitative Polymerasekettenreaktion R ...................................................Korrelationskoeffizient nach Pearson Real-time RT-qPCR .....................Real-time Reverse Transcription- quantitative PCR RFI ................................................rezidivfreies intervall RNA .............................................Ribonukleinsäure RNase ...........................................Ribonuclease ROX .............................................6-Caboxy-X-Rhodamin RT .................................................Reverse Transkription s.c. .................................................subkutan SD...................................................Standardabweichung SP .................................................Sense-Primer T ...................................................Thymin tägl. ...............................................täglich TAMRA .......................................6-Carboxy-tetramethylrhodamin Tm .................................................Schmelzpunkt ™ ..................................................Warenzeichen u ....................................................units VCR ..............................................Vincristin WHO ............................................Weltgesundheitsorganisation 10 11 1 EINLEITUNG Die Chemotherapie ist ein wichtiger Bestandteil der Tumortherapie beim Kleintier. Sie wird mit dem Ziel der Heilung (z.B. beim Stiker-Sarkom des Hundes (CALVERT et al. 1982)), zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung des Überlebens (z.B. bei multiplen Myelomen, Mastozytomen oder Lymphomen (MATUS et al. 1986; MCCAW et al. 1997; LINK u. HIRSCHBERGER 1999; THAMM et al. 1999)) sowie im Anschluss an eine chirurgische Tumortherapie zur Vernichtung okkulter Mikrometastasen und Verbesserung der lokalen Tumorkontrolle (z.B. bei Hunden mit Osteosarkomen (STRAW et al. 1991)) durchgeführt. Die Wirksamkeit der Chemotherapie wird häufig durch Resistenzen der Tumoren gegen die verfügbaren Zytostatika begrenzt (STEWART u. GORMAN 1991; BERGMAN u. OGILVIE 1995). Grundsätzlich wird in der Onkologie zwischen intrinsischen und erworbenen Zytostatikaresistenzen unterschieden. Tumoren mit intrinsischer Resistenz sind von vornherein chemotherapeutisch nicht beeinflussbar. Als Beispiele hierfür werden beim Kleintier hepatozelluläre und gastrointestinale Karzinome genannt (STEWART u. GORMAN 1991). Tumoren mit erworbener Zytostatikaresistenz reagieren dagegen zunächst auf eine Chemotherapie mit einer Regression. Nach einer gewissen Zeitspanne entwickelt sich jedoch unter der Chemotherapie eine Resistenz gegen die eingesetzten Zytostatika. Es kommt zur Ausbildung eines Rezidivs, und die Tumorzellen werden therapierefraktär (LEHNERT 1996). Diese erworbene Zytostatikaresistenz treten beim Kleintier vor allem in der Therapie von lymphoproliferativen Neoplasien auf (MADEWELL 1999). Eine gleichzeitige Resistenz von Tumorzellen gegen verschiedene, strukturell unterschiedliche Chemotherapeutika wird als Vielfachresistenz oder multidrug resistance (MDR) bezeichnet (BIEDLER u. RIEHM, 1970; DANO 1973). In vitro können Vielfachresistenzen durch eine intermittierende oder langanhaltende Exposition von Tumorzellen mit nur einem Zytostatikum induziert werden (TURKER et al. 1991). Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine, wie zum Beispiel des sogenannten P-Glykoproteins, und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Beim individuellen Patienten können jedoch auch Veränderungen der Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Metabolisierung 12 und Elimination) der eingesetzten Zytostatika den Behandlungserfolg beeinträchtigen (BERGMAN u. OGILVIE 1995). Das maligne Lymphom zählt zu den beim Kleintier am häufigsten chemotherapeutisch behandelten Tumoren. Die überwiegende Mehrheit der an malignem Lymphom erkrankten Hunde entwickelt im Therapieverlauf eine Vielfachresistenz (MADEWELL 1998). In ersten Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein und der Überlebenszeit bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden beschrieben (BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Seit langem ist bekannt, dass neben der Expression von P-Glykoprotein zahlreiche weitere Mechanismen, wie z.B. die Expression von Mitgliedern der Familie der multidrug resistance-associated proteins (MRPs) oder Inhibitoren der Apoptose zur Ausprägung von Vielfachresistenzen in vitro führen können. Im Gegensatz zu vielfachresistenten Zelllinien exprimieren in vivo viele Tumoren die eine Vielfachresistenz vermittelnden Zellmembranproteine nur verhältnismäßig niedrig (BROXTERMAN et al. 1996). Als sehr sensitives Verfahren zum Nachweis einer Expression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der Familie der MRPs auf Nukleinsäureebene wird die Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) angesehen (MURPHY et al. 1990). Ziel der vorliegenden Studie war es, eine RT-PCR zu entwickeln, mit der P-Glykoprotein, MRP1, MRP2 und Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund sicher quantifiziert werden können, mit diesem Verfahren die Expression der Gene in malignen Lymphomen zu bestimmen sowie den Zusammenhang zwischen der Höhe der jeweiligen Genexpression und der chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit in vivo zu untersuchen. 13 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Malignes Lymphom des Hundes Maligne Lymphome sind Tumoren des lymphoretikulären Gewebes und verlaufen fast immer systemisch (ETTINGER 2003). Häufig nehmen sie ihren Ursprung im Lymphknoten, seltener in extranodalen lymphoretikulären Geweben (FAN 2003). Entsprechend der anatomischen Lokalisation des Lymphoms werden multizentrische (etwa 80% der Fälle beim Hund), gastrointestinale, mediastinale, kutane und sogenannte „sonstige“ Formen unterschieden (OWEN 1980; CROW 1987). Die Ätiologie ist unbekannt (MADEWELL 1999). In verschiedenen Studien wurde ein Zusammenhang zwischen der Entstehung von Lymphomen beim Hund und einer Infektion mit Retroviren (TOMLEY et al. 1983), Herbizid- (HAYES et al. 1991) oder Magnetfeldexposition (REIF et al. 1995), dem Leben in Industriegebieten (GAVAZZA et al. 2001), Chromosomenaberrationen (HAHN et al. 1994) sowie einer Störung des Immunsystems (WEIDEN et al. 1974; OWEN et al. 1975) vermutet. Jedoch konnte keine der Hypothesen bisher ausreichend bewiesen werden. Unterbleibt eine adäquate Therapie, ist die Prognose schlecht, die Patienten versterben durchschnittlich vier bis sechs Wochen nach Diagnosestellung (MACEWEN et al. 1981). Durch hochdosierte Kortikosteroidgaben kann zwar bei etwa 50 % der Patienten ein Tumorrückgang erreicht werden, jedoch rezidivieren die Tumoren zum Großteil innerhalb von 4 bis 8 Wochen (SQUIRE et al. 1973; CROW 1982). Die Therapie der Wahl bei Hunden mit Lymphomen ist heute im allgemeinen die Chemotherapie (ROSENTHAL 1996). Chemotherapie Bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden wird die Chemotherapie in erster Linie palliativ zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung der Überlebenszeit eingesetzt (CROW 1987; ETTINGER 2003). Die Zahl der in den letzten 30 Jahren eingesetzten Therapieprotokolle ist relativ beträchtlich (Tabelle 1). Neben der Monochemotherapie mit Doxorubicin haben sich vor allem Kombinationschemotherapien bewährt (ROSENTHAL 1996). 14 Tabelle 1: Ergebnisse einiger in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien zur Wirksamkeit verschiedener Chemotherapieprotokolle bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden Substanzen (Kurzname) n CR PR Remissionsdauer (Median) ASP, CTX, VCR, MTX 59 90% 7% 132 Tage bei CR 1 77 75% 14% 180 Tage bei CR 2 20 70% 100 Tage bei CR 3 21 76% 206 Tage bei CR 3 37 59% 22% 151 Tage bei CR 4 45 84% 7% 210 Tage bei CR 5 41 76% 12% 330 Tage bei CR 5 112 73% 25% 238 Tage bei CR 6 34 94% - 214 Tage bei CR 7 55 84% 7% 252 Tage 8 CTX, VCR, Pred (COP) DOX VCR, CTX, DOX, Pred (COPA) ASP, VCR, CTX, Dox, Pred (ACOPA) ASP, VCR, CTX, CBL, DOX, MTX, Pred (Madison-Wisconsin) Abkürzungen und Fußnoten ASP: L-Asparaginase DOX: Doxorubicin CBL: Chlorambucil CR: komplette Remission CTX: Cyclophosphamid MTX: Methotrexat n: Patientenanzahl PR: partielle Remission Pred: Prednison Ref.: Referenzen VCR: Vincristin 1 2 3 4 5 6 7 8 MACEWEN et al. 1981 COTTER 1983 CARTER et al. 1987 POSTORINO et al. 1989 STONE et al.1991 GREENLEE et al. 1990 MACEWEN et al. 1992 KELLER et al. 1993 Ref. 15 Je nach verwendetem Chemotherapieprotokoll kann bei bis zu 90% der behandelten Patienten ein Rückgang des Tumors erreicht werden (MACEWEN et al 1981; KELLER et al. 1993; VALERIUS et al. 1997). Heilungen sind jedoch sehr selten (MADEWELL 1999). Die Hälfte der Patienten entwickelt innerhalb der ersten sieben bis neun Monate nach Therapiebeginn ein Tumorrezidiv (Tabelle 1). Bei einem Teil der Patienten, die ein Rezidiv entwickeln, kann durch eine Wiederholung der Chemotherapie der Tumor zurückgedrängt und eine erneute Remission induziert werden. Die Dauer der zweiten Remission ist zumeist jedoch deutlich kürzer als die Dauer der ersten Remission. Die Lymphome werden zunehmend gegen die eingesetzten Zytostatika resistent (ETTINGER 2003). Durch Verwendung von Zytostatika, die nicht Bestandteil der ursprünglichen Chemotherapie waren (sogenannte Rettungsprotokolle), können bestehende Zytostatikaresistenzen teilweise umgangen werden (MADEWELL 1999). Bei fast allen bisher erprobten Rettungsprotokollen liegen die Remissionsraten jedoch unter 50% (26-65%) und die mittlere Remissionsdauer unter vier Monaten (61 bis 126 Tage) (VANVECHTEN et al. 1990; MOORE et al. 1994; LUCROY et al. 1998; MOORE et al. 1999; RASSNICK et al. 2002). Letztendlich entsteht bei fast allen Patienten nach einer unterschiedlichen Anzahl an Remissionen eine Vielfachresistenz (multidrug resistance) des Tumors und die Patienten versterben infolge der Lymhomerkrankung (VANVECHTEN et al. 1990). Die 1-Jahres- und 2-Jahres-Überlebensraten liegen bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen in der Regel unter 45% bzw. 25% (ETTINGER 2003). Die zellulären Mechanismen, die zur Ausprägung einer multidrug resistance (MDR) in vitro führen, sind zahlreich. Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Zu den Zellmembranproteinen, die eine MDR vermitteln, zählen u.a. das P-Glykoprotein und Mitglieder der Familie der Multidrug resistanceassociated proteins (MRPs). Aufgrund der großen Bedeutung der MDR für den Erfolg chemotherapeutischer Behandlung wurden diese Proteine nach ihrer Erstbeschreibung in zahlreichen Studien untersucht (RAPPA et al. 1999). 16 2.2 P-Glykoprotein Der bisher am weitesten erforschte Mechanismus, der zur Ausprägung einer MDR führen kann, ist die Expression eines 170 kDa schweren Zellmembranproteins, des sogenannten P-Glykoproteins (KARTNER et al. 1983; UEDA et al. 1987b; SIKIC 1997). Das P-Glykoprotein wurde erstmals 1976 von Victor Ling und Mitarbeitern in Colchicinresistenten Ovarzelllinien von Hamstern beschrieben (JULIANO u. LING 1976). Es gehört zur Familie der ABC (adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette) Transporterproteine und ist eine ATP-abhängige Efflux-Pumpe, welche die Substratmoleküle aus dem Zytoplasma hinauspumpt und sie damit wirkungslos macht (OBST 2000; DEAN et al. 2001). Substrate für das P-Glykoprotein sind zahlreiche Substanzen, darunter verschiedene hydrophobe Zytostatika (Tabelle 2). Tabelle 2: Zytostatika, die beim Menschen durch das P-Glykoprotein transportiert werden (modifiziert nach GOLDSTEIN 1996) Anthracycline Doxorubicin Daunomycin Vinkaalkaloide Vincristin Vinblastin Epiphylotoxine Etoposide Taxane Docetaxel Sonstige Actinomycin-D Mitoxantron Bei Säugetieren wird das P-Glykoprotein von einer kleinen Gen-Familie kodiert (RIORDAN et al. 1985). Bisher sind beim Menschen zwei, beim Hamster, bei der Maus und Ratte drei und beim Schwein fünf Isoformen des P-Glycoproteins beschrieben worden (DG et al. 1989; DEUCHARS et al. 1992; CHILDS u. LING 1996; DEAN et al. 2001). Die mit der Ausbildung der MDR in Zusammenhang stehende Isoform des P-Glykoproteins wird beim Menschen vom MDR1-Gen kodiert (GROS et al. 1986; UEDA et al. 1987a). Bei Hund und 17 Katze wurde das MDR1-Gen mittlerweile ebenfalls sequenziert (STEINGOLD et al. 1998; OKAI et al. 2000). Die Sequenzhomologie zum MDR1-Gen des Menschen beträgt beim Hund 93% (STEINGOLD et al. 1998). Über weitere Isoformen des P-Glykoproteins ist bei diesen Tierarten, soweit aus der Literatur ersichtlich, bisher nichts bekannt. Physiologische Funktion Das P-Glykoprotein wird beim Menschein und Hund vor allem in der Leber (Gallengangskanäle), in den Nebennierenrinden, im Pankreas und Kolon, in den Nieren (proximale Tubulusepithelien) und im Gehirn (Kapillarendothelien) exprimiert (FOJO et al. 1987; GINN 1996). Es wird vermutet, dass das P-Glykoprotein sowohl am Transport exogener als auch endogener Metaboliten, wie zum Beispiel Cortisol, in verschiedenen Geweben beteiligt ist (WOLF u. HURVITZ 1992; VAN KALKEN et al. 1993; FISHER et al. 1996; LEONARD et al. 2003). Eine Bedeutung des P-Glykoproteins für die Funktion der Blut-Hirnschranke konnte anhand von mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen nachgewiesen werden (SCHINKEL et al. 1997). Die Mäuse waren vital und fertil, wiesen jedoch eine erhöhte Sensitivität gegen das neurotoxische Pharmakon Ivermectin sowie gegen Vinblastin auf (SCHINKEL et al. 1994). Ähnliche neurologische Nebenwirkungen wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen treten nach Gabe von Ivermectin bei etwa 1/3 der Hunde der Rasse Collie auf (PAUL et al. 1987). In verschiedenen Studien konnte bei Collies mit einer Überempfindlichkeit gegen Ivermectin, Loperamid oder Zytostatika eine Mutation des MDR1-Gens nachgewiesen werden (MEALY et al. 2001; ROULET et al. 2003; MEALEY et al. 2003; SARTOR et al. 2004). Bei der Mutation handelt es sich um eine 4 Basenpaare umfassende Deletion, die zur Verschiebung des Leserasters und vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese führt (MEALY et al. 2001). Der Anteil an Collies, bei denen beide Allele des MDR1-Gens mutiert sind, liegt in den USA nach einer ersten Studie bei 36% (MEALEY et al. 2002). Neben seiner Bedeutung für die Funktion der Blut-Hirn-Schranke konnte mittels KnockoutMäusen auch eine Beteiligung des P-Glykoproteins an der Absorption und Elimination verschiedener Medikamente sowie beim Schutz vom Knochenmark gegen zytotoxische Chemotherapeutika aufgezeigt werden (SCHINKEL et al. 1997). 18 Modulation der Expression durch Zytostatika und Glukokortikoide Nach dem derzeitigen Erkenntnisstand ist davon auszugehen, dass die Expression von PGlykoprotein und anteren Mitgliedern der ABC Transporterfamilie umfangreichen Regulationsmechanismen unterliegt (SCOTTO 2003). Grundsätzlich kann die Genexpression auf verschiedenen Ebenen (Transkrption, RNA posessing, Translation und Proteinaktivität) reguliert werden (PASSARGE 2001). Schon länger ist bekannt, dass verschiedene Steroidhormone Substrate für das P-Glykopotein sind (UEDA et al. 1992). Auch synthetische Glukokortikoide, wie zum Beispiel Prednisolon und Dexamethason, werden durch das P-Glykoprotein transportiert (UEDA et al. 1992, KARSSEN et al. 2002). Sowohl in vitro als auch in vivo kann in verschiedenen Geweben durch Dexamethason die Höhe der P-Glykoproteinexpression beeinflußt werden (ZHAO et al. 1993, DEMEULE et al. 1999). So führte die Gabe von Dexamethason bei Ratten zu einer Erhöhung der P-Glykoproteinexpression in Leber und Lunge, aber einer Reduktion der Erxpression in den Nieren (DEMEULE et al. 1999). Auch durch eine Exposition mit Zytostatika kann die Transkription des MDR1-Gens in vitro induzieren werden (SCOTTO 2003). Desweiteren wurde in Leukämiezellen eine MDR1Überexpression durch mRNA Stabilisierung und Translationsinduktion beschrieben (YAGUE et al. 2003). SCOTTO (2003) vermutet daher die Existenz multipler, in verschiedenen Zellarten vorkommender Mechanismen, welche die MDR1-Genexpression regulieren. Klinische Relevanz bei Tumorerkrankungen Eine Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen und Hund in zahlreichen Tumoren beschrieben (FOJO et al. 1987; GINN 1996). Insbesondere in Tumoren, die von Ursprungsgewebe mit physiologisch hoher P-Glykoproteinexpression abstammen, wie z.B. Lebertumoren, ist P-Glykoprotein relativ konstant nachweisbar (CHENIVESSE et al. 1993; ITSUBO et al. 1994; GINN 1996). Bei anderen Tumoren lässt sich P-Glykoprotein immunhistochemisch dagegen nur inkonstant darstellen. Beim Hund werden maligne Lymphome (BERGMAN et al. 1996, GINN 1996, LEE et al. 1996), kutane Mastozytome (MIYOSHI et al. 2002) und Harnblasenkarzinome (ROCHA et al. 2000) zu dieser Gruppe gezählt. 19 Für zahlreiche Tumoren des Menschen, wie z.B. myeloische Leukämien oder Non-HodgkinLymphome, wurde eine klinische Relevanz der Expression von P-Glykoprotein nachgewiesen (PILERI et al. 1991; YUEN u. SIKIC 1994; KANG 1995; SONNEVELD 2000). So kann eine Expression von P-Glykoprotein in Tumoren mit einer herabgesetzten Anreicherung von verschiedenen Zytostatika in der Zelle und einer erhöhten Chemotherapieresistenz einhergehen (LING, 1989). In ersten Untersuchungen beim Hund konnte ebenfalls ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe und dem Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung aufgezeigt werden (BERGMAN et al. 1996; LEE et al. 1996). Therapeutische Beeinflussbarkeit Seit über 20 Jahren ist bekannt, dass die Transportfunktion des P-Glykoproteins in vitro durch verschiedene Substanzen, darunter viele zugelassene Arzneimittel, nicht-selektiv gehemmt wird (ECKER u. CHIBA 1995). Zu diesen als P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation bezeichneten Substanzen zählen u.a. Verapamil, Ciclosporine und Steroide (TSURO et al. 1981; YANG et al. 1989; TWENTYMAN 1992). Zur Umgehung bestehender Vielfachresistenzen in vivo erwiesen sich die P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation jedoch als wenig geeignet. So liegt die zur Modulation der P-Glykoproteinfunktion erforderliche Plasmakonzentration dieser Substanzen häufig über ihrer therapeutischen Breite (FISHER 1996; SIKIC 1997; COVELLI 1999). Beim Hund wurde in einer Phase-I Studie die Wirksamkeit von Tamoxifen, einem Antiöstrogen, zur Hemmung der P-Glykoproteinfunktion geprüft (WADDLE et al. 1999). Plasmakonzentrationen von Tamoxifen, die in vitro zu einer Hemmung der P-Glykoproteinfunktion führen, konnten in der Studie nur bei einer hochdosierten Tamoxifengabe (600 mg/m²) erreicht werden (WADDLE et al. 1999). Bei einer kombinierten Gabe von Tamoxifen (600 mg/m², zweimal täglich per os) und Doxorubicin (1,25 mg/kg i.v.) traten bei Hunden mit verschiedenen Tumoren jedoch bei etwa 50% gastrointestinale Nebenwirkungen auf (WADDLE et al. 1999). In früheren Studien beschriebene östrogenähnliche Nebenwirkungen von Tamoxifen (MORRIS et al. 1993) wurden in der Studie von Waddle und Mitarbeiter (WADDLE et al. 1999) nicht beobachtet. 20 Im Gegensatz zu den P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation wurden die Antagonisten der 2. Generation, wie z.B. Valspodar (PSC 833), gezielt zur Umgehung von Vielfachresistenzen entwickelt (BOESCHE et al. 1991; LEONARD u. BATES 2003). Es hat sich jedoch gezeigt, dass Valspodar und andere P-Glykoproteinantagonisten der 2. Generation nicht nur die Transportfunktion von P-Glykoprotein sondern auch den Cytochrom P450 3A4 vermittelten Metabolismus vieler Zytostatika hemmen (WANDEL et al. 1999). Aufgrund der verzögerten Elimination der Zytostatika ist bei Gabe von P-Glykoproteinantgonisten der 2. Generation daher zumeist eine Reduktion der Zytostatikadosis zur Vermeidung schwerer Nebenwirkung erforderlich (DORR et al. 2001). Im Gegenstaz zu den Antagonisten der 2. Generation hemmen die Antagonisten der 3. Generation das Cytochrom P450 3A4-Isoenzym nicht (DANTZIG et al. 1999). Zu den PGlykoproteinantagonisten der 3. Generation zählen Tariquidar und Laniquidar. Sie werden derzeit beim Menschen klinisch erprobt (THOMAS u. COLEY 2003). Weitere sich in Prüfung befindliche Therapieansätze beruhen auf der nicht kompetitiven Hemmung der P-Glykoproteinfunktion durch monoklonale Antikörper oder der Beeinflussung der MDR1-Genexpression mittels Antisense-MDR1-Oligonukleotiden (WAGNER 1995; ALAHARI et al. 1996; BOUFFORD et al. 1996). Gentherapie Auch für die Gentherapie ist das P-Glykoprotein bzw. das MDR1-Gen von Interesse (SORRENTINO et al. 1995; LICHT et al. 2000). Eine Therapiestrategie ist es Zytostatikasensitives Gewebe, wie das Knochenmark, durch Gentranfer vor den toxischen Effekten einer Chemotherapie zu schützen und somit die Verträglichkeit der Chemotherapie zu verbessern bzw. die Gabe höherer Zytostatikadosen zu ermöglichen (SORRENTINO et al. 1995). 21 2.3 Multidrug resistance-associated protein (MRP) In den Jahren nach der Entdeckung des P-Glykoproteins wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen vielfachresistente Zelllinien, bei denen P-Glykoprotein nicht nachweisbar war, beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Mechanismen, die zur Ausprägung einer MDR führen können, entdeckten Cole und Mitarbeiter 1992 in einer Lungenzelllinie (H69AR) ein weiteres Membrantransporterprotein, das eine Vielfachresistenz gegen Zytostatika vermitteln kann (COLE et al. 1992). Es wurde als multidrug resistance-associated protein (MRP) bezeichnet. Wie das P-Glykoprotein gehört das MRP zur Familie der ABC Transporterproteine und fungiert als Efflux-Pumpe (COLE et al. 1992; ZAMAN et al. 1994, DEAN et al. 2001). Mittlerweile sind beim Menschen sieben (MRP1 bis MRP7) und beim Hund zwei (MRP-1 und MRP-2) Isoformen des MRP beschrieben worden (BORST et al. 2000; CONRAD et al. 2001). 2.3.1 MRP1 Das MRP1 ist ein 190-kDa schweres Zellmembranprotein (KRISHNAMACHARY u. CENTER 1993). Es wurde erstmals 1992 in vielfachresistenten Lungenzelllinien beschrieben (COLE et al. 1992). Später durchgeführte Transfektionsexperimente belegten, dass eine Überexpression des MRP1 beim Menschen in vitro u.a. eine Resistenz gegen Vincristin, Doxorubicin, Etoposid und Methotrexat vermitteln kann (COLE et al. 1994; GRANT et al. 1994; HOOIJBERG et al. 1999). Das kanine MRP1-Gen wurde erstmals 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Bisher konnte in vitro eine durch canine MRP-1 vermittelte MDR gegen Vincristine und Etoposide, aber im Gegensatz zum Menschen nicht gegen Doxorubicin nachgewiesen werden (MA et al. 2002). Auch wenn das MRP1 und das P-Glykoprotein zum größten Teil Resistenzen gegen dieselben Zytostatikaklassen vermitteln, unterscheiden sie sich in ihrer Substratspezifität (LOE et al. 1996). Studien belegen, dass durch das MRP1 vor allem Konjugate lipophiler Substanzen mit Gluthation (GSH), Glukuronsäure- und Schwefelsäure transportiert werden (JEDLITSCHKY et al. 1994, LEIER et al. 1994; MÜLLER et al. 1994; ZAMAN et al. 1995; JEDLITSCHKY 22 et al. 1996). Einige nicht konjugierte hydrophobische Substanzen, wie z.B. Vincristin oder Daunorubicin, scheinen ebenfalls, jedoch nur in Anwesenheit von reduziertem GSH, durch das MRP1 transportiert werden zu können (ZAMAN et al. 1995; RENES et al. 1999). Beim Menschen und Hund wird MRP1 in zahlreichen Organen und Geweben exprimiert (FLENS et al. 1996; HIPFNER et al. 1999; CONRAD et al. 2001). Die höchsten mRNA-Gehalte werden beim Menschen in der Skelettmuskulatur, dem Herz, den Nieren, der Lunge und den Hoden nachgewiesen. Studien haben gezeigt, dass verschiedene endogene Substanzen, wie z.B. Leukotrin C4, und Metabolite exogener Substanzen, wie z.B. Aflatoxin B1, durch das MRP1 transportiert werden (JEDLITSCHKY et al. 1994; LEIER et al. 1994; LOE et al. 1996; JEDLITSCHKY et al. 1996; LOE et al. 1997). Zusätzlich zu der Transporterfunktion wird eine Beteiligung des MRP1 an der Regulation verschiedener Ionenkanäle vermutet (LOE et al. 1999). Eine Einschränkung der Vitalität und Fertilität bestand bei mrp(-/-) Knockout-Mäusen, ähnlich wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen, nicht (RAPPA et al. 1999). Zwar wurde MRP1 beim Menschen in zahlreichen Tumoren nachgewiesen (FLENS et al. 1996), die klinische Relevanz der Expression ist jedoch noch relativ unbekannt (BORST et al. 2000) Ein Zusammenhang zwischen der Expression und dem Erfolg chemotherapeutischer Behandlung wurde u.a. bei Patienten mit Retinoblastom aufgezeigt. So wiesen Retinoblastome, die trotz der Gabe von Ciclosporin zum Zwecke der Umgehung einer P-Glykoprotein induzierten MDR nicht auf eine Chemotherapie reagierten, eine Expression von MRP1 auf (CHAN et al. 1997). 2.3.2 MRP2 MRP2 wurde aufgrund seiner Funktion als Transporter organischer Anionen in der kanikulären Membran von Hepatozyten ursprünglich als canicular multispecific anion transporter (cMOAT) bezeichnet. 1996 gelang es Paulusma und Mitarbeiter zu zeigen , dass das cMOAT der Ratte dem humanen MRP1 entspricht (PAULUSMA et al. 1996). Das MRP2 wird beim Menschen und anderen Spezies vor allem in der Leber, in der Niere und im Darm exprimiert (PAULUSMA et al. 1996; BORST et al. 2000). Seine Lokalisation in der Zelle ist apikal (KÖNIG et al. 1999). 23 Als wichtigste physiologische Funktion des MRP2 wird die hepatobiliäre Exkretion von verschiedenen organischen Anionen angesehen. So führt bei Ratten eine Mutation des MRP2-Gens (TR- Ratten) zu einem Defekt der hepatobiliären Exkretion verschiedener organischer Anionen und dem klinischen Bild einer chronischen Hyperbilirubinämie (PAULUSMA et al. 1996). In den Nieren ist MRP2 vermutlich an der Exkretion organischer Anionen in den Harn beteiligt (KÖNIG et al. 1999). Im Darm wird aufgrund von Untersuchungen an Ratten eine Rolle des MRP2 bei der Sekretion von Glutathionkonjugaten vermutet (GOTOH et al. 2000). Die Bedeutung des MRP2 in der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen ist noch relativ unbekannt. In Transfektionsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass MRP2 in Zellkulturen eine Resistenz gegen Methrotrexat, Etoposid, Vincristin, Cisplatin, Doxorubicin und Epirubicin vermitteln kann (CUI et al. 1999, HOOIJBERG et al. 1999). In einer weiteren Studie wiesen Taniguchi und Mitarbeiter in drei Cisplatin-resistenten Tumorzellinien eine vier- bis sechsfach erhöhte Expression des MRP2-Gens nach (TANIGUCHI et al. 1996). Beim Menschen wurde eine Expression von MRP2 in Nierenkarzinomen, Lungen-, Kolon-, Rektum- und Magentumoren sowie hepatozellulären Karzinomen beschrieben (SCHAUB et al. 1997; NARASAKI et al. 1997). Die klinische Relevanz der Expression ist jedoch unklar. Beim Hund wurde das MRP2-Gen im Jahre 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Die Sequenzhomologie zum Menschen beträgt 83%. Über die Expression von MRP2 in kaninen Tumoren ist, soweit aus der Literatur ersichtlich, nichts bekannt. 2.4 Apoptose und Zytostatikaresistenzen Als Apoptose wird ein genetisch programmierter, geregelter physiologischer Zelluntergang bezeichnet (HOCKENBERRY 1995). Eine Apoptose kann sowohl durch physiologische Stimuli, exogene Insulte (z.B. DNA-Schädigung durch γ-Strahlen) als auch durch Entzug von Vitalitätsfaktoren ausgelöst werden (REED 1997). Viele derzeit in der Tumortherapie gängigen Zytostatika lösen durch ihre zellschädigende Wirkung eine Determination der Apoptose aus (REED 1997). Eine herabgesetzte Fähigkeit der Zellen zur Apoptose kann somit die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika einschränken und zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen. Über die Bedeutung der Apoptose für die chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von Lymphomen beim Hund ist wenig bekannt. In 24 einer 2000 veröffentlichten Studie wiesen Hunde mit einer relativ niedrigen Apoptoserate im Tumor ein etwas längeres rezidivfreies Intervall (Median 202 Tage) auf als die restlichen Patienten (Median 162 Tage). Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. (PHILIPS et al. 2000). An der Regulation der Apoptose sind verschiedene Gene und Genprodukte beteiligt (REED 1997). Das sogenannte BCL-2-Genprodukt war der erste in Säugetierzellen nachgewiesene Apoptoseinhibitor (TSUJIMOTO et al. 1985) und ist Namensgeber einer Familie strukturell verwandter Proteine, die neben Inhibitoren der Apoptose auch pro-apoptotisch wirkende Proteine beinhalteten (REED 1997). Ein weiteres Mitglied der BCL-2 Familie, das sogenannte BCL-XL Gen, wurde kürzlich beim Hund kloniert und sequenziert (SANO et al. 2003). Das BCL-XL Protein ist wie das BCL-2-Genprodukt ein Apoptoseinhibitor. Neben der BCL-2 Familie spielt auch das Tumorsuppressorgen P53 bei der Induktion der Apoptose durch DNA schädigende Zytostatika eine Rolle (LOWE et al. 1994; HICKMAN 1996; MANFREDI 2003). Eine erste Studie beim Hund weist darauf hin, dass sowohl germinative als auch somatische Mutationen des P53-Gens bei Hunden mit malignen Lymphomen vorkommen (VELDHOEN et al. 1998). Weitere bisher bekannte Inhibitoren der Apoptose gehören zur IAP (inhibitor of apoptosis) Familie (LACASSE et al. 1998). 2.4.1 Survivin 1997 wurde von Ambrosini und Mitarbeitern beim Menschen ein bis dahin unbekanntes AntiApoptosegen beschrieben (AMBROSINI et al. 1997). Das sogenannte Survivingen gehört zur Familie der Apoptosenhibitoren (inhibitor of apoptosis, IAPs) und besteht aus drei Introns und vier Exons, wobei das 3. Intron und das 4. Exon bei der Maus länger sind als beim Menschen (AMBROSINI et al. 1997). Das zugehörige Protein ist 16,5 kDa schwer (AMBROSINI et al. 1997). Survivin wird als bifunktionales Protein angesehen, da es sowohl Apoptose unterdrückt als auch bei der Regulierung der Zellteilung beteiligt ist (ALTIERI u. MARCHISIO 1999; REED 2001). Survivin bindet und hemmt die Caspase-3 und Caspase-7, welche Apoptose in Zellen induzieren (TAMM et al. 1998). Es wird während der G2/M-Phase des Zell-Zyklus exprimiert (LI et al. 1998). In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Survivin sowohl 25 einer Apoptose durch Entzug von Vitalitätfaktoren als auch einer durch Fas (CD95), Bax, Etoposid oder UVB-Strahlen induzierten Apoptose entgegenwirkt (AMBROSINI et al. 1997; TAMM et al. 1998; GROSSMAN et al. 2001). Survivin wird beim Menschen in den meisten Geweben nur während der Fetalphase exprimiert. Beim erwachsenen Menschen konnte Survivin bisher nur in wenigen Geweben (Thymus, Plazenta, Kolon) nachgewiesen werden (AMBROSINI et al. 1997). Im Gegensatz zu unveränderten Geweben wurde eine Expression von Survivin beim Menschen bereits in verschiedenen Tumoren nachgewiesen (ALTIERI u. MARCHISIO 1999) (Tabelle 3). In menschlichen Nierenkarzinomzelllinien konnten zwei Splicevarianten identifiziert werden. Der Isoform Survivin-∆Ex3 fehlt das Exon3, wohingegen die Isoform Survivin-2B ein Stück des Intron 2 als kryptisches Exon enthält. Im Gegensatz zur Spilcevarante Survivin-∆Ex3 ist bei der Isoform Survivin2B die antiapoptotische Wirkung reduziert (MAHOTKA et al. 1999). Eine prognostische Relevanz der Expression von Survivin wurde beim Menschen u.a. bei Übergangszellkarzinomen, hepatocellulären Karzinomen und Lungentumoren beschrieben. (MONZO et al. 1999; SWANA et al. 1999; IKEGUCHI et al. 2002). Tabelle 3: Häufigkeit der Expression von Survivin in verschiedenen Tumoren beim Menschen (modifiziert und erweitert nach ALTIERI u. MARCHISIO 1999) Tumor n Methode Magenkarzinom Kolonkarzinom Blasenkarzinom Neuroblastom B-Zell-Lymphom Kolonkarzinom Astrozytom Glioblastom Mammakarzinom 174 171 36 72 222 20 18 20 293 IHC IHC IHC IHC / IB IHC IHC RT-PCR IHC Survivin positiv 34% 53% 78% 47% 60% 100% 70% 90% 60% Abkürzungen: IB: Immunoblot IHC: Immunhistochemie RT-PCR: Reverse Transkription- Polymerasekettenreakton Referenzen LU et al. 1998 KAWASAKI et al. 1998 SWANA et al. 1999 ADIDA et al. 1999 ADIDA et al. 2000 GIANINI et al. 2001 KAJIWARA et al. 2003 KENNEDY et al. 2003 26 2.5 Weitere Mechanismen Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist weitestgehend unbekannt. Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997) Membrantransportmechanismen P-Glykoprotein multidrug resistance-associated proteins (MRPs) lung-resistance protein (LRP) protein transporter of antigenic peptides (TAP) DNA-Reparaturmechanismen Hemmung der Apoptose P53 BCL-2 Survivin Alteration der Topoisomerasen Topoisomerase I Topoisomerase II Metabolische Zytostatika-Detoxifikation Glutathion-S-Transferase-System 27 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiere An malignem Lymphom erkrankte Hunde In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten. Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden 2. Tag per os unbekannt P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW einmal tägl. per os 4 Tage P16 unbekannt alle drei Tage parenteral 20 Tage P27 Dexamethason unbekannt unbekannt P28 Prednisolon unbekannt 7 Tage P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage P34 Prednisolon unbekannt 21 Tage P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW einmal tägl. per os unbekannt P44 unbekannt unbekannt unbekannt P48 Prednisolon unbekannt 8 Tage 28 Kontrolltiere Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert. Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie - K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor - K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid K18 Dt. Schäferhund 9 Jahre Analfissur - K19 Bordeuxdogge 3 Monate Darminvagination Infusion 29 3.2 Diagnose und klinische Stadieneinteilung Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei 22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung, sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt. Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN, 1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis, gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet. Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980) Stadium Definition I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks) II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen) III generalisierter Lymphknotenbefall IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III) V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV) Substadium a ohne Allgemeinsymptome Substadium b mit Allgemeinsymptomen 30 3.3 Chemotherapie Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine LangzeitKombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin. Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) Woche 1 L-Asp1 X VCR CTX2 X 2 X X X X 11 12 X X X 9 10 X X 8 X X 6 7 X X 5 Pred X 3 4 ADM1, 3 X X X X X X X X X ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp:L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v. 2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os) 3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v. 31 Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) Woche L-Asp1 VCR CTX ADM1, 2 MTX Pred Induktion 1 X X 2 X X 3 4 X X X X 5 X 6 X Erhaltung: Zyklus 1 8 X 10 12 X X 14 X Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp:L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v. 2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v. 32 3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges Therapieantwort Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens durchgeführt. Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001) Therapieantwort Definition Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich. Partielle Remission (PR) Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50% der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich. Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen Tumormanifestationen. Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen. Rezidivfreies Intervall (RFI) Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall (RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt. 33 3.4 Entnahme und Lagerung der Proben Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie (Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C gelagert. Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen, umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert. Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik. Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S. 128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei Raumtemperatur gelagert. 3.5 Immunphänotypisierung Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische BLymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11). Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 105 Zellen) mit jeweils 5 µl der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert. 34 Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa. Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert (FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson). Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson) ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt. Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-ZellLinie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten. Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome Ansatz Antikörperspezifität Fluorochrom 1 Maus IgG1 PerCP caCD45 PE caIgM FITC caCD4 FITC caCD8 PE caCD3 PerCP caCD5 FITC caB cells PE 2 3 4 Abkürzungen: ca: kanine CD: cluster of differentiation FITC: Fluoreszeinisothyocyanat PE: Phycoerythrin PerCP: Peridin-Clorophyll-a-Proteinkomplex 35 3.6 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein Probenaufbereitung Das Schneiden der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte mit einem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM400, Fa. Microm) bei einer eingestellten Schnittdicke von 2 µm. Die Paraffinschnitte wurden in 40 °C warmem, destilliertem Wasser gestreckt (Paraffin Streckbad TFB45, Fa. Medite Medizintechnik), auf Objektträger (Superfrost® Plus, Fa. Menzel-Gläser) aufgezogen und für 60 min bei 65 °C im Trockenschrank getrocknet. Immunhistochemische Färbung Die getrockneten Schnitte wurden dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe (5 min in 100%igem Isopropanol, je 2 bis 3 min in 96%igem Ethanol und 70%igem Ethanol) rehydriert und in 0,05 molarer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Herstellung und Zusammensetzung siehe Anhang, Seite 128) dreimal für 5 min gewaschen. Zur Antigendemaskierung wurden die Schnitte 10 min in Citratpuffer (0,01 molar, pH-Wert 6,0) bei 600 Watt in einem Mikrowellenherd gekocht. Nach einer Abkühlungszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurden die Schnitte dreimal in PBS für 5 min gewaschen. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte für 30 min in 1,5%igem Wasserstoffperoxid in Methanol (≤99,8%) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte dreimal für 5 min in PBS gewaschen, in Coverplates (Fa. Shandon) überführt und für 20 min bei Raumtemperatur mit 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum überschichtet. Die Inkubation der Schnittpräparate mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht (12 - 18 h) bei 4 °C. Als Primärantikörper zum Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein monoklonaler Antikörper gegen menschliches P-Glykoprotein (Klon C219) verwendet. Seine Anwendung zum P-Glykoproteinnachweis beim Hund wurde erstmals von GINN 1996 beschrieben. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Als Verdünnungsmedium wurde PBS plus 0,05 % Tween-20 plus 1 % bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Am nächsten Tag wurden die Schnittpräparate dreimal für 5 min in PBS plus 0,05 % Tween-20 gewaschen 36 und mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege anti Maus IgG, Fa. Vektor Laboratories; 1:200 mit PBS verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Schnitte erneut dreimal für 5 min in PBS gewaschen. Die Ansetzung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Fa. Vector Laboratories) erfolgte nach Herstellerangaben (siehe Anhang, Seite 128). Die Schnitte wurden 30 min bei Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex inkubiert, dreimal für 5 min in PBS gewaschen und in Küvetten überführt. Als Chromogen wurde 3,3 Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Die Schnitte wurden in 0,05%iger Diaminobenzidin-Lösung mit Wasserstoffperoxid als Katalysator (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und mindestens 20 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte anschließend 5 min in Hämalaun nach MEYER (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) eingestellt und 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut. Zuletzt wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%iges Ethanol, 96%iges Ethanol, 100%iges Isopropanol) dehydriert, dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) eingestellt und mit Roti® Histokitt (Fa. Roth) eingedeckt. Kontrollen Als positive Gewebekontrolle wurde in jeder Serie unverändertes Lebergewebe mitgeführt. Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen wurde der Primärantikörper durch eine negative Reagenzienkontrolle (Maus IgG2a) ersetzt. Lichtmikroskopische Beurteilung Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionsergebnisse erfolgte mit einem Standard-Binokular-Lichtmikroskop bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung. 37 3.7 Molekularbiologische Untersuchungen 3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA Inzisionsbiopsien Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Inzisionsbiopsien wurde das Verfahren der PhenolChloroform-Extraktion verwendet. Etwa 100 mg der Gewebeprobe wurden in einem Porzellantiegel in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill zerrieben und in 2 ml TRIzol® Reagent (Fa. Invitrogen) suspendiert. Zum Scheren der DNA wurde die Gewebesuspension zehnmal durch eine 18’Einmalkanüle in eine Einmalspritze aufgezogen. 1 ml des Homogenisates wurde mit 0,2 ml Chloroform (99%) in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt, für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde unter Vermeidung der Interphase in ein neues 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol (≥99,7%) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das RNAPellet wurde in 75%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl DEPC behandeltem destilliertem Wasser (siehe Anhang S. 129) für 2 min im Wasserbad bei 70 °C gelöst. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei -80 °C gelagert. Feinnadelaspirate (FNA) Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Feinnadelaspiraten wurde ein von der Firma Qiagen entwickelter Kit (RNeasy® Mini Kit) verwendet. Die FNA wurden in 600 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) suspendiert. Die Probensuspension wurde auf eine QIAshredder™Spinsäule pipettiert und für 3 min bei 10.000 x g in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. 700 µl der Probe wurden auf eine Rneasy®-Spinsäule (RNeasy® Mini Kit) pipettiert und bei 10.000 x g 15 sec bei Raumtemperatur in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und der Vorgang mit dem restlichen Probenvolumen wiederholt. 38 Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nacheinander mit 700 µl RW1 Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec, mit 500 µl RPE Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec und mit 500 µl RPE Puffer für 2 min bei 10.000 x g gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde das Mikrozentrifugenröhrchen gewechselt. Anschließend wurde die Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säule pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Bestimmung der Konzentration an Gesamt-RNA Die Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie (siehe Anhang, Seite 129). 3.7.2 DNase-Behandlung 20 µg Gesamt-RNA wurden mit 10 Units DNase (RQ1 RNase-Free DNase®, Fa. Promega) und 10 µl RQ1 DNase 10 x Reaction Buffer (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl RQ1 DNase Stop Solution (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) beendet und die DNase durch Inkubation der Proben für 10 min bei 65 °C inaktiviert. 3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA Die Reinigung der Gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy® Mini Kit (Fa. Qiagen). 100 µl der RNA-Lösung wurden mit 350 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) und 250 µl 96%igem Ethanol vermischt, in eine RNeasy®-Spinsäule überführt und bei 10.000 x g für 15 sec in einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Säule wurde mit je 500 µl Buffer RPE (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec bzw. 2 min bei 10.000 x g gewaschen und anschließend für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. 39 Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5 ml-Mikroreaktionsgefäß überführt und umgehend in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Die Gesamt-RNA-Konzentration (siehe Anhang, Seite 129) wurde über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung der isolierten Gesamt-RNA erfolgte bei 80 °C. 3.7.4 Reverse Transkription (RT) Die gereinigte Gesamt-RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Als Reverse Transkriptase wurde bis November 2001 Superscript II™ Reverse Transcriptase (Fa. Invitrogen) und anschließend Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen) verwendet. Sofern ausreichende Mengen Gesamt-RNA nach der Isolierung vorlagen, wurden pro 20 µl-Reaktionsvolumen 1 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Bei sechs Feinnadelaspiraten lagen die isolierten Gesamt-RNA-Mengen unter 0,1 µg/µl bzw. 0,05 µg/µl. Bei diesen Proben wurden 0,5 µg (Tier-Nr. P18, P24, P41 bei Diagnose) bzw. 0,4 µg Gesamt-RNA (Tier-Nr. P08, P13, P14 bei Diagnose und P09 beim 1. Rezidiv) als Template für die RT eingesetzt. Für die RT mittels Superscript II Reverse Transcriptase® wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 11 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml) für 10 min bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß wurde auf Eis gestellt, 4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl) und 1 µl 10 mM dNTP zugegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 1 µl Superscript II™ Reverse Transcriptase erfolgte eine weitere Inkubation für 50 min bei 42 °C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 70 °C inaktiviert. Für die RT mittels Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa.Qiagen) wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml), 2 µl 10x First Strand Buffer, 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl), 2 µl 5 dNTP und 1 µl Omniscript™ Reverse Transkriptase für 10 min bei 25 °C und anschließend für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde für 5 min bei 93 °C inaktiviert. Die cDNA wurde bei -20 °C gelagert. 40 3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet. 3.7.5.1 Primer- und Sondendesign Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM® Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12). Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm* MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C Abkürzungen und Fußnoten: AP: Antisense-Primer SP: Sense-Primer * bei 100 mM Na+ FAM: 6-Carboxyfluorescein TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin MGB: Minor-groove-binder 41 Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr. CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr. AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-, MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2 Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein (FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1 174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied Biosystems bezogen. 3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren 123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang. Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP: Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm* Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C 42 Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa. Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet. 200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und 550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest. Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem 1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNABande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa 100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule je einmal mit 500 µl Buffer QB und 750 µl Buffer PE (QIAqick Gel Extraction Kit®) für 1 min bei 10.000 x g gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Die Säule wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zur Elution der DNA wurden 50 µl autoklaviertes dest. Wasser auf die Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie. Aus der DNA-Konzentration wurde die Anzahl an PCR-Produkten errechnet (Formel siehe Anhang Seite 129). Für jedes Gen wurden Standardverdünnungsreihen um den Faktor 10 mit einer Kopienzahl von100 bis 108 Kopien pro µl erstellt. Die internen Standards wurden aliquotiert und bei -20 °C gelagert. 43 3.7.5.3 Durchführung der RT-qPCR Die real-time RT-qPCR wurde mittels Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System der Fa. Stratagene durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des jeweiligen Gens wurde in jedem Lauf die Expression des Housekeeping-Gens HPRT in den Proben gemessen. In jedem PCR-Lauf wurden Standardverdünnungsreihen für das jeweilige Gen und für HPRT (MDR1, MRP1 und HPRT: 103 bis 108 Kopien; MRP2: 101 bis 106) mitgeführt. Die Proben und die Negativkontrollen wurden in jedem Lauf in Dreifach-Ansätzen, die Standardverdünnungen in Zweifach-Ansätzen gemessen. Alle Messungen wurden einmal wiederholt. Als Reaktionsgefäß wurden MicroAmp Optical 96-well plates (Fa. Stratagene) verwendet, die mit MicroAmp Optical caps (Fa. Stratagene) verschlossen wurden. Die Komponenten für den Reaktionsansatz wurden einem entsprechenden Kit (Brilliant™ Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene) entnommen. In einem PCRReaktionsvolumen von 25 µl waren 80 µM dNTP mix, 5 mM MgCl2, 300 nM der jeweiligen Primer, 100 nM der jeweiligen Sonde, 75 nM 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) als Referenzfarbstoff und 0,025 units / µl SureStart™ Taq DNA Polymerase in 1x PCR-Puffer enthalten. An eine initiale Denaturation über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 PCR-Zyklen mit 15 sec bei 95 °C (Denaturation) und 1 min bei 61 °C (MDR1) bzw. 60 °C (MRP2) oder 59 °C (MRP1) an (Anlagerung und Verlängerung). 44 3.7.5.4 Auswertung der RT-qPCR Die Auswertung erfolgte für jeden PCR-Lauf separat unter Verwendung der dem Gerät zugehörigen Software. Zunächst wurde aus den in den ersten PCR-Läufen erhobenen Messdaten für jeden Ansatz eine Grundlinie (baseline) bestimmt. Die Festlegung der Spannweite der PCR-Zyklen für die Erstellung der baseline erfolgte Software-gesteuert (Software-Einstellung: adaptive baseline). Durch Subtraktion des Wertes der Gradenfunktion der baseline von den in den Ansätzen in den PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden die baseline korrigierte Fluoreszenz (dR) und hinterher als Quotient der dR von Reporterfarbstoff und Referenzfarbstoff (ROX) das sogenannte normalisierte baseline-korrigierte Reportersignal (dRn) berechnet. Anschließend wurde anhand der in fünf der ersten zehn PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten (Hintergrundfluoreszenz) der sogenannte Grenzwert (Threshold) bestimmt und für jeden Ansatz der Threshold Cycle (Ct-Wert), d.h. der PCR-Zyklus, bei dem die dRn den Grenzwert erstmals übersteigt, ermittelt. Zur Bestimmung der Ausgangskopienzahl in den Proben wurde mittels der Software eine Standardkurve erstellt. Die Ct-Werte der jeweiligen Standardverdünnungen wurden gegen die logarithmierte Kopienzahl aufgetragen und die Standardkurve algorithmisch generiert. Aus der Gradengleichung wurden die Effizienz der Amplifikation und die Ausgangskopienzahl in den Proben durch Interpolation bestimmt. Aus den in der gleichen Probe (dreifacher Ansatz) im selben Lauf ermittelten Ct-Werten bzw. cDNA Kopienzahlen wurden der arithmetischer Mittelwert (MW) und die Standardabweichung (SD) berechnet. Die mittlere Kopienzahlen des jeweiligen Gens wurden durch die im selben Lauf in der gleichen Probe ermittelten Kopienzahlen des Housekeeping-Gens (HPRT) geteilt. Zuletzt wurde aus den in zwei separaten Läufen ermittelten normalisierten Kopienzahlen für MDR1, MRP1 bzw.MRP2 der MW und die SD berechnet. 45 3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe Die Untersuchung der Survivin-Expression in kaninem Gewebe erfolgte mittels RT-PCR. Die kanine Survivin mRNA- Sequenz wurde der Genbank (Genbank-Nr. AB095108) entnommen. Die Primerpaare, SURV1 bis SURV3 (Tabelle 14), wurden aus Sequenzabschnitten ausgewählt, bei denen gemäß den in der Genbank enthaltenen Sequenzen eine 100% Homologie zwischen Mensch und Hund besteht. Als Positivkontrolle dienten menschliches Kolonkarzinomgewebe, kanines Plazentagewebe sowie genomische DNA (c=50ng/ml) von Mensch und Hund. Für die Negativkontrollen wurde das jeweilige Template durch ein identisches Volumen an destilliertem Wasser ersetzt. In jedem PCR-Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C (SURV1 60°C), Elongation für 2 sec im ersten Zyklus, zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet. Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1%igen Agarosegel. Etwaige Banden wurden unter UV-Lichtexposition (BiodocAnalyserSystem, Biometra) beurteilt und fotografiert. Tabelle 14: Primer (SP: Sense Primer; AP: Antisense Primer) für den Nachweis von Survivin mRNA. Sequenz, Produktlänge und Schmelzpunkt (Tm) bei 100 mM Na+ Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) SURV1 SP GCATGGGTGCCCCGACGTTG SURV1 AP GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA SURV2 SP TGCCCCGACGTTGCC SURV2 AP CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT SURV3 SP GGTAACAGTGGCTGCTTCTCTC SURV3 AP TCTAGCAAAAGGGACACTGCCT Produktlänge 448 bp 69 bp 120 bp Tm 73,2 °C 71,3 °C 62,9 °C 64,2 °C 59,5 °C 60,1 °C 46 3.8 Statistische Auswertung Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SPSS verwendet. Die in den verschiedenen Stichproben ermittelten normalisierten MDR1, MRP1 und MRP2 mRNA Kopienzahlen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung geprüft. Zum Vergleich der Höhe der Genexpression zwischen den Kontrollgeweben (Leber versus Lymphknoten) und zwischen den Kontrolltieren (Beagle versus Klinikpatienten) wurde der tTest nach Student verwendet. Mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson wurde der Zusammenhang zwischen der Höhe der MDR1, bzw. MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe bestimmt. Zum Vergleich der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen Patienten mit unterschiedlichen Krankheitscharakteristika (Immunphänotyp, anatomische Form und Vorbehandlungsstatus) wurde der U-Test nach Mann und Whitney und zum Vergleich der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen verschiedenen Messzeitpunkten (Diagnosestellung und 1. Rezidiv) der Wilcoxon-Test verwendet. Der Zusammenhang zwischen einer Hyperkalzämie und dem Immunphänotyp sowie zwischen dem Erreichen einer kompletten Remission und der Höhe der MDR1- bzw. MRP1Genexpression wurde mit dem Fishers exakter Test evaluiert. Für die Überlebensanalyse wurden die Hunde, die sich bei Ende der Studie in Remission befanden bzw. bei denen keine Informationen über den Gesundheitsstatus zum Ende der Studie vorlagen, zensiert. Zur Darstellung des zeitlichen Verlaufs des rezidivfreien Überlebens wurden eine Kaplan-Meier-Überlebenskurven erstellt und das mittlere RFI sowie das zugehörige 95% Konfidenzintervall des Medians nach der Methode von Kaplan-Meier berechnet (KAPLAN 1958). Zum Vergleich der Dauer des rezidivfreien Überlebens zwischen verschiedenen Patientengruppen wurde der Lok-Rang-Test verwendet (PETO et al., 1977). Bei allen angewandten statistischen Testverfahren wurden Aussagen, die mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 behaftet waren, als signifikant bewertet. 47 3.9 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 3.9.1 Probenentnahme und Lagerung Tru-cut Biopsienadel, Fa. Allegiance Heathcare Cooperation, USA RPMI 1640, Fa. Promo Cell, Heidelberg, Art.-Nr. C-76010 Formaldehyd 37%ig, stabilisiert in 10% Methanol, Fa. Roth, Karlsruhe, Art.-Nr.4979.2 3.9.2 Immunphänotypisierung 3.9.2.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien CellWASH ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 349524 BD FACS ™ Lysing Solution, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003 FALCON® Teströhrchen 12 x 75 mm, Fa. Becton Dickinson FACS Flow ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003 3.9.2.2 Antikörper Primärantikörper: Fa. Serotec, Düsseldorf Mouse anti canine CD3: purified, Klon CA17.2A12, Art.-Nr. MCA1774 Rat anti canine CD4: FITC, Klon YKIX 302.9, Art.-Nr. MCA1038F Rat anti canine CD5: FITC, Klon YKIX 332.3, Art.-Nr. MCA137F Rat anti canine CD8a: RPE, Klon YCATE 55.9, Art.-Nr. MCA1039PE Rat anti canine CD45: RPE, Klon YKIX716.13, Art.-Nr. MCA1042PE Mouse anti canine B-Cells: RPE, Klon CA2.1D6, Art.-Nr. MCA1781PE Goat anti canine IgM: FITC, Art.-Nr. AA130F Sekundärantikörper Rat Anti Mouse IgG1: PerCP, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr: 340272 48 3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung Verbrauchsmaterialien Coverplates, Fa. Shandon, Frankfurt / Main, Art.-Nr. 7210013 Objekträger Superfrost® Plus, Fa. Menzel-Gläser, Art.-Nr. 041300 Deckgläser 24 x 40 mm , Fa. Roth, Art.-Nr. 1870 Reagenzien Bovines Serumalbumin (BSA), Fa. Serva Feinchemie, Art.-Nr.13182 Citrat-Puffer-Konzentrat pH 6,0, Fa. ProTaqstura, Art.-Nr. 400300692 3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), Fa. Fluka, Art.-Nr. 32750 Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1 Hämalaun nach Mayer (Rezeptur siehe S.128) Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1 Natriumchlorid (NaCl), Fa. Fluka, CH-9471 Buchs, Art.-Nr. 71381 Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4), Fa. Fluka, Art.-Nr. 71496 Natronlauge, 1 mol/l (1 N), Fa. Merck, Art.-Nr. 9137 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 molar, pH-Wert 7,25 (Rezeptur siehe S.128) Roti®-Histokitt, Fa. Roth, Art.-Nr. 6638.1 Roticlear®, Fa. Roth, Art-Nr. A5381 Vectastain® ABC Kit, Fa. Vektor Laboratories Inc, Art-Nr. PK-6100 Tween 20, Fa. Serva Feinbiochemie, Art.-Nr.37470 Wasserstoffperoxid 30% (Perhydrol®), Fa. Merck, Art.-Nr. 1.07209.0250 Antikörper Maus anti P-Glycoprotein, Klon C219, Fa. Dako., Art.-Nr.M3521 Ziege anti Maus IgG (H+L), biotinyliert, Fa. Vektor Laboratories, Art.-Nr. CA 94010 49 3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen 100 mM dNTP Set, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10297-018 Agarose NA, Fa Pharmacia LKB; Art.-Nr. 17-0554-02 Borsäure, Fa. Roth, Art.-Nr. 6943.2 Brilliant™ Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene, Art.-Nr.600530 Chloroform, Fa. Sigma, Art.-Nr. C2423 Diethylpyrocarbonat (DEPC), Fa. Aldrich, Art.-Nr. 27238-8 EDTA Dinatriumsalz Dihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1 Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1 Ethidiumbromid, Fa. Pharmacia LKB, Art.-Nr.80-1129-13 Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1 Mercaptoethanol, Fa. Sigma, Art.-Nr.M6250 Mineral oil, Fa. Sigma, Art.-Nr. M5904 Natriumacetat-Trihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 6779.1 Omniscript™ Reverse Transcriptase, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 205110 QIAquick® Gel Extraction Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 28704 QIAshredder™, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 79654 Random Hexamers, Fa. Promega, Art.-Nr. C1181 RNaseOUT™, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10777-019 RNeasy® Mini Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 74104, RQ1™ RNase-free DNase, Fa. Promega, Art.-Nr. M6101 Superscript™ II Rnase H- Reverse Transcriptase, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 18064-022 TBE-Puffer (Rezeptur siehe Anhang, S.129) Taq DNA Polymerase, Fa. Promega, Art.-Nr. M1665 TRIS, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1 TRIzol® Reagent , Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 15596 50 4 ERGEBNISSE 4.1 Allgemeine Patientencharakteristika Die in die Studie aufgenommenen, an malignem Lymphom erkrankten Hunde (n=50) waren bei Diagnosestellung zwischen 4 Monate und 13 Jahre alt. Das Durchschnittsalter betrug 7 Jahre. Die Hunde gehörten 24 verschiedenen Rassen an (Tabelle 15). Am häufigsten waren Mischlinge (n=9), Berner Sennenhunde (n=4) und West Highland White Terrier (n=4) vertreten. 33 Patienten waren männlich (25 intakt, 8 kastriert) und 17 weiblich (11 intakt, 6 kastriert). Bei 44 Hunden lag ein multizentrisches und bei 6 Patienten ein gastrointestinales Lymphom vor. Tabelle 15: Rasseverteilung der an malignem Lymphom erkrankten Hunde Rasse Mischling Anzahl 9 Berner Sennenhunde, West Highland White Terrier 4 Bouvier des Flandres, Boxer, Dobermann, Golden Retriever 3 Bobtail, Jack-Russel-Terrier, Schweißhund, Yorkshire-Terrier 2 Collie, Dandie-Diamond Terrier, Deutsch-Drahthaar, Deutscher Schäferhund, Foxterrier, Hovawart, Kleiner Münsterländer, Neufundländer, Pon, Riesen Schnauzer, Rottweiler, Staffordshire-Terrier, Weimaraner 1 Summe 50 51 4.2 Klinische Stadieneinteilung Bei der Mehrheit der Hunde mit multizentrischem Lymphom (n=44) lag bei Diagnosestellung ein fortgeschrittenes Erkrankungsstadium (Stadium IV oder V) vor (Tabelle 16). Bei einem Hund wurde das klinische Stadium als I, bei 3 Patienten als III, bei 20 als IV und bei 9 als V klassifiziert. Bei den restlichen 11 Hunden war aufgrund des Verzichts auf eine Knochenmarkuntersuchung keine zuverlässige Stadieneinteilung möglich. Die Beurteilung des klinisches Substadiums ergab bei 20 der Patienten eine Erkrankung des Substadiums a und bei 30 Patienten des Substadiums b. Bei allen Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6) lag eine Erkrankung des Substadiums b vor (Tabelle 16). Tabelle 16: Klinische Stadien- und Substadienverteilung der an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde Klinisches Stadium klinisches Substadium Summe a b I 1 - 1 III 3 - 3 IV 11 9 20 V 3 6 9 2 9 11 20 24 44 unbekannt Summe 52 4.3 Immunphänotypisierung Eine Immunphänotypisierung des Lymphoms erfolgte bei 36 Hunden. Bei 28 Patienten wurde das Lymphom der B-Zelllinie und bei 8 Patienten der T-Zelllinie zugeordnet. Bei den restlichen 14 Hunden konnte aus Mangel an Probenmaterial keine durchflusszytometrische Immunphänotypisierung durchgeführt werden. Alle 28 als B-Zell-Lymphom klassifizierten Tumoren reagierten mit den Antikörpern gegen kanine B-Lymphozyten und kanines IgM, jedoch nicht mit den verwendeten T-Lymphozytenmarkern (Tabelle 17). Alle acht als T-Zell-Lymphome klassifizierten Tumoren reagierten sowohl mit dem Antikörper gegen caCD3 als auch gegen caCD5. Bei sieben T-Zell-Lymphomen war zusätzlich eine Expression von caCD4 und bei einem Tumor von caCD8 nachweisbar (Tabelle 17). Tabelle 17: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung Antigenexpression n B-cell IgM CD3 CD5 CD4 CD8 + + - - - - 28 - - + + + - 7 - + + + - + 1 + positiv - negativ 4.4 Kalziumplasmaspiegel Bei 6 der Patienten lag der Kalziumspiegel im Plasma über dem Referenzbereich. Bei 5 der Patienten mit einer Hyperkalzämie lag ein T-Zell-Lymphom vor. Bei dem verbleibenden Patienten war der Immunphänotyp des Lymphoms unbekannt. Der Zusammenhang zwischen dem erhöhten Kalziumplasmaspiegel und dem Immunphänotyp erwies sich als statistisch signifikant (Fishers exakter Test; p<0.001). 53 4.5 Chemotherapie 4.5.1 Initiale Chemotherapie Eine Chemotherapie (Kurzzeit-Kombinationsprotokoll) wurde bei 25 Patienten durchgeführt. Die Krankheitscharakteristika (anatomische Form, klinisches Stadium- und Substadium, Immunphänotyp, Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und Kalziumgehalt im Plasma) der therapierten Patienten sind in Tabelle 18 enthalten. Tabelle 18: Chemotherapeutisch behandelte Patienten: Anatomische Erkrankungsform, klinisches Stadium und Substadium, Glukokortikoidvorbehandlung und Kalziumgehalt im Plasma Faktor Anzahl anatomische Form 23 - gastrointestinal 2 klinisches Stadium (multizentrische Lymphome) -I 1 - III 3 - IV 13 -V 3 - unbekannt 3 klinisches Substadium -a 17 -b 8 Immunphänotyp - B-Zell-Lymphom 19 - T-Zell-Lymphom 2 - unbekannt 4 Glukokortikoide - vorbehandelt 7 - nicht vorbehandelt 18 Kalziumgehalt im Plasma - im Referenzbereich 25 - multizentrisch 54 4.5.1.1 Behandlungsergebnisse Bei 22 Patienten konnte durch die Kurzeit-Chemotherapie eine komplette Remission und bei 2 Hunden eine partielle Remission erreicht werden. Nur bei einem Hund reagierte der Tumor nicht auf die Chemotherapie. Von den 24 Patienten mit einer Tumorremission entwickelten 16 im Beobachtungszeitraum ein Rezidiv. Ein Hund erfüllte die Studienkriterien aufgrund einer langfristigen Gabe von Prednisolon nach Abschluss der Chemotherapie nicht mehr. 4 Hunde befanden sich bei Beendigung der Studie noch in der ersten Remission. Bei den restlichen 3 Hunden waren keine Angaben über den Gesundheitsstatus bei Studienende verfügbar. Das rezidivfreie Intervall (RFI) war bei den Patienten, die im Beobachtungszeitraum ein Rezidiv entwickelten, zwischen 30 und 511 Tage lang. Das mittlere RFI betrug 222 Tage, das zugehörige 95 % Konfidenzintervall für den Median lag bei 143 bis 301 Tagen. Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Stadium, Substadium oder einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und der Dauer des RFI war bei den Hunden mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19) nicht nachweisbar (Tabelle 19). Auf eine statistische Überprüfung des Einflusses des Immunphänotyps sowie der anatomischen Form auf die Länge des RFIs wurde aufgrund einer zu geringen Anzahl an Patienten mit einem T-Zell-Lymphom (n=2) bzw. einem gastrointestinalen Lymphom (n=2) verzichtet. Tabelle 19: Einfluss des klinischen Stadiums und Substadiums sowie einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls (RFI) bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19) Faktor n RFI Median Log-Rang-Test 14 3 222 Tage 224 Tage p=0,77 14 5 224 Tage 157 Tage p=0,6 6 13 222 Tage 273 Tage p=0,86 Klinisches Stadium - III und IV -V Klinisches Substadium -a -b Glukokortikoide - vorbehandelt - nicht vorbehandelt 55 4.5.2 Zweite Chemotherapie Bei 7 Patienten, die ein Tumorrezidiv entwickelten, stimmten die Besitzer einer zweiten Chemotherapie zu. 3 Hunde erhielten eine Langzeitchemotherapie, ein Patient wurde mit einer Kombination aus Cytarabin und Carboplatin behandelt und bei 3 Patienten wurde das ursprüngliche Kurzzeit-Kombinationsprotokoll wiederholt. Durch die erneute chemotherapeutische Behandlung konnte bei 5 Hunden eine komplette und bei einem Patienten eine partielle Remission erreicht werden. Bei einem Hund reagierte das Tumorrezidiv nicht mehr auf die Chemotherapie (Tabelle 20). Der Median des zweiten RFI betrug bei den Patienten mit einem Tumorrückgang (n=6) 139 Tage (95% Konfidenzintervall 59 bis 219 Tage). Tabelle 20: Behandlungsergebnisse der zweiten Chemotherapie Tier-Nr. Protokoll Therapieantwort RFI P07 Kurzzeitchemotherapie PR 190 Tage P09 Cytarabin / Carboplatin CR 42 Tage P11 Langzeitchemotherapie CR 139 Tage P12 Langzeitchemotherapie CR 128 Tage P10 Kurzeitchemotherapie CR 94 Tage* P39 Kurzzeitchemotherapie CR 42 Tage** P46 Langzeitchemotherapie PD - Abkürzungen und Fußnoten: CR: komplette Remission PR : partielle Remission PD: progressive Tumorerkrankung RFI: rezidivfreies Intervall * Verlauf nach letzter Vorstellung in der Klinik unbekannt ** bei Studienende in Remission 56 4.6 Real-time RT-qPCR 4.6.1 Sensitivität der qPCR Zur Überprüfung des sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurden Verdünnungen der Standards für MDR1, MRP1 und MRP2 von 106 bis 100 Kopien pro µl erstellt und in dreifachen Ansätzen gemessen. Bei allen drei etablierten qPCR-Assays waren 10 Kopien pro µl Reaktionsvolumen noch sicher detektierbar (Tabelle 21). Tabelle 21: Sensitivitätskontrolle der qPCR. Arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der als Triplikate in verschiedenen Verdünnungsstufen der Standards gemessenen Ct-Werte Gen MDR1 MRP1 MRP2 Kopienzahl je PCR-Reaktion 6 10 105 104 103 102 101 100 0 106 105 104 103 102 101 100 0 106 105 104 103 102 101 100 0 MW 19,79 23,09 27,67 30,75 32,90 37,17 kein Ct kein Ct 20,31 23,35 26,61 28,65 32,13 34,80 Kein Ct Kein Ct 18,59 22,00 25,73 29,35 33,00 37,24 39,36 kein Ct Ct-Wert SD 0,50 0,25 0,22 0,45 0,24 1,24 0,17 0,21 0,25 0,43 0,23 0,47 0,24 0,40 0,30 0,23 0,43 0,65 0,71 - 57 4.6.2 MDR1-Genexpression 4.6.2.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere In allen unveränderten Leber- (n=14) und Lymphknotenproben (21 Proben von 15 Hunden) war mittels der etablierten RT-qPCR eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar. Im Lebergewebe (n=14) waren durchschnittlich 147 (Spannweite 69 bis 246) und im Lymphknotengewebe (15 Proben von 15 Hunden) 14 (Spannweite 5 bis 28) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar. Der Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden Geweben erwies sich im t-Test nach Student als hoch signifikant (p<0,001). Zwischen den Klinikpatienten und den Beaglen unterschied sich die Höhe der MDR1Genexpression im Leber- und im Lymphknotengewebe dagegen nur unwesentlich (Leber: MDR1 Kopien pro HPRT Kopie p=0,956; Lymphknoten: p=0,22) (Abbildung 1). Beagle "Sonstige" 200 150 B A 100 50 Beagle A 0 "Sonstige" B Lymphknoten Gewebe Leber Abbildung 1: MDR1-Genexpression (arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie) im unveränderten Lymphknoten- und Lebergewebe gesunder Beagle (Leber n=6; Lymphknoten n=9) und Hunde aus der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6) 58 Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression im Lebergewebe und im Lymphknotengewebe bestand bei Hunden, bei denen Proben aus beiden Geweben untersucht wurden (n=10), nicht (Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) =0,056 p=0,88). MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Leber 300 200 100 0 0 10 20 30 MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten Abbildung 2: Korrelation der Höhe der MDR1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=0,056, p=0,88) Zum Ausschluss einer relevanten Schwankung in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen Lymphknoten verschiedener Körperregionen wurde bei einem Beagle (Tier-Nr. K9) die Höhe der MDR1 Geneexpression in sieben verschiedenen Lymphknoten (ein Poplitealsowie je zwei Zervikal-, Mandibular- und Darmlymphknoten) bestimmt. Die gemessene MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie in den sieben Biopsien schwankte zwischen 12 und 28 und variierte weniger als zwischen Biopsien Popliteallymphknoten von 9 verschiedenen Beaglen (Spannweite 5 bis 28). aus den 59 4.6.2.2 Maligne Lymphome Bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden war bei Diagnosestellung eine Expression des MDR1-Gens im Tumorgewebe mittels der etablierten RT-q PCR nachweisbar. Die Höhe der gemessenen MDR1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte von 0,1 bis 369 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Die Mehrheit der untersuchten Lymphome wies bei Diagnosestellung eine relativ niedrige MDR1-Genexpression auf (Median 1,7 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Nur bei drei Lymphomen war die MDR1-Genexpression höher als im unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (Abbildung 3). Bei zehn Hunden lag die Höhe der MDR1-Geneexpression innerhalb des im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Wertebereiches. Bei den restlichen 37 Patienten war die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere. Anzahl an Patienten 30 20 10 n=37 0 n=10 n=3 < Ln. = Ln. > Ln. MDR1-Genexpression bei Diagnose Abbildung 3: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15) 60 Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen Von den 50 untersuchten Patienten wiesen 44 ein multizentrisches und 6 ein gastrointestinales Lymphom auf. Bei den Patienten mit einem multizentrischen Lymphom waren durchschnittlich (Median) 1,4 (Spannweite 0,1 bis 369), bei den Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom durchschnittlich 11,4 (Spannweite 2,4 bis 50) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 4). Im Mittelwertvergleich (U-Test nach Mann und Whitney) erwies sich der beobachtete Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie anatomischen Lymphomformen als signifikant (p=0,002). R 300 200 R 100 0 R R R R R R R R multizentrisch gastrointestinal anatomische Form Abbildung 4: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6). (U-Test von Mann und Whitney: p=0,002) 61 Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen Zwischen den Patienten mit einem multizentrischem T-Zell-Lymphom (n=8) und den Hunden mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=18) unterschied sich die Höhe der MDR1Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung dagegen nicht deutlich (U-Test von Mann und Whitney p=0,54). Durchschnittlich (Median) waren bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Hunden im Tumorgewebe 2,8 (Spannweite 0,1 bis 132) und bei den an einem B-Zell-Lymphom erkrankten Patienten 1,2 (Spannweite 0,2 bis 10) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie Kopie nachweisbar (Abbildung 5). 150 R 100 50 0 R R R R R R R R R B-Zell-Lymphom T-Zell-Lymphom Immunphänotyp Abbildung 5: Vergleich der MDR1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,54) 62 Einfluss von Glukokortikoiden auf die MDR1-Genexpression Ein Einfluss einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Höhe der MDR1Geneexpression war anhand der vorliegenden Daten nicht nachweisbar (U-Test von Mann und Whitney p=0,52). Der Median der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie betrug bei den 11 vorbehandelten Hunden 2,6 (Spannweite 0,2 bis 132) und bei den 33 nicht MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie vorbehandelten Hunden 1,3 (Spannweite 0,1 bis 369) (Abbildung 6). R 300 200 R 100 0 R R R R R R ja nein Vorbehandlung mit Glukokortikoiden Abbildung 6: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=11), und von an malignem Lymphom erkrankten Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=33) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,521) 63 Einfluss der MDR1-Genexpression auf die Therapieantwort Von 3 Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe höher als im unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (>Ln.), reagierte keiner auf die Chemotherapie mit einer Vollremission (CR). Bei einem Hund honnte eine Teilremission (PR), bei den anderen beiden Hunden kein Rückgang des Tumors (NC) erreicht werden. Im Vergleich dazu reagierten 27 von 29 Hunden, bei denen die MDR1-Genexpression gegenüber dem Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war (≤ Ln.), auf die Chemotherapie mit einer kompletten Remission (Abbildung 7). Die Überprüfung des beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression (> Ln. gegenüber ≤ Ln.) und der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) auf statistische Signifikanz ergab eine deutliche Assoziation zwischen dem Fortbestehen klinischer Anzeichen einer Tumorerkrankung (PR oder NC) und einer erhöhten MDR1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (Fishers exakter Test; p= 0.002) Anzahl an Patienten 30 23 20 10 NC PR 4 0 < Ln. = Ln. 2 CR > Ln. MDR1 Genexpression vor Therapiebeginn Abbildung 7: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe an malignem Lymphom erkrankter Hunde vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und jeweilige Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NC: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission 64 Einfluss der MDR1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien wurden nur Hunde mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten RFIs in der Analyse berücksichtigt. Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden wiesen 16 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erniedrigte MDR1-Genexpression auf (Gruppe IIb). Bei den restlichen 3 Hunden entsprach die Höhe der MDR1-Genexpression den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten (Gruppe IIa). Die Spannweite des ersten RFI reichte in der Gruppe IIa von 30 bis 93 Tagen und in der Gruppe IIb von 126 bis 511 Tagen. Der LogRang-Test ergab einen p-Wert von 0,0001 (Abbildung 8). Kum. rezidivfreies Überleben 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 0 200 400 600 RFI in Tagen Abbildung 8: Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls (RFI) der Hunde mit multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=19) als Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve. Gestrichelte Linie: Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumor niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (Gruppe IIb, n=16). Durchgezogene Linie: Hunde, bei denen die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumor den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (Gruppe IIa; n=3) 65 MDR1-Genexpresssion in Tumorrezidiven Bei 12 Hunden konnte sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs eine Gewebeprobe entnommen werden. Ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv war bei 7 Hunden nachweisbar (Tabelle 22). Bei einem Hund wurde ein undeutlicher Anstieg (Faktor 1,8), bei 4 Patienten keine nennenswerte Änderung (Faktor 0,6 bis 1,1) der MDR1Genexpression vermerkt. Im Wilcoxon-Test erwies sich der Anstieg der MDR1-Genexpression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs als signifikant (p=0,032). Tabelle 22: MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden (n=12) bei Diagnosestellung und bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs sowie der errechnete Anstiegsfaktor (1.Rezidiv/Diagnose) Tier-Nr. P07 P09 P11 P12 P22 P26 P28 P30 P32 P39 P42 P46 MDR1 Kopien pro HPRT Kopie Diagnose 1. Rezidiv 0,4 1,3 1,7 2,6 1,8 0,5 4,6 0,4 1,5 1,0 0,3 5,2 0,3 0,8 3,6 2,9 1,7 5,7 8,1 1,1 7,3 2,0 0,6 39,4 Faktor 0,8 0,6 2,1 1,1 0,9 11,4 1,8 2,8 4,9 2,0 2,0 7,6 66 Beim Vergleich der Länge des ersten RFIs von Patienten mit und ohne Anstieg der MDR1Genexpression im Tumorrezidiv zeigten sich deutliche Unterschiede. Die mittlere Dauer des ersten RFI war bei den 8 Patienten, bei denen eine gesteigerte (≥ Faktor 1,8) MDR1Genexpression im Tumorrezidiv nachweisbar war, deutlich kürzer (Median 133 Tage, 95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den 4 Hunden ohne einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv (Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis 408 Tage). Im Log-Rang-Test erwies sich der Unterschied als signifikant (p=0,012). Kum. rezidivfreies Überleben 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 0 200 400 600 RFI in Tagen Abbildung 9: Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve des rezidivfreien Intervalls (RFI), getrennt für Hunde mit einem Anstieg (≥ Faktor 1,8) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (durchgezogene Linie) und für Hunde ohne einem deutlichen Anstieg (< Faktor 1,1) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (gestrichelte Linie) 67 4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression 4.6.3.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere Eine Expression des MRP1 Gens war sowohl in allen untersuchten Leber- (n=14) als auch Lymphknotenproben (n=14) mittels der etablierten qPCR nachweisbar. Die Höhe der Expression war im unveränderten Lebergewebe mit durchschnittlich 25 (SD 13) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich niedriger als im Lymphknotengewebe (130 (SD 57) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie; p<0,001) (Abbildung 10). Zwischen den gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und den Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6) unterschied sich die Höhe der MRP1-Genexpression in beiden Geweben nur undeutlich MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie (Leber: p=0,435; Lymphknoten: p=0,387) (Abbildung 10). 200 Beagle " Sonstige" 150 A B 100 50 Beagle " Sonstige" A 0 Lymphknoten Gewebe B Leber Abbildung 10: MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe von gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6) 68 Die Höhe der MRP1-Geneexpression im unveränderten Lymphknotengewebe variierte zwischen Biopsien von verschiedenen Beaglen (nur Popliteallymphknoten; n=9) stärker als zwischen Biopsien von verschiedenen Lymphknoten (n=7) desselben Beagles (Spannweite 59 bis 247 bzw. 114 bis 221 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Es bestand keine deutliche Korrelation zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression im Lebergewebe und im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10; R=-0,007; p=0,985) (Abbildung 11). MRP1 Kopien pro HPRT Kopie / Leber 100 75 50 25 0 0 100 200 300 MRP1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten Abbildung 11: Korrelation der Höhe der MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=-0,007; p=0,985) Eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) war nur in den Leberproben, nicht aber im unveränderten Lymphknotengewebe nachweisbar. Durchschnittlich waren im Lebergewebe 21 (SD 13) MRP2 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie enthalten. Ein signifikanter Unterschied in der Höhe der MRP2-Geneexpression zwischen den Beaglen (n=6) und den Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik (n=8) bestand nicht (p=0,662). 69 4.6.3.2 Maligne Lymphome Eine Expression des MRP1-Gens war bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung im Tumorgewebe nachweisbar. Die Höhe der MRP1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte von 11 bis 2499 (Median 268) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Eine in Relation zu den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten (Spannweite 55 bis 247 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie) erniedrigte MRP1Genexpression wiesen acht Lymphome auf (Abbildung 11). Bei 28 Lymphomen lag die Höhe der MRP1-Genexpression über den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten. Anzahl an Patienten 25 20 15 10 5 n=8 n=14 n=28 < Ln. = Ln. > Ln. MRP1-Genexpression bei Diagnose Abbildung 12: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15) Im Gegensatz zu MRP1 war eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2 cDNA Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung nachweisbar. 70 Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen Durchschnittlich (Median) waren bei den Hunden mit multizentrischem Lymphom (n=44) im Tumorgewebe 273 (Spannweite 11 bis 2499) und bei den an einem gastrointestinalen Lymphom erkrankten Patienten (n=6) 192 (Spannweite 11 bis 542) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 13). Der Unterschied zwischen Lymphomen unterschiedlicher anatomischer Lokalisation erwies sich im U-Test MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie nach Mann und Whitney als nicht signifikant (p=0,179). R 2000 R 1000 0 R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R multizentrisch gastrointestinal anatomische Form Abbildung 13: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6) (UTest von Mann und Whitney: p=0,179) 71 Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen Die Höhe der MRP1-Genexpression unterschied sich im U-Test nach Mann und Whitney deutlich (p=0,001) zwischen Hunden mit multizentrischem T- Zell- und B-Zell-Lymphom. Bei Hunden mit einem B-Zell-Lymphom (n=28) waren durchschnittlich 406 (Spannweite 142 bis 2499), bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Patienten (n=8) durchschnittlich 95 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie (Spannweite 11 bis 735) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie nachweisbar. R 2000 R 1000 R R R R R R R R R R R R R R R 0 R R R R R B-Zell-Lymphom T-Zell-Lymphom Immunphänotyp Abbildung 14: Vergleich der MRP1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,001) 72 Einfluss von Glukokortikoiden auf die MRP1-Genexpression Aufgrund des Einflusses des Immunphänotyps auf die Höhe der MRP1-Genexpression wurden nachfolgend nur Hunde mit einem B-Zell-Lymphom berücksichtigt. Hunde, die bei Diagnosestellung mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren, wiesen im Durchschnitt eine höhere MRP1-Genexpression im Tumorgewebe auf (Median 508, Spannweite 407 bis 2499 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie) als nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde (Median 355, Spannweite 142 bis 1551 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie) (Abbildung 15). Im U-Test nach Mann und Whitney erwies sich MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie der Unterschied jedoch als nicht signifikant (p=0,055). 2500 R 2000 R 1500 R R 1000 500 R R R R R R R R R R R R R R R R R ja nein Vorbehandlung mit Glukokortikoiden Abbildung 15: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem B-Zell-Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=7), und von Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=21) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,055) 73 Einfluss der MRP1-Genexpression auf die Therapieantwort Ingesamt reagierten 8 von 9 (89%) der Patienten, bei denen die Höhe der MRP1Genexpression im Tumorgewebe den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (=Ln.), mit einer Vollremission auf die erste bzw. zweite Chemotherapie. Bei den Patienten mit einer in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erhöhten MRP1-Genexpression (>Ln.) konnte in 19 von 23 (83%) der Fälle eine Vollremission erzielt werden. Die Überprüfung auf statistische Signifikanz ergab keine deutliche Assoziation zwischen der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) und der MRP1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (>Ln. gegenüber =Ln.) (Fishers exakter Test: p= 0,65). Anzahl an Patienten 30 2 20 2 19 Therapieantwort 10 NR 8 PR 0 CR = Ln. >Ln. MRP1-Genexpression Abbildung 16: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NR: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission 74 Einfluss der Höhe der MRP1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien wurden nur Hunde mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls in der Analyse berücksichtigt. Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden wiesen 15 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unveränderten Lymphknotengewebe erhöhte MRP1-Genexpression auf (Gruppe I). Bei den restlichen 4 Hunden entsprach die Höhe der MRP1-Genexpression den in den Lymphknoten der Kontrolltieren gemessenen Werten (Gruppe IIa). Das mittlere erste RFI (Median) war bei den Hunden der Gruppe IIa (MRP1-Genexpression = Ln.) 224 Tage (95% Konfidenzintervall 67 bis 381 Tage) und bei Hunden der Gruppe I (MRP1-Genexpression > Ln.) 281 Tage (95% Konfidenzintervall 166 bis 396 Tage). Der Log-Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,323. 75 MRP1-und MRP2-Genexpresssion bei Tumorrezidiven Bei 12 Hunden konnten sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs Gewebeproben entnommen werden. Im Wilcoxon-Test erwiesen sich die Unterschiede in der MRP1-Genexpression im Tumorgewebe zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten (Diagnose und erstes Rezidiv) als nicht signifikant (p=0,53). Nur bei einem Hund war ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MRP1-Genexpression zwischen Diagnose und erstem Rezidiv nachweisbar (Tabelle 23). Bei allen anderen schwankte die Höhe der MRP1-Genexpression zwischen den Untersuchungszeitpunkten nur unwesentlich (Faktor 0,5 bis 1,4). Im Gegensatz zum MRP1-Gen war keine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2 cDNA Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in den untersuchten Tumorrezidiven nachweisbar. Tabelle 23: MRP1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung und Ausbildung des ersten Tumorrezidivs bei 12 an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden und errechneter Anstiegsfaktor Tier-Nr. P07 P09 P11 P12 P22 P26 P28 P30 P32 P39 P42 P46 MRP1 Kopien pro HPRT Kopie Diagnose 1. Rezidiv 475 355 229 380 406 1057 507 870 141 142 171 475 445 344 220 424 1095 913 517 545 96 132 283 461 Faktor 0,9 1,0 1,0 1,1 2,7 0,9 1,0 0,6 0,7 0,9 1,7 1,0 76 4.7 RT-PCR zum Nachweis von Survivin mRNA Mit allen drei PCR-Assays war eine Expression von Survivin mRNA in menschlichem Kolonkarzinomgewebe nachweisbar (Tabelle 24). In Plazentagewebe vom Hund war dagegen mit keinem der Primerpaare eine Expression von Survivin mRNA detektierbar. Bei zwei Primerpaaren ließ sich das jeweilige PCR-Produkt aus genomischer DNA vom Menschen, nicht aber aus genomischer DNA vom Hund amplifizieren (Tabelle 24). Tabelle 24: Ergebnisse der zum Nachweis von Survivin durchgeführten PCR-Assays Template Spezies cDNA Kolonkarzinom Primerpaar SURV1 SURV2 SURV3 Mensch positiv positiv positiv cDNA Plazenta Hund negativ negativ negativ gDNA Hund negativ negativ negativ gDNA Mensch negativ positiv positiv 77 4.8 Immunhistochemische Untersuchung der P-Glykoproteinexpression Zum immunhistochemischen Nachweis von P-Glykoprotein wurde der Antikörperklon C219 verwendet. Die Färbung wurde an Lebergewebe etabliert. Das Färbemuster im Lebergewebe (multifokale Färbung der kanikulären Oberfläche der Hepatozyten) entsprach den Angaben zur P-Glykoproteinexpression im Lebergewebe aus der Literatur (GINN 1996). Nach Etablierung des Antikörpers wurde bei 20 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden die Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe bei Diagnosestellung untersucht. Bei 19 von 20 Hunden reagierten nur einzelne Tumorzellen mit dem Antiköper gegen P-Glykoprotein (< 1%) (Abbildung 17). Nur bei einem Patienten (Tier-Nr.P20) ließen sich multifokal Tumorzellgruppen mit dem Antikörperklon C219 anfärben (Abbildung 17). Bei dem Tumor dieses Patienten handelte es sich um ein gastrointestinales, nicht mit Glukokortikoiden vorbehandeltes Lymphom, welches nicht auf eine Chemotherapie reagierte. Die Höhe der MDR1-Genexpression betrug bei dem Lymphom mit der deutlichen P-Glykoproteinexpression 50 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Bei den restlichen 19 Hunden, bei denen nur sehr wenige Tumorzellen mit dem Antikörperklon C219 reagierten, war die mittels RT-qPCR gemessene Höhe der MDR1-Genexpression im Tumorgewebe dagegen mit 0,4 bis 16 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich niedriger. 78 Abbildung 17: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein. Oberes Bild. Lymphom, bei dem nur einzelne Zellen mit dem Antikörperklon C219 reagierten. Umteres Bild. Lymphom mit deutlicher Immunreaktivität gegen den Antikörperklon C219 (Balken = 50 µm) 79 5 DISKUSSION Voraussetzung für die Durchführung von klinischen Studien zur MDR beim Hund ist die Möglichkeit, die Expression von Zellmembranproteinen, die eine Vielfachresistenz vermitteln können, in Tumorbiopsien reproduzierbar quantifizieren zu können. Zur Untersuchung der PGlykoprotein-, MRP1- und MRP2-Expression stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung (BECK et al. 1996; BROXTERMAN et al. 1996). Die Proteine können mittels monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden oder die Expression der für die Proteiene kodierenden Gene kann untersucht werden (NOONAN et al. 1990; HERZOG et al. 1992; FLENS et al. 1994; HIPFNER et al. 1994). Zwar können hohe Expressionsdichten mit allen Verfahren zuverlässig bestimmt werden, die Messung geringer Expressionsdichten bereitet jedoch häufig Schwierigkeiten (BECK et al. 1996, BROXTERMAN et al. 1996; MARIE et al. 1997). Beim Hund werden zur Untersuchung der P-Glykoproteinexpression sowohl immunhistochemische Techniken als auch Western Blots eingesetzt und zur Bestimmung der MDR1-Genexpression konventionelle RT-qPCRs verwendet (MOORE et al. 1995; GINN 1996; STEINGOLD et al. 1998). Mit keiner dieser Techniken können jedoch präzise quantitative Daten, die einen Vergleich der Expressionshöhe zwischen verschiedenen Geweben, Tumorentitäten oder Krankheitsstadien ermöglichen, erhoben werden. In der vorliegenden Studie wurde zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2Genexpression in kaninen Lymphomen eine RT-qPCR im real-time-Modus etabliert. Die Untersuchungsmethode wurde erstmals 1996 von GIBSON und Mitarbeitern beschrieben (GIBSON et al. 1996). Als allgemeine Vorzüge der RT-qPCR im real-time-Modus gelten u.a. eine hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten, (BUSTIN 2002; GINZINGER 2002). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphophoribosyltransferase (HPRT) verwendet. HPRT wird im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen sehr niedrig und konstant exprimiert (FOSS et al. 1998). Die in der eigenen Studie gemessenen HPRT cDNA Kopienzahlen entsprachen in etwa den in den MDR1 niedrig exprimierenden Lymphomen gemessenen MDR1 cDNA Kopienzahlen. HPRT ist somit als endogenes Kontrollgen für die etablierten qPCR-Assays geeignet. 80 Zur Beurteilung der Sensitivität der etablierten RT-qPCR wurden Verdünnungen der MDR1-, MRP1- und MRP2-Standards mit 106 bis 100 Kopien pro 25 µl PCR-Ansatz analysiert. Sowohl bei MDR1 als auch bei MRP1 und MRP2 konnten 10 Kopien pro PCR-Ansatz sicher nachgewiesen werden. Die Streuung der Ct-Werte innerhalb der als Triplikate gemessenen Ansätze war relativ gering (SD < 1,25). Dies unterstreicht die Zuverlässigkeit der Messergebnisse. Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurde der Variationskoeffizient der Ct-Werte herangezogen. Alle cDNA-Proben wurden in zwei verschiedenen Messdurchgängen jeweils als Triplikat untersucht. Der Variationskoeffizient der Ct-Werte innerhalb der Messdurchgänge und zwischen den Messdurchgängen reichte von 0,1% bis 5% und entsprach den von BUSTIN veröffentlichten Empfehlungen (BUSTIN 2000). Aufgrund der in verschiedenen Studien nachgewiesenen Expression von P-Glykoprotein, MRP1 und MRP2 in der Leber beim Hund (GINN 1996; CONRAD et al. 2001) wurde unverändertes Lebergewebe als Positivkontrolle verwendet. Lymphknotengewebe diente als Vergleichsgewebe. In allen untersuchten Lymphknoten- und Leberproben war eine Expression von MDR1 mRNA und MRP1 mRNA mittels der etablierten RT-qPCR nachweisbar. Eine Expression des MRP2-Gens war dagegen nur in unverändertem Lebergewebe, nicht aber in Lymphknotengewebe sicher detektierbar. Die Höhe der MRP2-Genexpression war jedoch auffallend niedrig. Beim Menschen wird MRP2 in der Leber relativ hoch exprimiert. Unterschiede im MRP2-Expressionsmuster zwischen Hund und Menschen werden vermutet (CONRAD et al. 2001). Zur Verbesserung der Repräsentativität der Vergleichswerte wurden neben gesunden Beaglen auch Patienten der Klinik für kleine Haustiere als Kontrolltiere verwendet. Die Höhe der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- bzw. Lymphknotengewebe unterschied sich zwischen den Klinikpatienten und den gesunden Beaglen nicht deutlich. Dies unterstreicht die Repräsentativität des Kontrollkollektivs. Die interindividuelle Variation der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war verhältnismäßig hoch. Ähnliche Messwertschwankungen wurden auch in Lebergeweben von gesunden Menschen gefunden (SCHUETZ et al. 1995). Ursache und Bedeutung der Schwankungen sind ungeklärt. Möglicherweise spielen Alter, Abstammung oder Ernährung eine Rolle. 81 In früheren Studien zur P-Glykoproteinexpression beim Hund wurde unverändertes Lymphknotengewebe als Negativkontrolle verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et al. 1996; LEE et al. 1996). Bemerkenswerterweise war in der eigenen Studie in allen untersuchten Lymphknotenproben eine Expression des MDR1-Gens mittels RT-qPCR nachweisbar. Die Höhe der Expression war jedoch deutlich niedriger als in den untersuchten Lebergeweben. Es ist anzunehmen, dass die in der vorliegenden Studie etablierte RT-qPCR sensitiver ist als die in anderen Studien verwendeten immunhistochemischen Nachweisverfahren. Studien, in denen eine Expression von P-Glykoprotein in Lymphozyten des peripheren Blutes beim Menschen nachgewiesen wurde, unterstützen diese Annahme (KLIMECKI et al. 1994; LOHRI et al. 1997). Die Chemotherapie ist derzeit fast immer die Therapie der Wahl bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden (MADEWELL 1999). Zu Beginn der Behandlung kann bei bis zu 90% der an einem multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde ein Tumorrückgang erreicht werden (ETTINGER 2003). Mittels der etablierten real-time RT-qPCR wurde die MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression in 50 Lymphomen bei Diagnosestellung und in 12 Tumorrezidiven quantifiziert. In allen Lymphomen war eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar. In der Mehrzahl der untersuchten Fälle war die Expression jedoch relativ niedrig. Nur 3 von 50 Lymphomen wiesen bei Diagnosestellung eine in Relation zu gesundem Lymphknotengewebe gesteigerte MDR1-Genexpression auf. Dieser niedrige Anteil steht im Einklang mit der im Allgemeinen guten chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit der Lymphome des Hundes zu Behandlungsbeginn. In früheren Studien konnte eine Expression von P-Glykoprotein mittels Western Blot oder Immunhistochemie in 3 bis 33 % der Lymphome des Hundes bei Diagnosestellung nachgewiesen werden (MOORE et al. 1995; GINN 1996; LEE et al. 1996). Ähnlich variierende Angaben werden für das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen berichtet (YUEN u. SIKIC 1994). Zumeist wurden zum Nachweis von P-Glykoprotein beim Hund die Antikörperklone C219 und C494 verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et al. 1996; GINN 1996; LEE et al. 1996) Es ist bekannt, dass die Verwendung unterschiedlicher Antikörperklone gegen P-Glykoprotein beim Menschen zu abweichenden Färbeergebnissen führen kann (PILERI et al. 1991; BECK et al. 1996). Ähnliches könnte unter Umständen auch 82 für den Hund gelten. In der eigenen Studie war nur bei einem der 20 immunhistochemisch untersuchten Lymphome eine deutliche Immunreaktivität mit dem Antikörperklon C219 feststellbar. Im Vergleich zu früheren Studien erscheint dieser Anteil zunächst als verhältnismäßig gering. In zwei von drei Studien, die ebenfalls den Antikörperklon C219 verwendeten, wurden jedoch ähnlich niedrige Anteile P-Glykoprotein-positiver Lymphome gefunden (MOORE et al. 1995; GINN 1996). Interessanterweise wies das stark P-Glykoprotein-positive Lymphom eine deutlich höhere MDR1-Genexpression auf als die restlichen 19 immunhistochemisch untersuchten Lymphome. Eine Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und der Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen u.a. bei Non-Hodgkin-Lymphomen beschrieben (LIU et al. 2001). Im Allgemeinen war nur bei Non-Hodgkin-Lymphomen mit einer relativ hohen MDR1-Expression auch eine Expression von P-Glykoprotein immunhistochemisch nachweisbar (LIU et al. 2001). Nach den eigenen Untersuchungsergebnissen kann eine Korrelation zwischen der Expressionsdichte von P-Glykoprotein und der Höhe der MDR1-Genexpression ebenfalls vermutet werden. Die etablierte RT-qPCR bietet zwar gegenüber dem immunhistochemischen Nachweis den Vorteil der höheren Sensitivität, ermöglicht aber im Gegensatz zur Immunhistologie keine morphologische Zuordnung der Expression. Somit ist eine Beeinflussung der Untersuchungsergebnisse durch einen hohen Gehalt an nicht neoplastisch entarteten Zellen denkbar. Bisher gelang es jedoch nicht, einen deutlichen Einfluss einer Kontamination mit T-Lymphozyten auf die gemessene Höhe der MDR1-Genexpression in Lymphomen des Menschen nachzuweisen (KANG et al. 1995). Dennoch erscheint eine gewisse Beeinflussung möglich. Der Einsatz neuerer Techniken zur Gewebeisolierung könnte zur Klärung dieser Problematik dienlich sein. Maligne Lymphome können sich sowohl in ihrem pathologisch-anatomischen Erscheinungsbild als auch in ihren tumorbiologischen Eigenschaften erheblich unterscheiden (FAN 2003). Unter anderem gelten gastrointestinale Lymphome als im Allgemeinen schlechter chemotherapeutisch beeinflussbar als multizentrische Verlaufsformen (COUTO et al. 1989). Interessanterweise war in der vorliegenden Studie die mittlere Höhe der MDR1Genexpression im Tumorgewebe von Hunden mit gastrointestinalen Lymphomen bei Diagnosestellung deutlich höher als bei Patienten mit multizentrischen Verlaufsformenn. Bei 83 gesunden Hunden unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen Darmlymphknoten und Lymphknoten anderer Körperregionen dagegen nicht. Eine Chemotherapie wurde nur bei zwei der Hunde mit einem gastrointestinalen Lymphom durchgeführt. Ein Patient reagierte mit einer Teilremission, der andere mit einem stationären Tumorverhalten. Ein direkter Zusammenhang zwischen der höheren MDR1-Genexpression und der schlechteren therapeutischen Beeinflussbarkeit gastrointestinaler Lymphome lässt sich somit vermuten. Inwieweit sich dieser Zusammenhang in zukünftigen Studien bestätigt, bleibt allerdings abzuwarten. In zwei früheren Studien wurde bereits eine prognostische Relevanz der Expression von P-Glykoprotein für die Überlebenszeit von Hunden mit malignem Lymphom beschrieben (BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Dagegen konnten Steingold und Koautoren keinen Zusammenhang zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und dem Therapieerfolg nachweisen (STEINGOLD et al. 1998). In der eigenen Studie bestand eine deutliche Assoziation zwischen der Höhe der MDR1Genexpression und der Therapieantwort. So konnte bei keinem der Lymphome mit einer gesteigerten MDR1-Genexpression durch die Chemotherapie eine vollständigen Rückbildung des Tumors erreicht werden. Auch die Länge des ersten rezidivfreien Intervalls war bei den Patienten mit einer erniedrigten MDR1-Genexpression vor Therapiebeginn deutlich länger als bei Hunden, bei denen die gemessenen Werte den in gesundem Lymphknotengewebe ermittelten normalisierten MDR1 cDNA Kopienzahlen entsprachen. Die Ergebnisse lassen eine Relevanz der gesteigerten MDR1-Expression für den Behandlungserfolg bei einem Teil der untersuchten Patienten vermuten. Bei verschiedenen Tumoren des Menschen wurde eine Zunahme der P-Glykoprotein- bzw. MDR1-Genexpression im Therapieverlauf nachgewiesen. 1979 wurde von GOLDIE und COLDMAN ein Modell aufgestellt, nach dem - ausgehend von einer Mutationsrate von 10–5 bis 10–6 - die Wahrscheinlichkeit, bereits in einem Tumor mit 107 Zellen keine resistenten Tumorzellen zu finden, äußerst gering ist (GOLDIE u. COLDMAN 1979). Etwaige resistente Tumorzellen weisen unter dem Selektionsdruck der Chemotherapie einen Überlebensvorteil auf. Letztendlich entsteht ein therapierefraktäres Tumorrezidiv (NÜSSLER u. GIESELER 2000). In der vorliegenden Studie konnte bei 7 von 12 Patienten ein deutlicher Anstieg der MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung nachgewiesen 84 werden. Interessanterweise war bei diesen Patienten auch die Länge des rezidivfreien Intervalls gegenüber den Patienten ohne Anstieg der Höhe der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv deutlich verkürzt.. Bei vier der Patienten mit einem Anstieg der MDR1Genexpression im Tumorrezidiv wurde die Chemotherapie wiederholt. Bei einem Patienten erwies sich das Lymphom als therapierefraktär, bei den restlichen drei Patienten konnte eine vollständige Remission erzielt werden. Bemerkenswerterweise war bei dem Patienten mit dem therapierefraktären Lymphom die MDR1-Genexpression deutlich höher als bei den restlichen Patienten. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass bei einem Teil der Lymphome des Hundes die MDR1-Genexpression im Therapieverlauf ansteigt. Ein Zusammenhang zwischen einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv und der Abnahme der chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit ist zu vermuten. Im Gegensatz zur Expression von P-Glykoprotein ist über die klinische Relevanz der Expression von MRP1 und MRP2 beim malignen Lymphom des Hundes, soweit aus der Literatur ersichtlich, noch nichts bekannt. In der vorliegenden Studie konnte bei einem Patienten mit einer geringen MDR1-Genexpression kein vollständiger Tumorrückgang erreicht werden. Somit ist ein Vorkommen alternativer Resistenzmechanismen bei kaninen Lymphomen zu vermuten. Beim Menschen wurde bereits eine Expression des MRP1 in Non-Hodgkin-Lymphomen nachgewiesen und eine Beteiligung bei der Ausprägung von Zytostatikaresistenzen bei einem Teil der Patienten vermutet (FLENS 1996; ZHAN et al. 1997). In der vorliegenden Studie war MRP1 mittels real-time RT-qPCR in allen untersuchten Lymphomen nachweisbar. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression und der Therapieantwort oder der Länge des rezidivfreien Intervalls war jedoch nicht feststellbar. Ein deutlicher Anstieg der MRP1-Expression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs war ebenfalls nur bei einem von 12 Patienten nachweisbar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MRP1 bei der Mehrheit der untersuchten Hunde als Resistenzmechanismus nicht von wesentlicher Bedeutung war. Inwieweit die MRP1-Überexpression bei dem Patienten mit der gesteigerten MRP1Expression bei Rezidivausbildung von klinischer Relevanz war, ist ungewiss. Zwar kann in vitro durch eine Steigerung der MRP1-Expresssion um 50% eine deutliche Herabsetzung der Empfindlichkeit von Zellen gegen Doxorubicin (Senkung der IC50 um 50%) erzielt werden, 85 jedoch ist die Höhe der MRP1-Genexpression, die in vivo eine MDR vermitteln kann, bisher nicht bekannt (GRANT et al. 1994; ZHAN et al. 1997). In Transfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass neben P-Glykoprotein und MRP1 auch MRP2 eine Resistenz gegen verschiedene Zytostatika in vitro vermitteln kann (CUI et al. 1999). In der vorliegenden Studie war weder in den unveränderten Lymphknotengeweben noch in den Lymphomen zum Zeitpunkt der Diagnose oder Rezidivausbildung eine deutliche Expression von MRP2 nachweisbar. Dieses weist darauf hin, dass MRP2 kein Resistenzmechanismus bei den untersuchten Patienten war. Schon seit einiger Zeit ist bekannt, dass die MDR1-Genexpression in Zellkulturen beim Menschen durch Dexamethason zelltypspezifisch aktiviert werden kann (ZHAO et al. 1993). Eine Behandlung mit Glukokortikoiden vor Chemotherapiebeginn gilt bei Hunden mit Lymphomen als prognostisch ungünstig (PRICE et al. 1991). BERGMAN (2003) vermutet, dass die schlechtere chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von mit Glukokortikoiden vorbehandelten Hunden möglicherweise mit einer Induktion der Expression von P-Glykoprotein im Zusammenhang steht. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Studie die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den mit Glukokortikoiden vorbehandelten und den nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphomen verglichen. Ein deutlicher Unterschied war jedoch nicht feststellbar. Auch bestand zwischen diesen beiden Patientengruppen kein deutlicher Unterschied in der Länge des ersten rezidivfreien Intervalls. An Zellkulturen gelang es ZHAO und Mitarbeitern zu zeigen, dass die Induktion der MDR1-Genexpression durch Dexamethason sowohl zeit- als auch dosisabhängig ist (ZHAO et al. 1993). Die Intensität und Dauer der Vorbehandlung variierten im eigenen Patientenkollektiv stark. Es kann somit nicht ausgeschlossen werden, dass die Dosis und Dauer der Glukokortikoidbehandlung bei einem Teil der untersuchten Patienten zu niedrig waren, um eine Induktion der MDR1-Genexpression auszulösen. Über den Effekt von Glukokortikoiden auf die MRP1-Expression ist bisher wenig bekannt. ZHU und CENTER zeigten, dass der Promotor des humanen MRP1-Gens ein sogenanntes glucocorticoid response element (GRE) enthält und vermuteten eine mögliche Expressionssteigerung des MRP1-Gens durch Glukokortikoide (ZHU u. CENTER 1994). In vitro konnte jedoch kein Einfluss von Dexamethason auf die Expression von MRP1 in kaninen Osteosarkomzellinien oder humanen Kapillarendothelzellen nachgewiesen werden 86 (MEALEY et al. 2003, TOROK et al. 2003). Überraschenderweise wiesen in der vorliegenden Studie die mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphome eine höhere MRP1Genexpression auf als die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Tumoren. Eine systematischere Prüfung des Zusammenhanges wäre wünschenswert. Der Immunphänotyp gilt derzeit als einer der wichtigsten prognostischen Faktoren beim malignen Lymphom des Hundes (MADEWELL 1999). In zahlreichen Studien ist ein Zusammenhang zwischen dem Immunphänotyp und der Remissionsdauer oder der Überlebenszeit aufgezeigt worden (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al. 1994; DOBSON et al. 2001). Es stellt sich somit die Frage, inwieweit sich T-Zell- und B-Zell-Lymphome hinsichtlich der Höhe der MDR1-Genexpression unterscheiden. Beim Menschen ist eine Korrelation zwischen der P-Glykoproteinexpression und dem Immunphänotyp von Lymphomen bereits beschrieben worden (CHENG et al. 1993). Lee und Mitarbeiter konnten dagegen beim Hund keinen Zusammenhang nachweisen (LEE et al. 1996). In der vorliegenden Studie unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen T-Zellund B-Zell-Lymphomen ebenfalls nicht deutlich. Überraschenderweise wiesen Hunde mit einem T-Zell-Lymphom jedoch eine deutlich niedrigere MRP1-Genexpression im Tumorgewebe auf als die Patienten mit einem B-Zell-Lymphom. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese unerwarteten Studienergebnisse zu überprüfen. Im Gegensatz zu MDR1, MRP1 und MRP2 gelang eine Etablierung einer RT-PCR zum Nachweis einer Expression von Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund in dieser Studie nicht. Alle zum Nachweis verwendeten Primer wurden so ausgewählt, dass eine 100%iger Sequenzhomologie des Amplikons zwischen Mensch und Hund bestand. Zwar gelang der Nachweis von Survivin in Kolonkarzinomgewebe und genomischer DNA vom Menschen, jedoch nicht in genomischer DNA oder Plazentagewebe vom Hund. Die Integrität der verwendeten cDNA und genomischen DNA wurde überprüft. Die Ergebnisse der durchgeführten Vorversuche lassen weitere Untersuchungen, wie eine Überprüfung der aus der Genbank entnommenen Survivinsequenz, als notwendig erscheinen. In verschiedenen Studien wurde das maligne Lymphom des Hundes als mögliches Modell für das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen vorgeschlagen. Als Voraussetzung für Studien zur Modulation bestehender Vielfachresistenzen beim malignen Lymphom des Hundes wird die Etablierung eines sensitiven und reproduktiven Untersuchungsverfahrens zum Nachweis 87 möglicher, mit der Ausprägung einer MDR in Zusammenhang stehender Mechanismen angesehen. Mit den in der vorliegenden Studie etablierten RT-qPCR-Assays steht ein solches Nachweisverfahren zur Verfügung. Die Ergebnisse der Studie lassen vermuten, dass ein Teil der an malignem Lymphom erkrankten Hunde von einer Modulation der P-Glykoprotein-Transporterfunktion profitieren würde. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese Patienten prospektiv zu erfassen und die Wirksamkeit und Sicherheit einer etwaigen Therapie zu prüfen. 88 6 ZUSAMMENFASSUNG K. Culmsee Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen Lymphom des Hundes Eine systemische Chemotherapie ist derzeit die Therapie der Wahl bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen. Zwar spricht zu Behandlungsbeginn die überwiegende Mehrheit der Tumoren sehr gut auf die Chemotherapie an, jedoch sind Rezidive aufgrund erworbener Vielfachresistenzen (multidrug resistance, MDR) im Therapieverlauf relativ häufig. Es wird angenommen, dass eine Steigerung der Expression verschiedener Gene, wie z.B. des multidrug resistance 1–Gens (MDR1); der multidrug resistance associated-protein 1 (MRP1)- und 2 (MRP2)-Gene zur Ausprägung einer MDR führen können. In der vorliegenden Studie wurde eine Reverse Transkription quantitative-PolymeraseKettenreaktion (RT-qPCR) im real time Modus zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression in gesunden und neoplastischen Geweben beim Hund etabliert. Die MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression wurde bei 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden gemessen. Tumorgewebeproben wurden bei allen Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung und bei 12 Hunden zusätzlich bei Ausbildung eines Tumorrezidivs entnommen. 25 Hunde wurden mit einer Kombinationschemotherapie aus L-Asparaginase, Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin und Prednisolon behandelt. In allen untersuchten Tumorproben war eine Expression des MDR1- und MRP1-Gens nachweisbar. Die Höhe der Expression variierte bei beiden Genen zwischen den untersuchten Proben. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung wiesen 3 von 50 Lymphomen eine im Vergleich zu unveränderten Lymphknotengewebe erhöhte MDR1- und 28 von 50 Lymphomen eine erhöhte MRP1-Genexpression auf. Im Gegensatz zum MDR1- und MRP1-Gen war eine Expression des MRP2-Gens in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung oder zum Zeitpunkt des ersten Tumorrezidivs nachweisbar. Gastrointestinale Lymphome wiesen eine höhere MDR1-Genexpression auf als multizentrische Lymphome (p=0,002). Lymphompatienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Vergleich zum Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war, reagierten deutlich häufiger auf eine 89 Chemotherapie mit einer Vollremission als Hunde, bei den die MDR1-Genexpression gesteigert war (p=0,002). So konnte bei keinem von drei Tumoren mit einer MDR1Genexpression höher als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere, aber bei 27 von 29 Tumoren ohne gesteigerter MDR1-Genexpression eine Vollremission erreicht werden. Ein Zusammenhang zwischen der Therapieantwort und der Höhe der MRP1-Genexpression bestand bei den untersuchten Patienten dagegen nicht (p=0,56). Bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom unterschied sich die Länge des ersten rezidivfreien Intervalls in Abhängigkeit zur Höhe der MDR1-Genexpression (p<0,001), nicht aber in Abhängigkeit zur Höhe der MRP1-Genexpression. Ein deutlicher Anstieg (≥ Faktor 2) der MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung war bei 7 von 12 Hunden nachweisbar. Dagegen war die Höhe der MRP1Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung mit Ausnahme eines Hundes nicht wesentlich verändert. Bei den Hunden mit einem deutlichen Anstieg der MDR1Genexpression zwischen Diagnose und erstem Rezidiv war die mittlere Dauer des rezidivfreien Intervalls signifikant kürzer (Median 133 Tage, 95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den Hunden ohne deutliche Änderung der MDR1-Genexpression (n=4;Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis 408 Tage; p=0,012). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MDR1, aber nicht MRP1 oder MRP2 für die Ausprägung einer Vielfachresistenz bei einem Teil der Patienten von Bedeutung war. 90 7 SUMMARY K. Culmsee: Clinical relevance of MRD1, MRP1 and MRP2 gene expression in canine lymphoma In dogs, systemic chemotherapy for management of multicentric lymphoma is rewarding. Although the majority of lymphomas initially respond well to chemotherapy, the development of disease relapse due to multidrug resistance (MDR) is relatively common. Upregulation of several genes thought to be involved in MDR including multidrug resistance 1 (MDR1), multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) and 2 (MRP2). In the present study, a real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction assay (RT-qPCR) was established to accurately and reproducibly quantify the expression levels of MDR1, MRP1 and MRP2 in canine normal and neoplastic tissues. mRNA levels of MDR1, MRP1 and MRP2 were quantified in 50 dogs with lymphoma by RTqPCR. Tumor tissue samples were taken from all dogs at diagnosis and from 12 dogs at the first relapse. All dogs underwent a combination chemotherapy (L-asparaginase, vincristine, cyclophosphamide, doxorubicin, prednisolone). MDR1 and MRP1 gene expression levels were detected in all samples analysed, with varying copy numbers between the samples. At diagnosis in 3 of 50 lymphomas MDR1 expression levels were higher than in normal lymph node tissue. Wheras, distinctly higher MRP1 expression levels were measuerd in 28 of 50 lymphomas. In contrast to MDR1 and MRP1, no significant expression of MRP2 in any of the lymphomas at diagnosis or first relapse was detectable. Interestingly, gastrointestinal lymphomas expressed higher MDR1-RNA levels than multicentric lymphomas (p=0,002). When lymphomas were assigned based on their MDR1 gene expression to groups there was a significant difference in ability to induce complete (p=0,002) In none of three tumors with MDR1 expression levels higher than in normal lymph node tissue, but in 27 of 29 tumors with no increase in MDR1 expression a complete remission was achieved. In contrast there was no association between MRP1 mRNA expression levels and achievement of complete remission detectable (p=0,56). Also, only high MDR1 mRNA levels (p<0,001) but not high MRP1 levels, were associated with shorter relapse-free intervals in dogs with multicentric B-cell lymphoma. There was a significant 91 increase (≥ factor 2) in MDR1 mRNA expression between diagnosis and first relapse in 7 of 12 dogs. Whereas MRP1 mRNA expression levels between diagnosis and first relapse were, with the exception of one dog, unchanged. In dogs with an increase in MDR1 gene expression between diagnosis and the first relapse (n=8) the median duration of relapse free interval was significant shorter (median 133 days, 95% confidence interval 90 to 176 days) than in the dogs with no clear change in MDR1 gene expression (n=4;median 312 days, 95% confidence interval 216 to 408 days; p=0,012). In conclusion the results of this study suggest that in contrast to MDR1, expression of MRP1 and MRP2 may not be a major mechanism of multidrug resistance for the majority of dogs with lymphoma. 92 8 LITERATURVERZEICHNIS ADIDA, C., D. BERREBI, M. PEUCHMAUR, M. REYES-MUGICA u. D. ALTIERI (1998): Anti-apoptosis gene, survivin, and prognosis of neuroblastoma Lancet 351, 882-883 ADIDA, C., C. 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BROXTERMAN, H.S.L. CHAN, W.S. DALTON, M. DIETEL, A.T. FOJO, R. GASCOYNE, D. HEAD, P.J. HOUGHTON, D.K. SRIVASTAVAD, M. LEHNERT, C.P. LEITH, E. PAIETTA, Z.P. PAVELIK, L. RIMSZA, B.I. SIKIC, P.R. TWENTYMAN, R. WARNKE u. R. WEINSTEIN (1996): Methods to detect P-glycoprotein-associated multidrug resistance in patients’ tumors: consensus recommendations Cancer Res. 56, 3010-3020 BERGMAN, P.J., G.K. OGILVIE u. B.E. POWERS (1996): Monoclonal antibody C219 immunohistochemistry against P-glycoprotein: sequential analysis and predictive ability in dogs with lymphoma J. Vet. Intern. Med. 10, 354-359 BERGMAN, P.J. u. G.K. OGILVIE (1995): Drug resistance and cancer therapy Comp. Cont. Edu. 17, 549-558 BERGMAN, P.J. (2003): Mechanisms of anticancer drug resistance Vet. Clin. North Am. Small Anim. 33, 651-667 BIEDLER, J.L. u. H. 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CENTER (1994): Cloning and sequence analysis of the promoter region of the MRP gene of HL60 cells isolated for resistance to adriamycin Cancer Res. 54, 4488-4492 126 9 ANHANG 9.1 Rasse und Alter der an Lymphom erkrankten Hunde Tabelle 25: Rasse und Alter der an malignem Lymphom erkrankten Hunde Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P1 Dandie-Diamond-Terrier 11 P2 Dobermann 5 P3 Bouvier des Flandres 7 P4 Bouvier des Flandres 7 P5 Kleiner Münsterländer 7 P6 Weimaraner 5 P7 Deutsch-Drahthaar 6 P8 Dandie-Diamond-Terrier 1 P9 Bouvier des Flandres 5 P10 Berner Sennenhund 6 P11 Berner Sennenhund 7 P12 Boxer 6 P13 Neufundländer 4 P14 Riesen Schnauzer 5 P15 West Highland White Terrier 11 P16 Dobermann 7 P17 Rottweiler 4 P18 Schweißhund 7 P19 Schweißhund 5 P20 Dobermann 7 P21 Mischling 5 P22 Berner Sennenhund 5 P23 Mischling 7 P24 Mischling 6 P25 Mischling 7 127 Tabelle 25 Fortsetzung Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P26 Mischling 8 P27 Mischling 6 P28 West Highland White Terrier 11 P29 Golden Retriever 8 P30 Deutsche Schäferhund 8 P31 Yorkshire-Terrier 13 P32 Boxer 6 P33 Hovawart 7 P34 Bobtail 6 P35 Staffordshire-Terrier 5 P36 Yorkshire-Terrier 13 P37 Jack-Russel-Terrier 8 P38 West Highland White Terrier 8 P39 Collie 10 P40 West Highland White Terrier 8 P41 Boxer 11 P42 Foxterrier 8 P43 Mischling 11 P44 Golden Retriever 4 P45 Mischling 10 P46 Jack-Russel-Terrier 10 P47 Mischling 7 P48 Golden Retriever 8 P49 Berner Sennenhund 9 P50 Pon 0 128 9.2 Rezepturen der verwendeten Lösungen und Gele 10%iges, neutralgepuffertes Formalin nach LILLIE 100 ml Formalin (37%iges Formaldehyd) werden mit 4 g Natriumdihydrogenphosphat und 6,5 g Dinatriumhydrogenphosphat in 1 l dest. Wasser gelöst. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,05 molar, pH=7,25) 40g Natriumchlorid und 7,8 g Natriumdihydrogenphosphat werden in etwas weniger als 5 l dest. Wasser gelöst. Der PH-Wert wird mit Normalnatronlauge (ca. 40 ml) auf 7,25 eingestellt und die Lösung mit dest. Wasser auf 5 l aufgefüllt. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Fa. Vector Laboratories) Für 1 ml Reagenz werden 1ml PBS, 15 µl Avidin-Lösung (Reagenz A) und 15 µl biotinylierte Peroxidase (Reagenz B) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (nach Zugabe der Reagenzien A und B Lösung jeweils kurz mischen). Lösung für die enzymhistochemische Farbreaktion (3,3 Diaminobenzidin 0,05%) Für 200 ml Lösung werden 100 mg 3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in 50 ml PBS über mehrere Stunden gelöst (Stammlösung 0,2%ig, Lagerung bei –25 °C im Dunkeln). Vor Gebrauch wird die Stammlösung 1:4 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und filtriert (Faltenfilter, Fa. Schleicher & Schuell). Der filtrierten Lösung werden 2 ml Wasserstoffperoxid (3%ig) zugesetzt. Färbelösung Hämalaun nach MAYER Für 2 l Färbelösung werden 1g Hämatoxylin mit 1 l dest. Wasser gelöst. Anschließend werden in der Hämatoxylinlösung 200 mg Natriumjodat (NaJO3) und 50 g Kalialaun unter Schütteln gelöst (blauviolette Lösung). Die Lösung wird mit 50 g Chloralhydrat und 1 l Zitronensäure versetzt (rotviolette Lösung). 129 DEPC-behandeltes destilliertes Wasser (0,01%) 100 mg Diethylpyrocarbonat (DEPC) mit 1 l dest. Wasser in Glasflasche vermischen. Über Nacht stehen lassen und autoklavieren. Tris-Borat-EDTA-(TBE)-Puffer (5 x) Für 1 l einer 5-fach konzentrierten Stocklösung des TBE-Puffers werden 54 g TRIS, 27,5 g Borsäure (H3BO3) und 20 ml 0,5 M EDTA (pH=8) mit dest. Wasser auf 1 l aufgefüllt. 1% iges Agarosegel Für ein 1%iges Agarosegel werden 1 g Agarose in 100 ml 0,5 x TBE-Puffer suspendiert, in der Mikrowelle kurz aufgekocht und bei Raumtemperatur auf 50-60 °C abkühlen gelassen. Nach Zugabe von Ethidiumbromid (10 µg) wird die Lösung in die abgedichtete Gelkammer mit eingesetzter Taschenschablone gegossen und 30-60 min bei Raumtemperatur bis zur Gelbildung stehen gelassen. 9.3 Verwendete Formeln und Gleichungen Berechnung der Gesamt-RNA-Konzentration c (µg/ml) = OD260 x VF x 40 mg/µl (c: Gesamt-RNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor) Berechnung der DNA-Konzentration c (µg/ml) = OD260 x VF x 50 µg/ml (c: DNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor) Berechnung der PCR-Produktanzahl 1µg eines 4361 bp langen PCR-Produktes entsprechen 2,1 x1011 Moleküle 130 9.4 Ergebnisse der RT-qPCR-Messdurchgänge Tabelle 26: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct-Wert MDR1 HPRT MW SD MW SD - Lebergewebe K1 25,22 0,01 31,41 0,21 K2 25,05 0,31 31,33 0,21 K3 24,37 0,02 31,60 0,62 K4 25,71 0,45 32,04 0,23 K5 24,86 0,44 32,24 0,50 K6 24,71 0,29 32,73 0,53 K10 26,09 0,15 33,07 0,30 K11 25,86 0,28 32,64 0,38 K12 25,01 0,11 33,06 0,19 K13 24,02 0,11 31,28 0,19 K16 23,90 0,11 31,91 0,39 K17 26,13 0,05 33,53 0,33 K18 25,35 0,20 32,91 0,10 K19 25,31 0,18 32,21 0,01 - Lymphknotengewebe K1 27,44 0,10 29,72 0,17 K2 27,52 0,06 30,95 0,20 K3 27,00 0,18 30,18 0,10 K4 27,80 0,15 29,20 0,19 K5 27,73 0,07 30,26 0,33 K6 28,10 0,14 30,67 0,31 K7 27,60 0,04 30,07 0,20 K8 27,84 0,13 30,04 0,02 K9 / LMD 25,59 0,10 30,29 0,48 K9 / LMS 25,96 0,18 30,29 0,11 K9 / LCSD 26,13 0,05 31,09 0,23 K9 / LCSS 25,77 0,31 30,75 0,24 K9 / LPD 27,47 0,37 33,97 0,25 K9 / LPS 25,87 0,38 30,31 0,20 K9 / LJ1 25,02 0,08 30,22 0,34 K9 / LJ2 25,24 0,14 30,46 0,16 K10 27,56 0,11 30,33 0,12 K11 27,41 0,19 31,55 0,30 K12 29,72 0,16 34,07 0,08 K13 27,66 0,24 33,27 0,85 K14 26,71 0,14 30,88 0,16 K15 26,95 0,07 31,17 0,12 Nr. Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MW SD MW SD 30.053 34.090 23.597 22.347 14.847 42.577 5.506 9.376 11.310 28.617 24.207 7.721 26.234 9.162 172 6.978 235 6.278 805 7.983 562 1.862 774 2.121 1.791 254 3.450 1.117 201 212 239 133 156 169 46 95 74 216 135 51 154 108 27 28 87 20 54 57 8 13 10 28 34 12 10 0 4.573 4.289 6.075 3.581 3.735 1.684 4.083 3.487 4.284 3.209 3.024 4.130 3.102 7.456 6.409 5.549 4.185 1.302 550 1.106 5.251 4.426 361 175 729 338 156 155 93 305 287 417 99 725 731 2.287 339 501 309 167 58 179 488 216 571 254 419 805 405 207 452 461 339 330 196 244 80 246 350 295 381 102 44 48 314 254 61 34 27 105 90 44 60 7 104 24 28 36 13 34 79 30 30 28 10 25 33 21 131 Tabelle 27: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct -Wert MDR1 HPRT MW SD MW SD - Lebergewebe K1 25,42 0,11 32,79 0,22 K2 23,60 0,45 31,25 0,28 K3 24,16 0,53 31,87 0,15 K4 24,16 0,21 32,17 0,18 K5 24,99 0,33 32,81 0,35 K6 24,56 0,02 32,45 0,33 K10 26,10 0,34 35,04 0,67 K11 26,09 0,14 34,24 0,52 K12 25,04 0,19 35,10 0,65 K13 23,37 0,07 32,75 0,14 K16 24,25 0,19 31,91 0,33 K17 25,78 0,24 32,32 0,24 K18 25,41 0,15 32,41 0,36 K19 25,65 0,06 32,19 0,58 - Lymphknotengewebe K1 26,70 0,22 29,78 0,56 K2 26,97 0,17 30,63 0,34 K3 26,43 0,15 30,25 0,17 K4 26,90 0,16 29,19 0,16 K5 26,03 0,13 29,58 0,14 K6 26,43 0,30 29,62 0,09 K7 25,92 0,09 29,19 0,14 K8 25,38 0,13 29,06 0,11 K9 / LMD 26,09 0,60 31,23 0,17 K9 / LMS 25,50 0,29 31,09 0,36 K9 / LCSD 25,64 0,43 30,84 0,10 K9 / LCSS 25,75 0,81 31,16 0,22 K9 / LPD 26,17 0,36 31,28 0,22 K9 / LPS 26,25 0,36 30,92 0,20 K9 / LJ1 24,08 0,38 30,80 0,65 K9 / LJ2 24,96 0,47 29,90 0,36 K10 27,19 0,10 30,51 0,10 K11 27,90 0,10 31,31 0,17 K12 29,26 0,41 34,37 0,13 K13 26,44 0,18 32,37 0,45 K14 26,38 0,12 30,05 0,23 K15 26,84 0,08 30,16 0,19 Nr. Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MW SD MW SD 11.970 23.857 16.683 16.035 9.333 17.403 6.988 3.464 14.030 1.397 2.537 9.536 24.286 8.552 856 6.855 6.114 2.199 2.178 210 1680 324 1798 1.019 2.807 1.539 2.482 343 106 221 146 120 79 73 56 46 52 119 122 63 120 111 15 39 15 14 18 17 22 14 22 11 27 10 28 22 3.654 3.068 4.370 3.182 5.669 4.409 6.077 8.688 9.388 13.190 4.839 12.216 7.477 8.050 33.620 8.567 3.738 2.347 323 2.101 6.998 4.647 505 347 418 326 461 823 354 772 4.012 2.616 1.312 6.921 1.578 2.000 8.579 2.621 242 157 83 260 1.440 257 384 238 349 702 543 481 703 756 819 912 320 857 247 311 1.142 523 461 276 19 78 295 274 26 18 42 75 52 60 63 56 92 208 21 116 38 43 467 63 30 30 2 26 45 36 132 Tabelle 28: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P01 29,71 0,33 31,37 0,38 661 136 1.191 305 P02 27,61 0,33 33,44 0,23 782 161 26 4 P03 25,46 0,50 29,23 0,12 3.512 1.104 461 36 P04 30,78 0,41 30,44 0,33 90 23 204 45 P05 28,15 0,13 28,23 0,11 613 54 1.004 76 P06 28,50 0,19 30,66 0,10 487 61 197 13 P07 32,45 0,41 32,08 0,22 74 20 144 21 P08 32,17 0,24 31,11 0,04 89 13 270 7 P09 29,50 0,12 30,57 0,44 508 41 395 106 P10 31,69 0,19 31,82 0,07 64 8 128 6 P11 28,55 0,10 30,60 0,38 530 35 305 73 P12 28,77 0,20 30,95 0,13 407 56 163 15 P13 29,77 0,15 33,06 0,46 233 24 56 18 P14 33,80 0,24 30,90 0,43 21 4 153 42 P15 30,83 0,22 30,58 0,21 152 23 188 27 P16 26,95 0,11 29,34 0,43 2.238 165 878 225 P17 32,84 0,07 30,28 0,58 220 10 347 65 P18 30,81 0,57 30,51 0,35 766 315 369 86 P19 28,90 0,53 30,08 0,35 2.689 969 488 109 P20 28,08 0,04 34,02 0,12 1.354 30 24 2 P21 21,98 0,03 31,32 0,16 71.475 1.633 209 22 P22 30,37 0,14 30,83 0,25 296 27 185 19 P23 31,04 0,06 31,10 0,11 189 8 168 12 P24 27,96 0,08 30,28 0,04 1.210 70 218 7 P25 24,99 0,18 29,62 0,12 10.176 1.155 632 48 P26 30,46 0,22 29,17 0,10 217 32 470 33 P27 27,36 0,02 31,01 0,32 1.832 29 134 29 P28 28,34 0,12 30,94 0,10 1.162 90 268 19 P29 31,87 0,50 29,72 0,04 88 28 624 15 P30 32,36 0,56 30,78 0,26 44 18 163 28 P31 30,23 0,10 29,74 0,33 177 11 329 67 P32 30,55 0,10 31,72 0,86 216 14 154 16 Nr. 133 Tabelle 28 Fortsetzung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P33 27,74 0,17 28,96 0,13 1.380 151 1.284 105 P34 29,91 0,20 29,81 0,25 310 38 622 111 P35 27,08 0,01 31,97 0,25 2.128 10 182 31 P36 29,70 0,19 31,79 0,85 378 47 223 109 P37 32,40 0,35 31,12 0,20 110 26 253 33 P38 27,58 0,12 29,51 0,19 1.434 117 758 105 P39 29,43 0,12 29,49 0,11 775 59 736 51 P40 29,24 0,17 29,93 0,11 480 52 585 41 P41 26,27 0,04 33,95 0,29 3.703 107 33 6 P42 30,18 0,08 28,52 0,06 309 16 1.346 56 P43 28,52 0,28 29,67 0,45 1.287 228 412 123 P44 24,32 0,03 29,04 0,18 12.297 215 1.023 119 P45 27,04 0,28 29,91 0,19 2.071 398 551 70 P46 28,42 0,08 30,29 0,84 1.606 88 274 142 P47 30,84 0,46 30,72 0,40 210 69 308 87 P48 29,63 0,03 32,13 0,44 488 11 156 49 P49 29,49 0,25 30,96 0,47 546 90 348 115 P50 32,99 0,67 30,31 0,02 79 30 463 6 - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung P07 31,24 0,13 30,42 0,18 68 6 367 45 P09 31,28 0,26 32,18 0,06 135 24 157 7 P11 26,94 0,08 31,40 0,39 4.030 200 1.172 281 P12 29,05 0,14 31,01 0,57 967 96 271 107 P22 31,03 0,11 32,07 0,25 178 13 120 22 P26 27,83 0,15 31,73 0,35 1.222 127 164 37 P28 27,79 0,33 31,48 0,28 1.680 359 180 34 P30 31,07 0,43 31,12 0,06 255 73 240 10 P32 27,21 0,08 31,34 0,21 1.955 97 273 39 P39 28,97 0,60 29,95 0,39 1.186 439 609 170 P42 29,91 0,21 29,13 0,06 636 87 1.126 44 P46 26,82 0,21 32,07 0,32 4.868 672 139 30 Nr. 134 Tabelle 29: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P01 28,56 0,93 29,38 0,26 554 114 840 132 P02 27,37 0,10 32,99 0,26 1.035 71 42 7 P03 24,99 0,09 28,88 0,24 5.032 305 654 110 P04 30,65 0,50 30,84 0,22 95 6 177 26 P05 28,32 0,19 28,17 0,16 476 60 953 103 P06 28,62 0,15 30,66 0,23 389 39 174 27 P07 32,11 0,29 31,40 0,13 36 7 104 9 P08 31,74 0,06 30,50 0,37 225 10 980 230 P09 29,11 0,15 30,78 0,39 364 36 270 70 P10 31,29 0,11 31,35 0,34 157 11 235 50 P11 28,43 0,08 29,82 0,02 1.023 49 631 8 P12 29,19 0,12 31,41 0,20 621 47 223 28 P13 29,29 0,32 31,67 0,31 1.450 315 510 100 P14 33,37 0,54 30,24 0,17 350 110 4.140 440 P15 30,17 0,02 30,26 0,24 545 8 820 121 P16 27,54 0,12 29,76 0,51 3.022 241 1.164 367 P17 30,58 0,14 30,25 0,53 229 22 346 16 P18 29,25 0,09 30,65 0,72 1.102 64 700 306 P19 27,50 0,17 29,98 0,12 1.758 185 506 40 P20 27,58 0,07 33,24 0,30 1.320 59 31 6 P21 21,32 0,07 30,37 0,23 85.060 3.858 215 32 P22 29,77 0,73 31,80 0,62 263 22 137 16 P23 30,28 0,10 31,16 0,27 242 16 234 43 P24 28,33 0,09 31,52 0,34 2,770 308 498 48 P25 25,19 0,65 29,48 0,20 10.080 521 714 92 P26 31,57 0,41 30,74 0,19 136 34 215 28 P27 28,28 0,06 31,96 0,08 2.045 85 112 7 P28 27,88 0,14 30,30 0,03 1.079 97 225 4 P29 31,42 0,36 30,05 0,02 110 28 421 5 P30 33,13 0,49 32,31 0,16 64 23 107 11 P31 31,29 0,16 30,87 0,04 255 32 242 2 P32 31,98 0,19 31,99 0,05 167 20 109 4 Nr. 135 Tabelle 29 Fortsetzung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P33 29,18 0,08 29,42 0,22 1.110 55 659 104 P34 29,92 0,21 30,55 0,13 289 29 315 0 P35 27,98 0,18 31,57 0,25 2.027 244 189 32 P36 30,02 0,10 30,26 0,28 472 31 270 50 P37 31,65 0,36 31,68 0,09 138 31 165 10 P38 27,66 0,14 29,79 0,05 1.493 138 498 19 P39 29,41 0,16 29,74 0,04 579 57 583 12 P40 29,15 0,18 30,46 0,16 527 64 321 33 P41 27,06 0,19 34,44 0,10 5.358 672 36 2 P42 30,73 0,06 29,23 0,15 245 10 814 84 P43 28,17 0,04 30,17 0,12 1.154 26 452 35 P44 24,57 0,74 27,44 0,29 18.472 7.649 1.802 328 P45 28,56 0,12 30,98 0,63 1.534 119 360 158 P46 28,97 0,13 31,26 0,43 1.133 103 247 68 P47 30,34 0,11 30,05 0,29 333 24 252 192 P48 30,29 0,16 30,14 0,48 348 38 157 42 P49* 30,24 0,22 29,88 0,35 724 112 420 156 P50 32,82 0,32 29,38 0,06 86 17 462 19 - - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung P07 31,45 0,32 29,79 0,27 111 26 309 56 P09 32,59 0,38 33,08 0,85 270 70 350 165 P11 26,85 0,21 30,29 0,41 1.298 185 408 118 P12 29,05 0,10 30,56 0,47 998 66 376 106 P22 30,80 0,09 31,90 0,18 244 15 121 15 P26 29,40 0,31 31,85 0,19 803 174 157 19 P28 27,71 0,17 30,78 0,18 2.676 301 390 46 P30 30,99 0,27 31,09 0,23 137 24 133 21 P32 28,07 0,10 31,15 0,18 1.865 122 236 30 P39 28,41 0,09 28,53 0,13 1.625 92 825 73 P42 30,61 0,27 29,12 0,18 571 98 843 100 P46 26,28 0,27 30,98 0,20 6.841 1.289 156 21 Nr. 136 Tabelle 30: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Standardabweichung Messdurchgang Ct-Wert Nr. MRP1 MW SD - Lebergewebe K1 31,74 0,17 K2 30,41 0,26 K3 31,30 0,12 K4 29,69 0,08 K5 30,45 0,20 K6 29,38 0,15 K10 31,24 0,15 K11 30,32 0,13 K12 32,57 0,52 K13 28,60 0,46 K16 29,32 0,29 K17 32,02 0,17 K18 31,49 0,18 K19 31,45 0,52 - Lymphknotengewebe K1 25,85 0,24 K2 27,67 0,61 K3 27,04 0,19 K4 25,72 0,70 K5 25,66 0,12 K6 26,09 0,15 K7 25,46 0,12 K8 25,93 0,10 K9 / LMD 26,13 0,08 K9 / LMS 26,17 0,29 K9 / LCSD 25,20 0,10 K9 / LCSS 24,95 0,16 K9 / LPD 27,76 0,34 K9 / LPS 24,98 0,07 K9 / LJ1 25,14 0,16 K9 / LJ2 25,98 0,11 K10 27,44 0,22 K11 26,19 0,24 K12 29,58 0,11 K13 26,12 0,16 K14 26,21 0,08 K15 26,90 0,21 HPRT MW SD I. MW: arithmetischer Mittelwert, Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MW SD MW SD 32,99 32,34 31,96 31,62 32,14 32,64 33,62 31,30 34,33 30,64 31,68 32,52 31,86 31,61 0,65 0,25 0,06 0,30 0,33 0,35 0,41 0,21 0,06 0,07 0,26 0,53 0,24 0,37 679 1.692 917 2.750 1.641 5.024 2.637 3.911 944 6.049 7.452 2.282 1.843 1.953 76 317 79 133 219 487 237 332 309 1.922 1.251 239 216 611 42 62 80 103 72 117 84 249 32 359 194 161 171 205 20 10 3 22 17 28 23 34 1 16 36 60 28 47 29,25 31,24 30,00 29,74 29,80 31,14 30,92 30,06 30,56 31,27 31,42 21,24 31,22 31,24 30,73 31,38 30,70 31,38 33,68 30,32 30,75 31,32 0,01 0,06 0,39 0,05 0,23 0,28 0,27 0,17 0,31 0,17 0,27 0,03 0,11 0,03 0,18 0,30 0,58 0,35 0,43 0,13 0,09 0,16 48.305 11.455 32.597 43.973 43.100 78.087 71.247 25.680 51.530 30.147 57.373 67.933 20.337 66.040 60.013 34.003 27.027 67.707 6.377 65.130 61.073 38.840 7,474 4.130 4.420 17.694 3.443 7.432 5.840 1.880 8.150 5.846 3.639 7.337 4.458 2.786 6.273 2.539 4.116 9.812 481 6.746 3.225 5.333 380 241 244 268 357 293 358 337 326 238 216 241 103 241 341 222 577 350 75 709 530 361 2 9 60 12 56 52 62 38 123 26 36 4 8 4 38 44 221 80 19 62 32 39 s: 137 Tabelle 31: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertenmLeber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct-Wert Nr. MRP1 MW SD - Lebergewebe K1 30,48 0,21 K2 29,74 0,17 K3 31,73 0,17 K4 29,70 0,16 K5 31,77 0,12 K6 31,10 0,37 K10 30,55 0,06 K11 30,70 0,29 K12 31,05 0,22 K13 30,42 0,14 K16 30,26 0,13 K17 31,74 0,33 K18 31,65 0,17 K19 31,33 0,23 - Lymphknotengewebe K1 26,69 0,25 K2 28,56 0,27 K3 26,11 0,12 K4 26,78 0,07 K5 25,26 0,05 K6 26,20 0,05 K7 25,65 0,28 K8 26,58 0,29 K9 / LMD 26,35 0,25 K9 / LMS 25,99 0,15 K9 / LCSD 25,37 0,11 K9 / LCSS 25,86 0,11 K9 / LPD 25,71 0,02 K9 / LPS 26,01 0,24 K9 / LJ1 25,55 0,19 K9 / LJ2 26,65 0,07 K10 28,62 0,57 K11 26,10 0,49 K12 30,55 0,36 K13 26,65 0,39 K14 26,41 0,14 K15 27,05 0,27 HPRT MW SD Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MW SD MW SD 32,05 31,15 31,32 31,20 34,20 32,95 32,22 31,53 33,70 30,03 32,89 33,59 32,69 32,63 0,17 0,22 0,21 0,21 0,23 0,12 0,15 0,06 0,59 0,14 0,21 0,40 0,33 0,07 3.306 6.460 1.850 6.625 3.065 27.29 5.894 5.426 4.305 4.455 4.055 1.529 1.605 1.988 450 715 198 719 250 630 237 995 611 395 366 319 189 307 159 163 146 157 152 50 190 296 76 369 125 79 144 148 18 22 21 21 22 4 18 12 31 35 17 21 32 7 29,36 31,95 31,04 31,09 29,86 30,37 30,52 29,70 30,14 29,05 31,34 30,39 31,70 31,53 30,90 29,96 31,85 31,38 33,30 29,93 30,77 31,01 0,03 0,12 0,04 0,01 0,04 0,14 0,16 0,14 0,55 0,21 0,26 0,21 0,05 0,11 0,46 0,30 0,63 0,23 0,33 0,13 0,40 0,35 45.562 11.985 31.480 76.660 113.100 61.750 83.453 45.590 40.910 64.797 38.007 70.520 40.017 65.380 33.710 42.253 19.487 74.110 6.042 76.140 87.403 57.907 7.346 2.108 2.672 3.691 8.890 1.949 15.313 9.017 8.259 6.319 2.867 4.785 1.055 10.600 4.270 1.906 7.576 21.185 1.306 17.955 7.974 9.727 528 169 151 1.137 674 272 437 295 206 636 141 265 163 223 196 352 307 349 94 851 501 424 8 13 4 11 19 24 46 30 9 85 25 38 19 16 64 72 119 52 19 73 132 103 138 Tabelle 32: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P01 28,90 0,36 30,55 0,06 36.667 9.092 226 9 P02 31,10 0,10 34,33 0,60 8.257 540 28 12 P03 32,08 0,02 29,07 0,06 5.232 53 627 25 P04 27,93 0,15 29,86 0,20 81.733 8.250 369 53 P05 29,90 0,29 29,48 0,18 18.477 3.805 659 79 P06 27,72 0,27 30,38 0,19 134.533 24.075 338 17 P07 23,49 0,01 31,21 0,16 172.500 424 282 30 P08 28,61 0,36 31,39 0,03 207.225 48.620 925 15 P09 24,23 0,12 29,89 0,44 54.883 4.550 218 70 P10 25,19 0,01 33,23 0,13 135.600 1.153 69 6 P11 27,13 0,49 31,03 0,18 62.967 9.935 286 14 P12 25,47 0,13 31,53 0,29 23.350 2.153 69 13 P13 33,34 0,45 32,41 0,10 9.560 2.580 470 30 P14 28,84 0,26 32,21 0,21 61.985 10.035 1.020 135 P15 25,78 0,15 32,59 0,23 90.563 9.459 108 17 P16 27,14 0,13 30,75 0,07 118.533 10.904 198 9 P17 26,76 0,21 30,36 0,23 153.833 20.733 260 37 P18 28,18 0,64 31,66 0,16 120.394 51.472 310 85 P19 25,79 0,11 28,94 0,12 114.533 8.456 849 69 P20 30,30 0,21 33,55 0,41 14.083 1.918 31 8 P21 29,75 0,60 31,25 0,12 10.650 3.868 141 12 P22 26,19 0,15 31,92 0,28 116.067 11.545 242 43 P23 24,66 0,12 30,98 0,06 20.462 1.650 100 4 P24 33,82 0,31 31,03 0,36 3.340 674 342 42 P25 30,03 0,62 30,63 0,24 8.865 3.883 217 35 P26 24,89 0,33 32,11 0,30 137.767 33.201 152 33 P27 24,64 0,10 30,17 0,38 463.300 29.816 589 154 P28 27,04 0,13 32,10 0,08 49.783 4.274 104 6 P29 25,35 0,11 32,00 0,37 117.300 8.106 237 60 P30 26,27 0,05 32,40 0,14 82.723 2.565 86 8 P31 24,26 0,25 32,46 0,34 237.000 36.626 175 41 P32 28,23 0,13 32,46 0,41 30.907 2.759 194 25 Nr. 139 Tabelle 32 Fortsetzung: Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P33 24,82 0,25 29,29 0,11 179.167 27.339 1.003 78 P34 28,93 0,21 30,66 0,34 7.905 1.103 421 99 P35 26,01 0,22 31,01 0,11 107.937 16.448 498 36 P36 25,27 0,11 30,56 0,18 26.797 2.013 134 16 P37 24,30 0,03 31,95 0,45 54.093 915 200 67 P38 26,67 0,07 30,37 0,20 62.913 2.642 452 59 P39 23,63 0,21 30,63 0,22 80.900 10.310 458 40 P40 26,50 0,22 31,52 0,20 62.780 16.025 213 27 P41 26,12 0,15 33,35 0,25 30.006 2.990 38 6 P42 25,80 0,08 30,70 0,16 91.493 4.591 639 61 P43 25,96 0,37 31,19 0,36 113.347 29.387 449 107 P44 25,95 0,12 29,48 0,19 92.313 7.028 489 61 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 61.670 2.426 312 38 P46 24,50 0,16 30,77 0,28 212.600 21.180 631 110 P47 24,46 0,21 31,69 0,43 355.967 48.850 284 84 P48 25,91 0,10 31,85 0,49 138.667 9.226 257 85 P49* 25,77 0,12 30,66 0,41 158.200 15.027 555 158 P50 28,65 0,11 29,50 0,18 35.433 2.610 804 108 - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung P07 24,38 0,06 30,14 0,17 132.500 5.200 364 49 P09 27,54 0,23 32,94 0,50 48.706 17.785 365 120 P11 24,06 0,73 30,79 0,30 187.100 14.234 448 33 P12 25,15 0,05 32,08 0,12 138.933 4.479 267 21 P22 27,85 0,25 33,73 1,26 138.567 25.576 543 62 P26 24,72 0,17 32,69 0,40 132.700 15.650 145 41 P28 25,52 0,22 31,65 0,57 87.490 14.059 217 76 P30 25,19 0,34 31,03 0,10 112.613 23.217 252 16 P32 28,08 0,03 31,12 0,07 17.013 290 237 11 P39 25,92 0,33 29,04 0,16 127.467 24.953 1.095 119 P42 23,91 0,50 30,00 0,23 321.200 111.061 1043 156 P46 24,99 0,15 31,76 0,22 154.00 15.012 330 46 Nr. 140 Tabelle 33: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P01 28,33 0,19 30,04 0,34 88.277 10.975 409 97 P02 32,40 0,06 33,85 0,31 5.536 214 31 7 P03 31,15 0,08 30,27 0,17 6.795 336 470 20 P04 28,01 0,87 31,44 0,22 60.590 27.997 204 31 P05 30,94 0,32 29,58 0,26 15.147 3.357 554 92 P06 28,00 0,02 32,12 0,10 19.217 309 146 9 P07 23,93 0,01 30,03 0,44 66.730 750 198 58 P08 29,84 0,74 32,47 0,07 121.550 35.205 390 15 P09 23,85 0,10 31,13 0,12 135.200 8.854 295 24 P10 25,66 0,20 31,27 0,36 542.450 73.893 178 43 P11 25,84 0,14 30,58 0,48 80.707 7.285 340 115 P12 24,96 0,21 32,13 0,11 63.307 8.903 150 11 P13 33,33 0,59 32,40 0,14 13.835 4745 455 40 P14 30,66 0,53 32,37 0,29 33.115 10.665 900 170 P15 25,15 0,17 31,08 0,30 174.567 18.733 208 43 P16 26,63 0,08 30,41 0,11 209.933 11.949 340 23 P17 26,77 0,12 30,58 0,20 191.667 14.840 306 41 P18 26,69 0,17 31,23 0,51 246.000 26.794 598 184 P19 27,61 0,07 29,31 0,18 110.533 5.254 711 85 P20 29,90 0,07 35,75 0,49 8.559 2.989 14 5 P21 29,84 0,16 31,61 0,20 16.343 1.736 182 23 P22 24,46 0,01 30,02 0,17 137.350 1.768 415 47 P23 26,21 0,13 32,39 0,31 49.227 4.201 175 36 P24 33,46 0,05 32,34 0,50 2.944 90 230 74 P25 29,34 0,50 29,05 0,26 33.167 9.901 640 115 P26 23,98 0,18 30,44 0,23 381.367 46.165 315 49 P27 25,25 0,07 32,05 0,13 35.153 1.500 152 5 P28 26,91 0,12 31,37 0,09 114.283 9.456 213 12 P29 25,28 0,30 30,39 0,07 118.410 23.201 371 17 P30 25,68 0,07 32,18 0,15 89.560 4.327 115 11 P31 24,99 0,15 31,61 0,06 194.533 19.176 145 4 P32 28,01 0,10 32,92 0,10 14.883 942 121 8 Nr. 141 Tabelle 33 Fortsetzung: Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung P33 24,79 0,30 29,25 0,17 141.067 33.497 935 102 P34 29,02 0,39 30,83 0,36 12.021 3.196 363 81 P35 24,37 0,14 30,09 1,32 50.120 4.615 240 203 P36 26,48 0,27 32,63 0,33 41.380 7.667 149 35 P37 24,05 0,27 31,57 0,06 33.220 5.517 119 5 P38 26,44 0,23 30,59 0,25 81.747 12.390 660 110 P39 23,72 0,05 29,84 0,31 41.187 1.412 387 85 P40 24,61 0,01 30,62 0,92 164.600 849 482 275 P41 26,23 0,08 34,72 0,30 20.124 7.978 28 6 P42 25,32 0,16 29,32 0,41 141.636 14.512 716 306 P43 27,45 0,57 32,25 0,64 39.550 15.411 137 57 P44 26,89 0,32 30,18 0,03 94.990 21.859 571 12 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 99.077 24.643 294 63 P46 24,35 0,15 31,10 0,03 196.100 2.687 303 7 P47 23,75 0,52 31,71 0,36 404.867 132.873 219 97 P48 24,78 0,06 31,67 0,19 176.167 6.615 349 41 P49 25,39 0,29 31,19 0,40 137.300 15.136 451 112 P50 30,68 0,30 29,86 0,21 12.820 2.503 495 67 - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung P07 23,07 0,06 30,58 0,32 230.100 8.883 437 99 P09 26,27 0,15 33,21 0,29 128.465 1.257 365 70 P11 25,15 0,18 29,76 0,35 79.673 9.167 484 106 P12 23,99 0,27 30,79 0,35 124.133 23.674 380 91 P22 25,83 0,28 32,75 0,32 146.767 25.891 141 31 P26 24,02 0,12 30,97 0,06 237.067 18.499 261 10 P28 25,07 0,09 32,14 0,14 149.967 10.563 238 21 P30 26,22 0,02 32,94 0,34 34.813 490 54 12 P32 28,81 0,21 32,42 0,47 21.207 2.762 177 50 P39 26,36 0,38 29,40 0,43 101.860 23.946 686 179 P42 24,66 0,13 29,46 0,15 312.567 26.931 1.209 106 P46 25,88 0,27 32,11 0,01 68.030 12.577 149 5 Nr. 142 Tabelle 34: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP2-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I und II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung Ct-Wert MRP2 HPRT MW SD MW SD - Lebergewebe – Messung I K1 25,58 0,11 32,64 0,63 K2 25,02 0,06 28,59 0,28 K3 24,69 0,21 31,61 0,34 K4 25,08 0,21 27,70 0,22 K5 26,23 0,19 32,03 0,31 K6 25,25 0,11 32,04 0,32 K10 27,56 0,17 33,26 0,32 K11 27,86 0,22 32,21 0,15 K12 30,01 0,11 35,11 0,40 K13 28,59 0,03 31,33 0,25 K16 26,17 0,17 32,73 0,46 K17 28,07 0,02 32,19 0,22 K18 26,45 0,05 32,09 0,05 K19 27,52 0,14 32,37 0,19 - Lebergewebe – Messung II K1 26,32 0,18 32,71 0,13 K2 25,56 0,17 28,74 0,29 K3 25,29 0,05 31,79 0,33 K4 25,91 0,10 28,20 0,15 K5 27,06 0,06 32,13 0,13 K6 26,03 0,17 32,18 0,18 K10 26,83 0,21 32,34 0,29 K11 26,76 0,31 32,06 0,43 K12 27,75 0,15 33,79 0,18 K13 27,81 0,10 32,81 0,19 K16 26,38 0,10 31,26 0,10 K17 27,89 0,04 32,00 0,46 K18 27,14 0,08 31,73 0,55 K19 27,68 0,20 31,44 0,78 Nr. Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP2 HPRT MW SD MW SD 6.474 9.350 11.663 8.981 4.250 8.029 2.826 2.052 503 1.439 4.280 927 2.745 1.793 463 351 1.499 1.196 528 592 304 291 37 23 469 12 82 160 97 1.305 184 2.310 139 138 120 160 25 414 111 87 92 137 38 240 39 340 30 28 26 15 6 66 30 13 3 16 4.397 7.177 8.500 5.697 2.705 5.282 2.810 2.950 2.492 1.487 4.700 1.773 2.884 2.045 493 818 242 380 90 564 369 594 240 100 289 51 151 253 114 1.526 210 2.146 167 162 140 171 84 196 178 113 136 171 10 295 42 213 14 19 28 49 9 23 11 34 44 77 143 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. I. Nolte für die Überlassung des interessanten Themas, für die jederzeit gewährte Hilfe und fachliche Unterstützung bei der Erstellung der Arbeit. Weiterhin bedanke ich mich bei den Mitgliedern meiner Betreuungsgruppe, Herrn Prof. Dr. W. Löscher und Herrn Prof. Dr. J. Bullerdiek, für die konstruktiven Gespräche im Rahmen des Ph.D.-Studiums. Herrn Prof. Dr. A. Gruber aus dem Institut für Pathologie möchte ich für die Einweisung in die molekularbiologischen Techniken, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Institut für Pathologie und die jederzeit gewährte fachliche Unterstützung danken. Darüber hinaus ein herzliches Dankeschön an die Mitarbeiter des Institutes für Pathologie für die freundliche Atmosphäre im Labor. Ein besonderes Dankeschön gebührt Frau N. Eberle und Frau I. Buitenduif aus der Klinik für kleine Haustiere für die Hilfsbereitschaft bei der Probenentnahme. Herrn Dr. G. v. Samson-Himmelstjerna aus dem Institut für Parasitologie danke ich für die Erstellung der Primerseqenzen für die RT-qPCR und die Nutzung des Mx 4000. Vielen Dank an Frau Prof. Dr. Günzel-Apel aus dem Institut für Reproduktionsmedizin und Herrn Dr. C. Epe aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie an Herrn Dr. M. Mengel aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover für die Überlassung der Kontrollgewebe. Frau PD Dr. M.-L. Enss und Frau S. Faber danke ich für die Betreuung während des Ph.D.-Studiums. Zuletzt ein ganz herzliches Dankeschön an meine Eltern für ihre uneingeschränkte Unterstützung sowie ihr stets entgegengebrachtes Vertrauen.