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Aus der
Chirurgischen Universitätsklinik
Abteilung Allgemein- und Viszeralchirurgie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Differentielle Analyse der Genexpression
in der Niere der Ratte nach Hirntodinduktion
INAUGURAL DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Carolin Horn
geboren in Frankfurt am Main
Dekan:
Prof. Dr. med. Christoph Peters
1.Gutachter:
Priv. Doz. Dr. med. Robert Obermaier
2.Gutachter:
Priv. Doz. Dr. med. Jan Kaminsky
Jahr der Promotion:
2008
I
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG............................................................................................................................. 1
1.1 Nierentransplantation – Indikation und Problematik............................................................ 1
1.1.1
Indikation und Nutzen........................................................................................................... 1
1.1.2
Anzahl der Spenderorgane .................................................................................................... 2
1.1.3
Art der Spenderorgane .......................................................................................................... 2
1.1.4
Komplikation und Gründe für den Transplantatverlust ........................................................ 2
1.1.5
Antigenabhängige - antigenunabhängige Faktoren für die chronische Abstoßung .............. 4
1.1.6
Der Hirntod als antigenunabhängiger Faktor........................................................................ 5
1.2 Hirntod ........................................................................................................................................ 6
1.2.1
Entwicklung der Definition „Hirntod“.................................................................................. 6
1.2.2
Der Einfluss des Hirntodes auf das Transplantat.................................................................. 7
1.3
Hämodynamik – Makrozirkulation – Mikrozirkulation........................................................ 8
1.4
Endokrines Systems ................................................................................................................... 9
1.5
Morphologische Unterschiede................................................................................................. 10
1.6
Apoptose .................................................................................................................................... 11
1.7
Inflammatorisches System....................................................................................................... 12
Einzelne Komponenten der Entzündungsreaktion .......................................................................... 13
1.7.1
Zytokine .............................................................................................................................. 13
1.7.1.1
Interleukin – 6 .............................................................................................................. 14
1.7.1.2
Chemokine ................................................................................................................... 14
1.7.1.3
Interleukin-1 und Interleukin-1-rezeptor-Antagonist................................................... 15
1.7.2
Selektine – Vertreter der Adhäsionsmoleküle .................................................................... 15
1.7.3
Makrophagen....................................................................................................................... 16
1.7.4
Die Heat-Shock-Proteine - Hämoxygenase-1 .................................................................... 17
1.8
Ansatzpunkt dieser Arbeit....................................................................................................... 18
2.
MATERIAL UND METHODEN............................................................................................ 20
2.1
Tiermodell ................................................................................................................................. 20
2.2
Anästhesie und Monitoring ..................................................................................................... 21
2.3
Parameter zur Überwachung der Kreislaufstabilität........................................................... 22
2.4
Schrittweise Hirntodinduktion ............................................................................................... 22
2.5
Multiorganentnahme ............................................................................................................... 23
2.6 RNA-Extraktion ....................................................................................................................... 24
2.6.1
RNA-Miniprep-Protokoll .................................................................................................... 25
2.6.2
Quantitative Bestimmung.................................................................................................... 26
2.6.3
Qualitative Bestimmung...................................................................................................... 26
II
2.6.4
RNA- Pooling...................................................................................................................... 27
2.7 Genchip-Hybridisierung.......................................................................................................... 28
2.7.1
DNA-Microarray................................................................................................................. 28
2.7.2
Affymetrix-Standardprotokoll der cDNA-Synthese ........................................................... 29
2.7.3
Aufbau und Durchführung der DNA-Microarrays ............................................................. 32
2.7.4
Chiphybridisierung.............................................................................................................. 33
2.7.5
Waschen, Färben und Antikörperamplifikation.................................................................. 34
2.7.6
Scannen ............................................................................................................................... 36
2.7.7
Datenanalyse ....................................................................................................................... 36
2.8 Quantitative PCR ..................................................................................................................... 38
2.8.1
Durchführung der RT-PCR ................................................................................................. 38
2.8.2
Durchführung der PCR ....................................................................................................... 39
2.9
Statistik...................................................................................................................................... 41
3.
ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 43
3.1
Makrohämodynamik ............................................................................................................... 43
3.2
PH-Wert .................................................................................................................................... 46
3.3
pCO2 und pO2 ........................................................................................................................... 46
3.4
Analytisches Agarosegel der Gesamt-RNA............................................................................ 48
3.5
RNA-Extraktion und Poolung................................................................................................. 48
3.6
Ergebnisse der Chiphybridisierung........................................................................................ 49
3.7
Bestätigung der Genchip-Daten mit Real – Time - PCR...................................................... 55
4.
DISKUSSION ........................................................................................................................... 57
4.1 Studienaufbau........................................................................................................................... 57
4.1.1
Relevanz der Studie ............................................................................................................ 57
4.1.2
Versuchsmodell des Hirntods ............................................................................................. 57
4.1.3
Zeitlicher Rahmen des Versuches....................................................................................... 58
4.1.4
Auschluß von Einflußfaktoren auf das Ausmaß des Hirntods............................................ 58
4.2 Diskussion der einzelnen Komponenten ................................................................................ 59
4.2.1
Zytokine .............................................................................................................................. 60
Il-6.................................................................................................................................................. 60
Il-1RA ............................................................................................................................................ 61
Calgranuline................................................................................................................................... 61
4.2.2
Chemokine .......................................................................................................................... 63
4.2.3
Adhäsionsmoleküle ............................................................................................................. 63
4.2.4
Transkriptionsfaktoren........................................................................................................ 65
4.2.5
Transportergene .................................................................................................................. 66
4.2.6
Apoptose ............................................................................................................................. 67
4.2.7
Gerinnung............................................................................................................................ 68
4.2.8
Heat-Shock-Proteine und Regenerationsproteine ............................................................... 69
4.3
Limitation und Ausblick.......................................................................................................... 71
III
5.
ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................................... 73
6.
LITERATURVERZEICHNIS UND QUELLENANGABEN .............................................. 74
7.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ 96
8.
SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG............................................................................. 98
9.
DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 99
10.
LEBENSLAUF ....................................................................................................................... 100
Abbildungsverzeichnis
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Versuchsablauf in der Hirntod- und in der Kontrollgruppe ........................................ 21
Abbildung 2:
Ratte nach gradueller Hirntodinduktion ...................................................................... 23
Abbildung 3:
Agarosegel der Gesamt-RNA ...................................................................................... 27
Abbildung 4:
Schema der Repräsentation eines Gens auf Mikroarrays von Affymetrix .................. 33
Abbildung 5
Prinzip der Chipanalyse nach Affymetrix®Gene Expression Assay ........................... 37
Abbildung 6:
Mittlerer arterieller Druck (Mittelwerte ± SEM) während und kurz nach der
Hirntodinduktion mit initialem Druckanstieg der HT-Gruppe.................................... 44
Abbildung 7:
Vergleich der Herzfrequenz (Mittelwerte ± SEM) von Hirntodgruppe und
Kontrollgruppe ............................................................................................................ 45
Abbildung 8:
Vergleich des mittleren pH-Werte (Mittelwerte ± SEM) der Kontrollgruppe
sowie der Hirntodgruppe. ............................................................................................ 46
Abbildung 10: Vergleich des mittleren pCO2-Wertes (Mittelwerte ± SEM) der
Kontrollgruppe mit der Hirntodgruppe, Messabstand eine Stunde............................. 47
Abbildung 11: Elektrophorese des RNA-Pools .................................................................................. 49
Abbildung 12: Boxplots der mRNA Expression der drei Einzelgene HO-1, ELAM und
CCL2 im Vergleich zwischen Hirntod- und Kontrollgruppe ...................................... 56
Tabellenverzeichnis
V
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Posttransplantative Organüberlebensraten (DSO) ................................................................. 6
Tabelle 2: Genspezifische RT-PCR Primer .......................................................................................... 40
Tabelle 3: RNA-Konzentration nach Poolung ...................................................................................... 48
Tabelle 4: Ergebnisse der Chiphybridisierung...................................................................................... 55
1
Einleitung
1.
Einleitung
1.1
1.1.1
Nierentransplantation – Indikation und Problematik
Indikation und Nutzen
Die häufigsten Ursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium sind die diabetische Nephropathie
und verschiedene primäre und andere sekundäre Glomerulopathien (109). Im terminalen Stadium der
Niereninsuffizienz ist zur Korrektur des Elektrolyt- und Säure-Base-Haushaltes, zur Elimination von
Wasser und harnpflichtigen Substanzen, sowie zur Vermeidung weiterer Komplikationen die Nierenersatzbehandlung indiziert (56).
Bezüglich der Patientenanzahl, die sich in einer chronischen Nierenersatztherapie befindet, ist von
1997 bis 2005 im Durchschnitt ein jährlicher Zuwachs der Prävalenz von 4,8 % und der Inzidenz von
5,2 % zu verzeichnen (Eurotransplant, Jahresbericht 2006).
Nach Angaben von Eurotransplant befinden sich in Deutschland aktuell ca. 87.000 Personen in chronischer Nierenersatztherapie. 72,8% werden mit Dialyseverfahren behandelt, von denen 3% eine Peritonealdialyse erhalten und sich in etwa 27,2% Personen in der Transplantationsnachsorge befinden.
Im Jahre 2005 wurden in Deutschland 2712 Patienten nierentransplantiert. Eine primäre Nierentransplantation ohne vorherige Dialysebehandlung (präemptive Transplantation) wurde für ca. 0,6% aller
Transplantationen verzeichnet. Die Nierentransplantation wird standardmässig auch im Rahmen einer
simultanen Pankreas-Nierentranplantation (SPKT) zur Behandlung niereninsuffizienter Diabetiker
angewandt (50), mit guten Langzeiterfolgen hinsichtlich Überlebensdauer und Lebensqualität der
Patienten (45). Für Diabetiker ist die Nierentransplantation bzgl. Mortalität und Morbidität günstiger
als die Dialyse. Die Überlebensrate nach Nierentransplantation liegt bei ca. 60 % für Typ-2Diabetiker nach 5 Jahren. Dagegen beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate unter Hämodialyse und Peritonealdialyse bei dieser Patientengruppe weniger als 25 % (90). Die Patientenüberlebensrate von Typ1-Diabetikern liegt nach alleiniger Nierentransplantation noch höher als bei Typ-2-Diabetikern. Bei
Patienten mit Typ-1-Diabetes kann mit einer kombinierten Nieren-Pankreas-Transplantation sogar
eine weitere Reduktion der Mortalität im Vergleich zur alleinigen Nierentransplantation beobachtet
werden (180).
Einleitung
1.1.2
2
Anzahl der Spenderorgane
Auf der Warteliste des Jahres 2005 für Nierentransplantationen konnte die dreifache Zahl der tatsächlich durchgeführten Transplantationen, nämlich 8850 Patienten, verzeichnet werden. Die mittlere
Wartezeit für eine Nierentransplantation beträgt ca. 40 Monate. Obwohl die Nierentransplantation als
Mittel der Wahl und erfolgreichste kausal rehabilitierende und resozialisierende Therapieform der
terminalen chronischen Niereninsuffizienz bezeichnet werden kann, ist nicht jedem Betroffenen eine
solche Behandlung zu ermöglichen (81).
1.1.3
Art der Spenderorgane
Ein wichtiger weiterer Punkt in der Beurteilung der Nierentransplantation ist die Differenzierung in
Lebendspenderorgane und postmortale Spenderorganen. Im Jahre 2005 belief sich die Quelle der
2712 Nierentransplantationen in Deutschland zu über 80% auf postmortale Spender, der Anteil der
Nierenlebendspender lag bei 19,2% (143).
1.1.4
Komplikation und Gründe für den Transplantatverlust
Eine der Hauptkomplikationen der Transplantation ist die Abstoßung des Organs. Wenn die Behandlung einer Abstoßung erfolglos ist, muss der Empfänger zur Dialyse zurückkehren und auf eine erneute Transplantationschance warten. Weitere spätere Komplikationen sind die Nierentoxizität der Immunsuppression, Infektionen, Nierenerkrankungen und das Auftreten von Tumoren. Das Risiko eines
Karzinoms oder Lymphoms ist 30-mal höher als in der Normalbevölkerung (142, 206).
Die Abstoßungsreaktionen
Die 5-Jahres-Funktionsraten der transplantierten Nieren unterscheiden sich je nach ihrer Spenderquelle. Durch Fortschritte in der Transplantationsmedizin kann aktuell eine 5- Jahresfunktionsrate von
71% nach postmortalen Nierenspenden, bzw. von 84% nach Lebendspenden erreicht werden. Dies ist
neben verbesserten chirurgischen Techniken und postoperativen Nachbehandlungen vor allem der
Entwicklung hochpotenter Immunsuppressiva zu verdanken (143).
Einleitung
3
Hyperakute Abstoßung
Eine Transplantatabstoßung lässt sich in verschiedene Kategorien einteilen. Die seltene hyperakute
Abstoßung, auch Typ-II-Immunreaktion genannt, tritt bei allogenen Transplantationen innerhalb von
Minuten bis Stunden nach der erfolgten Transplantation und der Wiederherstellung des Blutflusses
auf. Sie wird durch präformierte, allospezifische Antikörper oder durch blutgruppenspezifische Antikörper, die zum Zeitpunkt der Transplantation bereits vorhanden sind (zytotoxische Antikörper gegen
AB0- oder HLA-Antigene des Transplantats), verursacht. Nach der Komplementaktivierung kommt es
durch intravasale Gerinnungsvorgänge zur vollkommenen Thrombosierung der Gefäße des Transplantats und somit zur irreversiblen Schädigung des Organs (178).
Akute Abstoßung
Von der akuten Abstoßung spricht man bei spezifisch gegen die Transplantationsantigene gerichteten
Immunreaktionen, die zwischen Tagen bis einigen Monaten die Transplantatvitalität bedrohen. Eine
Abstoßung zwischen dem 2. und 5. Tag nach der Operation bezeichnet man auch als akzelerierte Abstoßung. Neben dem ABO-Blutgruppensystem sind die HLA-Komplexe (HLA= humanes Leukozytenantigen) (engl. Major histocompatibility complex, MHC) mit ihren Histokompatibilitätsantigenen
von entscheidender Bedeutung für die akute Immunantwort. Als Transplantationsantigene spielen sie
sowohl eine entscheidende Rolle bei der immunologischen Erkennung und Abwehr, als auch bei der
Antigenpräsentation (178).
HLA-I-Antigene sind als Glykoproteine auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen in die Zytoplasmamembran integriert und exprimiert und sind wichtiger Bestandteil für die Erkennung körpereigener
und fremder Antigene. Endothelzellen werden zur vermehrten Expression von MHC-Antigenen angeregt, welche wiederum die Immunogenität des Spenderorgans erhöhen, und somit das fortlaufende
Zugrundegehen des Organs weiter triggern. HLA-Klasse-II-Antigene sind hauptsächlich auf BLymphozyten, dendritischen Zellen, sowie stimulierten Makrophagen zu finden. Wichtige Ursache für
die zelluläre Immunreaktion und nachfolgende akute Abstoßung des Organs sind die aktivierten Lymphozyten, die aus Kapillaren in das Interstitium wandern und dort Nekrosen hervorrufen (177, 195,
196).
Chronische Abstoßung
Die wichtigsten Gründe für einen langfristigen Transplantatverlust stellt die chronische allogene
Transplantatnephropathie (CAN) dar (78). Die chronische Abstoßung eines Transplantats ist hauptsächlich durch eine über Monate und Jahre fortschreitende, langsame und kaum beeinflussbare Funktionsverschlechterung des Transplantates gekennzeichnet (62). Meist beruht diese chronische Abstossungsreaktion vorwiegend auf einer obliterierenden Arteriopathie mit Intimafibrose. Sie ist vermutlich
eine überschießende Antwort auf eine unentwegte Schädigung der Gefäßwandzellen durch die Kom-
Einleitung
4
plexe von Transplantationsantigenen mit den Wirtsantikörpern (190). Chronische Aktivierung zellulärer und humoraler Abstoßungsmechanismen führen zu einer chronischen Tranplantatvaskulopathie,
die vor allem die Rindenarterien betrifft und zu renaler Ischämie mit tubulärer Atrophie, Nephronzerstörung und interstitieller Nephrose führt, bis hin zur Schrumpfung des Nierenparenchyms (207).
Einige Vermutungen werden dahingehend angestellt, dass die chronische Abstoßung ein Ergebnis
ständiger kleinerer Verletzungen des Endothels darzustellen scheint, das dadurch in einer ständigen
Aktivierung gehalten wird (70, 153). Dies kann in eine Expressionsstimulation von zum Beispiel Adhäsionsmolekülen münden, gefolgt von der Aufrechterhaltung einer Entzündungsreaktion (73). Die
zuvor durchgemachte akute Abstoßung oder eine Entzündung des Organs sind dabei Risikofaktoren
bei der Niere, die eine spätere chronische Abstoßung oder Dysfunktion wahrscheinlich machen
(178). Es besteht eine hohe Korrelation zwischen der Anzahl akuter Abstoßungsreaktionen und der
Wahrscheinlichkeit eine chronischen Abstoßung zu erfahren (6).
1.1.5
Antigenabhängige - antigenunabhängige Faktoren für die chronische Abstoßung
Pathophysiologisch definiert man antigenabhängige, aber auch antigenunabhängige Risikofaktoren,
die die progrediente Entwicklung einer chronischen Abstoßung entscheidend beeinflussen können
(199).
Antigenabhängige Ursachen
Immunogene Gründe für eine Transplantatabstoßung sind seit langem bekannt. So ist eine schlechtere
HLA-Kompatibilität mit einer höheren Anzahl an Abstoßungsreaktionen assoziiert. Antikörper gegen
HLA-klasse 1 (A, B, C) oder Klasse 2 (DR, DQ) können vermehrt in Gruppen gefunden werden, die
vorher gegen diese Glykoproteine sensibilisiert wurden (33), z.B. durch Schwangerschaft, Bluttransfusionen oder eine vorhergehende HLA-unpassende Transplantation (84). Vorhergehend stark immunisierte Patienten haben eine statistisch höhere Abstoßungsrate, als nicht-sensibilisierte Personen, was
die antigenabhängige Beeinflussung im Outcome aufweist (163, 214).
Antigenunabhängige Ursachen
Obwohl sich frühere Erklärungen für die progrediente Entwicklung einer chronischen Abstoßung von
Spenderorganen vornehmlich auf antigenabhängige Unterschiede zwischen Spendern und Empfängern stützten, rückte in den letzten Jahren die Erkenntnis über antigenunabhängige Beeinflussung
durch nicht-immunologische Faktoren stark in den Vordergrund (154). Ihre Einflussnahme auf renale
Transplantatabstoßungen gilt inzwischen als bekannt (49). Klinische Datenbanken und wissenschaftliche Studien konnten beweisen, dass nicht-immunologischen, spenderspezifischenden Risikofaktoren
wie Spenderalter (39), Vorerkrankungen (144, 169), Rasse (86), die Möglichkeiten der intensivmedi-
Einleitung
5
zinische Betreuung bei Organentnahmen (24, 35, 91), aber auch der Hirntod (170, 201, 212) und der
Ischämie- und Reperfusionsschadens (93, 146) einen Einfluss auf die Qualität des Organs haben. Pathophysiologische Veränderungen sorgen für eine immunologische Grundaktivierung des zu transplantierenden Organs, und somit zu erhöhten Entzündungsreaktionen im Körper des Empfängers und
des Spenders (212).
Der Ischämie-/Reperfusionsschaden, als ebenfalls anerkannter antigen-unabhängiger Faktor, folgt
dem Hirntod im Prozess der Transplantation, beginnend mit der Minderperfusion und Ischämie nach
der Organentnahme des Spenders. Forschungsarbeiten konnten aufweisen, dass diese zu einer Verschlechterung der mikrovaskulären Durchblutung, einer Leukozytenendothelreaktion, dem Austritt
von Entzündungszellen und Mediatoren aus den Gefäßen in das Gewebe, sowie der Freisetzung von
freien Sauerstoffradikalen und proteolytischen Enzymen führt (132). Durch Präkonditionierungsversuche konnten in einem nächsten Schritt die klinischen Auswirkungen dieser Organschäden beeinflusst werden. Es zeigte sich zum Beispiel, daß durch die Vorbehandlung mit Endotoxin exprerimentell eine signifikant geringere Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens auftrat. (133, 134).
1.1.6
Der Hirntod als antigenunabhängiger Faktor
Parallel zu den Studienfortschritten des Ischämie/Reperfusionsschadens, wurde in den letzten Jahren
klar, dass die schlechteren Langzeiterfolge hirntoter Spenderorgane betreffend Funktion, Abstoßungsrate und Transplantatüberlebenszeit ihren grundlegenden Ursprung in pathophysiologischen Veränderungen während des Hirntodprozesses haben (28).
Vertiefungen der Forschung in diesem Bereich erscheinen auch deswegen so sinnvoll, da die postmortalen Spendernieren gut 80% aller Organtransplantate ausmachen.
Erwiesenermaßen liegt die Halbwertszeit der Funktion von hirntoten Spendernieren aber signifikant
unter den Kurz– und Langzeitergebnissen von verwandten, aber auch unverwandten Lebendspendern
(32, 189). In der Vergangenheit galten immunogene Faktoren, also möglichst identische Histokompatibilitätskomplexe, als primäre Prognosefaktoren für das Transplantatüberleben. HLA-identische
Zwillinge zeigen in der Tat statistisch beste Funktionsergebnisse bei Nierentransplantationen. Weitere
Studien konnten jedoch zeigen, dass HLA-angepasste, hirntote Spendernieren in Kurz- und Langzeitresultaten trotzdem weit unter den Ergebnissen HLA-unangepasster, lebendgespendeter Nieren liegen
(202). Beispielsweise zeigen gesammelte Daten über die Ergebnisse von Nierentransplantationen
zwischen Ehegatten oder anderen unverwandten und HLA-unangepassten Lebendspendern im Vergleich zu postmortalen Spendern bessere Transplantat- und Patientenüberlebensraten (United Network of Organ Sharing; UNOS, Sollaborative Transplant Study, DSO) (63, 143, 194).
6
Einleitung
Niere
1-Jahres-Überleben
5-Jahres-Überleben
Totspender-Organ
85.0%
71,0%
Lebendspender-Organ
95.1%
84,0%
Tabelle 1: Deutsche Stifung für Organtransplantation; Collaborative Transplant Study (CTS),
2005
Die These, dass der Hirntod als antigenunabhängiger Faktor per se die Donororgane vor der Explantation beeinflusst, sensibler für Preservations- und Ischämie/Reperfusionsschäden macht und zu einer
gesteigerten immunogenen Aktivität des Spenderorgans führt, welche bei der späteren Transplantation
die Immunantwort des Empfängers beschleunigt, konnte bereits in verschiedenen Tierexperimenten
und in klinischen Studien bewiesen werden (24, 91, 92, 172, 174, 204). Hierauf soll im Folgenden
etwas genauer eingegangen werden.
1.2
1.2.1
Hirntod
Entwicklung der Definition „Hirntod“
Mit Einführung der mechanischen Ventilation, suffizienter Oxygenierung peripheren Gewebes und
verbessertem Management kritisch kranker Patienten geriet die traditionelle Definition des Todes als
Herz-Kreislauf-Stillstand und Aussetzen des Herzschlages in Diskussion (44).
Auf der Basis der in Frankreich publizierten Definition des „irreversiblen Komas“ von 1950, transplantierten französische und belgische Chirurgen einige Jahre später erstmals Nieren von herzkreislaufstabilen, hirntoten Spendern (16, 124, 183).
Dadurch konnte die Ischämiezeit um ein Vielfaches gesenkt und die effiziente Wiederaufnahme der
renalen Funktion erhöht werden (153).
Die Benutzung solcher hirntoter Spender initiierte weltweit rechtliche und moralische Debatten (191).
Eine legale Basis wurde erst im August 1968 in Form der Harvard Kriterien des Hirntods geschaffen,
die diesen Zustand als irreversiblen Endpunkt des Daseins definierten und in seinen Kriterien genau
differenzierten (1).
Der Hirntod lässt sich als vollständiger und irreversibler Ausfall des menschlichen Bewusstseins definieren, einhergehend mit dem Verlust aller zerebralen Funktionen (Großhirn, Kleinhirn, Hirnstamm)
bei künstlich aufrechterhaltener Herz-Kreislauf-Funktion und kontrollierter Beatmung (191).
Einleitung
1.2.2
7
Der Einfluss des Hirntodes auf das Transplantat
Die Annahme, der Hirntod sei eine gegebene statische Kondition hat sich anhand verschiedener experimenteller Forschungsarbeiten als falsch bewiesen (153).
Tierexperimentelle Studien mit gleichen Bedingungen betreffend Explantation, Ischämiezeit und
Transplantationsprozess zwischen Hirntodmodellen und Kontrollgruppen zeigten, dass das Kadaverorgan zum Zeitpunkt der Transplantation neben systemischen auch schon organspezifische, komplexe
funktionelle und morphologische Veränderungen durchlaufen hat und dementsprechend, unabhängig
von direkten antigenabhängigen Einflüssen, eine schlechtere Funktion aufweist (158, 174, 189, 203,
204, 215). So wurde in den letzten Jahren klar, dass die Ursache der unterschiedlichen Erfolgsraten
zwischen lebendgespendeten Nieren und denen hirntoter Spender besonders auch auf dem Hirntod
basieren, und nicht nur, wie vielfach angenommen, in den Unterschieden der kalten Ischämiezeit (24,
91, 136).
Die Ätiologie, also Tempo und Ausdehnung des Hirntods, spielt ebenfalls eine große Rolle (176).
Man unterscheidet einen explosionsartigen Typ des Hirntodes, der die peripheren Organe auf ein vielfaches stärker beeinflusst und eine graduierte Form, bei der der Hirntod des Individuums schrittweise
hervorgerufen wird (157).
8
Einleitung
1.3
Hämodynamik – Makrozirkulation – Mikrozirkulation
Der Effekt des Hirntods zeigt sich in rapiden Schwankungen der Hämodynamik (Mittlerer arterieller
Blutdruck und Herzfrequenz) und daraus resultierenden pathologischen Folgeereignissen. (153)
Die Auswirkungen auf das kardiopulmonale System und die hämodynamische Stabilität des Donors
kann generell in zwei Phasen unterteilt werden.
Hypertensive Phase
Nach der sehr frühen parasympathischen Episode mit Bradykardie folgt eine intensive sympathische
Stimulation als Folge der zerebralen Ischämie und Einklemmung des Hirnstamms, die für einige Minuten andauert (8). Diese Dynamik wird entweder durch direkte neuronale Aktivität oder durch die
Ausschüttung endogener Katecholamine ausgelöst (23, 34, 77, 149, 157). Es besteht eine Korrelation
zur Art der Hirntodinduktion, entsprechend auch zu Anstiegskurve des intrakraniellen Druckes (76,
176). Es konnten in diesem Zusammenhang weit über das Ausgangsniveau reichende Level an Adrenalin, Norepinephrin und Dopamin nachgewiesen werden Dabei konnten teilweise Steigerungen des
Dopaminlevels bis 800% und eine 700%ige Erhöhung des Norepinephrins aufgezeigt werden (65).
Diese initiale Phase nach Hirntodinduktion wird mit dem Begriff des „Autonomic storm“ zusammengefasst, der Alterationen betreffend den Blutdruck, der Gerinnung und den Elektrolyt- und Hormonhaushalt mit sich zieht (157).
Der massive Anstieg des systemischen Katecholaminlevels zieht bei gleichzeitiger Aktivitätssteigerung des Herz-Kreislaufsystem mit positiv chronotroper, inotroper und dromotroper Wirkung einen
veränderten vaskulären Widerstand mit sich, der in der Niere auf das Vierfache ansteigt, in der Milz
sogar auf das Neunfache (77). Diese gravierende Vasokonstriktion und der erhöhte Perfusionsdruck
führen zu einer signifikant erniedrigten Organperfusion (76). Eine andere Ursache des veränderten
Organwiderstandes sind Veränderungen im mikrovaskulären Strombett. Intravitalmikroskopische
Untersuchungen an der Leber haben gezeigt, dass es bereits drei Stunden nach Hirntod zu einer reduzierten sinusoidalen Perfusion und zu einer gesteigerten Leukozyten-Endothelinteraktion in der
mikrovaskulären Strombahn kommt (130, 138, 139). Es konnte ein vergleichbarer Effekt für die
pankreatische Mikrozirkulation gezeigt werden (133).
Hypotensive Phase
Auf die hypertensive folgt eine spätere normo- bis hypotensive Phase, die nach abgeschlossener Hirntodinduktion durch die irreversible Entkopplung des Rückenmarks von höheren Hirnarealen erklärt
wird.
9
Einleitung
Sie wird durch eine Reduktion hämodynamischen Parameter definiert (68). Inotropie und Chronotropie, sowie der kardiale Ausstrom werden erniedrigt (68). Der reduzierte autonome Tonus führt zu
einer veränderten vaskulären Autoregulation mit erniedrigter Blut- und Sauerstoffversorgung der Organe und Gewebe. Sowohl anfängliche als auch spätere Zirkulationsveränderungen können also schon
vor der Organentnahme zu schweren ischämischen Schäden und zu schlechter Funktion im Empfänger
führen (148, 153). Die Hypotension kann durch gutes klinisches Management, Volumenaufrechterhaltung, adäquater Sauerstoffversorgung und Gewebeperfusion kontrolliert werden (36, 150).
1.4
Endokrines Systems
Desweiteren besteht ein Zusammenhang zwischen Hirntod und der Störung der HypothalamusHypophysen-Achse (53, 110, 112, 119).
In verschiedenen Tiermodellen konnte eine Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysenachse in
Form einer Verminderung der Hypophysenhomone Vasopressin und ACTH dargestellt werden.
ACTH sinkt 45 Minuten nach Hirntodinduktion sogar auf Werte nahe dem Nullpunkt und auch Vasopressin (Antidiuretisches Hormon, ADH) ist zum Ende der Versuchsreihe nicht mehr messbar. Es
entsteht ein neurogener Diabetes insipidus. Stark erhöhte, hypotone Urinausscheidungen konnten
beobachtet werden (181).
Messungen des Plasmaspiegels von ACTH und Vasopressin könnten daher möglicherweise als diagnostische Hilfsinstrumente für den Hirntod dienen. Die Erklärung für die Abnahme liefert dabei die
Histologie der Hypophyse, bei der Veränderungen vom Ödem bis hin zur Nekrose gefunden werden
(10). Hier scheint sich die zugrunde liegende Störung des Regelkreises zu begründen. Auch der signifikante Abfall von Aldosteron weist neben Cortisol auf eine Einbeziehung der Nebeniere, als eine der
Endstrecken der Hypothalamus-Hypophysenachse, hin (52).
Adrenerge Insuffizienz ist in verschiedenen Studien ebenfalls als Folge des Hirntodes zu registrieren.
Markanter Abfall von Schilddrüsenhormonen (Triiodthyronin und Thyroxin) (168), Glucagon und des
Cortisols konnte in einer retrospektiven Studie bei 76% der Patienten mit Kriterien des Hirntods dargestellt werden (43, 67, 82, 131). Andere Studien, z.B. von Powner und Lopau (107, 151), zeigten
wiederum keine signifikanten Veränderungen der hormonellen Konzentrationen nach Hirntod, bzw.
nicht zwangsweise endokrines Versagen. Leichte Schwankungen in Hormonkonzentrationen (TSH,
Insulin, Laktat) konnten zwar fast überall aufgezeigt werden, es bestand aber keine Korrelation zu
metabolischen und hämodynamischen Fehlfunktionen, sowie der Organfunktion nach Transplantation
(67, 107).
10
Einleitung
Hormonelle Substitutionstherapien führten in verschiedenen Studien zu einer Verbesserung des kardiovaskulären Status, verminderten perioperativen inotropen Medikation und signifikant weniger Bikarbonatgabe durch Verminderung des Serumlaktats (131). Progressiver Energieverlust und Stoffwechseleinschränkungen infolge mitochondrialer Schädigung als Hauptfolge hormoneller Schwankungen, konnten ebenfalls erfolgreich mit einer Kombination von T3, Cortisol und Insulin unterbunden werden (131).
1.5
Morphologische Unterschiede
Studien über genaue morphologische und funktionelle Veränderungen als Effekte des Hirntods sind
an verschiedenen Organen erläutert worden.
Am Herzen am besten untersucht, werden diese als katecholamininduzierte Toxizität beschrieben und
entsprechen mit petechialen, subendothelialen Hämorrhagien und Myozytennekrosen Veränderungen,
die auch bei hoher experimentell-exogener Katecholaminzufuhr beobachtet werden (119, 197, 218).
Dieselben Schäden ließen sich bei Patienten aufweisen, die an akuten zerebralen Veletzungen starben
(17). Diese myozytotoxischen Mechanismen führen zu ausgeweiteten Herzmuskelnekrosen sogar im
gut durchbluteten Herzen (118). Eine Studie von Yeh et al. (217) erweiterte diese Bilanzen mit der
Hypothese, dass neben der Toxizität auch eine veränderte myokardiale Genexpression zur Dysfunktion beiträgt. 2002 untersuchten sie in einer Studie die Auswirkung einer zentralen sympathomimetischen Blockade, um die Effekte der hohen Katecholaminausschüttung durch den „Autonomic storm“
auf die myokardiale Genexpression zu unterbinden. Sie konnten zeigen, dass durch die erniedrigten
Level an Katecholaminen sowohl die hämodynamische Instabilität, die elektrokardiographischen Veränderungen, als auch die myozellulären Schäden, die durch den Hirntod aufzuweisen waren, signifikant verringert waren (152, 161, 217).
Bei Lungentransplantaten zeigt sich eine chronische Abstoßung morphologisch meist als obliterierende Bronchiolitis. Histologisch zeigt sich ein fibroproliferativer Prozess, der durch eine Entzündungsreaktion sowie eine Fibrose gekennzeichnet ist (15). Doch auch der direkte und akute Einfluss des
„Autonomic storm“ auf die Lunge bewirkt eine Schädigung, sofern er nicht medikamentös zu kontrollieren ist. Die Entwicklung einer pulmonalen Dysfunktion beispielsweise im Sinne eines neurogenen
Ödems, ist als Komplikation bei zentralnervösen Traumata beschrieben. Studien zeigen, dass eine
Behandlung während der hypertensiven Phase mit α-Rezeptor Antagonisten die Infiltration des pulmonalen Gewebes mit Entzündungszellen vermindert, während in der hypotensiven Phase Noradrenalin eine verbesserte pulmonale Oxygenierung gewährleisten kann (12).
11
Einleitung
Eine Studie von van der Hoeven et al. über die Funktion der von hirntoten Ratten transplantierten
Leber, zeigte signifikante perizentrale Nekrosen und profunde Vakuolisierungen überall am Transplantat, die sich bei lebendtransplantierten Kontrolllebern nicht auffinden ließen (201, 202).
Kardiovaskuläre Instabilität, Hypotension und nachfolgende Ischämie stellen Hauptgründe für Nierenschäden dar (198). Eine hohe Inzidenz tubulärer Nekrosen wurde posttransplantativ an Nieren von
hirntoten Spendern mit instabilem hämodynamischen Status beobachtet (99). Die histopathologischen
Veränderungen in der Niere nach Hirntod liegt in einer glomerulären Hyperämie mit nachfolgender
Entwicklung einer Glomerulitis, endotheliale Proliferation und Periglomerulitis (126). Innerhalb von
3 Tagen präsentieren sich Degeneration und Atrophie tubulärer Zellen.
In Studien von Pratschke et al. (154, 158) über kurzfristige und langfristige Auswirkungen des Hirntods auf die Abstoßung von Nierentransplantaten, ließen sich jeweils signifikante Unterschiede zugunsten der Lebendspender demonstrieren. Eine progrediente Funktionsverschlechterung ging parallel
mit morphologischen Veränderungen einher: Alle Nierenbiopsien zeigten zwei Wochen nach Transplantation histologische Merkmale von Gewebeschaden. Allerdings präsentierte sich das Gewebe der
hirntoten Spenderorgane, im Vergleich zu Lebendspendern, kortikointerstitiell zwei- bis dreifach
stärker mit Monozyten infiltriert, zeigte einen zweifach höhergradigen tubulären Schaden und früheres Einsetzen von interstitieller Fibrose. Nach acht Wochen war das Interstitium markant mit wirtseigenen mononukleären Zellen infiltriert. Im histologischen Bild ließ sich verstärkt eine glomeruläre
Hypertrophie und interstitielle Fibrose mit parallel zunehmender tubulärer Atrophie demonstrieren.
Nach 48 Wochen zeigte sich das Organ im finalen Stadium und morphologisch ausgebrannt (158).
Eine Studie am hirntoten Schwein zeigt eine signifikante Erniedrigung von intrazellulärem Natrium
und Kalium im Vergleich zu lediglich anästhestetisierten Tieren (211). Diese Elektrolytparameter der
Nierenfunktionstüchtigkeit korellierten mit der funktionellen und morphologischen Qualität der Kadaverorgane.
1.6
Apoptose
Die Apoptose führt zum programmierten Zelltod infolge von Verletzungen, Ischämie, metabolischem
Ungleichgewicht oder anderen Stressfaktoren (60, 69). Sie wird hauptsächlich durch eine Reihe von
Proteinen kontrolliert, die man als Kaspase–Kaskade bezeichnet. Die Beteiligung von TNF-alpha
durch Bindung an seinen Oberflächenrezeptor ist in diesem Zusammenhang bekannt und seine Erhöhung nach Hirntodinduktion gilt als bewiesen (2, 113). Eine andere Auslösung des programmierten
Zelltods stellen Zytokine dar, die direkt durch die Zellmembran diffundieren, und die Kaspase Kaskade in Gang setzen. Die nachfolgenden Schritte führen zu Veränderungen in der Zellmembran, Kon-
12
Einleitung
densation von nuklearen und zytoplasmatischen Strukturen und zur Spaltung der DNA-Helix (104,
184). Die Zelle zerfällt schließlich und wird von Gewebsmakrophagen abgeräumt und absorbiert.
Neuere Studien zeigen eine deutliche Verknüpfung zwischen Hirntod, inflammatorischer Antwort und
erhöhter Apoptoserate in der Leber. Es wurde bereits beschrieben, dass durch den Hirntod proapoptotische Proteine verstärkt exprimiert werden und die apoptotische Kaskade im Donororgan vermehrt
induziert wird (38, 145). Erhöhte Apoptoseinduktion übt dementsprechend einen negativen Einfluss
auf die Organvitalität posttransplantativ aus. Das Resultat ist wiederum eine schlechte Kurz-und
Langzeitfunktion des Spenderorgans im Empfänger (22, 203). Kalte Konservierung und KaspaseInhibitoren konnten den Zelltod in Studien am Pankreas bereits erfolgreich minimieren (105).
1.7
Inflammatorisches System
Stressoren, wie in diesem Fall der Hirntod, aber auch Schock, oxidativer Stress, oder Hyperthermie,
rufen eine Stress- und Entzündungsantwort des Körpers hervor, die auf komplexen ineinander greifenden Kaskaden endogener Mediatoren basiert (155, 176).
Die inflammatorische Reaktionsabfolge beginnt mit der Immunaktivierung, es folgen die zelluläre
Rekrutierung, das Rolling, die Adhäsion, Diapedese und schließlich die Infiltration durch inflammatorische Zellen.
Im Mittelpunkt steht die These, dass das Organ eines hirntoten Spenders schon im Vorfeld für erhöhte
Entzündungsreaktionen sensibilisiert wurde, das heisst, dass Organe von postmortalen Spendern zum
Zeitpunkt der Einpflanzung schon molekulargenetische Veränderungen durchgemacht haben und dazu
programmiert sind, spätere Entzündungsreaktionen im Empfänger zu triggern und Tempo und Intensität immunologischer Antworten in großem Ausmaß zu verstärken (35, 64, 177). Erhöhtes Tempo und
Intensität der immunologischen Aktivierung durch hirntote Spenderorgane im Vergleich zu lebendgespendeten Transplantaten, lässt sich anhand der Expressionslevel der inflammatorischen Proteine
beweisen (153). Die Aktivierung des inflammatorischen Systems besteht aus verschiedenen kaskadenartigen Reaktionen auf molekularer und zellulärer Ebene, durch erhöhte Expression inflammatorischer Gene, aber auch durch Reaktionsabfolgen in der Peripherie.
Eine Schädigung des zentralen Nervensystems, in unserem Fall die Induktion des Hirntodes, ruft eine
direkte und massive Expression inflammatorischer Induktoren, z.B. den Histokompatibilitätsantigenen (HLA I und II), aber auch von Adhäsionsmolekülen, Zytokinen und anderer Akut-PhasenProteine in den peripheren Organen hervor. Die erhöhte Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen HLA I und HLA II wird als direkte Verstärkung der Immunogenität gesehen (71, 125). Die
Einleitung
13
kortikale Nekrose führt zu einer Aktivierung entzündungsspezifischer Zelltypen mit Freisetzung unterschiedlicher proinflammatorischer Zytokine (PIC).
Das zentrale Ereignis triggert also prompte, unspezifische Entzündungsvorgänge, die später wiederum
die Intensität, sowie das Eintreten spezifischer immunologischer Reaktion, im Sinne einer Abstoßungsreaktion, beschleunigen können (199). Tierstudien zeigen ein frisch transplantiertes und perfundiertes Transplantat eines hirntoten Spenders immunhistologisch schon nach drei Stunden von
neutrophilen Abwehrzellen infiltriert, kurz gefolgt von größeren Zahlen an Makrophagen und TZellen (96, 154), signifikant stärker als im Vergleich zu lebendgespendeten Transplantaten. Im Folgenden soll auf einzelne Komponenten des Entzündungssystems und ihre Auswirkungen auf die
Transplantatniere während der unterschiedlichen Reaktionsschritte eingegangen werden.
Einzelne Komponenten der Entzündungsreaktion
1.7.1
Zytokine
Die Familie der Zytokine, als primärer Überbegriff für eine große, in den sechziger Jahren entdeckte
Gruppe endogener Proteine, ist in ihren zahlreichen Funktionen bei entzündlichen, angiogenetischen,
antitumorösen und wachstumsbeeinflussenden Prozessen schwer zu überschauen und zu klassifizieren. Zusammenfassungen von Xing (216) und Raeburn (159) zeigen die Funktion der Zytokine als
Mediator zwischen somatischen und myeoloischen Zellen. Neben essentiellen positiven Effekten der
Zytokine auf Zellen und Organismus, sowie ihrer Funktion als iatrogen eingesetzte Therapeutika, sind
auch krankhafte Zustände durch zu hohe oder zu niedrige Zytokinkonzentrationen im Körper bekannt
(104, 149).
Eine veränderte Zytokinproduktion nach Hirntod wurde bereits intensiv untersucht und beschrieben
(66, 102, 107). Lopau et al. (107) konnten zum Beispiel nach Hirntodinduktion einen Anstieg von IL6, TNF-α, als auch von IL-2 als Marker für die immunogene Aktivierung aufzeigen. Amado et al (7)
zeigten Il-6 im Vergleich zu der Zytokin-Konzentration von Kontrollgruppen signifikant erhöht. Die
erhöhte Konzentration von IL-6 läßt sich durch die im Hirn entstehende Ischämie, bzw. durch die
exzessive Katecholaminausschüttung erklären (158, 197, 217).
14
Einleitung
1.7.1.1
Interleukin – 6
Interleukin-6 stellt den bekanntesten Vertreter der proinflammatorischen Zytokine dar.
Es ist Initiator in der Immunreaktion des Körpers und ist entscheidend bei der Umwandlung von BLymphozyten in Plasmazellen (108), sowie an der vermehrten Synthese von inflammatorischen Proteinen in der Leber beteiligt. Il-6 ist einer der stärksten Vermittler der Akuten-Phase-Proteins-Synthese
und induziert eine grosse Reihe systemischer Folgeeffekte, endokriner und metabolischer Veränderungen. Im Gegenzug zu seinen proinflammatorischen Eigenschaften inhibiert es jedoch die Aktivität
von Il-1, was seine Funktion als dualer Effektor kennzeichnet (140).
Il-6 ist bei Patienten mit akutem Gehirnschaden sowohl in der zerebrospinaler Flüssigkeit - durch
intrathekale Ausschüttung - , als auch im Serum und im geschädigten Gewebe selber stark erhöht (13,
102).
1.7.1.2
Chemokine
In den letzten Jahren konnten verschiedene chemotaktische Zytokine, die Chemokine, als spezifische
Lockboten für die Infiltration von Entzündungszellen während einer akuten Abstoßung verantwortlich
gemacht werden (94, 165).
Der Prozess der Leukozytendiapedese von der zirkulatorischen Seite zu der des betroffenen Gewebes
beinhaltet eine grosse Anzahl von Interaktionen zwischen löslichen Faktoren und Oberflächenmolekülen (25). Die meisten der heutzutage bekannten Chemokine sind Mitglieder zweier Subfamilien, den
CC-Chemokinen und den CxC-Chemokinen, unterteilt durch die Präsenz oder Absenz einer Aminosäure zwischen den ersten zwei Cysteinmolekülen. CC-Chemokine sind für die Aktivierung von TZellen und Makrophagen/ Monozyten zuständig, CxC-Chemokine wirken eher auf Granulozyten (95).
Chemokine werden von unterschiedlichen Zellarten, einschließlich der Leukozyten produziert.
Histomorphologisch korrelierend, kommt es es im Zusammenhang mit dem Hirntod zu einer Entzündungsreaktion. Vielfach wurde gezeigt, dass der Hirntod selbst durch die entstehende kortikale
Nekrose mit Aktivierung einer Vielzahl von Zelltypen zu einer Freisetzung proinflammatorischer
Cytokine, so auch den Chemokinen, führt. Ihre Konzentration findet sich bei Abstoßungsreaktionen
transplantierter Nieren erhöht. So scheinen endotheliale Nierenzellen, tubulointerstitielle Epithelien,
mesangiale Zellen und Fibroblasten Chemokine konstitutiv oder als Antwort auf zerebralen Schaden
zu exprimieren (175). Interessant erscheint ihre signifikant unterschiedlich erhöhte Konzentration in
Vergleich zwischen Lebend- und Totspendernieren, was die These einer hintodinduktiv erhöhten Genexpression nahe legt.
15
Einleitung
1.7.1.3
Interleukin-1 und Interleukin-1-rezeptor-Antagonist
Eines der potentesten proinflammatorischen Vermittler ist das früh agierende Zytokin Il-1, ein Schlüsselenzym bei der Mediation interzellulärer Kaskaden. Die IL-1 Familie besteht aus drei Polypeptiden,
den Proteinen Il-1alpha und Il-1beta, welche eine große Reihe biologischer transduktorischer Signale
übermitteln und dem Il-1-rezeptor-Antagonisten (114). Il-1RA ist in der Lage, die von Il-1 induzierte
T-Zell-Proliferation und die Aktivierung von B-Zellen zu unterbinden. Il-1-RA reguliert also die Aktivität von Il-1-alpha und beta als gegenläufiger Ligand (192). Il-1 wird von aktivierten MonozytenMakrophagen produziert und bindet an Zell-Oberflächen –Rezeptoren.
Interessanterweise zeigt sich nach Hirntod diese Aktivierungsachse im Vergleich zu Kontrollgruppen
stark angeregt. In den Nieren hirntoter Spender werden deutlich erhöhte Konzentrationen an Il-1 gemessen. Dies erklärt sich durch die funktionelle Beteiligung von Il-1 an B- und T-Zell-Aktivierung,
Fieber-Reaktionen und der Initiierung an der Akute-phase-Protein-Synthese, alles Prozesse, die durch
den Hirntod aktiviert werden (37).
Vorrangegangene Studien zeigen an postmortal gespendeten Nieren eine ebenfalls erhöhte Konzentration von Il-1-RA, was eine gegenläufige Kompensation des Körpers der erhöhten immunogenen Aktivierung präsentiert. Fraglich scheint eine Korrelation der Abstoßungshäufigkeit mit den Expressionsleveln von Il-1-RA.
1.7.2
Selektine – Vertreter der Adhäsionsmoleküle
Die zentrale Schädigung bei Hirntod führt einerseits zur prompten Katecholaminsekretion mit resultierender peripherer Vasokonstriktion und Gewebsischämie, andererseits zu einer Ausschüttung von
Hormonen und entzündlichen Mediatoren, die die Organfunktion direkt beeinflussen können. Eine
Gruppe dieser hochregulierten Mediatoren sind die adhäsiven Akute-Phase-Moleküle. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind die Selektine (61).
Im März 1989 wurde die Entdeckung der primären Sequenzen von drei unabhängig studierten Zelloberflächen-Glykoproteinen publiziert, die man auf Endothel, Thrombozyten und Leukozyten gefunden hatte (20). Jedes Molekül beinhaltet eine NH2-terminale Lektin-ähnliche Domäne, einen EGFrepeat und eine diskrete Anzahl von Modulen, ähnlich zu solchen, die man in Komplement-bindenden
Proteinen gefunden hatte. Die Kollektion dieser Domänen wurde zum Markenzeichen einer neuen
Molekülfamilie, die heute als Selektine bekannt sind (115). Die Bezeichnung Selektin wurde ursprünglich vorgeschlagen um die Präsenz der Lektin-domäne hervorzuheben, aber auch, um die selektive Expression und Funktion der Moleküle hervorzuheben. Jedes Familienmitglied wurde entspre-
Einleitung
16
chend seines erst-detektierten Zelltyps klassifiziert: E-selektin (Endothel), P-Selektin (Platelets) und
L-Selektin (Lymphozyten). Alle drei Selektinarten agieren in Zusammenarbeit mit anderen Zelladhäsions-Molekülen, wie z.B. ICAM-1 (Intercellular Cell Adhesion Molecule), VCAM-1 (Vascular)
oder PECAM (Platelet-Endothelial), die aufgrund ihrer molekularen Struktur der ImmunglobulinSuperfamilie zugehörig sind. Sie alle bewerkstelligen Interaktionen zwischen Leukozyten, Plättchen
und endothelialen Zellen (98).
Durch die Selektine wird die Infiltration von Entzündungszellen in das Gewebe ermöglicht. Ischämie,
Hypoxie und Azidose führen zu einer progressiven Verlangsamung des Leukozytenverkehrs entlang
der Gefäßwände (117, 138, 139). Selektine reagieren dann mit Liganden zirkulierender polymorphonukleärer Leukozyten (PMN) und bewirken den „Rolling-Effekt“ derselben entlang der Gefässwände,
einem Prozess, der der festen Haftung und Diapedese in das entzündliche Gewebe vorangeht (205).
Eine erhöhte Induktion der De-Novo-Synthese dieser Adhäsionsmoleküle bewirken unterschiedliche
Zytokine, wie z.B. Il-1, INF gamma oder TNF-alpha, welche wiederum, wie oben genannt, nach Eintritt des Hirntodes massiv ausgeschüttet werden. Vergleiche zwischen hirntoten und lebendverwandten Spendern zeigen einen signifikanten Unterschied in der Selektinexpression- und konzentration (72). Studien zeigen, dass die Selektinexpression in hirntoten Spendern schon vor der Organentnahme deutlich erhöht ist. Sie erreicht ihr Maximum vier bis sechs Stunden nach Hirntodinduktion
(61, 92). Im Gegensatz dazu, zeigt sich die Selektinexpression und korrelierbare Leukozyteninfiltration in lebendgespendeten Nieren nach Reperfusion gleich null (93).
1.7.3
Makrophagen
Die Makrophagen sind eine sehr komplexe und heterogene Zellpopulation. Makrophagen können in
großer Konzentration bei der akuten und chronischen Abstoßung nach Nierentransplantation detektiert werden, sowohl bei der Antikörper-vermittelten und vaskulären Abstossung, als auch bei der
akuten zellulären Abstossungsreaktion, alles Ereignisse, die bei Nieren von hirntoten Spendern signifikant häufiger vorkommen, als bei lebendgespendeten Nieren.
Monozyten-Makrophagen sind antigen-präsentierende Zellen, die Interleukine produzieren, T-ZellAktivierung durch Kostimulationen bewerkstelligen und die Entwicklung von Th1-CD4+ Zellen fördern, welche eine dominante Rolle im Abstoßungsprozess spielen (220).
Makrophagen verhalten sich als phagozytierende Zellen, die nekrotische Zellkomponenten bei tubulärer Nekrose nach einer Transplantation abbauen. Im aktivierten Zustand schütten sie selber Chemokine aus, z.B. Il-8, MCP-1 oder MIP1a, zudem sind sie für ungünstige Prozesse der Postreperfusionsperiode verantwortlich, indem sie Sauerstoffradikale und Lipidperoxidation induzieren (47). Zu nennen
Einleitung
17
ist trotzdem auch die von Monozyten-Makrophagen gegenzügliche Exprimierung antiinflammatorischer Moleküle. Dazu gehören Il-1RA, Il-10, TGF-b und Lipoxine (220).
Die Anzahl der Makrophagen zeigt sich nach Hirntodinduktion im peripheren Gewebe stark erhöht.
Ihre Rekrutierung und Aktivierung wird mitunter durch C-C-Chemokine hervorgerufen. Nach Rolling
und Adhäsion präsentieren die in das Transplantat eingewanderten Leukozyten-MakrophagenPopulationen andere Klassen von adhäsiven Molekülen (87) und aktivieren proinflammatorische
Lymphokine (155), sowie das Komplementsystem (189, 210). Somit wirken sie als Trigger der inflammatorischen Reaktionskaskade nach Hirntodinduktion in der Peripherie.
Nach Eintritt des Hirntodes infiltrieren sie entzündetes Gewebe und verursachen dadurch Gewebsschaden (140). Dies zeigt sich in der Niere mit einer halbmondförmigen Glomerulonephritis und progredienter tubulärer Atrophie (158). Diese ausgeprägte Makrophageninfiltration zeigt sich im Vergleich, bei lebendgespendeten Nieren, nicht (156).
1.7.4
Die Heat-Shock-Proteine - Hämoxygenase-1
Stressoren führen zur Denaturierung von Proteinen und zu Fehlfaltung in der Proteinstrukur (40). Die
Zellantwort auf Stress ist vielfältig und beinhaltet unter anderem die Aktivierung der Transkription
und die Induktion von unterschiedlichen Genen (188). Ein ziemlich genau bekannter Mechanismus
(4) der Stressantwort der Zelle ist die Induktion der Heat-shock-Familie, der Heat-Shock-Proteine
(HSP) (18, 193, 208). Heat-Shock-Proteine gehören zu einer Multigenfamilie und bestehen aus verschiedenen, strukturell nicht miteinander verwandten Gruppen von Proteinen.
Neben dem Hitzeschock gehören zellschädigende Faktoren, wie schwere intrazelluläre Azidose (pH<
6.7), Entleerung der ATP-Reserven (<65%) (18, 171), Schwermetalle, Aminosäureananloga, Entzündungen (216), ischämiescher und oxidativer Stress (89) zu den Stressoren, die die Expression von
HSP´s triggern. In unserer Arbeit bezieht sich die HSP-Expression als Antwort auf den Hirntod als
systemischer „Stressfaktor“.
Charakteristischerweise wird nach einem starken Stressreiz durch die Phosphorylierung von Initiationsfaktoren die allgemeine Proteinsynthese inhibiert (219), im Gegensatz dazu aber die HSP-Gene
besonders stark exprimiert und die zugehörigen Proteine translatiert. Auf diese Weise können innerhalb von Minuten nach einem Stressereignis die Heat-Shock-Proteine bis zu 25% aller intrazellulären
Proteine ausmachen und in den wichtigen Zellkompartimenten Proteine vor Denaturierung schützen
(18). Einige cytosolische HSP´s translozieren sogar in den Nukleolus und verhindern dort die Auslösung von stressinduzierten Apoptosemechanismen (116).
18
Einleitung
Von den 3 Isoformen HO-1, HO-2 und HO-3 ist HO-1 die am weitesten verbreitete Form. HO-1, die
induktive Isoform entspricht HSP32 und wird durch diverse Stressoren induziert (18). HSP32 mediiert
genau wie die NO-Synthase guanylatcyclaseabhängig eine Thrombozyteninhibition und eine Vasodilatation. Endogenes oder exogen zugeführtes NO führt zudem zu einem bis zu 6-fachen Anstieg der
HSP32-Genexpression, was auf eine synergistische Wirkungsweise schließen lässt. Für die Induktion
der HSP32-Genexpression sind vor allem Heat-Shock-Faktor 1 (HSF1) und der durch Hypoxie induzierte TF-1 (Transkriptionsfaktor 1) von Bedeutung.
HSP32-Konzentrationen zeigen sich bereits in Studienergebnissen vorangegangener Arbeiten nach
Nierentransplantation hirntoter Spender signifikant erhöht (172). Der Hirntod scheint als Stressinduktion eine deutliche Expressionserhöhung zu bewirken.
Die HO-1 ist ein Heat-Shock-Protein, das antioxidative, antiinflammatorische und antiapoptotische
Funktionen aufweist und die Regulation des Gefäßtonus beeinflussen kann. Diese klaren zytoprotektiven Fähigkeiten konnten in verschiedenen experimentellen Modellen der Organtransplantationsforschung dargestellt werden (18, 101).
1.8
Ansatzpunkt dieser Arbeit
Der hirntote Spender stellt die größte Quelle für Nierentransplantationen dar (63). Dies begründet die
intensive Forschung an diesem Spenderkollektiv, denn trotz vielfältiger Verbesserungen der Immunsuppression bleibt die Erfolgsrate der Kurz- und Langzeitorganfunktion signifikant unter der von sowohl lebend-verwandten, als auch lebend- unverwandten Spendern (194).
Basierend auf bisherigen Forschungsarbeiten scheint es erwiesen, dass die komplexe Reaktionenskaskade des gesamten Organismus als Antwort auf den Hirntod bereits vor der Explantation,
durch verzweigte pathophysiologische Prozesse, eingeleitet wird. Die erhöhte Frequenz schwerer
akuter und chronischer Abstoßungsreaktionen scheint ihren Ursprung auf molekularer Ebene zu haben. Die Erkennung, Beeinflussung und Kontrolle der frühen Faktoren, die den Verlauf nach Organtransplantation beeinflussen können, ist ein vordringliches Ziel in der Weiterentwicklung der Transplantationsmedizin.
Das übergeordnete Bestreben dieses Projektes besteht daher in der weiteren Aufklärung der Auswirkung des Hirntodes auf die Niere, da die komplexen Mechanismen, die nach dem massiven Hirnschaden ausgelöst werden, noch immer ungenau verstanden sind und somit inadäqut behandelt werden
können. Der Ansatz der Überexpression/ bzw. Abschaltung zahlreicher Gene und Proteine nach Hirntodinduktion wurde in spezifischen Bereichen schon erforscht und beschrieben. Die Resultate weisen
19
Einleitung
bereits auf den relevanten Zusammenhang zwischen molekularer und funktioneller Ebene hin (19,
217, 218).
Die von uns benutzte standardisierte DNA-Microarray-Technologie bietet den Vorteil der simultanen
Analyse von zahlreichen Genen mit dem Potential eine Vielzahl von Veränderungen der Genexpression in der Niere zu detektieren. Frühere Forschungsmethoden basierten hauptsächlich auf Zuhilfenahme von PCR oder Gelelektrophorese bei einzelnen selektierten Genen. Durch hochdichte Genchips ist
die Untersuchung der Genexpression für einen Großteil des Gesamtgenoms gleichzeitig durchzuführen und diese im selben Schritt quantitativ zu erfassen.
Das Wissen über den Hirntod als elementares Ereignis und als antigenunabhängiger Risikofaktor in
der Transplantationsmedizin, lässt sich anhand dieser Methoden auf seine molekulare Ebene ausweiten. Bereits dargestellte Erkenntnisse über morphologische oder zelluläre Veränderungen peritransplantativ lassen sich nun auf Genebene erklären und verifizieren. Aufschluss über Gene und
Proteine unterschiedlicher Funktionsgruppen, die bisher nicht im Zusammenhang mit dem Hirntod
diskutiert wurden, könnte gewonnen werden. Nach Beweis ihrer veränderten Expression könnte dann
eine entsprechende iatrogene Stimulation oder Inhibition Folgeschäden reduzieren. Letztlich können
so neuartige therapeutische Ansatzpunkte für die Transplantationsmedizin und die Organerhaltung
von hirntoten Spendern geschaffen werden.
In der aktuellen Tranplantationsmedizin sind peritransplantative Abläufe und Transplantationsresultate schon lange durch Intensivmangagement und moderne Pharmaka verbessert worden. Zukunftsgerichtete Arbeiten zeigen jedoch bereits die Möglichkeiten, auf genetischer Ebene anzugreifen, um so
prophylaktisch bestimmte pathologische Reaktionen im Ursprung zu stoppen, oder protektive körpereigene Mechanismen zu fördern (152, 217)
Der experimentelle Teil dieser Arbeits lässt sich wie folgt untergliedern:
1. Tier-Modell des Hirntodes und Organentnahme (Niere) an der Ratte
2. RNA-Extraktion aus dem renalen Gewebe
3. Genchip-Hybridisierung und Auswertung der Genexpression
4. Quantitative PCR zur Verifizierung der Gensexpression
Material und Methoden
2.
20
Material und Methoden
Die Durchführung der Tierexperimente wurde den Vorschriften des Deutschen Tierschutzgesetzes
und der „European Convention on Animal Care“ untergeordnet und durch die Veterinärbehörde des
Regierungspräsidiums Freiburg mit der Registriernummer G-01/73 genehmigt
2.1
Tiermodell
Als Versuchstierte dienten männliche Wistar Ratten mit einem Körpergewicht von 300-400g.
Die Tiere wurden paarweise in Plexiglaskäfigen gehalten, die Fütterung erfolgte mit handelsüblicher
Trockennahrung, sowie ständigem Zugang zu Frischwasser.
Für die Studie wurde ein von Pratschke et al. (135, 157) etabliertes Tiermodell angewandt. Dies ist
ein kontrollierter Versuchsaufbau, auf dessen Basis die Herz-Kreislauffunktion der Ratten bei Isothermie über mehrere Stunden aufrechterhalten werden kann, nachdem ein graduierter, normotoner
Hirntod induziert wurde. Nachfolgend konnten entsprechende Organe zur weiteren Untersuchung
entnommen werden.
Versuchsgruppen
Um die Ergebnisse als alleinige Folgen des Hirntods definieren zu können, benötigt man den Vergleich zu einer Kontrollgruppe.
Die Ratten wurden den zwei Versuchsgruppen randomisiert zu je 5 Tieren zugeteilt. Material, Zeitablauf und Operationsvorgang wurden exakt gleichgestellt.
Kontroll-Gruppe (n=5)
Multiorganentnahme nach Narkoseinduktion und einer Beobachtungsperiode von sechs Stunden ohne
Hirntodinduktion.
Hirntod-Gruppe (n=5)
Multiorganentnahme nach Narkoseinduktion und Auslösen des Hirntodes bei einer Beobachtungsperiode von sechs Stunden nach Hirntodinduktion.
21
Material und Methoden
HIRNTOD-GRUPPE
Narkoseinleitung
+ Präparation
<
▲
ca.10 min
Hirntodinduktion
><
Messung MAD
HF und BG
nach Katheterimplantation
5min
><
360min
><
▲
▲
▲
▲
▲▲
▲
▲
▲
▲
minütliche Messung
alle 60min Messung MAD, HF, pH, pO2, CO2
von MAD und HF
KONTROLL-GRUPPE
Narloseinleitung
+ Präparation
<
▲
ca.10 min
><
▲
ca.10min
▲
>
MultiorganEntnahme
6 h Liegezeit
360min
▲
▲
Messung MAD
HF und BG
nach Katheterimplantation
MultiorganEntnahme
6 h Liegezeit
▲
><
▲
ca.10min
▲
>
Alle 60min Messung MAD, HF, pH, pO2, CO2
Abbildung 1: Darstellung des Versuchsablaufes bei der Kontroll- und Hirntodgruppe in der
Zeitachse. Die dargestellten Pfeile (▲) markieren die Messzeitpunkte von mittlerem arteriellen
Druck (MAD), Herzfrequenz (HF) und Blutgasanalyse (BG).
2.2
Anästhesie und Monitoring
Zur Narkoseeinleitung werden die Ratten in einer Kleintierbeatmungskammer ( Klaus Thoma GmbH,
Freiburg ) mit 4.0 Vol% Isofluran und einem Flow von 4 l Sauerstoff (O2) /min bis zum Verlust des
Stellreflexes narkotisiert. Anschließend wird die Narkose mit einer Kleintierbeatmungsmaske mit 1.31.8 Vol% Isofluran, 30 Vol% Lachgas und 60 Vol% Sauerstoff fortgesetzt. Die Tiere werden in Rückenlage auf einer Wärmeplatte (Temperaturmesser von KE medizinisch technischer Gerätebau Typ
OP-T, Pfaffing) platziert und die Körpertemperatur mittels eines rektalen Temperaturfühlers zwischen 35º C und 37º C automatisch konstant gehalten und protokolliert. Zur Prämedikation werden
5 µg Atropin (Atropinsulfat, Braun, Melsungen) subkutan injiziert. Nach Rasur der Bauchdecke und
des Halses wird ein querer Kragenschnitt durchgeführt, die Halsmuskulatur stumpf lateralisiert und
die Trachea freigelegt. Diese wird in der Vorderwand halbseitig inzidiert und ein Tubus zur kontrollierten Beatmung in die Luftröhre eingeführt und fixiert. Die Beatmungsmaschine (Kleintierbeat-
Material und Methoden
22
mungspumpe Typ 50ml, RHG Rhemalabortechnik, Hofheim) hält das Atemzugvolumen um 4.5 - 5ml
und die Atemfrequenz auf 35 - 40 min-1 volumenkontrolliert konstant.
Der inspiratorische Sauerstoffgehalt wird dabei im Bereich von 65 Vol% gehalten (Oxygen Monitor
810, Kontron medical). Die genaue Justierung der Beatmungspumpe, also die adäquate Einstellung
von Atemzugvolumen und Atemfrequenz, erfolgt in Adaption an stündlich durchgeführte Blutgasanalysen (Radiometer GmbH, Willich, Copenhagen, ABL 725).
Angestrebte Zielparameter sind dabei in allen Versuchsgruppen ein pH-Wert von 7.4 ± 0.1, ein pO2
von 110 – 250 mmHg und ein pCO2 von 25 - 50 mmHg. Diese kontinuierliche Überwachung der
Kreislaufparameter kann nach erfolgter Kanülierung der rechten Arteria carotis communis und der
linken Vena jugularis mit einem Polyethylenkatheter (Fine-Bore Polyethylen Tubing, ID 0.5mm;
1,0mm OD Sims Portex Ltd, Uk) erfolgen. Der venöse Katheter wurde mithilfe eines DruckSpülsystem (DPS Monitoring-Set, Medex Medical Ltd, Lancshire, Great Britain) mit isotoner Kochsalzlösung (ca. 0.5ml/h, 0.9% NaCl, Braun Schiwa, Glandorf) kontinuierlich gespült und somit offengehalten. Die Infusion dient ebenfalls als Volumensubstitution, ihre Menge pro Zeit wird mit Hilfe
des Perfusors an den MAD adaptiert.
2.3
Parameter zur Überwachung der Kreislaufstabilität
Zur Bestimmung der Makrozirkulation dienen die Parameter mittlerer arterieller Druck (MAD) und
die Herzfrequenz (HF). Beide werden kontinuierlich gemessen (Sirecust 403 P, Siemens), zum Zeitpunkt der Katheterimplantation und nachfolgend stündlich protokolliert. Als Ausschlusskriterien gelten Tiere, bei denen der MAD im Verlauf des Versuchs länger als fünf Minuten unter 50mmHg liegt,
sowie der biologische Tod der Tiere vor Ablauf des jeweiligen Untersuchungszeitraumes.
2.4
Schrittweise Hirntodinduktion
Die tracheotomierten und intubierten Tiere der Hirntodgruppe werden in Bauchlage umgelagert und
mit Klebestreifen fixiert, um Lageveränderungen durch tonisch-klonische Krämpfe während der Hirntodinduktion zu vermeiden. Am dorsoparietalen Skalpgebiet werden Fell, Haut und Muskeln entfernt.
Mit Hilfe einer Kanülenspitze werden Periost und Schädeldecke manuell vorgebohrt. An diesem Ansatz wird mit einem Dremel (Dremel, Multipro Cordless) 0.2 – 0.5 mm lateral der sagittalen Naht ein
2 mm großes Loch gebohrt. Ein Forgarty-Katheter (Edward Lifescience, Größe 4F, Länge 80 cm)
Material und Methoden
23
wird dann durch das Loch intrakraniell eingeführt und fixiert. Zur Erhöhung des Hirndrucks erfolgt
nun die graduelle Inflation des Ballons mit Kochsalzlösung. In dieser Phase werden die Kreislaufparameter minütlich protokolliert. Das Erreichen der Hirntodinduktion und der Einklemmung des Hirnstamms wird durch den Ausfall der Hirnstammreflexe, Apnoe über eine Minute nach Ausschalten der
Beatmungsmaschine und bilateral maximal dilatierte und fixierte Mydriasis definiert. Das durchschnittliche Ballonvolumen zur Auslösung des Hirntods liegt bei 0.3 - 0.4 ml NaCl über einen Zeitraum von fünf Minuten, analog des von Pratschke et al. beschriebenen Modells (157). Der Ballon
bleibt während der nun folgenden sechsstündigen Adaptionszeit expandiert. In Fällen, in denen die
Tiere hypotensiv werden und ein zirkulatorischer Kollaps droht, wird das intrakranielle Ballonvolumen um 10 ul NaCl pro Minute reduziert und die venöse Volumenzufuhr erhöht. Als Folge der Dekompression erreichen die Tiere wieder Normotension.
Abbildung 2: Beatmete Ratte nach Hirntodinduktion mit platziertem Forgarty-Katheter und
maximal dilatierten Pupillen.
2.5
Multiorganentnahme
Die Multiorganentnahme erfolgt bei der Kontroll- und Hirntodgruppe nach sechsstündiger Beobachtung.
Dazu werden die Tiere wieder in Rückenlage positioniert. Es folgt ein Oberbauchquer -und Medianschnitt mit medianer Sternotomie. Die Schnittränder werden mit Hilfe von Fixierklemmen nach außen
Material und Methoden
24
offengehalten. Nach Präparation der infrarenalen Aorta abdominalis wird diese nach kaudal und kranial ligiert, temporär kranial mit einem Gefäßclip abgeklemmt und dazwischen quer eröffnet. Nach
Einführung eines Katheters infrarenal in die abdominelle Aorta (Vasofix Braunüle, Venenverweilkanüle, 14G, 2.1 x 50mm, Fa.Braun) werden 2 ml Blut entnommen.
Nach der Durchtrennung der Vena cava inferior werden die Organe durch Infusion einer gekühlten
isotonischen NaCl Lösung aortal blutleer gespült.
Danach wurden nacheinander erst das Pankreas, dann beide Nieren, Herz und Teile der Leber entfernt, steril in verschlossenen Eppendorfröhren aserviert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgt in -80° C Kühlschränken.
2.6
RNA-Extraktion
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus kleinen Mengen von Nierengewebe beinhaltet verschiedene
Reaktionsschritte, die mithilfe von RNeasy Kits, Qiagen (Hilden, Deutschland) erfolgen, und sich an
das vorgegebene Aufarbeitungsprotokoll (Trizol/Qiagen, RNA Miniprep) halten.
RNA kann unter nativen Bedingungen leicht enzymatisch degradiert oder katalytisch hydrolisiert
werden. Die RNA-Stabilisierung in biologischen Ausgangsmaterialien ist eine essentielle Voraussetzung, um die Genexpression zuverlässig zu analysieren, da es sonst unmittelbar nach Probenentnahme
durch spezifische und unspezifische RNA-Abbauprozesse und durch die Induktion der Transkription
zu Veränderungen im Genexpressionsmuster kommt. Die Qualität der von uns gewonnen GesamtRNA, und damit auch unseres Analyseergebnisses, wird dabei bereits durch die ersten Schritte bei der
Probenentnahme mitbeeinflusst. Da es bei den Versuchen mit anschließender Genchipanalyse und
PCR gerade darum geht, zuverlässige quantitative Genexpressions-Analysedaten zu gewinnen, werden die Organproben bis zur Durchmischung mit dem Trizolreagenz ständig mit Flüssigstickstoff
gekühlt und damit in dem schon direkt nach der Organentnahme schockgefrosteten Zustand belassen.
Die RNeasy Methode isoliert RNA-Moleküle mit einer Länge von über 200 Nukleotiden.
Das Verfahren trennt RNA-Spezies mit weniger als 200 Nukleotiden Länge (z.B. 5.8SrRNA, 5srRNA und tRNAs, die zusammen 15 - 20% der Gesamt-RNA ausmachen) selektiv ab, so dass es zu
einer Anreicherung der mRNA kommt. Das spezielle Hochsalz-Puffersystem ermöglicht die Bindung
von bis zu 100µg RNA an die RNeasy Silicagel-Membran, während die übrigen Substanzen effizient
ausgewaschen und somit abgetrennt werden. Die isolierte RNA wird dann mit RNase-freiem Wasser
eluiert.
Material und Methoden
2.6.1
25
RNA-Miniprep-Protokoll
Das bei -80° C gefrorene Nierengewebe wird als erstes unter ständiger Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einem Metallmörser pulverisiert. Ein Auftauen des Materials muss unbedingt vermieden werden. Bis zu 40 mg werden in einer Kugelmühle (Kugelmühle MM2000, Retsch, Haan, Germany) von
8 mm Mahlkugeln zweimal eine Minute lang zermahlen und homogenisiert.
Es folgt die zweimalige Extraktion mit einem TRIZOL® Reagent (GibcoBRL manufactured for LIFE
Technologies), Chloroform (Isomayl-Alkohol 24:1, Amresco®, Solon, Ohio, USA) und 2Mercaptoethanol (Merck, Darmstadt). Das benutzte TRIZOL® Reagent ist ein gebrauchsfertiges Reagenz zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen und Geweben. Es setzt sich zusammen aus Phenol
und Guanidin. Das ebenso hinzu gegebene Chloroform-Isomaylalkoholgemisch hilft bei der Denaturierung und Phasierung und teilt die nach Zentrifugierung entstandene Lösung in eine wässrige und
organische Phase auf, wobei die RNA in der wässrigen Phase zurückbleibt. 2-Mercaptoethanol fällt
die RNA aus und verfügt über eine antioxidante Wirkung. Nach Mischung des Homogenats mit den
Reagenzien erhalten wir nach der Zentrifugation einen farblosen Überstand.
Dieser farblose Überstand wird in ein frisches Röhrchen pipettiert und ein gleiches Volumen von
Ethanol (70%, J.T. Baker, Deventer, Holland, 8006) hinzugefügt. Ethanol stellt die Bindebedingungen
für die Säule ein, an der die RNA später haften soll. Das Reagenz wird gemischt und sofort auf RNeasy Säulchen (Qiagen, RNeasy –kit, Hilden, Deutschland, Cat.nr. 74104) pipettiert und für 15 sec mit
10.000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen, die RNA haftet jetzt an der Säule. Falls das
vorherige Volumen zu groß ist, wird die Säule ein zweites Mal geladen.
Im nächsten Schritt werden 350 µl RW1 (Waschpuffer, Qiagen, RNeasy-kit, Hilden) aufgetragen, um
die übrigen Substanzen auszuwaschen. Nach 15 Sekunden Zentrifugation bei 10.000 rpm wird der
Durchlauf verworfen. Zur Verdauung von Resten organischer DNA werden danach 10 µl DNase1
(RNase-frei) mit 70 µl RDD gemischt und auf die Säulenmembran pipettiert. Die Röhrchen werden
jetzt 15 min bei Raumtemperatur (20 - 30° C) inkubiert. Danach wird die Säulenmatrix erneut mit 350
µl RW1 gewaschen, zentrifugiert und die Säulchen danach in frische Sammelröhrchen gesteckt. Im
weiteren Schritt werden 500 µl RPE (Waschpuffer, Qiagen, RNeasy-kit, Hilden) aufpipettiert, zentrifugiert und der Durchlauf verworfen. Dieser Waschschritt wird wiederholt und die Säulenmembran
danach noch mal 1min bei 10.000 rpm zentrifugiert und somit getrocknet. Es folgt das Herauslösen
der RNA in destilliertes RNase-freies Wasser.
Material und Methoden
2.6.2
26
Quantitative Bestimmung
Um die Konzentration im Eluat zu bestimmen, benötigte man eine 1:100 Verdünnung. Dafür wurde 1
µl RNA-wasser mit 99 µl destilliertem H2O gemischt.
Die einzelnen Konzentrationen konnten jetzt quantitativ im Photometer (Pharmacia Biotech, Ultrospec 2000, Modell 80-2106-06, Cambridge, UK) bei 260 nm bestimmt werden
Lagen die Konzentrationen unter 0.2 µg / µl musste das Prozedere wiederholt werden, da die Menge
an RNA ungenügend war.
2.6.3
Qualitative Bestimmung
Zur Qualitäts- und Intaktheitsüberprüfung der extrahierten RNA erfolgte eine AgaroseGelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidimprägnation. Hierbei sollte sich zeigen, ob die
Gesamt-RNA frei von Kontamination mit genomischer DNA war, und ferner, ob die RNA intakt war.
Ethidiumbromid wird zum Anfärben von Nukleinsäure bei der Gelelektrophorese verwendet. Einzelne
Ethidiumbromidmoleküle interkalieren dabei zwischen die Basen der RNA. Dadurch verändert sich
das Anregungsspektrum von Ethidiumbromid und die Fluoreszenz der Substanz wird so durch ultraviolettes Licht stark erhöht. Die Lichtintensität ist dabei proportional zur vorliegenden RNAKonzentration sowie zur Länge der Nukleinsäure.
Entscheidend für die Integrität der RNA waren dabei die Fragmente, die auf die 18S und 28S RNA
zurückzuführen sind. Die Intensitäten der 18S-Banden und 28S RNA-Banden sollten dabei ein Verhältnis von 1:1.5 - 2.5 zeigen (siehe Abbildung 3).
Zur Vorbereitung des Gels wurde TBE (Trisborat-EDTA, pH 7.5, 10x) aus Tris, EDTA und Bovicacid als Ladepuffer hergestellt. Zur Herstellung eines 10x10 cm 1% igen Agarosegels benötigte man
80ml TBE und 0.8 g Agarose, (Invitrogen™, Life Technologie). Das Gemisch wurde in der Mikrowelle (Siemens) einige Minuten erhitzt und aufgekocht, bis sich das Pulver vollständig im TBE gelöst
hatte. Es folgte eine Abkühlung auf 60° C bevor man dem Gel 4 µl Ethidiumbromid (EtBr, Amresco)
zur Anfärbung der Banden zufügte. Das Gel wurde auf die vorbereiteten Platten gegossen und ein
Kamm mit 40 µl Taschenvolumen eingesteckt. Das erkaltete Gel wird in die mit 1-fach TAE-Puffer
gefüllte Laufkammer gelegt und mit der gewonnen RNA befüllt. Die elektrophoretische Auftrennung
der Nukleinsäuren erfolgt bei einer Spannung von 120 V und einer Stromstärke von 100 mA (P25
Powerpack, Biometra, Göttingen). Die Wanderung der RNA entsprechend ihrer Ladung von Minus
nach Plus dauert ungefähr 60-70 Minuten. Als Kontrolle dient ein 1kb DNA- Ladepuffer (MBI Fermentas, 0.1 mgDNA/ ml, Gene Ruler, SM0313), der im Gel mitläuft. Danach wurde das Gel in die
UV- Kammer (UV-System, Intas) gelegt und die Banden im Fotogramm angeschaut und dokumentiert. Das Verhältnis der Färbeintensitäten von 28S-rRNA zu 18S-rRNA sollte hierbei ungefähr 2:1
betragen (Abb. 3).
27
Material und Methoden
Ein abweichendes Verhältnis, oder eine unscharfe und undeutliche RNA-Bande, wies auf eine RNADegradation während der Präparation hin. Dieser Versuchsdurchlauf wurde dann wiederholt.
28S-rRNA Bande
18S-rRNA Bande
1kb DNA Ladder
Abbildung 3: Agarosegel der Gesamt-RNA, Betrachtung unter UV-Licht nach
elektrophoretischer Auftrennung. Die Intensitäten der 18S-Banden und 28S
RNA-Banden zeigen ein Verhältnis von 1: 2.
2.6.4
RNA- Pooling
Um jetzt die Genexpressionsänderungen als Querschnitt der einzelnen Gruppen auf den Genchips
identifizieren zu können, wird die RNA pro Gruppe gepoolt.
Hierzu wird von jeder der fünf extrahierten RNAs jeder Gruppe sechs µg RNA entnommen und mit
den anderen RNA´s der Gruppe vermengt. Das entstandene Volumen wird dann mit RNase-freiem
Wasser auf 100 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 350 µl Buffer RLT und 250 µl 96%igem Ethanol wird
das Gemisch auf die RNeasy Mini Säule aufgetragen. Nach zweimaligem Waschen mit 500 µl Buffer
RPE und einem Durchgang der Trockenzentrifugation wird die RNA wieder in RNase freiem Wasser
eluiert und mittels Photometer und Gelelektrophorese quantitativ und qualitativ kontrolliert.
Material und Methoden
2.7
28
Genchip-Hybridisierung
Die Arbeiten erfolgen in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Koczan (Universitätsklinikum
Rostock, Immunologisches Institut Prof. Dr. Thiessen).
2.7.1
DNA-Microarray
Die Firma Affymetrix ist Produzent von DNA-Microarrays, mit deren Hilfe wir die RNA-Profile unterschiedlicher Organe erstellen konnten. In unserer Arbeit verwendeten wir den GeneChip® Rat Genome 230 2.0 Array.
Das Prinzip der Mikroarray-Technologie ist die Miniaturisierung eines bekannten analytischen Verfahrens, das auf der Hybridisierung und Detektion eines freien, markierten Nukleinsäurestrangs mit
einem immobilisierten, komplementären Nukleinsäurestrang beruht. Dieses Prinzip findet in zahlreichen Anwendungen bereits Verwendung (Southern Blot, Northern Blot, Dot Blot).
Das Besondere an Mikroarrays ist die sehr hohe Dichte, mit der Tausende von unterschiedlichen Sequenzen durch neuartige Technologien nebeneinander auf einen Träger aufgebracht werden, und innerhalb eines Testansatzes analysiert werden können.
Der Einsatz von Mikroarrays ermöglicht die schnelle und parallele Untersuchung der Genexpression
von bekannten Genen (probe genes) oder Gensequenzen und deren Veränderung zwischen zwei Experimentgruppen. Für den synthetischen Oligonukleotid-Mikroarray von Affymetrix ist im RoutineEinsatz eine Ausgangsmenge von 5 µg Gesamt-RNA ausreichend.
Die folgenden Hauptschritte werden dabei bei der Expressionsanalyse der Genchips durchlaufen:
1. Probengewinnung (siehe RNA Phenolextraktion) sowie Weiterbearbeitung der gepoolten
RNA vor Hybridisierung
2. Chiphybridisierung
3. Waschen, Färben und Antikörperamplifikation
4. Scannen
5. Datenanalyse
29
Material und Methoden
2.7.2
Affymetrix-Standardprotokoll der cDNA-Synthese
Bei der vorherigen Phenolextraktionsmethode gewonnenen RNA handelt es sich um messenger-RNA
(mRNA), also eine transkribierte Arbeitskopie eines Gens der DNA, welches im normalen Stoffwechsel der Zelle aus dem Zellkern herauswandert und dann mit Hilfe der Ribosomen in Proteine translatiert wird. Durch Zuhilfenahme von Reverser Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) wird
im nächsten Schritt aus dieser mRNA zuerst eine doppelsträngige copyDNA (cDNA) gewonnen, aus
welcher danach durch in vitro-Transkription eine cRNA gewonnen werden kann. In diesem Schritt
findet auch schon durch Einbau eines bestimmten mit Fluorochrom markierten Nukleotids die Vorbereitung zur späteren Erkennung statt.
Die Herstellung der copyDNA (cDNA) erfolgt in zwei Schritten, beginnend mit der Erststrangsynthese. Hierzu werden 10 µg des Gesamt-RNA-Eluats in ein frisches 1.5 ml Safe Lock Reaktionsgefäß
(Eppendorf Biopur) überführt und 2 µl einer Glykogenstammlösung (Ambion, P/N 9510) hinzugesetzt. Es folgt die Ethanolpräzipation, bei der 50 % einer 7.5M Ammoniumacetatlösung (Sigma, P/N
A2706), sowie das Dreifache des jetzt entstandenen Volumens an 96%igen Ethanol hinzugemischt
werden. Die Mixtur wird danach in flüssigem Stickstoff schockgefroren, bevor sie 30 Minuten lang
bei -3° C zentrifugiert wird. Der Überstand wird dekantiert, die übrige Lösung kurzzeitig zentrifugiert,
und der adhärenten Rest des nun entstandenen Eluates abpipettiert. 600 µl 80%igen Ethanols werden
hinzugegeben, danach kurz mit dem Vortex aufgerüttelt und erneut drei Minuten zentrifugiert. Das
neue Eluat wird bis auf ca. 50 µl mit einer Pipette abgenommen und erneut kurz anzentrifugiert. Bei
offenem Reaktionsgefäß und Zimmertemperatur erfolgt nun die Trocknung.
Ein HPLC-gereinigter T7-(dT)24 Primer (5`-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTTCACTATAGGG
AGGCGG-(dT)24-3` wird nun zum Priming der Erststrangsynthese in einer Konzentration zu 10
pmol/µl mit RNase freiem Wasser (Ambion) vorverdünnt. 10 µl dieser Primerlösung werden zum
vorher getrockneten Inhalt des Reaktionsgefäßese hinzugegeben. Es erfolgt eine dreiminütige Inkubation bei 70° C. Danach wird die Lösung auf Eis heruntergekühlt und eine Minute lang in die Zentrifuge gestellt.
Es erfolgt die Beisetzung eines Mastermixes.
Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
1 µl
dNTP Stammlösung ( je 10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
2 µl
Dithiothreitol
4 µl
Erststrang 5x Puffer (GibcoBRL, Invitrogen)
_________________________________________
∑
7 µl
Mastermix
30
Material und Methoden
Danach werden noch 3.5 µl SuperScript™ II RNase H Reverse Transcriptase (GibcoBRL, Invitrogen) hinzugegeben und anschließend bei 42° C für ein bis zwei Stunden inkubiert. Es folgt ein mindestens zweiminütiges Abkühlen auf Eis. Anschließend wird für einige Sekunden zentrifugiert, der
am Boden des Reaktionsgefäßes befindliche Reaktionsansatz abpippetiert und zur Zweitstrangsynthese weiterverwendet.
Die Zweitstrangsynthese wird mit einem anderen Mastermix durchgeführt.
Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
91 µl
RNase freies Wasser (DEPC-treated water, Ambion)
30 µl
5x Second Strand Buffer (GibcoBRL, Invitrogen)
3 µl
dNTP Stammlösung (je 10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
4 µl
DNA Polymerase I von E.coli (5-10 Units/µl; GibcoBRL, Invitrogen)
1 µl
E.coli DNA Ligase (10 Units/µl; GibcoBRL, Invitrogen)
1 µl
Ribonulease H (1-4 Units/µl; GibcoBRL, Invitrogen)
_________________________________________
∑
130 µl
Mastermix
Der Mastermix wird mit dem Reaktionsgemisch der Erststrangsynthese vermischt und zwei Stunden
bei 16° C inkubiert. Es folgt die „End-polishing“- Auffüllreaktion, bei der 2 µl T4 DNA Polymerase
(1-8 units/µl; GibcoBRL, Invitrogen) hinzugegeben werden und die Mischung für fünf Minuten bei
16° C inkubiert wird. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 µl 0,5M EDTA Lösung (Sigma) beendet.
Anschließend erfolgt die Aufreinigung durch eine Phenolextraktion. Es werden hierzu 160 µl Phenol/Chloroform (Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol, Ambion) zur zuvor gewonnen Lösung hinzugegeben und kräftig im Vortex vermischt. Es folgt eine fünfminütige Abkühlung auf Eis. Danach wird
zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und die wässrige Phase in ein 1.5 ml Safe Lock Reaktionsgefäß (Eppendorf Biopur) pipettiert. Der Mixtur werden dann 2 µl Glykogenstammlösung zugesetzt (Ambion, P/N 9510). Hiernach erfolgt erneut eine Präzipitation mit Ethanol und darauf ein
Waschgang mit 600 µl 80% igen Ethanol.
Affymetrix-Standardprotokoll der cRNA-Transkription und Markierung mit Biotin
Als Ergebnis erhält man eine cDNA, die wesentlich stabiler ist, als die RNA, dem Transkriptom eines
Zellpools in einem bestimmten Zustand jedoch identisch ist. Sie bietet sich daher als Ausgangspunkt
für Untersuchungen der Genexpression an. Nach Anleitung des von Affymetrix empfohlenen Stan-
31
Material und Methoden
dardprotokolles folgt die In-Vitro-Transkription dieser cDNA mit gleichzeitiger Markierung durch
biotinylierter Cytidintriphosphate (CTP) und Uridintriphosphate (UTP).
Hierzu wird das BioArrayTM High YieldTM RNA TranscriptLabeling Kit (P/N 900182, Enzo) verwendet. Es wird ein anderer Ansatz eines neuen Mastermixes benötigt.
Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
22 µl
RNase freies Wasser (DEPC treated water, Ambion)
4 µl
10x HY Reaction Buffer
4 µl
10x Biotin Labeled Ribonucleotides
4 µl
10x DTT
4 µl
10xRNase Inhibitor Mix
2 µl
20x T7 RNA Polymerase
_____________________________________
∑
40 µl
Mastermix
Nach Hestellung des Mastermix wird dieser in das getrocknete Hütchen pipettiert. Es folgt eine Inkubation für fünf bis 15 Stunden, abhängig von der eingesetzten Gesamt-RNA. Anschließend wird der
Reaktionsansatz aufgereinigt: Hierzu wird der komplette Reaktionsansatz auf eine RNeasy Minisäule
(Qiagen, Hilden) pipettiert und bei 10000 G für 15 Minuten zentrifugiert. Der Durchsatz wird ein
zweites Mal auf die Säule geben und zentrifugiert. Insgesamt folgt eine dreimalige Waschung der
Säule. Dabei wird im erstenWaschschritt die Waschung mit 700 µl RW (RNeasy Kit) im zweiten und
dritten Waschschritt mit 500 µl RPE (RNeasy Kit) durchgeführt, sowie jeweils 15 Sekunden bei
10000 G zentrifugiert. Eine Trockenzentrifugation der Säule für 2 Minuten bei 19940 G erfolgt im
letzten Schritt.
Anschließend wird die Säule in ein frisches RNase freies 1.5 ml Safe Lock Reaktionsgefäß (Eppendorf Biopur) überführt, um die RNA zu eluieren. Es folgt eine zweimalige Waschung mit je 30 µl
RNase freien Wasser (DEPC-treated water, Ambion). Nach einminütiger Inkubation wird für eine
weitere Minute bei 19940 G zentrifugiert. Danach werden die gewonnenen 60 µl in ein frisches, RNase freies 1.5 ml Safe Lock Reaktionsgefäß (Eppendorf Biopur) umpipettiert. Nach Herstellung einer
1:50 Verdünnung der eluierten cRNA (1.4 µl + 68.6 µl Wasser) folgt zur Quantifizierung (1 OD = 40
µg/ml) eine photometrische Messung bei 260 nm.
Um RNA-Fragmente gleicher Länge und Hybridisierungskinetik, sowie gleicher Anzahl inkorporierter Biotinmoleküle herzustellen, die alle eine gleich hohe Spezifität zu dem entsprechenden Oligonukleotid auf dem Chip haben, efolgt nun die Fragmentierung, die auch als saure Hydrolyse bezeich-
Material und Methoden
32
net wird. Hierzu gibt man 12.5 µl fünffach Fragmentierungspuffer (Trizma Base, Sigma P/NT 1503)
pro Reaktionsansatz hinzu und inkubiert dies bei 94° C für 35 Minuten. Anschließend wird mit Eis
Heruntergekühlt und kurzzeitig zentrifugiert. Zur anschließenden Qualitätskontrolle und Volumenbestimmung des nachfolgenden Hybridisierungsgels werden zunächst die Gelkammer, der Schlitten und
der Kamm mindestens 30 min mit 3 %igem Wasserstoffperoxid inkubiert und anschließend abgewaschen. Danach wird ein 1.6 %iges TBE-Agarosegel hergestellt, in das 1 µl der zuvor fragmentierten
cRNA auftragen wird (Elektrophorese: 10 V/cm, max. fünf Zentimeter Lauflänge). Mittels einer Geldokumentationsanlage über 254 nm UV-Licht erfolgt die Fotodokumentation und Datenspeicherung.
2.7.3
Aufbau und Durchführung der DNA-Microarrays
Bei dem cDNA-Microarray handelt es sich meist um einen Siliziumträger, auf den durch Photolithographie spezifische DNA-Sequenzen punktförmig und in systematischer Reihenfolge auf 11x11 µ m
große, so genannte Sondenzellen, fixiert werden.
Jede Sondenzelle ist also mit einem einzigartigen Oligonukleotid bestückt, das eine Länge von 25
Basenpaaren hat und in ca. 107 Kopien pro Sondenzelle vorkommt. Jede mRNA-Referenzsequenz
wird durch 20 verschiedene Sondenpaare (= ein Sondensatz) repräsentiert.
So ist es möglich auf einer 1.28 cm2 großen Fläche 1.3 Millionen Oligonukleotide für die Analyse
von bis zu 54000 Zielsequenzen zu erstellen.
Jede Sondenzelle mit einem so genannten Perfect-Match (PM) enthält ein zur Referenzsequenz genau
komplementäres Oligonukleotid. Ihr gegenübergestellt liegt eine Miss-Match-Sondenzelle (MM) mit
einem Oligonukleotid, welches bis auf einen homomeren Austausch an Position 13 mit dem Oligonukleotid der gegenüberliegenden PM-Sondenzelle identisch ist. Sie bilden gemeinsam ein Sondenpaar. Bei Anwesenheit des Transkripts in der Probe des Experiments, wird das Oligonukleotid der
PM-Sondenzelle besser mit dem Transkript hybridisieren, als das Oligonukleotid der MMSondenzelle. Dadurch wird das gemessene Fluoreszenzsignal der PM-Sondenzelle (heller dargestellt)
über dem Signal der MM-Sondenzelle (dunkler dargestellt) liegen.
Die Software von Affymetrix ermittelt dann die durchschnittliche Differenz zwischen PM- und MMSondenzellen über die Gesamtheit des Sondensatzes und trifft eine Aussage über die Anwesenheit
und die Signalstärke des Transkripts. Die Signalsstärke wird verwendet, um den Faktor der Expressionsveränderung zwischen den zwei Gruppen zu bestimmen. Beim Auftreten von unspezifischen
Hybridisierungen betreffen diese PM- und MM-Sondenzellen annähernd gleichermaßen, da nur eine
Base zwischen den Oligonukleotiden unterschiedlich ist. Dadurch ergibt sich für die durchschnittliche
Differenz der Fluoreszenzsignale ein Wert bei Null. Dies führt zu einer deutlichen Reduktion falschpositiver Signale und Fehlinterpretationen der Software.
33
Material und Methoden
Abbildung 4: Schema der Repräsentation eines Gens auf Mikroarrays von Affymetrix
Jede Referenzsequenz wird in bis zu 20 verschiedene Sondenpaare eingeteilt. Das Sondenpaar besteht
aus Oligonukleotiden, die identisch mit der Referenzsequenz sind, Perfect Match (PM), oder einen
einzigen Basenaustausch besitzen, Miss Match (MM). Nach der Hybridisierung wird die Fluoreszenzintensität der markierten Probe aller Sondenzellen gemessen und berechnet, ob und in welcher Signalstärke ein Transkript anwesend war. Bei Anwesenheit ist die Fluoreszenz der PM-Sondenzelle in der
Regel höher als die der MM-Sondenzelle (103).
2.7.4
Chiphybridisierung
Affymetrix-Standardprotokoll der Chip-Hybridisierung
Die Herstellung eines zweifachen Hybridisierungspuffers, muß vor der Durchführung der eigentlichen
Genhybridisierung erfolgen.
Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
∑
8.3 ml
der 12x MES-Stammlösung (70,4 g 2-(N-Morholino)Ethansulfonsäure Natriumsalz (Sigma, M 3058) plus 800 ml Wasser (Molecular Biology Grade, BioWhittaker, P/N 16-001 Y))
17.7 ml
5 M NaCl (RNase frei, Ambion, P/N 9760)
4.0 ml
0.5 M EDTA (Sigma, P/N E 7889)
0.1 ml
10 % Tween 20 (Pierce, P/N 28230)
19.9 ml
RNase freies Wasser (DEPC treated water,Ambion)
50
ml
2x Hybridisierungspuffer
34
Material und Methoden
Danach wird ein Hybridisierungsmix synthetisiert. Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
∑
5 µg
cRNA Fragmentierungsansatz
50 µl
2x Hybridisierungspuffer
1 µl
Bovines Serumalbumin (50mg/ml, GibcoBRL, P/N 15561-020)
1 µl
Heringsspermien DNA (10 mg/ml, Promega P/N D 1811)
1.7 µl
B2-Oligo Bio-GTC GTC AAG ATG CTA CCG TTC AGG A,
HPLC gereinigt, Sigma)
5 µl
20x Kontrollspikes (BioB, 150 pM; BioC, 500 pM; BioD 2,5 nM;
Cre,10 nM)
x µl
RNase freies Wasser (DEPC treated water, Ambion) bis zu einem
Gesamtvolumen von 100µl
100µl
Hybridisierungsmix
Es folgt die Hybridisierung, für die die die Arrays mit 200 µl einfach Hybridisierungspuffer aufpipettiert werden, um danach bei 45° C und 60 rpm im Hybridisierungsofen (Hybridization Oven 640, Affymetrix) vorhybridisiert zu werden.
Schließlich wird für den Schritt der eigentlichen Hybridisierung der zuvor gemischte Hybridisierungsmix für fünf Minuten auf 99° C erhitzt und anschließend für fünf Minuten bei 45°C abgekühlt.
Nach Zentrifugation wird die Vorhybridisierungslösung vom Chip abpipettiert und mit dem eigentlichen Hybridisierungsmix befüllt. Die Durchführung der Hybridisierung dauert 16 Stunden bei 45° C
und 60 rpm im Hybridisierungsofen (Hybridization Oven 640, Affymetrix).
2.7.5
Waschen, Färben und Antikörperamplifikation
Nach dem Protokoll von Affymetrix erfolgt anschließend der Wasch- und Anfärbevorgang in der
halbautomatischen Waschstation (Fluidics Station 400). Es erfolgt die Herstellung von Waschpuffern.
Die Rezeptur setzt sich wie folgt zusammen:
Stringenter Waschpuffer (1000 ml):
83.3 ml
12x MES-Stammlösung
5.2
ml
5 M NaCl (Ambion, P/N 9760)
1.0
ml
10 % Tween 20 (Pierce, P/N 28320)
35
Material und Methoden
∑
910.5 ml
Wasser (Molecular Biology Grade, BioWhittaker)
1000 ml
Stringenter Waschpuffer
Nicht-stringenter Waschpuffer (1000ml):
∑
300 ml
20x SSPE (3 M NaCl; 0,2M NaH2PO4;0,02M EDTA, BioWhittaker, P/N
16-010Y)
1.0 ml
10 % Tween 20 (Pierce, P/N 28320)
699 ml
Wasser (Molecular Biology Grade, BioWhittaker)
1000 ml
Nicht-stringenter Waschpuffer
Zweifach Stain Buffer (250ml)
∑
41.7 ml
12x MES Stammlösung
92.5 ml
5 M NaCl (RNase frei, Ambion, P/N 9760)
2.5
10 % Tween 20 (Pierce, P/N 28320)
ml
112.8 ml
RNase freies Wasser (DEPC treated water, Ambion)
250
Stain Buffer
ml
Färbelösung
∑
300 µl
2x Stain Buffer
270 µl
RNase freies Wasser
24 µl
Acetyliertes BSA (50 mg/ml, GibcoBRL P/N 15561-020)
6
R-Phycoerythrin Streptavidin (Molecular Probes, P/N S-866)
µl
600 µl
Färbelösung
36
Material und Methoden
Antikörperlösung
300
∑
µl
Zweifach Stain Buffer
266.4 µl
RNase freies Wasser
24
µl
Acetyliertes BSA
6
µl
10 mg/ml Ziegen-IgG (Sigma, P/N I5256; gelöst in PBS GibcoBRL ohne
Ca/Mg)
3.6
µl
0.5 mg/ml biotinylierter Anti-streptavidin Antikörper (Ziege) (Vector Laboratories, P/N BA-0500)
600
µl
Antikörperlösung
Durch zweimaliges Anhängen an die halbautomatische Waschstation werden die Arrays mit der beschriebenen Färbelösung gefärbt. Dazwischen erfolgt die Antikörperamplifikation durch das Anhängen der Antikörperlösung.
2.7.6
Scannen
Durch Substrahierung der unspezifischen Hybridisierungsmerkmale von den Signalen der PerfectMatch-Proben werden die Ergebnisse ausgewertet. Ebenso werden die gescannten Resultate aller
aufgetragenen Oligonukleotiden für ein Gen mit einem Scanner (GeneChip Scanner 3000, Hewlett
Packard, Affymetrix) untereinander verrechnet. Der Scanner kann bei einer Auflösung von 1.56 micron eine Laseranregung der Farbteilchen erzeugen und die Fluoreszenz in den verschiedenen Fragmenten quantitativ erfassen. Die Ergebnisse repräsentieren hinterher die quantitative Expression des
Gens: Das Ausmaß der Fluoreszenz gibt demnach die Menge der zuvor gewonnenen mRNA wieder
und lässt weiterhin gute Rückschlüsse auf die Proteinexpression zu.
2.7.7
Datenanalyse
Die Datenanalyse und Koordinierung der Affymetrixgeräte wie zum Beispiel des Scanners, inkl. Färbung und Auswertung der gescannten Daten erfolgt mit GCOS 1.2 (GeneChip Operating Software)
und dem Data Mining Tool 3.1. Dazu werden zwei zu analysierende Proben, die auf zwei DNAMicroarrays aufgebracht werden, miteinander verglichen, um Veränderungen zu bestimmen und zu
quantifizieren. Die Software dient der Analyse folgender Daten:
-
Spezifikation der experimentellen Daten (Experimentname, Array-Typ usw.)
37
Material und Methoden
-
Scannen der gefärbten Chips
-
Umwandlung der Rohbilddaten in Intensitätsdaten
-
Umwandeln der Intensitätsdaten in Maßzahlen, wie beispielsweise Signal, Detection Call
-
Report über Qualitätskriterien wie Background und und 3'/5' Ratio der Housekeeping-Gene
-
Exportieren der Maßzahlen nach Excel oder ins txt-Format
Eine Exceltabelle liefert die Ergebnisse als Vergleichswerte zweier gescannter Gruppen. Durch eine
Vernetzung des Programms mit unterschiedlichen Datenbanken können bei der Auswertung des
betreffenden Gens Name, Funktion und Similaritätswahrscheinlichkeiten aufgezeigt werden.
Extraktion der Poly-A
- RNA
Zellpool aus
Gewebeproben oder
Zellkulturen
Amplifikation und
Markierung der RNA
Chip-hybridisierung
Oligonukleotid
Auslesen des Fluoreszenzsignals
Chipzelle
Abbildung 5 Prinzip der Chipanalyse nach Affymetrix®Gene Expression Assay im vereinfachten Schema
Gepoolte, markierte und fragmentierte cRNA hybridisiert mit Oligonukleotidsonden auf dem Chip.
Entfernen nicht hybridisierter Nukleotide im Waschvorgang und Auswertung der quantitativen Bindung durch Markieren und Scannen der gebundenene cRNA (Darstellung in Anlehnung an Affymetrix®Gene Expression Assay)
38
Material und Methoden
2.8
Quantitative PCR
Die Genchip-Hybridisierung wird mit dem Querschnitt der Gene, dem RNA-Pool, durchgeführt. Für
die quantitative PCR wird ein spezifisches Gen eines jeden Tieres vorher ausgewählt und einzeln
untersucht, um zu verifizieren, dass die beobachteten Expressionsveränderungen, die im Pool der
Genchiphybridisierung aufgezeigt wurden, auch auf ein einzelnes Tier zutreffen. Außreißer können so
dargestellt werden.
Das genetische Screening durch die Chiphybridisierung fördert eine große Bandbreite hoch- und runterregulierter Gene zutage. Die 2-Step-Real-Time-PCR (Taqman, core facility) wird in unserer Arbeit
für exemplarisch selektierte Gene durchgeführt. Das Prinzip der PCR-Reaktion beruht auf der enzymatischen Amplifizierung eines bestimmten DNA-Abschnittes, der zwischen zwei Startersequenzen,
den so genannten Primern, liegt. Diese markieren den zu vervielfältigenden Genabschnitt. Da wir
nach der Phenolextraktion RNA produziert haben und diese mittels PCR-Reaktion nicht amplifiziert
werden kann, muss diese durch reverse Transkriptase in einem ersten Schritt in cDNA (copy DNA)
umgeschrieben werden. Da RT und PCR separat in zwei Reagenzgefäßen durchgeführt werden,
spricht man von zweistufiger oder 2-Step-RT-PCR.
2.8.1
Durchführung der RT-PCR
Erstellung von cDNA
Zur Erstellung von cDNA benötigt man zuerst folgende Substratzusammensetzung:
∑
x µl
RNA (1µg RNA)
1 µl
Random Hexamers
1 µl
dNTPs
8-x µl
H2O
10 µL
RNA-Mix
Zu diesem RNA-Mix werden 10 µl eines ReverseTranskriptase (RT) -Mixes folgender Zusammensetzung hinzugegeben und eine Stunde bei 50 °C inkubiert:
39
Material und Methoden
∑
2 µl
10x RT-Puffer
4 µl
MgCl2 (25mM)
2 µl
DTT (10mM)
1 µl
RNase out (40U/µL)
1 µl
Superscript III (200 U/µL)
10 µl
RT-Mix
Bei 85° C erfolgt die Denaturierung der RT bei fünfminütiger Inkubationszeit. Anschließend folgt die
Denaturierung der RT durch fünfminütige Inkubation. Zur Zerstörung der zurückgebliebenen RNA
wird im Anschluss ein µl RNaseH hinzugegeben und 20 Minuten bei 37 ° C inkubiert.
2.8.2
Durchführung der PCR
Mit der nun vorhandenen DNA erfolgt die eigentliche PCR, welche im Wesentlichen aus der zyklischen Wiederholung von drei Reaktionsschritten besteht: Bei 95° C erfolgt eine Hitzedenaturierung
des DNA-Doppelstrangs, um die beiden DNA-Stränge voneinander zu trennen (melting) Es folgt bei
52° C ein Hybridisierungsschritt, mit Bindung der beiden Primer an den jeweils komplementären
Strang (annealing). Im letzten Schritt wird der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt mithilfe der hitzestabilen DNA-Polymerase und der im Reaktionsmix vorhandenen Desoxyribonucleotide
bei ca. 72° C selektiv synthetisiert (extension). Zu Reaktionsbeginn nimmt die Zahl der amplifizierten
DNA-Fragmente exponentiell mit der Zykluszahl zu. Eine Abweichung von dem exponentiellen
Wachstum tritt nach ca. 17 Zyklen auf und erreicht nach ca. 35 Zyklen ein Maximum. Ausschlaggebend hierfür ist unter anderem die begrenzte Verfügbarkeit der beteiligten Komponenten. Diese
Amplifizierunsschritte werden mit einem PCR-Cycler durchgeführt.
Durch die Auswahl bestimmter Primer (Tabelle 2) und 35-40-faches Durchlaufen dieser Schritte
kommt es zur Amplifizierung der Ausgangs-DNA.
Material und Methoden
Gen
Il-1-RA
CCL2 /
MCP-1
Hmox-1
ELAM
Il-6
40
Primersequenzen
5´-GAATGTGTTCTTGGGCATCC-3´
5´-GATTCGAAGCTGGTGGTAGG-3`
5´-GGTCTCTGTCACGCTTCTGG-3´
5´-CTGGACCCATTCCTTATTGG-3´
5´-CAGAGTTTCTTCGCCAGAGG-3´
5´-ATGGCATAAATTCCCACTGC-3´
5´-GTACCTCATCCGGTGTCTGG-3´
5´-CTTGTGCACTGCATTCAACC-3´
5´-GATGGATGCTTCCAAACTGG-3´
5´-AGGAGAGCATTGGAAGTTGG-3´
Fragmentlänge (bp)
177
211
169
201
233
Tabelle 2: Genspezifische RT-PCR Primer und deren Länge
Früher wurde zur Detektierung hauptsächlich Ethidiumbromid (EtBr) verwendet (79), heutzutage
scheinen andere interkalierende Farbstoffe ein zum Teil besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis aufzuzeigen und werden bevorzugt benutzt. Wir verwenden das SYBR®-Green I (Molecular Probes,
Portland, Oregon). Dies ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der sich – wie EtBr – unspezifisch in Doppelstrang-DNA einlagert, wodurch es mit fortschreitender PCR-Reaktion zu einem Fluoreszenzanstieg
kommt. Dieser so genannte fluoreszierende Reporterfarbstoff macht es möglich, die Reaktion darzustellen und einen mit der Produktmenge proportionalen Anstieg anzuzeigen. Die Messung erfolgt mit
einem optischen Detektionsmodul, das die ansteigenden Fluoreszenzwerte messen kann.
Der CT-Wert oder Threshold Cycle basiert auf einem bestimmten Fluoreszenz Schwellenwert und
dient der Quantifizierung der PCR. Der CT-Wert ist jener PCR-Zyklus, bei dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Am Anfang der PCR-Reaktion wird nur die
Basis- oder Hintergrundfluoreszenz gemessen, da die Reporterfluoreszenz aufgrund der geringen
Templatekonzentration im Reaktionsgefäß während der ersten PCR-Zyklen normalerweise nicht detektierbar ist. Die Kinetik der PCR-Reaktion, nicht die absolute Menge des PCR-Produktes ist für die
Quantifizierung der DNA-Menge relevant. Der CT-Wert gilt als richtungsweisend, da die ansteigende
Produktmenge zu diesem Zeitpunkt exponentiell ist und es in dieser Phase der PCR-Reaktion keine
limitierenden Faktoren, wie Primer- oder Nukleotidmangel, sowie nachlassende Enzymaktivität gibt.
Gleichzeitig werden in jedem PCR-Lauf bekannte Templatemengen von18s rRNA amplifiziert, sodass
man Templatemenge und CT-Wert korrelieren kann. Ein niedriger CT in der abschließenden Messung signalisiert, dass der exponentielle Anstieg in einer Gruppe, z.B. unserer Hirntodgruppe schnel-
Material und Methoden
41
ler erreicht wurde, als in der Kontrollgruppe. Dies erklärt sich durch eine höhere Ausgangsmenge an
DNA in der Hirntodgruppe, als in der Kontrollgruppe.
Die Gleichung für dieser relativen Messung bildet die ∆∆C(t)- Methode. C (t) ist der schon oben beschriebene CT-Wert, entspricht also der Zyklusnummer, bei der das Thresholdlevel erreicht wird.
Die Formel, die hierbei Verwendung findet, lautet:
∆∆C(t) = ∆C(t) Hirntodgruppe - ∆C(t) Kontrollgruppe
∆C(t) Hirntodgruppe und ∆C(t) Kontrollgruppe lassen sich wie folgt berechnen:
∆C(t) Hirntodgruppe = C(t) Hirntodgruppe - C(t) 18s bzw.
∆C(t) Kontrollgruppe = C(t) Kontrollgruppe - C(t) 18s
Zum Beweis oder Ausschluss eines signifikanten Expressionsunterschiedes zwischen beiden Gruppen, kann mit folgender Formel, nach Standardisierung neu gewonnener Werte der Versuchsgruppen
durch Referenzgene, weitergerechnet werden:
2-∆∆C(t)
Dieser Zahlenwert entspicht der relativen Expressionsveränderung der untersuchten Gruppe zur Referenzgruppe. Als Normwert gilt ein sogenanntes House-keeping-gene, auch Hausgen genannt. Im Vergleich mit den Ergebnissen der Genchipanalyse können sich die Werte zu diesem quantitativ unterscheiden, qualitativ sind sie immer übereinstimmend.
Mit einer Gel-Elektrophorese wird die PCR überprüft. Die PCR-Reaktionsergebnisse werden mit je 4
µl 6x Gel-Ladepuffer vermischt und in die Geltaschen pipettiert, daneben 4 µl des Molekulargewichtsmarkers. Nach einer Stunde der Wanderung bei einer Spannung von 120 V und einer Stromstärke von 100 mA werden die Nukleinsäuren im Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Dokumkentation der Ergebnisse wird photographisch digitalisiert und gespeichert.
2.9
Statistik
Die Darstellung der Daten erfolgt mit Mittelwerten ± SEM, in Normalverteilung. Die Makrohämodynamik wird anhand der gemessenen Kreislaufparamter mit zwei verschiedenen Tests pro Parameter
präsentiert. Die Nullhypothese wird einerseits anhand des Vergleiches gleicher Mittelwerte der Hirntod- und Kontrllgruppe gegen die Alternative signifikant verschiedener Mittelwerte durch den t-Test
kontrolliert. Zum anderen werden Hirntod- und Kontrollgruppe mittels eines einfaktoriellen ANOVATests separat darauf überprüft, ob die Mittelwerte zu den jeweilig aufgenommenen Zeitpunkten mit-
Material und Methoden
42
einander verträglich sind. Als Nullhypthese wird hier ebenfalls angenommen, dass alle Mittelwerte
innerhalb einer Gruppe miteinander verträglich sind. Alle Tests werden bei einem a priori gewählten
Signifikanzniveau von p < 0.05 durchgeführt.
Analog dazu werden die Daten der PCR ausgewertet. Zur optischen Vereinfachung werden diese als
Boxplots dargestellt. Zur Berechnung der Statistik aller Daten, sowie zur Darstellung der Boxplots
wird die Statistik Toolbox von MATLAB® The MathWorks sowie das Program R und SPSS verwendet. Die Darstellung der makrohämodynamischen Parameter erfolgt mit Sigmaplot 9.0.
43
Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1
Makrohämodynamik
Zum Zeitpunkt 0 (Baseline, vor Hirntodinduktion) besteht zwischen den beiden Versuchsgruppen kein
signifikanter Unterschied des mittleren arteriellen Blutdruckes (K-Gruppe 113.2 ± 10.5 mmHg versus
HT-Gruppe 98 ± 2.3 mmHg). Nach Hirntodinduktion präsentiert sich ein signifikanter Anstieg des
mittleren arteriellen Blutdruckes mit einem Maximalwert von 176 ± 14.6 mmHg (* p < 0.05) im Vergleich zu der Baseline der Kontrollgruppe. Nach 60 Minuten war der Unterschied noch signifikant mit
Werten von 120 ± 13.5 mmHg zu 90 ± 7.5 mmHg (* p < 0.05), danach zeigten sich im Verlauf vergleichbare Werte des mittleren arteriellen Blutdruckes zwischen den Gruppen (siehe Abbildung 6).
Auch die Herzfrequenz zeigt zwischen beidne Gruppen ausser bei dem letzten Messpunkt, nach
360 Minuten (p < 0.05), keine Signifikanz.
44
Ergebnisse
*
200
*
*
*
180
HT-Gruppe
MADMAP
[mmHg]
[mmHg]
160
*
K-Gruppe
*
*
140
120
100
80
60
Ka
0
36
0
30
0
24
0
18
0
12
60
th
Fo ete
ga ri m
H rtyk pl.
ir n a
to th.
di
nd
.
1
2
3
4
5
0
Zeitverlauf [min]
Abbildung 6: MAD (MW ± SEM) im Verlauf. Signifikante Unterschiede zeigen sich nur während
der Hirntodinduktion durch Inflation des Forgathykatheters (* p < 0.05).
45
Ergebnisse
400
*
380
Herzfrequenz [1/min]
360
340
320
300
280
HT-Gruppe
K - Gruppe
260
240
220
200
36
0
30
0
24
0
18
0
12
0
60
Ka
th
et
e
Fo rim
ga pl.
rty
k
Hi ath
rn
.
to
di
nd
.
0
Zeitverlauf min]
Abbildung 7: Herzfrequenz (MW ± SEM) im Versuchsverlauf. Nur am Versuchsende (6 h nach
Hirntodinduktion) bestand ein signifikanter Unterschied (* p < 0.05) zwischen Hirntod- und Kontrollgruppe.
46
Ergebnisse
3.2
PH-Wert
Die Untersuchung des pH-Wertes, die beginnend mit der arteriellen Katheterisierung stündlich bestimmt wird, zeigt weder signifikanten Unterschiede in und zwischen den Gruppen. Der Zeitpunkt
Null bezeichnet dabei sowohl bei der Hirntod-, wie auch bei der Kontrollgruppe den Zeitpunkt der
ersten Blutentnahme direkt nach Positionierung des Katheters in die A. carotis.
7,55
K-Gruppe
HT-Gruppe
7,50
pH [-log c(H+)]
7,45
7,40
7,35
7,30
7,25
7,20
0
60
120
180
240
300
360
Zeitverlauf [min]
Abbildung 8: pH (MW ± SEM) im Versuchsverlauf
3.3
pCO2 und pO2
Die Messung von pO2 (Abb.9) und pCO2 (Abb.10) zeigt keine signifikanten Unterschiede (p< 0.05) in
den jeweiligen Gruppen.
47
Ergebnisse
H T -G ruppe
K -G ruppe
300
250
PO2 [mmHg]
200
150
100
50
0
0
60
120
180
240
300
360
Z eitverla uf [m in ]
Abbildung 9: Mittlerer pO2-Wert (MW ± SEM) der Kontrollgruppe und der Hirntodgruppe. Keine
signifikanten Unterschiede.
60
H T-G ruppe
K - G ruppe
pC02 [mmHg]
50
40
30
20
10
0
0
60
120
180
240
300
360
Zeitverlauf [m in]
Abbildung 10: Mittlerer pCO2-Wert (MW ± SEM) der Kontrollgruppe und der Hirntodgruppe.
Keine signifikanten Unterschiede
48
Ergebnisse
3.4
Analytisches Agarosegel der Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNAs werden nach der DNaseI-Verdauung mittels 1 % iger Agarosegele überprüft.
Die analytischen Agarosegele zeigen die beiden erwarteten, charakteristischen, diskreten RNABanden bei 1.9 und 4.5 kb, die die eukaryontische ribosomale 18S und 28S RNA repräsentieren. Das
Auftreten dieser diskreten Banden bestätigt, dass die isolierte RNA intakt ist. Auch das Verhältnis der
Bandenintensitäten 18S zu 28S liegt annähernd im Bereich von 1:1.5-2.5. (Abb. 11) Zusätzliche Banden, die bei kleineren kb-Werten auftreten, sind auf ribosomale 5S RNA und tRNA zurückzuführen.
Die Effektivität des DNaseI-Verdaus wird bestätigt, da bei höheren kb-Werten keine Banden zu sehen
sind, die auf eine noch vorhandene Kontamination mit genomischer DNA hingewiesen hätte.
3.5
RNA-Extraktion und Poolung
Nach dem im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Poolen wird die eluierte RNA photometrisch quantitativ bestimmt. Für die Niere ergibt sich dabei in den verschiedenen Versuchsgruppen
die in Tabelle 3 angegeben Konzentration.
Pool-Nr.
Gruppe
Konzentrationen in µg/µl
1
Hirntodgruppe
0.41
2
Kontrollgruppe
0.47
Tabelle 3: RNA-Konzentration nach Poolung
49
Ergebnisse
Kontrollpuffer
Hirntodgruppe
Shamgruppe
Kontrollgruppe
Abbildung 11: Elektrophorese des RNA-Pools: Zwei Banden zeigen die Intaktheit der gepoolten
RNA an
3.6
Ergebnisse der Chiphybridisierung
Die folgende Tabelle gliedert die im Gruppenvergleich unterschiedlich exprimierten Gene nach ihrer
vermuteten oder gesicherten Funktion auf. Das Expressionsprofil der Nieren hirntoter Ratten zeigt im
Microarray signifikante Unterschiede zu der Kontrollgruppe. Es werden die Gene präsentiert, die
GCOS 1.2 und das Data Mining Tool 3.1 eindeutig zuordnen konnten und die als cut-off point, also
als Mindestwert, ab welchem die Gene als unterschiedlich exprimiert gelten, eine mindestens zweifache Expressionsveränderung der Hirntodgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe aufweisen.
Mit diesem Filter können wir nach 6 Stunden Hirntod im Verhältnis zur Kontrollgruppe 151 Gene
hoch- und herunterreguliert darstellen. Aus dieser Gesamtmenge sind 88 relevante Gene nachfolgend
in ihrer Funktion aufgegliedert dargestellt. Hauptsächliche Gruppen dieser identifizierten Transkripte
stellen die der Chemokine/Cytokine, der Zelladhäsion, Ionenkanäle und Proteasen dar, aber auch Gene der Transkription und des Stoffwechsels zeigen bemerkenswerte Veränderungen. Interessanterweise werden auch protektive Gene der Abwehr und Reparatur in ihrer Expression hochreguliert, was
den induzierten Zellschutz des Körpers kennzeichnet. Die Kategorisierung der Gene nach bekannter
oder mutmaßlicher biologischer Funktion in verschiedene Gruppen erfolgt mit Hilfe von einer Recherche in Gen- und Proteindatenbanken wie Pubmed oder Expasy (Expert Protein Analysis System).
50
Ergebnisse
Gruppe
Abkürzung
Cyp1b1
PDK4
PsPLA1
HMGCS2
Stoffwechsel
Cytokine,
Chemokine
Beschreibung/Name
Cytochrome P450, family 1, subfamily b,
polypeptide 1
Pyruvate dehydrogenase kinase
Isoenzyme 4
Phosphatidylserine-specificPhospholipase A 1
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym
A-Synthase 2
Expressionsveränderung
+3.69
+3.38
+3.49
+2.88
CES1
Carboxylesterase 1
+2.64
BHMT
Betaine-homocysteine methyltransferase
+2.24
PPM2c
Protein phosphatase 2C, magnesiumdependent, catalytic subunit
+2.24
CA3
Carbonic anhydrase 3
-3.24
A4GALT
Alpha 1,4-galactosyltransferase
-3.31
IL-6
Interleukin 6
+22.45
IL-1R2
Interleukin 1 receptor, type II
+135.5
S100a8
S100 calcium binding protein A8
(Calgranulin A)
+48.98
CCL2 /
MCP-1
Chemokine (C-C motif ) ligand 2
+5.75
S100a9
Calcium binding protein A9
(Calgranulin B)
+25.57
CXCL-1
Chemokine (C-X-C motif ) ligand 1
+25.55
IL-1b
Interleukin 1 beta
+10.91
CCL20
Chemokine (C-C motif) ligand 20
+12.68
IL-1RA
Interleukin 1 receptor antagonist
+4.52
CCL4
Small inducible cytokine A4
+4.72
CCL3
Chemokine (C-C motif) ligand 3
+5.79
CXCL2
Chemokine (C-X-C motif) ligand 2
+7.29
MIP2
Macrophage inflammatory protein-2
+2.1
IL-6st
Interleukin 6 signal transducer
+4.02
51
Ergebnisse
Gruppe
Abkürzung
Beschreibung/Name
Expressionsveränderung
Immediate
early
response
Gene
CSRP3
Cysteine-rich protein 3
+19.88
IER5
Immediate early response 5
+2.41
KIM-1
Kidney injury molecule 1
+9.45
ICAM1
Intercellular adhesion molecule 1
+4.4
ELAM-1
Selectin, endothelial cell
+188.48
VCAM-11
Vascular cell adhesion molecule 1
+3.37
GLYCAM-1
Glycosylation dependent cell adhesion
molecule 1
+4.68
SPIN2c
Serine protease inhibitor
+23.56
TIMP1
Tissue inhibitor of metalloproteinase 1
+7.4
ADAMTS-1
Adisintegrin-like and metalloprotease
+4.68
SLPI
Secretory leukocyte peptidase inhibitor
+3.16
Zelladhäsion
Proteasen/
-inhibitoren
52
Ergebnisse
Gruppe
Transkriptionsfaktoren
Hormone /
Wachtsumsfaktoren
Abkürzung
Beschreibung/Name
Expressionsveränderung
NFIL3
Nuclear factor, interleukin 3 regulated
+3.09
ATF3
Activating transcription factor 3
+2.95
IRF1
Interferon regulatory factor 1
+2.55
IFRD1
Interferon-related developmental
regulator 1
+2.44
STAT3
Signal transducer and activator of
transcription 3
+2.27
CEBPD
CCAAT/enhancer binding protein
delta
+2.18
DbP
D site albumin promoter binding
protein
-3.96
NR4A1
Nuclear receptor subfamily 4 group A,
member 1
-2.65
NR1D1
Nuclear receptor subfamily 1, group
D, member 1
-3.19
Egr3
Early growth response gene 3
+2.8
Znf354a
Zinc finger protein 354A
-3.36
TGFb1i4
Transforming growth factor beta
stimulated clone 22
+3.4
GDF15
Growth differentiation factor 15
+2.59
Nrg1
Neuroregulin 1n
+4.84
DTR
Diphtheria toxin receptor heparinbinding EGF-like growth factor
+3.24
IGFBP1
Insulin-like growth factor binding
protein 1
+5.4
53
Ergebnisse
Gruppe
Wachstums /
Zellzyklus
Abwehr /
Reparatur
Apoptose
Abkürzung
Beschreibung/Name
Expressionsveränderung
PRL 1
Tyrosine phosphatase
+2.2
BTG 2
B-cell translocation gene 2, antiproliferive
+3.9
BRFl
Butyrate response factor 1
+2.1
GADD45g
GADD45gamma
+2.3
SOCS-3
Suppressor of cytokine signaling-3
+2.5
Clu
Clusterin
+4.81
HSP70
Heat shock protein 70
+2.9
PAIl
Plasminogen activator inhibitor
+2.8
HO-1
Hemeoxygenase 1
+30.5
GSTA2
Glutathione-S-transferase, alpha type2
-2.15
Bcl2a1
B-cell leukemia/lymphoma 2 related
protein A1
+4.43
Birc3
Inhibitor of apoptosis protein 1
+3.85
Tnfrsf1a
Tumor necrosis factor receptor
superfamily member 1a
+2.86
Aqp2
Aquaporin2
-2.0
Ttr
Tranthyretin
-4.28
Alb
Albumin
-24.48
Lcn2
Lipocalin 2
+8.67
Transporter
54
Ergebnisse
Gruppe
Blut /
Gerinnung
Abkürzung
Expressionsveränderung
Fgb
Fibrinogen, B beta polypeptide
+15.68
TFPI2
Tissue factor pathway inhibitor 2
+11.72
Fgg
Fgg -fibrinogen, gamma polypeptide
+7.07
Fgl2
Fibrinogen-like 2
+6.86
Kng1
Kininogen 1
+6.46
F3
Coagulation factor 3
+3.08
F2RL1
Coagulation factor II (thrombin
receptor-like 1)
+2.58
HRG
Histidine-rich glycoprotein
+2.06
Fxyd4
FXYD domain-containing ion
transport regulator 4
-2.09
Fxyd6
FXYD domain-containing ion
transport regulator 6
-2.15
SNFlk
SNF-like-Kinase
PIM3
Serin/Threonin-protein Kinase
PAK1
P21 (CDKN1A)-aktivierte Kinase 1
NEK 6
Pik 3r1
NIMA (never in mitosis gene)-related
expressed kinase 6
Mitogen-aktivierte ProteinKinase 1
Epidermal growth factor
Rezeptor
Phosphatidylinositol 3-Kinase
Sphk 1
Sphingosinkinase 1
EFNA 1
Ephrin A1
Ionenkanäle
Kinasen
Beschreibung/Name
MAP 3kl
EGFR
-2.2
-2.21
+2.12
+2.12
+2.57
+2.91
+3.18
+3.6
+3.79
55
Ergebnisse
Gruppe
Abkürzung
Beschreibung/Name
Expressionsveränderung
Andere
LOX
Lysiloxydase
+2.54
CaSR
Calcium-sensing-Rezeptor
-2.53
Tabelle 4: Ergebnisse der Chiphybridisierung, gruppenspezifische Gliederung der differentiell
regulierten Gene
3.7
Bestätigung der Genchip-Daten mit Real – Time - PCR
Zur Bestätigung der durch die Chip-Hybridisierung gewonnen Daten mit der extrahierten RNA wird
eine quantitative 2-step RT-PCR durchgeführt.
Exemplarisch werden drei Gene aus verschiedenen Funktionsgruppen ausgewählt, die im Einzelnen
und im Vergleich zur Kontrollgruppe in der Genchipanalyse hochreguliert sind.
Aus der Gruppe der Zytokine/ Chemokine wählen wir das proinflammatorische Gen MCP-1 / CCL2.
Aus der Gruppe der protektiven Gene mit Funktionen in der Abwehr und Reparatur wird die Hämoxygenase (HO-1) ausgewählt. Die Gruppe der Zelladhäsion wird durch das Selektin (ELAM-1) repräsentiert.
Die gemessenen Werte der mRNA-Expression der Einzelgene wurden in Relation zu den Werten des
Housekeeping-Gens gesetzt. Die mediane mRNA Expression der untersuchten Gene (HO-1, ELAM
und CCL2) ist in der Hirntodgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Im Ergebnis
zeigt sich für alle drei Einzelgene eine statistisch signifikante mRNA Expressionserhöhung (p<0.05,
Wilcoxon Test) der Hirntodgruppe gegenüber der Kontrollgruppe (Abbildung 12). Somit kann qualitativ mit zwei unterschiedlichen Techniken, Chipanalyse und RT-PCR, eine Hochregulierung dieser
Gene nachgewiesen werden.
56
Ergebnisse
P < 0.05
P = 0.043
P < 0.05
P = 0.043
P < 0.05
P = 0.042
Abbildung 12: Boxplots der mRNA Expression der drei Einzelgene HO-1, ELAM und CCL2 im
Vergleich zwischen Hirntod- (HT) und Kontrollgruppe (K)
57
Diskussion
4.
Diskussion
4.1
4.1.1
Studienaufbau
Relevanz der Studie
Die Gruppe der hirntoten Spender stellt weltweit die Hauptquelle für Spendernieren in der Transplantationsmedizin dar. Im Fokus unserer Untersuchung stehen die Auswirkungen des Hirntodes auf den
Organspender als primär antigenunabhängiger Faktor und seine Einflüsse auf die spätere Transplantatfunktion.
Transplantatüberlebensraten von lebendgespendeten Nieren standen im Langzeitoutcome immer über
denen totgespendeter Organe, egal wie hoch die Übereinstimmung der HLA waren. Die von Ehepartnern gespendeten Nieren konnten in Studienresultaten als sehr ähnlich zu denen eingeordnet werden,
die von Familienmitgliedern mit nur einem Haplotyp-Mismatch aufgefunden werden (31, 84, 194).
Dies zeigt, dass die Transplantatprognose keiner rein antigenabhängigen Beeinflussung unterliegt. Es
ist also von Nöten, auch die nicht-antigenabhängige Ebene, in diesem Fall die komplexen Auswirkungen des Hirntods, zu analysieren und zu verstehen, um in der Zukunft die Ergebnisse der Transplantatfunktion von postmortalen Spendern weiter zu verbessern.
4.1.2
Versuchsmodell des Hirntods
In unserer Arbeit benutzten wir das von Pratschke et al. etablierte Rattenmodell, das die Durchführung einer graduellen, normotensiven Hirntodinduktion erlaubt (157).
Dieses Vorgehen vermeidet im Gegensatz zu explosiven Hirntodmodellen ausgedehnte hypotensive
Phasen und schließt somit pathologische Reaktionskaskaden basierend auf systemischer Hypotension
weitestgehend aus. Tiermodelle mit explosiver Hirntodinduktion induzieren derart starke Kreislaufschwankungen mit ausgeprägten hypotensiven Phasen, dass die intensive Behandlung mit kreislaufstabilisierenden Medikamenten, wie z.B. Katecholaminen, benötigt wird, die die Ergebnisse der hirntodinduzierten Veränderungen mitbeeinflussen könnten (204). Studien zeigen, dass posttransplantative Folgeerscheinungen, wie z.B. die Morphologie des Transplantats, schon je nach Ätiologie des
Hirntodes deutliche Unterschiede zeigen (176). In unserem Ansatz ist eine Berücksichtigung demographischer Faktoren nicht möglich. In der Praxis sind Resultate von älteren Spendern, die an intrazerebraler Blutung oder thrombotischem Schlaganfall gestorben sind, sicher schlechter, als Organe von
jungen Spendern, die an akutem Schädel-Hirn-Trauma gestorben sind (154). Unser Set-up repräsentiert also eher den optimalen, gesunden Spender.
Diskussion
4.1.3
58
Zeitlicher Rahmen des Versuches
Um dem Körper eine ausreichende Zeit zur Einstellung auf die Narkose und den Hirntodstatus zu
gewährleisten, musste eine Aufrechterhaltung des Kreislaufs und der Atmung über mehrere Stunden
gewährleistet sein. Nur so kann die Adaption auf Ebene der Gene sichergestellt werden. Wir wählten
in unserer Arbeit mit sechs Stunden Hirntod einen Zeitraum, der sich in vorhergehenden Studien als
sinnvoll herausgestellt hatte, und auch von anderen Autoren als adäquat angesehen wird (76, 157,
172, 202, 218).
4.1.4
Auschluß von Einflußfaktoren auf das Ausmaß des Hirntods
Indem die Organe vor der Explantation in etwa analog zur humanen Multiorganentnahme mit NaClLösung gespült wurden, konnte die klinische Situation der Nierentransplantation simuliert werden, da
hier Transplantate vor der Ischämie mit einer Konservierungslösung perfundiert werden.
Gruppen
Mithilfe der Kontrollgruppe konnten wir den Anteil an Genexpressionsveränderungen herausfiltern,
der durch die Faktoren Anästhesie, Präparation, Operationsdauer und Explantation entstanden ist.
Sichtbar wird die differentielle Genexpression, die nicht durch die Induktion des Hirntods ausgelöst
wurde, anhand der Daten der Kontrollgruppe. Änderungen auf Geneebene dieser Gruppe basieren
primär auf dem Stress, dem die Nieren durch die Operation, die Versuchsdauer und die Präparation
am Organ selbst ohne den Faktor „Hirntod“ ausgesetzt sind.
Untersuchung der Genexpression
Zur Untersuchung der Genexpression auf RNA-Ebene versucht man heutzutage, Alternativen zu der
„Ein Gen-Ein Experiment“-Basis zu finden. Um die differentielle Genexpression in unserem Fall in
der Niere von hirntoten Ratten versus Kontrollen zu analysieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit die
Affymetrix-Microarray-Technologie eingesetzt. Der Affymetrix-Chip ermöglicht die Untersuchung
von bis zu 12000 verschiedenen Genen mit Kontrollen auf einer ca. 1.5 cm2 großen Fläche und somit
die Erfassung der mRNAs tausender Gene eines Organismus für das ausgewählte Gewebe. Es können
eine Vielzahl an Transkripten einer experimentellen oder einer klinischen Probe nachgewiesen werden, und damit auch Gentranskripte, die der Experimentator a priori noch nicht kennt, bzw. erwartet.
Die Signifikanz unserer Arbeit liegt damit in einem relativ kompletten Screening der veränderten Genexpression nach Hirntodinduktion und der Aufdeckung herauf- oder herunterregulierter Gene, bzw.
bisher unerkannter Gengruppen in der Spenderniere.
59
Diskussion
4.2
Diskussion der einzelnen Komponenten
Hirntodgruppe
Der massive Hirnschaden ist mit multiplen hämodynamischen, neurohormonalen und morphologischen Abweichungen assoziiert (96, 187, 189). Die initiale hypertensive Krise und der „autonomic
storm“ kann über einen sekundären Anstieg des Sauerstoffverbrauchs und durch stärkste periphere
Vasokonstriktion zu Ischämie, Endothelschaden und verringerter Mikrozirkulation führen. Vorangehende Studien begründen den Ursprung dieser Reaktionsabfolgen auf molekulargenetischer Ebene.
Immunaktivierung
Der Status des Hirntodes eines Spenders beeinflusst die posttransplantive Organfunktion und das Organüberleben bereits vor der Explantation und stellt somit einen wesentlichen primär nichtimmunogenen Risikofaktor dar. Klinische und experimentelle Studien weisen immer wieder auf die
Bedeutung von proinflammatorischen Cytokinen, Chemokinen und Adhäsionsmolekülen in Zusammenhang mit einer Verschlechterung der Organqualität in Totspendern als sogenannte „Entzündungsantwort“ hin. Sie sind demnach mitentscheidend im Ablauf dieser inflammatorischen Kaskade. Diese
Auswirkungen werden durch die Beobachtung unterstützt, dass im Transplantationsexperiment am
Schwein selbst kurzzeitige hohe iatrogene Verabreichungen von Katecholaminen, entsprechend dem
„autonomic storm“ des Hirntodes, zu erhöhten Zytokinkonzentrationen, schlechteren initialen Organfunktionen und reduzierten Überlebensraten führen. (147, 153)
Zytokine werden im Prozeß des Hirntodes unter anderem von Astrozyten und Mikroglia des verletzten
Hirngewebes sezerniert und gelangen dann über die im Hirntod geschädigte Blut-Hirn-Schranke in
das periphere Blut, können aber auch von immunkompetenten Zellen des zirkulierenden Blutes selber,
als auch von geschädigtem peripheren Gewebe freigesetzt werden (213). In den vergangenen Jahren
stand der inflammatorische Status des Transplantats im Fokus zahlreicher Forschungen. Adhäsionsmoleküle und Zytokine finden sich in Spendernieren von Ratten (96) und Menschen (58, 92) immens
hochreguliert.
Unsere Ergebnisse bestätigen diese Thesen und zeigen das starke Ausmaß dieser Aktivierung anhand
einer großen Gruppe von Genen, wie den Adhäsionsmolekülen (E-Selektine x 188, GLYCAM-1 x 4,
u.a.), Chemokinen (CXCL-1 x 26, CCL20 x 13, MCP-1 x 6 u.a.), Zytokinen (IL-6 x 22, IL-1beta x 11,
IL1-R2 x 135 u.a.) und anderen neutrophilen oder monozytären Lockstoffen, welche in der akuten
Phase der inflammatorischen Antwort und im endothelialen Schaden eine Rolle spielen (97, 158).
Unsere Daten zeigen eine signifikante Hochregulation von Genen unterschiedlicher Funktionsgruppen, die im Folgenden näher beschrieben werden sollen.
Diskussion
4.2.1
60
Zytokine
In Studien über Zytokinexpressionen nach postmortaler Nierentransplantation kann neben der deutlichen Steigerung von Serumkonzentrationen der makrophagen-assoziierten Produkte (Il-1, IL-6 und
TNF – alpha) (21), auch ein Anstieg der von Th1-Zellen ausgeschütteten Faktoren (IL-2 und IFNgamma) und der mRNA von Makrophagen-Inhibitor-Protein-1 in der Niere nachgewiesen werden. Die
Erhöhung zeigt sich im Vergleich mit Kontrollgruppen signifikant verstärkt (156, 172, 212), was die
erhöhte inflammatorische Kaskade durch den Status des Hirntodes kennzeichnet.
Korrelierend mit der quantitativen Steigerung dieser Zytokinkonzentrationen kann in NierenTransplantationsmodellen eine deutliche funktionelle und morphologische Verschlechterung der Organe gezeigt werden (13). In anderen Studien zeigen die lebendgespendeten Nieren der Kontrollgruppe eine deutlich niedrigere Erhöhung der Zytokin-mRNA-Expression im Vergleich zu den totgespendeten Nieren (96, 189).
Il-6
In unserer Arbeit zeigte sich Interleukin-6 im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich hochreguliert (x
22.4) und in der qualititativen PCR bestätigt. Dies korreliert mit vorhergehenden Arbeiten (155, 172).
Der Hirntod geht mit ausgedehnter kortikaler Nekrose einher. In diesen geschädigten Arealen stimulieren Zelllyse und weitere Entzündungsprozesse die eingewanderten Monozyten und Makrophagen
zur Ausschüttung verschiedener Zytokine. Interleukin-6 stellt einen der wichtigsten Vertreter
proinflammatorischer Zytokine dar. Es wird von praktisch jedem verletzten Gewebe gebildet, z.B. von
Endothelium, Keratinozyten, Skelettmuskelzellen, Neuronen, Mikroglia und Astrozyten (7). Das
Ausmaß der Gehirnläsion korreliert mit dem Anstieg dieser Produkte, deren Konzentration auch im
peripheren Blut ansteigt und wiederum periphere Organschäden durch Verstärkung der endogenen
Entzündungskaskade verursacht (7, 51, 210, 220). Man kann die zirkulierenden Blutkonzentration von
Il-6 insofern als Marker für Hirnnekrose und potentiellen prognostischen Parameter für die spätere
Transplantatfunktion anerkennen (120).
Hancock et al. zeigten, dass in Nieren hirntoter Spender eine beständige intraglomeruläre Expression
von Il-6 vorherrschte, dessen mitogener Effekt für mesangiale Zellen in vitro nachgewiesen ist. Il-6
gilt somit als Mediator für mesangiale Expansion, fortschreitenden glomerulären Untergang und Glomerulosklerose bei chronischer Abstoßung einzuschätzen ist (71). Die Hochregulierung von Il-6 kann
somit eine schlechtere Nierentransplantatfunktion im Empfänger nach Hirntodspende bedeuten, aufgrund einer erhöhten bereits präexplantativen Entzündungsantwort im Transplantat. Il-6 führt zu einer
vermehrten Einwanderung immunaktiver Zellen in die peripheren Organe, in unserer Arbeit die Niere,
und somit zu chronischen Entzündungszuständen mit strukturellen Umwandlungen und verschlechterter Funktion.
Diskussion
61
Il-1RA
Il-1RA zeigte in unserer Arbeit in den Nieren hirntoter Ratten im Vergleich zu der Kontrollgruppe
vierfach erhöht.
Il-1 aktiviert B- und T-Zellen, amplifiziert Fieberreaktionen und triggert akute-Phase-Reaktionen peripherer Organe. Diese Reaktionen werden von Il-1-RA antagonisiert. Die Organe werden von endogener Seite vor diesen proinflammatorischen Kaskaden geschützt. Vorangegangene Studien zeigen,
dass Il-1RA, der gegenläufige Ligand zu den immunogenen Aktivatoren IL1 alpha und beta, in wesentlich größeren Mengen bei posttransplantativ abstoßungsfreien Nieren gefunden wurde, als bei
geschädigten, was seine anti-inflammatorische Wirkung demonstriert (111). Es existieren unterschiedliche Anzahlen an Tandem-repeat –Polymorphismen (VNTR) am Il-1-RA-gen. Bei manchen ist eine
erhöhte IL-1-RA-Expression die Folge. Hier fallen akute Graft-versus-host-diseases (GvHD) häufig
milder aus, als bei Kontrollen (114).
Eine Studie von Suzuki et al bewies eine IL1-β induzierte erhöhte Apoptose am Herzen mit vermehrten Nekrosen von Kardiomyozyten und akuter Entzündungsreaktion. Eine induzierte Il-1-RA Überexpression konnte dieses Ausmaß verringern und erbrachte bessere Resultate (186). Eine Behandlung
des Donors nach Hirntod mit rekombinantem Il-1RA, oder die Perfusion des Donororgans sofort nach
Entnahme mit Il-1-RA blockiert die Aktivität von Il-1. Diese Vorbehandlung war in der Lage, bestimmte inflammatorische Il-1 getriggerte Kaskaden und die Hochregulation von MHC-Komplexen
im Spender-gewebe zu reduzieren und später verringerte Abstoßungskomplikationen zu verringern.
(186).
Eine Studie von Endo zeigte im Tierexperiment, dass bei Lebertransplantationen von hirntoten Ratten
versus lebenden Ratten anfangs deutliche erhöhte Il-1RA-Konzentrationen in der Gruppe des Hirntodes bestanden, die nach 24 Stunden unter die Konzentration der Lebendspender-Ratten fielen.
Eine Erklärung ist die primäre Induktion des protektiven Genes durch den „Stressfaktor“ Hirntod mit
nachfolgender Erschöpfung der Proteintranslation und somit unzureichenden Serumleveln nach circa
24 Stunden (48).
Diese Ergebnisse bestätigen, dass einem besseren posttransplantativen Resultat eine schwächere immunologische Antwort vorausgeht.
Calgranuline
Eine weitere Bestätigung vorangegangener Arbeiten ist die Hochregulation von Genen in der Niere,
die für Calgranulin A (S100A8) und Calgranulin B (S100A9) kodieren (97, 172). Beide Calgranuline,
auch bekannt als Myeloid-related-Proteins (MRP8, MRP14) gehören zu der Familie kalziumbindender Proteine, einer neuen Gruppe proinflammatorischer Zytokine, die von Phagozyten ausgeschüttet wird (75).
Diskussion
62
In unserer Arbeit zeigen sich hochregulierte Expressionswerte von x 49 für Calgranulin A (MRP8)
und x 26 für Calgranulin B (MRP14).
Calgranuline wirken proinflammatorisch, indem sie an Zelloberflächen kummulieren und durch Interaktionen mit karboxylierten Glykanen die Bindung von Phagozyten auf dem Gefäßendothel vereinfachen (14, 26). Ryckmann et al. sehen die vordergründige Bedeutung der Calgranuline in der
Neutrophilen-Migration und der L-Selektin-Ausschüttung (166).
Immunhistochemische Analysen menschlicher Nierenbiopsien mit unterschiedlichen Formen von
Nephritiden weisen auf die Korrelation zwischen der Expression von MRP8/14-Komplexen und der
Schwere des inflammatorischen Prozesses hin (57). Burkhardt et al. bestimmten Serumkonzentrationen von MRP8/14-Komplexen nach Nierentransplantation. Sie setzten die Werte in Korrelation zu
Serumkreatinin-Leveln und Nierenbiopsien. Es zeigten sich stark erhöhte MRP8/14-Konzentrationen
in Fällen der akuten Nierenabstoßung und dies im Durchschnitt 5 Tage vor Beginn der klinischen
Abstoßungssymptomatik mit hoher Spezifität und Sensitivität. Dies beweist MRP8 und 14 als funktionstüchtige frühe Parameter im Monitoring dieses unwünschenswerten Prozesses (27).
Die Stellung von Calgranulinen in Fällen vaskulärer oder traumatischer Hirnschädigung wurde ebenfalls vielfach untersucht. Studien zeigten eine Korrelation des Konzentrationsanstieges von Calgranulinen im Serum zu der Intensität der Hirnschädigung (42, 200). Weiter ansteigende Serumwerte konnten in den Patienten nachgewiesen werden, die später Hirntod erleiden sollten. Dies prädestiniert
Calgranuline als Prädiktor und Parameter für das Ausmaß der Schädigung und die frühe Diagnose des
Hirntodes (160).
Diskussion
4.2.2
63
Chemokine
Vertreter der Gruppe der Chemokine, z.B. CxCl1- (x 26)- und CxCl-2 (x 7), Ccl3 (x 6) und MCP1
(x 6), zeigten sich in unseren Daten gegenüber der Kontrollgruppe unterschiedlich stark erhöht.
Funktionellen und morphologischen Veränderungen in der Niere liegen unter anderem einer Aktivierung der Makrophagen zugrunde. Ihre Rekrutierung und Einwanderung in entzündliches Gewebe
scheinen vor allem von C-C-Chemokinen abhängig zu sein.
C-C-Chemokine sind in gesunden Kontrollnieren nicht detektierbar, zeigen aber im Falle einer Glomerulonephritis eine starke Präsenz (100). Der entzündliche Prozess im Falle einer Abstoßung präsentiert sich mit einer Makrophagen- und Leukozyteninfiltration, Mesangiumproliferation und Gewebsfibrose, was unter anderem durch Chemokine gesteuert wird. Die Arbeitsgruppe um Liu untersuchte
die glomeruläre Expression von C-C-Chemokinen in verschiedenen Formen von Glomerulonephritiden. Hochexprimiertes MCP-1, ein wichtiger Vertreter der C-C-Chemokine, das an vier Chemokinrezeptoren gleichzeitig koppeln kann, korreliert demnach mit einem verstärkten Entzündungsprozess
und demzufolge mit einer schlechteren Transplantatfunktion und –prognose (106).
Die Arbeitsgruppe von Notohamiprodjo zeigte, daß die systemische Behandlung mit dem ChemokinAntagonisten Met-RANTES eine direkte Suppression des akuten Schadens transplantierter Nieren
durch die Blockade der Entzündungszellinfiltration erreicht werden kann. Durch präventive Suppression der MCP-1/ CCL 2-Funktion konnte eine Verbesserung der Posttransplantergebnisse erzielt werden (129).
4.2.3
Adhäsionsmoleküle
Die zentrale Schädigung des Hirntodes führt neben einer massiven Veränderung der Makrohämodynamik und Ausschüttung von Hormonen und verschiedenen Mediatoren zu einer reaktiven inflammatorischen Kaskade, die unter anderem die erhöhte De-Novo-Synthese der Adhäsionsmoleküle beinhaltet. Die Adhäsionsmoleküle spielen eine zentrale Rolle in der Modulation des Entzündungsstatus des
Transplantats (182). Sie sind oberflächliche Glykoproteine und interagieren mit inflammatorischen
und proinflammatorischen Zellen, um deren Rekrutierung und Invasion in das Spenderorgan zu fördern. Studien zeigten bereits, dass die Expression von Selektinen, wichtige Vertreter der Adhäsionsmoleküle, bei hirntoten Spendernieren, im Vergleich zu lebendgespendeten Nieren, die eine deutlich
geringere Adhäsionsmolekülexpression und Leukozyteninfiltration aufweisen, bereits vor der Explantatation deutlich erhöht ist (92, 93).
Die Ergebnisse unserer Arbeit zeigen eine vierfach erhöhte Expression sowohl von V-CAM, I-CAM1, als auch von E-Selektin (ELAM-1, x 188). Da wir ein Gesamthomogenat der Niere verwendet ha-
Diskussion
64
ben, können wir in unserer Studie nicht die Expression in unterschiedlichen anatomischen und funktionellen Kompartimente der Niere unterscheiden. Bestätigt wurde unsere Untersuchung mittels RTPCR von E-Selektin (ELAM-1), einem Repräsentanten der Gruppe der Adhäsionsmoleküle. Eine signifikante Hochregulation in der Hirntodgruppe konnte nachgewiesen werden (p<0.05).
Vorausgehend untersuchten bereits unterschiedliche Arbeitsgruppen die Expression von ICAM-1,
VCAM-1 oder E-Selektin sowohl in Kadavernieren von Ratten, als auch an menschlichen Spenderbiopsien.
Im Tierversuch zeigten Skrabal et al eine signifikante Hochregulation von ICAM-1-mRNA in den
Nieren hirntoter Ratten bereits vier bis sechs Stunden nach Hirntodinduktion (179). Yoshida et al.
bestätigten im Tierversuch bei postmortal transplantierter Nieren von Ratten eine in erster Linie vermehrte VCAM-1-Expression auf den Endothelien der Glomeruli, wobei ICAM-1 auch in den Vasae
afferentes und efferentes gefunden werden konnte (204). Die De-novo-Expression der adhäsiven Moleküle in renalen Gefässen und den Glomeruli erweist sich als diagnostischer Parameter für die Intensität inflammatorischer Reaktionen nach Transplantationen von Kadavernieren. Sie reflektieren die
Schwere des strukturellen Schadens durch die entzündlichen Vorgänge in der Niere, die akute tubuläre Nekrose und chronische Nephropathien (72).
Ähnliche Untersuchungen wurden auch in menschlichen Spenderbiopsien bestätigt:
Koo et al. demonstrierten in prätransplantativen renalen Proben von hirntoten menschlichen Spendern
eine Hochregulation von ICAM-1 und VCAM-1 auf den proximalen Tubuli, bzw. von E-Selektin in
den intertubulären Kapillaren (92, 127). In einer immunhistochemischen Analyse von renalen Glomeruli und Interstitium vor der Explantation konnte in den Nieren hirntoter Patienten ein erhöhtes Level
an E-Selektin, sowie eine entsprechend starke Infiltration inflammatorischer Zellen aufgewiesen werden. Diese Resultate wurden mit denen lebendgespendeter Nierentransplantationen verglichen. In den
Ergebnissen zeigten sich 53% der Kadavernieren mit Leukozyten infiltriert bei hohen Leveln an ESelektin, während sich die lebendgespendeten Nieren nur zu 9% entzündlich infiltriert und mit hohen
E-Selektin-Leveln zeigten. Die Werte korrelierten mit den späteren Funktionsraten der Nieren, die bei
den lebendgespendeten Nieren deutlich über denen der totgespendeten lagen (92, 93).
Gasser et al. untersuchten den negativen Einfluß der Selektine auf spätere Transplantatfunktionen in
der Niere, indem die frühen entzündlich-adhäsiven Vorgänge durch einen löslichen rekombinanten Pselektin Glykoliganden unterdrückt wurden. Das Resultat bot deutlich bessere funktionelle und morphologische Ergebnisse, als unbehandelte hirntote Spenderorgane von Versuchsratten. Eine Behandlung des Spenders mit dem Liganden noch vor der Organentnahme bewirkte eine kompetitive Bindung der Selektinrezeptoren und somit eine Unterbrechung der negativen Kaskade posttransplantativ
(61).
Diskussion
65
Bemerkenswert im Zusammenhang der Adhäsionsmoleküle scheint ebenfalls die Hochregulation eines noch nicht vollständig erforschten Genes, dem Kidney-injury-molecule-1 (KIM-1), das für das
Typ-1 transmembranale Glykoprotein kodiert (172). KIM-1 ist in der gesunden Niere nicht detektierbar, wird aber auf dedifferenzierten proximalen Tubuluszellen, die eine Regeneration nach toxischem
oder ischämischem Schaden durchlaufen, stark erhöht exprimiert (14, 83, 85). Die Expression von
KIM-1 korreliert mit der Ausscheidung von KIM-1 im Urin (uKIM-1) und zeigt sich mit progredienter renaler Fibrose und Entzündung des Organes assoziiert.
In unserer Arbeit zeigte sich eine Hochregulation des Genes der hirntoten Gruppe im Vergleich zur
Kontrollgruppe (x 9.5).
Van Timmeren et al. erklären KIM-1 als möglichen non-invasiven Biomarker nephrologischer Erkrankungen und signifikanter Parameter zur Einschätzung von Transplantatverlust nach Nierentransplantation.
4.2.4
Transkriptionsfaktoren
Regulatorische Vorgänge in Zellen müssen teilweise sehr schnell geschehen. Hierzu zählen zum Beispiel Vorgänge der Feinregulation des Zellstoffwechsels, welche durch die prompte Aktivierung oder
Deaktivierung von Proteinen oder Enzymen gesteuert wird.
Diesbezüglich wurde in letzter Zeit vermehrt die wichtige Rolle von Transkriptionsfaktoren in den
Vordergrund gerückt. Ein Transkriptionsfaktor ist molekularbiologisch ein Protein, das für die Initiierung der RNA-Polymerase bei der Transkription von Bedeutung ist. Spezifische Transkriptionsfaktoren werden durch Rezeptor-vermittelte Proteinkinasen aktiviert und binden an den DNA-Abschnitt,
dessen Gen transkribiert werden soll.
Schuurs et al. zeigten diese Transkriptionsfaktoren als wesentliche Weichensteller für die nachfolgenden unterschiedlichen Expressionsmuster anderer Effektoren. Ein Großteil dieser Transkriptionsfaktoren gehört zu den sogenannten frühen Transkriptionsfaktoren, oder „immediate early genes“ (IEGs).
IEGs antworten via Signaltranduktionswege auf extrazelluläre Stimuli, wie z.B. Hormone oder Streß,
nach denen ihre Expression rapide induziert wird (172).
Unsere Ergebnisse bestätigen diese Daten. Wir können in unserer Arbeit ein verändertes Expressionsmuster der Transkriptionsfaktoren zeigen (x 3 Atf3, x 3 Nfil3, x 2 Stat3, x 3 Irf1).
Der aktivierende Transkriptionsfaktor-3 (ATF-3), zeigte in vorangegangenen Studien eine Korrelation
zu Hirnischämie. Das Expressionsprofil von ATF-3 nach exogen induzierter Hirnischämie am Rattenmodell zeigte sich sofort, aber auch nachfolgend signifikant zur Kontrollgruppe erhöht. Betroffene
Diskussion
66
Areale des Gehirns zeigten nach Schädigung vermehrte Expression von ATF-3, was seine Funktion
als Marker für Neuronenschädigung aufzeigen kann (137, 172). Ebenso zeigt sich ATF-3 als Induktor
der erhöhten Expression von Hämoxygenase-1, welche, wie unten näher beschrieben, eine wichtige
Rolle in der Regeneration und Protektion der Niere spielt (173).
Andere Arbeiten demonstrieren die erhöhte Expression von Transkriptionsfaktoren als profunden
Trigger der inflammatorischen Kaskade, z.B. Signal-Transducer-and-Activator-of-Transcription-3,
(STAT-3), das an der Genexpressionsinduktion der Akuten-Phase-Antwort beteiligt ist (162, 204).
Interferon-Regulatory-Factor-1 (IRF-1), ein anderer Transkriptionsfaktor, spielt eine wichtige Rolle in
der Induktion von Klasse1 und Klasse2 -MHC-Genen in der Niere und ist zudem in den zellulären
Widerstand bei Nekrosevorgängen involviert (3, 80). Die erhöhte Expression ist mitunter ursächlich
für die expansive Entzündungsreaktion in Nieren hirntoter Spender.
4.2.5
Transportergene
Bekannt ist die biochemische Analyse von Serumparametern, die eine fortschreitende Nierenfunktionsverschlechterung anzeigen. Erhöhte Kaliumwerte im Serum lassen sich z.B. durch eine Dysregulation von Natrium- und Kaliumtransportern erklären.
Eine andere Beobachtung ist die Herunterregulation des Aquaporin-2-Transporters in hirntoten Spendernieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Minderexpression von -2,0 der Hirntodgruppe im Vergleich
zu der Kontrollgruppe.
Aqp-2 ist ein Wasserkanal, der hauptsächlich in den Sammelrohrzellen der Niere platziert ist. Er spielt
eine signifikante Rolle in der Rückresorption von Wasser und ist somit stark in die Rolle der Urinkonzentration integriert. Interessanterweise zeigt sich als eine Konsequenz des Hirntods die markant
erhöhte Urinproduktion niedriger Konzentration, besser bekannt als Diabetes insipidus (29, 59). Unter
diesem Aspekt scheint fraglich, ob die verminderte Aqp-2-Expression, diese Folgewirkung wenigstens
teilweise erklären kann. Eine andere mögliche Ursache scheint die inadäquate Produktion von ADH
durch den posterioren Anteil der Hypophyse zu sein, was Forschungsergebnisse einer Studie von Szabo et al. aufweisen (187).
Desweiteren zeigen unsere Daten die Hochregulation des Lipocalin 2-Genes (x 8).
Neutrophile-Gelatinase-bindende Protein (NGAL/ Lipocalin 2) ist ein wichtiger Vertreter der Lipocaline, die generell als extrazelluläre Transporterproteine klassifiziert werden. Sie haben eine große
strukturelle und funktionelle Varianz und binden Retinoide, Fettsäuren und steroidale Proteine im
Plasma. Sie weisen biologische Funktionen z.B. in der Zellhomeostase, der Immunmodulation, der
Gustation und Olfaktion und des Pheromonhaushaltes auf. Zahlreiche Vertreter werden bislang be-
Diskussion
67
schrieben, unter anderem das Rentinol-bindende Protein (RBA), Complement c8-Gamma-Lipocalin,
Alpha-1-Mikroglobulin (A1M) und das Lipocalin 2/ NGAL (5, 55).
Lipocalin 2/ NGAL wurde ursprünglich aus neutrophilen Granulozyten isoliert, ohne seine Funktion
näher zu kennen. Es wirkt als Modulator der Immunantwort und spielt, wie c8-Gamma, eine wichtige
Rolle in der Akuten-Phase-Antwort (54).
Eine andere Arbeit zeigte, dass Lipocalin 2/NGAL protektive Komplexe mit Gelatinase B mit Auswirkungen auf regulatorische Prozesse der physiologischen und pathologischen Erneuerung von Gewebe, vor allem in der Angiogenese, bilden kann. Ebenso besitzt es bakterostatische Eigenschaften
durch die kompetitive Bindung von Eisen zwischen Bakterien und Lipocalin (122).
Die Arbeitsgruppe von Anwaar zeigte in Patienten mit hirnischämischem Schaden eine signifikante
Erhöhung von NGAL im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Hirnschädigung. Dies kennzeichnet die
chronische entzündliche Aktivität und endotheliale, sowie leukozytäre Aktivierung bei zerebrovaskulärem Schaden (9)
In neueren Arbeiten konnte NGAL als Aktivator für Nephronenbildung in der embryonalen Niere
identifiziert werden. Eine komplementäre DNA-Microarry-Analyse zeigte, dass Neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin 2 in Nieren nach ischämischem Schaden markant erhöht ist (185). Mishra
et al. beobachteten in NGAL-behandelten Nieren eine verminderte apoptotische Antwort, was NGAL
nierenprotektive Eigenschaften zuweisen lässt (121).
Die schnelle Diagnose eines akuten Nierenschadens durch lokale oder systemische Schädigung ist
häufig problematisch aufgrund der fehlenden frühen Biomarker für renale Dysfunktion. NGAL zeigte
sich in verschiedenen Studien als günstiger früher Parameter, der bei Nierenschädigung bereits im
frühen Stadium signifikant ansteigt. Dies geschieht 24 - 48 Stunden vor einem merklichen Kreatininanstieg. NGAL zeigt sich signifikant erhöht, sowohl im Serum als auch im Urin. Seine Verwendung
als Marker für frühen Nierenschaden nach Transplantation ist daher sinnvoll und bereits in einigen
Klassifikationen berücksichtigt (41, 164).
4.2.6
Apoptose
Programmierter Zelltod wird als wichtiger Faktor in der Ursache des Transplantatschadens hirntoter
Nierenspender akzeptiert (30). In der jetzigen Studie konnten wir eine Hochregulation der Expression
unterschiedlicher Gene bestätigen, die sowohl proapoptotische als auch antiapoptotische Eigenschaften besitzen. (Bcl2al x 4, Birc3 x 4). Drognitz et al. konnten in der Freiburger Arbeitsgruppe einen
Zusammenhang zwischen der Apoptose im azinären Pankreas einerseits und der verschlechterten
Mikrozirkulation mit Zunahme der Leukozytenadhäsion auf der anderen Seite aufzeigen (46). Ebenfalls ist die Verknüpfung zum inflammatorischen Regelkreis zu beachten, denn hier zeigt IL-1β eine
Diskussion
68
Mitbeteiligung bei der Aktivierung des Apoptoseweges. Der erhöhte Apoptoseprozess scheint bei der
Verschlechterung der Organqualität von hirntoten Spendern im Vergleich zum Lebendspender eine
signifikante Rolle zu spielen.
Antiapoptotische Stimulierung zeigt im Umkehrschluß verbesserte Ergebnisse der Nierenfunktion von
hirntoten Spendern. Eine Studie am Rattenmodell von Olszaneki et al. zeigte, dass eine Induktion der
Expression protektiver und antiapoptotischer Gene, z.B. der Hämoxygenase-1, ein deutlich verbessertes hämodynamisches Gleichgewicht, verminderte Caspase-3-Aktivität, zudem aber erhöhte Konzentrationen von antiapoptotischen Molekülen, z.B. Bcl-2 und Bcl-Xl, mit sich führte (141).
4.2.7
Gerinnung
Als wichtigster Trigger des plasmatischen Gerinnungssystems ist der „extrinsic pathway“ oder „tissue
factor pathway“ anzusehen. Er wird initiiert, wenn Gewebethromboplastin, Faktor III, (tissue factor,
TF) mit dem plasmatischen Faktor VII (FVII) in Kontakt kommt und einen Komplex bildet, wobei der
Faktor VII zu Faktor VIIa (FVIIa) aktiviert wird. Gewebethromboplastin ist ein Phospholipoprotein,
das aus verletzten Gewebezellen freigesetzt wird, ebenso auf Makrophagen erscheint und die weiterführende Gerinnungskaskade stimuliert. Auf einem unbeschädigten Endothel ist es dagegen gering
oder gar nicht präsent.
Die systemische Inflammation während des Hirntodes stimuliert die Gerinnung. Durch die veminderte
Mikrozirkulation, durch den „autonomic storm“, kommt es zur Hochregulation von Prothrombin
(158). Ebenso induzieren proinflammatorische Zytokine, z.B. Il-1, Il-6 und TNF, die Expression des
Faktor III auf Endothelien und Monozyten. Durch Verminderung der antithrombotischen Eigenschaften dieser Zellen entsteht eine erhöhte Koagulationsneigung. In unserer Arbeit finden sich hochexprimierte Gene, die für Fibrinogen kodieren (Fgb x 16, Fgg x 7, Fgl2 x 7), aber auch für
Prothrombin (x 3) und Gerinnungsfaktor III (x 3). Fibrinogen wird durch Thrombin in Fibrin umgewandelt, welches eines der wichtigsten Komponenten der Hämostase darstellt. Des Weiteren zeigen
unterschiedliche Spaltformen von Fibrinogen chemotaktische Aktvität und regulieren Teile der Zelladhäsion (123).
Der Zusammenhang zwischen Thrombose und Entzündung ist bereits durch Krankheitsbilder der Sepsis oder der Arteriosklerose bekannt und zeigt eine gegenseitige Beeinflussung der beiden Systeme
auf. Studien zeigen bereits, dass PIC die Gerinnungsaktivität beeinflussen und im Umkehrschluss
auch Elemente des Gerinnungssystems auf die Entzündungssituation einwirken (88)
Vor mehr als zehn Jahren bewiesen Herfy et al. bereits profunde Störungen im Gerinnungssystem
hirntoter Spender (74). Jüngste Forschungsergebnisse postulieren, dass die Induktion von Fgl2 auf
Diskussion
69
vaskulärem Endothel eine Rolle in der Pathogenese akuter vaskulärer abstoßungsassoziierter Thrombosen spielen könnte (128).
Tissue factor pathway inhibitor 2 ist ein Serinproteinase-Inhibitor, der als zentraler Inhibitor der exogenen Blutgerinnung bekannt ist, aber auch Funktionen im Bereich der Immunmodulation, Tumorsuppression und Arteriosklerose aufweist. Dieser Faktor zeigt sich in unserer Arbeit x 11.2 hochreguliert, was einerseits eine Gegenregulation des Körpers auf eine prokoagulatorische Situation darstellen
könnte, oder unverstandene Prozesse im Bereich der Immunmodulation. Zusammenfassend lassen
sich die Veränderungen im Gerinnungssystem hinsichtlich des Hirntodes als spenderspezifischer Faktor beschreiben, der die Qualität des Spenderorgans verschlechtern kann. Dabei bestätigen sich die
Erkenntnisse, dass eine Hyperkoagobilität zu einer Entwicklung einer Thrombose in der Spenderniere
führen könnte, die dann eine Mitursache für einen frühzeitigen Organverlust darstellt (172).
4.2.8
Heat-Shock-Proteine und Regenerationsproteine
Die endothelialen Nahtstellen sind die ersten Barrieren in einem vaskularisierten Organ, die sich der
Attacke des Immunsystems stellen. Das Endothel ist in der Lage, seinen Phänotyp drastisch zu verändern und Adhäsionsmoleküle zu exprimieren (z.B. Selektine, VCAMs, ICAMS, Chemokine, MCP-1
und Gewebsfaktoren). Es stellt somit eine proinflammatorische Umgebung her, die die zelluläre Invasion und Destruktion des Transplantats durch entzündliche Effektoren erleichtert und zur Apoptoseinduktion führen kann. Die Erhaltung eines integren Endotheliums sollte ein vaskularisiertes Tranplantat beschützen und sich positiv auf sein Überleben auswirken. Dieses Vermögen wird durch zytoprotektive Proteine gefördert. Die Definition eines zytoprotektiven Proteins beinhaltet sein Vermögen,
das Überleben und die physiologischen Funktionen der Zellen aufrechtzuerhalten, also in Verteidigung und Reperatur der Organe involviert ist (11). Das Ausmaß des Transplantatschadens reflektiert
die Balance zwischen schädigenden inflammatorischen Prozessen und protektiven Faktoren.
Wie in der Einleitung beschrieben, besitzen Heat-Shock-Proteine zytoprotektive Eigenschaften und
werden durch unterschiedliche Arten des Stresses induziert, z.B. Ischämie oder Toxineinwirkung.
In der Niere wurde ihre Expression in den Glomeruli, tubulären epithelialen Zellen und den glatten
Muskelschichten renaler Arterien detektiert. Diese zellulären Kompartimente werden bei der akuten
und chronischen Transplantatabstoßung durch proinflammatorische Stimuli zur erhöhten Expression
protektiver Gene angeregt (11, 101, 167).
Die Hämoxygenase-1 zeigt sowohl antioxidative und antiinflammatorische Eigenschaften, ebenso
moduliert sie den vaskulären Tonus. HO-1 induziert Bcl2, ein antiapoptotisches Gen und übt somit
ebenfalls eine Hemmung der Apopotose aus (101).
Diskussion
70
Trotzdem ist die Antwort dieser zellschützenden Gene oft nicht ausreichend, eine irreversible Abstoßung zu verhindern, obwohl sie vielleicht wirksam und nötig ist, das Leben von renalen Zellkomponenten aufrechtzuerhalten, bis die Immunattacke durch externe medikamentöse Immunsuppression zu
kontrollieren ist (101). Hirntodinduzierte protektive Genantwort scheint in der Klinik nur insuffizienten Schutz für die Nierenzellen zu bieten, da die schädlichen Prozesse durch den zerebralen Schaden
nicht aufzuwiegen sind.
Die mRNA-Levels von HO-1 präsentieren sich in verschiedenen tierexperimentellen Forschungsarbeiten über Nierentransplantationen mit und ohne Hirntodinduktion mit unterschiedlichen Ergebnissen.
Lemos et al. zeigten in hirntoten Spendernieren signifikant niedrigere mRNA-Level von HO-1, als in
Nieren von Lebendspendern (101). Erklärt wird dies durch eine verlängerte kalte Ischämiezeit bei
Nierentransplantationen hirntoter Spender und die defekte Anpassung des hirntoten Spenders an den
Ischämie-Reperfusionsschaden (101, 167).
In Arbeiten von Njiboer und Schuurs et al. zeigt sich eine signifikante Hochregulation der Expression
von HO-1 im Vergleich zu Lebenspendern, was wir in unserer Arbeit bestätigen können (+31). Die
Hochexpression zeigt die Reaktion des Körpers auf den Hirntod als systemischen Stressfaktor und
den Versuch Gewebsdestruktion durch inflammatorische Invasion und Apoptoseinduktion zu reduzieren.
In Nierentransplantationsmodellen ließ sich eine künstliche Überexpression von HO-1 durch pharmakologische Interventionen oder Hitze-Präkonditionierung erzeugen. Die so manipulierten Gruppen
zeigten ein deutlich verbessertes Transplantatüberleben und signifikant erhöhte Langzeitfunktionen,
bei gleichzeitig verminderter Apoptose und erniedrigten proinflammatorischen Zytokinkonzentrationen (162, 209).
Limitationen und Ausblick
4.3
71
Limitation und Ausblick
Unsere Arbeit untersucht den Hirntod und seine Auswirkungen auf genetischer Ebene durch die
Chipanalyse einer großen Anzahl an Genen, die in ihrer Expression beeinflusst werden. Diese sind an
einer Vielzahl pathophysiologischer Kaskaden beteiligt. Der Hirntod des Spenders und die unter dem
Begriff des „Autonomic Storms“ zusammengefassten Veränderungen führen im Ergebnis zu einer
Verschlechterung der Organqualität mit erhöhter Inflammation, Immunogenität und Thrombogenität
des Transplantates. Dies kann als Konsequenz mit Funktionsverschlechterungen und einer erhöhten
Frequenz von Transplantatabstoßungen korrelieren. Durch das elementare Ereignis des Hirntodes
wird neben dem schädlichen Einfluss auf die peripheren Organe jedoch auch die Bildung protektiver
Faktoren initiiert, was in unseren Ergebnissen dargestellt werden kann.
Nicht berücksichtigt wird in unserer Untersuchung ein Nachweis für Veränderungen auf Proteinebene, die Limitation erfolgt hier auf die Genexpressionsveränderungen im Rahmen des Hirntodereignisses. Durch Verwendung eines Nierengesamthomogenats ist in unserer Studie eine Zuordnung der
Expressionsveränderung auf bestimmten Kompartimenten der Niere, z.B. Endothel, Bindegewebe,
Glomeruli, Tubuluszellen, oder auch adhärenten oder infiltrierten Leukozyten, nicht möglich.
Mit einer Liegezeit von sechs Stunden wird weiterhin nur die Frühphase nach Hirntod dargestellt und
somit lediglich die Gesamtveränderung der Genexpression innerhalb dieses Zeitfensters analysiert.
Zusammenfassend lässt sich mit den von uns durchgeführten Untersuchungen unter Nutzung der DNA
Microarrys eine Vielzahl von differentiell exprimierten Genen nach Hirntodinduktion identifizieren.
Größtenteils korrelieren unsere Ergebnisse mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen und bestätigen mit den gefundenen Expressionsveränderungen die Aussage, dass der Hirntod als elementares
Ereignis die erhöhte Expression schädlicher Fakoren schon vor Transplantation bewirkt.
Die Ergebnisse ermöglichen die Weiterentwicklung non-invasiver peritransplantativer Serum- oder
Urin-Biomarker, die ein Abschätzen der zukünftigen Langzeitfunktion von Spendernieren oder das
Risiko einer akuten Abstoßung, ermöglichen.
Ergebnisse unserer und anderer Arbeiten sollen die Basis weiterer Forschungsinterventionen bilden,
beispielsweise die Analyse der Veränderungen einzelner Zellkompartimente in der Niere im Rahmen
des Hirntodes und die Entwicklung weiterer Therapieoptionen.
Anhand der erworbenen Erkenntnisse scheint es möglich, zukünftig gezielte Interventionen am hirntoten Spender zur Stabilisierung, bzw. zur Verbesserung der Transplantatqualität vor der Explantation
und Konservierung durchzuführen. Durch iatrogene Stimulation oder Inhibition auf molekulargeneti-
Limitationen und Ausblick
72
scher Ebene könnten schon prophylaktisch pathologische Kaskaden unterbunden, oder protektive,
körpereigene Mechanismen gefördert.
Zusammenfassung
5.
73
Zusammenfassung
Einleitung: Die Nierentransplantation als Ersatztherapie bei fortgeschrittener Niereninsuffizienz ist
Therapie der Wahl. Die Hauptquelle der Transplantate stellen postmortale Spenderorgane dar. Dennoch liegen diese in den Langzeitergebnissen signifikant unter den Nierenfunktionen von Lebendspendern. Dies ist unabhängig von bekannten antigenabhängigen Faktoren. Der Hirntod als primär
antigenunabhängiger Faktor übt einen entscheidenden Einfluß auf posttransplantative Resultate aus.
Im Fokus der Forschung stehen die weitreichenden systemmischen Veränderungen, die schon auf
molekulargenetischer Ebene durch den Hirntod per se beeinflusst werden. Ziel unserer Arbeit war die
Analyse und Identifikation von differentiell exprimierten Genen nach Hirntodinduktion im Vergleich
zu einer Kontrollgruppe.
Methoden: In unserer Arbeit wird ein Tiermodell des graduellen normotensiven Hirntodes verwendet. Nach Induktion des Hirntodes werden nach sechsstündiger Beobachtungszeit die Nieren und anderen Organe entnommen und im Folgenden einer RNA-Extraktion unterzogen. Die RNA wird nach
Pooling durch die Affymetrix-Genchiphybridisierung weiterverarbeitet. Die Ergebnisse der unterschiedlich exprimierten Gene werden in unterschiedliche Funktionsgruppen gegliedert. Einzelne Gene
unterschiedlicher Funktionsgruppen werden exemplarisch durch eine quantitative Two-step-RT-PCR
verifiziert. Als Vergleich dient eine Kontrollgruppe mit gleichfalls sechsstündiger Beobachtungszeit
(Narkose und Beatmung) ohne Hirntodinduktion.
Ergebnisse: Neben der Darstellung des zeitlichen Verlaufes von Kreislauf- und Blutparametern zwischen Hirntod- und Kontrollgruppe, können durch die Chiphybridisierung 150 unterschiedlich exprimierte Gene aufgeschlüsselt und 88 relevante Gene in unterschiedliche Funktionsbereiche eingeteilt
werden. Große Veränderungen zeigen die Genexpressionen der Zyto- und Chemokine, aber auch der
Adhäsionsmoleküle, der Gerinnung, Transkription, der Apoptose, aber auch der Protektion und Reparatur. Die RT-PCR kann bei drei ausgewählten Genen diese Expressionsunterschiede auf qualitativer
Ebene signifikant verifizieren.
Schlussfolgerung: Die induzierten Expressionsveränderungen von Genen unterschiedlichster Funktionsgruppen, zeigen die Auswirkung des Hirntodes als primär antigenunabhängiger Faktor
prätransplantativ. Der Hirntod per se induziert eine Herauf-/ oder Herabregulation von Genen, die z.B.
eine verstärkte Inflammation, Immunogenität, Thrombosierung oder Apoptose schon vor der Explantation kodieren. Bemerkenswert ist der Versuch des Körpers, durch vermehrte Expression zytoprotektiver Gene (z.B. die Hämoxygenase-1) körpereigene Schutzmechanismen zu aktivieren.
Unsere Ergebnisse bestätigen und ergänzen Ergebnisse vorhergehender wissenschaftlicher Arbeiten
und sollen das Verständnis der Auswirkungen des Hirntodes in der Transplantationsmedizin erweitern. Zukunftsgerichtet liegen die Ziele dieses Forschungsschwerpunktes in den medizinischpharmazeutischen Möglichkeiten, in pathologische Mechanismen einzugreifen und die Resultate der
Transplantationen bei postmortalen Spendern, Hauptquelle der Nierentransplantate, zu verbessern.
Literaturverzeichnis und Quellenangaben
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Abkürzungsverzeichnis
7.
96
Abkürzungsverzeichnis
A.
=
Arteria
A
=
arteriell
Alb
=
Albumin
Aqp2
=
Aquaporin 2
ATP
=
Adenosin-tri-phosphat
CAN
=
Chronische allograft Nephropathie (Abstoßungs-)
Ccl2
=
(=MCP-1), Chemokin – ligand 2
CO2
=
Kohlendioxid
DNA
=
Desoxyribucleic-acid, deutsch DNS (Desoxyribonukleinsäure)
DNES
=
Diffuses neuroendokrines System
EtBr
=
Ethidiumbromid
Fgb
=
Fibrinogen
GAG
=
Glykosaminoglykane
GvHD
=
Graft versus host disease
H
=
Stunde
HF
=
Herzfrequenz
HLA
=
Humanes Leukozytenantigen
HO
=
Hämoxgenase
HSP
=
Heat-Shock-Protein
HT-Gruppe
=
Hirntod-Gruppe
ICAM-1
=
Intercellular adhesion molecule - 1
Il
=
Interleukin
Il-1RA
=
Interleukin Rezeptor Antagonist
i.a.
=
Intraarteriell
i.v.
=
Intravenös
I/R
=
Ischämie/Reperfusion
µg
=
Mikrogramm
K-Gruppe
=
Kontrollgruppe
KIM
=
Kidney Injury Molecole
Lcn 2
=
Lipocalin 2
MAP
=
Mittlerer arterieller Druck
MCP
=
Makrophagen-chemotaktisches-Protein
MHC
=
master histocompatibility complex
Min
=
Minute
Abkürzungsverzeichnis
97
NaCl
=
Natriumchlorid
NH2
=
Ammoniak
NO
=
Stickstoff
NTX
=
Nierentransplantation
O2
=
Sauerstoff
PIC
=
Pro-inflammatorische Cytokine
PMN
=
Polymorphonukleäre Leukozyten
PCR
=
Polymerase Chain Reaction
RNA
=
Ribunucleic acid
RR
=
Blutdruck
RT
=
Reverse Transkriptase
S100a8
=
Calcium bindendes Protein A8/ Calgranulin A
S100a9
=
Calcium bindendes Protein A9/ Calgranulin B
SPKT
=
Simultaneous pancreas and (cadaver) kidney transplantation
STAT 3
=
Signal transcducer and activator of transcription factor 3
TGF-β
=
Transforming Growth Factor beta
TNF-α
=
Tumor Nekrose Faktor α
TPFI-2
=
Tissue factor pathway inhibitor 2
TX
=
Transplantation
VCAM-1
=
Vascular cell adhesion molecule – 1
V.
=
Vena
VEGF
=
Vasoactive endothelial growth factor
ZNS
=
Zentrales Nervensystem
Vol%
=
Volumenprozent
Selbstständigkeitserklärung
8.
98
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer, als der angegebenen, Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt
oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere abe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- beziehungsweise Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen
Prüfungsbehörde vorgelegt.
Danksagung
9.
99
Danksagung
Ich bedanke mich bei meinem Doktorvater PD Dr. med. Robert Obermaier für die Inspiration und
Überlassung des Themas, die freundliche Unterstützung und Förderung des Forschungsprojektes.
Ich danke PD Dr. Jan Kaminsky für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
Mein besonderer Dank für die hilfreiche Unterstützung gilt allen Mitarbeitern des Forschungslabores
der chirurgischen Abteilung. Allerbesten Dank vorallem an Silke Hempel, Jessica Pfannstiel und
Kolleginnen, die mich in die Materie eingearbeitet haben und mir immer mit freundlichen Ratschlägen zur Seite standen. Herrn PD Dr. Löbler danke ich für die Hilfe bei der Auswertung der gewonnen
Daten.
Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Kozcan und seinem Team in Rostock für die Kooperation
bezüglich der Chiphybridisierung und Datengewinnung. Herrn Dr. Pilarsky danke ich für die Hilfe bei
der Auswertung der gewonnen Chip-Daten.
Ich möchte mich herzlich bei Herrn Dr. med. Frank Hengl für seine langjährige Freundschaft und
Mithilfe als Mitarbeiter unserer Forschungsgruppe bedanken.
Am meisten danke ich meiner Familie, die mir das Studium in dieser Form ermöglicht hat, meinem
Bruder Michael Horn und meinem Freund Peter Grimminger für die stetige Unterstützung.
100
Lebenslauf
10. Lebenslauf
Personalien
Name:
Carolin M. Y. Horn
Geburtsdatum:
13.06.1980
Geburtsort:
Frankfurt am Main
Adresse:
Eifelstrasse 33
50677 Köln
Schulischer Werdegang
1986-1990
Grundschule Hofheim
1990-1999
Main-Taunus-Gymnasium Hofheim
1999
Abitur
Universitärer Werdegang
WS 1999/2000
Beginn des vorklinischen Studiums der Humanmedizin an der
Semmelweisuniversität in Budapest, Ungarn
WS 2001-2006
Fortsetzung des klinischen Studiums der Medizin an der
Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg am Breisgau
April 2006
3. Medizinisches Staatsexamen und Erlangung der Approbation
(Gesamtnote 1,6)
Beruflicher Werdegang
Seit August 2006
Assistenzärztin der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde ders
Universitätsklinikums Köln unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. med. Dr.
h.c. K.-B. Hüttenbrink