immunologie - Ruhr-Universität Bochum

Werbung
21
IMMUNOLOGIE
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Immunologische Nachweisverfahren werden zum Nachweis von vielen verschiedenen
Substanzen genutzt. Ist ein Stoff immunogen, so führt die Injektion dieses Stoffes in einem
fremden Organismus zur Antikörperbildung. Nach der Isolierung solcher Antikörper können
diese nicht nur zur Detektion von Proteinen, Antikörpern, Hormonen oder Viren eingesetzt
werden, sondern u.a. auch einen Nachweis von Toxinen und Pestiziden in Blut oder Urin von
Patienten ermöglichen. Hieraus ergibt sich eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten in
der Medizin und den Naturwissenschaften.
SCHWANGERSCHAFTSTEST DURCH IMMUNOLOGISCHEN NACHWEIS DES HUMANEN
CHORIONGONADOTROPINS (HCG) IM URIN
Eine der häufigsten Anwendungen ist der immunologische Schwangerschaftsschnelltest,
welcher im Jahr 1980 patentiert wurde und auch bei ungeübter Anwendung eine hohe
Zuverlässigkeit bietet. Hierbei wird durch eine einfache Immunreaktion ein Peptidhormon im
Urin der zu untersuchenden Person nachgewiesen, welches während der Schwangerschaft
von der Plazenta gebildet wird und für die Erhaltung der Schwangerschaft verantwortlich ist.
Anders als beim beschriebenen „Stäbchenschnelltest“ ist im Labor eine weitaus genauere
Diagnostik möglich. Vor allem innerhalb der ersten fünf Schwangerschaftswochen kann die
Hormonkonzentration im Urin unter der Nachweisgrenze des Schnelltests liegen, sodass
hierbei ein falsch negatives Testergebnis auftreten kann. Aber auch rechtsmedizinische
Fragestellungen können eine quantitative Bestimmung der hCG-Konzentration erforderlich
machen, wenn es z.B. darum geht, ob eine Schwangerschaft unrechtmäßig, also zu spät,
abgebrochen wurde.
QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON ANTIGENKONZENTRATIONEN
Mittels EIA (Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) bzw. ELISA (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) lässt sich schnell die genaue Konzentration eines Antigens in wässriger
Lösung bestimmen.
Die in den 60er Jahren entwickelte Methode, bei der Enzyme zur Markierung von
Antikörpern oder Antigenen verwendet werden, wird in der Immunologie sehr verbreitet für
den Nachweis einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung benutzt. Gleichzeitig eignet sich
22
diese Metthode für die quantittative Besttimmung von Antigen
n- bzw. Anntikörperkonzentrationen. D
Das Prinzip
p der Methode ist in A
Abb. 1 darg
gestellt:
Antigen
()
En
nzymgekoppelter
An
ntikörper
M
Markierter Antikö
örper gebun
nden
a n Antigen
farbloses
f
Substrat
S
farbige
es
Produkt
Die Anwessenheit eines Antigens wird mit Hilfe des Enzym-geko
E
oppelten Anntikörpers nachgewiesen. Das Enzym
m reagiert anschließe nd mit dem
m farblosen Substrat uund ein farb
biges,
leicht dete
ektierbares Produkt en
ntsteht. Die
e Menge de
es farbigen Produktess ist der En
nzymkonzentrattion und gle
eichzeitig de
er Antigenko
onzentration
n proportion
nal.
Der in Abb
b.1 beschrie
ebene Ablau
uf stellt eine
en sogenan
nnten direkte
en ELISA-T
Test dar, we
eil der
spezifische
e Antikörper direkt marrkiert ist. Offt ist es nich
ht möglich, den
d spezifisschen Antik
körper
mit einem Enzym zu koppeln.
k
In diesem Fa
all kann der an das Anttigen gebunndene Antik
körper
mit Hilfe eiines Enzym
m-gekoppelten Zweitan tikörpers au
us einer and
deren Spezzies (z. B. ZiegeZ
anti Maus IgG) nach
hgewiesen werden.
w
Di e Methode
e ist der so
ogenannte iindirekte ELISATest.
Das Prinzip
p ist in Abb.. 2 schematiisch darges
stellt:
Enzzym-gekopp
pelter AntiImm
munoglobulin Antikörpe
er
Anttikörper geg
gen Antigen
n
Imm
mobilisiertess Antigen
Diese Meth
hode ist im Vergleich zum
z
direkte n ELISA-Te
est wesentlich empfinddlicher, weil mehr
als ein Enzzym-gekopp
peltes zweittes Antikörp
permolekül an den prim
mären Antiggen-spezifis
schen
Antikörpern gebunden
n sein kann.
23
IMMUNGLOBULINE
Beim Menschen sind fünf verschiedene Immunglobulin (Ig) -Klassen zu finden, welche sich
in der Struktur ihrer konstanten Regionen unterscheiden und in verschiedenen Geweben in
unterschiedlichen Konzentrationen zu finden sind.
IgA ist in allen Schleimhäuten des Körpers zu finden. Es wird insbesondere von Drüsen rund
um die Brustwarze von Müttern sezerniert und schützt den Säugling vor Pathogenen. Im
Serum bildet es 15 % aller Immunglobuline.
IgD ist als membranständiger Antigenrezeptor auf der Oberfläche von B-Zellen zu finden,
allerdings ist die genaue Funktion noch unbekannt. Der IgD-Anteil im Serum liegt deutlich
unter 1 %.
IgE vermittelt nach Antigenbindung auf der Oberfläche von Mastzellen die Ausschüttung von
Histamin und spielt somit eine wichtige Rolle bei allergischen Reaktionen. Weniger als 1 %
der Immunglobuline des Körpers gehört zu dieser Klasse.
IgG ist die am häufigsten vorkommende Klasse von Immunglobulinen im Plasma und
während der Immunantwort wird es mit einiger Verzögerung gebildet, bleibt dann jedoch
lange erhalten. Von Bedeutung ist das Vorkommen von IgG im Zusammenhang mit
Impfungen, Autoimmunerkrankungen und dem Vorkommen des Rhesusfaktors während
Schwangerschaft.
IgM ist das erste Immunglobulin, welches im Verlauf einer Immunantwort an der Oberfläche
von B-Lymphozyten erscheint und zu einer Aktivierung des Komplementsystems beiträgt.
Ein erhöhter IgM-Anteil im Blut kann also auf eine momentane Infektion hinweisen.
GEWINNUNG VON ANTIKÖRPERN
Um in der Diagnostik immunologische Nachweisverfahren durchzuführen, wurden anfänglich
Antisera verwendet. Man immunisierte zunächst ein Versuchstier, z. B. ein Kaninchen, mit
dem nachzuweisenden Molekül und verwendete dann das Serum dieses Versuchstiers,
welches nun Antikörper gegen das nachzuweisende Molekül enthält, als Werkzeug in
immunologischen Tests. Ein Antiserum stellt somit ein Gemisch aus Antikörpern gegen alle
Antigene dar, mit denen das Versuchstier in Berührung gekommen ist. Dies birgt das Risiko
möglicher Kreuzreaktionen und einer verminderten Spezifität der Immunreaktion.
Ein monoklonaler Antikörper vermeidet diese Probleme, da er das Produkt einer einzigen
B-Zelle darstellt. Seine Herstellung ist allerdings sehr aufwendig. Zunächst wird eine Maus
mehrfach mit dem nachzuweisenden Molekül immunisiert. Dann wird ihr die Milz
entnommen, die nun zahlreiche B-Zellen enthalten sollte, die Antikörper gegen das
24
nachzuweisende Molekül produzieren. Um diese Zellen zu immortalisieren, werden sie mit
einer Mäusetumorzellinie fusioniert. Durch die Fusion der beiden Zellarten entstehen unter
anderem B-Zell-Tumorzell-Fusionen, welche selektiert und weiter kultiviert werden. So
können Zellkulturen angelegt werden, die ausschließlich Antikörper gegen ein einzelnes
Epitop sezernieren. Da die Zellen den gewünschten Antikörper kontinuierlich ins Medium
abgeben, kann man nun beliebige Mengen dieses monoklonalen Antikörpers herstellen.
Damit ist es theoretisch nur einmal nötig den aufwendigen Herstellungsprozess zu
durchlaufen. Für die meisten diagnostisch wichtigen Makromoleküle sind heute monoklonale
Antikörper kommerziell erhältlich. Diese werden aber auch therapeutisch eingesetzt. Da sie
jedoch meist aus der Maus stammen, würden sie eine Immunreaktion im Menschen
auslösen. Aus diesem Grund müssen die für die Antigen-Bindung nicht benötigten Regionen
eines solchen Antikörpers mit gentechnischen Methoden durch die entsprechenden
menschlichen Sequenzen ersetzt werden. Man spricht in diesem Fall von einem
humanisierten monoklonalen Antikörper.
REINIGUNG VON ANTIKÖRPERN
Um die gewonnen Antikörper für diagnostische Zwecke einsetzen zu können, bedarf es
häufig
einer
Reinigung
aus
Serum
oder
Zellkulturmedium.
Meistens
wird
eine
Affinitätschromatografie für diese Reinigung eingesetzt. Dabei können zum einen Antikörper
gereinigt werden, die spezifisch gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet sind oder es können
unspezifisch alle Antikörper aus der Lösung isoliert werden.
Bei der spezifischen Reinigung wird das Antigen, gegen das der gewünschte Antikörper
gerichtet ist, an eine Matrix kovalent gebunden. Diese Matrix wird mit der Antikörper-haltigen
Lösung inkubiert, wobei die gewünschten Antikörper an die Matrix binden. Nach mehreren
Waschschritten können die gebundenen Antikörper durch Zugabe eines sauren Puffers
wieder eluiert werden.
Für die unspezifische Reinigung werden die Antikörper-bindenden Eigenschaften von Protein
A bzw. Protein G ausgenutzt. Protein A und Protein G sind Oberflächenproteine von
Staphylococcus aureus bzw. Streptokokken. Beide Proteine besitzen die Eigenschaft
Immunglobuline, vor allem IgG, zu binden. Dabei erfolgt die Bindung nicht über die
Antigenbindestellen, sondern über den Fc-Teil des Immunglobulins. Für die Bakterien
fungieren diese Proteine als ein Schutzmechanismus, da durch die Bindung wirtseigener
Antikörper eine Erkennung durch das Immunsystem des Wirts erschwert wird.
Die Reinigung von Antikörpern über Protein A/G erfolgt wie zuvor durch kovalente Bindung
der Proteine an eine Matrix. Bei Inkubation mit Antikörperhaltigen Lösungen binden diese an
Protein A/G und können nach mehrmaligem Waschen durch Zugabe eines sauren Puffers
eluiert werden.
25
AUFTRENNUNG VON PROTEINGEMISCHEN MITTELS SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
Die Gelektrophorese bezeichnet im Allgemeinen die Wanderung von geladenen Teilchen
durch ein Trägermaterial in einem elektrischen Feld. Dabei wandern verschiedenartige
Moleküle und Partikel je nach Ladung und Größe mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten
und können so voneinander getrennt werden.
Bei der SDS-Gelelektrophorese (SDS = Sodium Dodecyl Sulfate = Natriumdodecylsulfat)
werden Proteine nach einem einzigen physiko-chemischen Parameter aufgetrennt, ihrem
Molekulargewicht. Sie dient der Analyse von Proteingemischen und ermöglicht schnelle
Molekulargewichtsbestimmungen.
SDS ist ein stark anionisches Detergenz, welches die Proteine denaturiert, sich an diese
anlagert und proportional zu ihrer Größe mit einer negativen Ladung versieht. Die
Eigenladungen der Proteine werden überdeckt. Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine
werden durch Aufspaltung der Wasserstoffbrücken und Streckung der Moleküle aufgelöst.
Lediglich Disulfidbrücken (Schwefelbrücken zwischen Cysteinen) kann das SDS nicht
spalten, diese können optional durch Zugabe reduzierender Thiole wie z.B.
2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) aufgebrochen werden. Durch das identische
Ladungs- zu Masse-Verhältnis sowie die Auffaltung und Streckung der Aminosäureketten
unterscheiden sich die SDS-Komplexe verschiedener Proteine für viele Messmethoden nur
noch in ihrer Größe.
Die Auftrennung der SDS-Protein-Mizellen erfolgt in der Regel in einem Polyacrylamidgel,
weshalb diese Methode auch als SDS-PAGE (SDS-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese)
bezeichnet wird. Die Gelmatrix besteht aus Ketten von polymerisiertem Acrylamid, die durch
einen Anteil von bifunktionalem Bisacrylamid quervernetzt sind. Im angelegten elektrischen
Feld wandern die negativ geladenen SDS-Protein-Komplexe zur Anode (Pluspol). Dabei
trennt der Molekularsiebeffekt der porösen Gelmatrix die einzelnen SDS-Protein-Komplexe
nach ihrem Molekulargewicht auf: Kleinere Proteine wandern schneller durch die Poren des
Gels als größere. Am Ende des Vorganges sind die Proteine nach Größe fraktioniert und
können
durch
weitere
Verfahren,
wie
z.B.
Coomassie-
oder
Silberfärbung
oder
immunologische Nachweismethoden, wie Immunoblotting, sichtbar gemacht werden. Mit
Hilfe von Markerproteinen, deren Molekulargewichte bekannt sind und die man ebenfalls auf
das Gel aufträgt, lassen sich die Molekulargewichte der zu analysierenden Proteine
abschätzen. Die Porengröße des Gels muss an den jeweiligen Molekulargewichtsbereich, in
welchem eine lineare Auftrennung der Proteine erzielt werden soll, angepasst werden.
26
Meistens wird die SDS-PAGE mit einem diskontinuierlichen Puffersystem durchgeführt, bei
welchem das Trenngel mit einem großporigen Sammelgel überschichtet ist. Die Probe und
das Sammelgel enthalten Tris-Cl (pH 6,8), der Puffer in der oberen und unteren
Pufferkammer Tris-Glycin (pH 8,3) und das Trenngel Tris-Cl (pH 8,8). Alle Komponenten des
Systems enthalten 0,1% SDS. Sobald das elektrische Feld anliegt, bilden die Chloridionen
die Spitze der sich in Richtung Anode bewegenden Molekülfront und die Glycin-Moleküle
den Schluss. Dazwischen befinden sich die SDS-Protein-Komplexe, die an der Grenzschicht
zum Trenngel durch den hohen Reibungswiderstand in einer sehr schmalen Zone
aufkonzentriert („gesammelt“) werden. Diese Verdichtung vor dem Eintritt ins Trenngel
bewirkt eine wesentliche Erhöhung der Bandenschärfe und Auflösung des Gels.
27
ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
I.
Aufreinigung von IgG-Antikörpern aus Schafserum
Im Rahmen des Versuchstages sollen Immunglobuline der Klasse IgG aus Serum des
Schafes affinitätschromatographisch mittels ProteinA-Sepharose isoliert werden. Sowohl
Reinigungserfolg als auch IgG-Gehalt im Serum sind anschließend mit Hilfe von SDS-PAGE
und Coomassie-Färbung zu bestimmen.
II.
ELISA-Test zum Nachweis des hCG-Hormons im Urin
Anhand eines ELISA sollen verschiedene vorgelegte Urinproben qualitativ auf das
Vorhandensein von hCG untersucht und die hCG-Konzentrationen, der positiven Proben,
jeweils einer Schwangerschaft im dritten bzw. siebten Monat zugeordnet werden. Das
qualitative Ergebnis ist am Ende des Versuches mit einem kommerziell erhältlichen
Schnelltest zu überprüfen.
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG DES ELISA-TESTS
Puffer für ELISA (stehen am Arbeitsplatz):
Verdünnungslösung für das Antigen: in 10 ml 0.01M Natrium-Phosphatpuffer
pH 7,2 und
25mg Mannitol
Waschpuffer (PBS-T) (blauer Deckel): NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,76 mM, 0,1 % Tween20, pH 7,2 (einstellen mit NaOH)
Blocklösung (orangener Deckel): 2,5 % Magermilchpulver in PBS-T
hCG-Antikörperlösung (gelber Deckel): ß-hCG-Antikörper (Calbiochem 230746-1)
1:4000 in PBS-T
Zweitantikörperlösung (gelb/blauer Deckel): Anti-Maus-AK POD-Konjugat (Invitrogen
626520) 1:4000 in PBS-T
28
Substrat-Lösung (braunes Gefäß): 1,2mg Tetramethylbenzidin in 1 ml Ethanol abs. lösen; 9
ml Na-Acetatpuffer 0,1M pH 5,0 und 10µl H2O2 (37%) hinzufügen
Lösung jeden Tag frisch ansetzen
Stopplösung (roter Deckel): 1M Schwefel säure (ätzend)
Versuchsdurchführung

Die Proben sind bereits in die Platte pipettiert und über Nacht inkubiert worden. Für die
Verteilung der Proben siehe Plattenschema.

Zunächst die in der Platte befindliche Flüssigkeit auskippen und den Rest durch
Ausklopfen der Platte auf Handtuchpapier entfernen.

Im Anschluss in jedes belegte Well 300 µl Waschpuffer Elisa pipettieren und direkt
danach ausschütten und ausklopfen. Diesen Vorgang insgesamt dreimal durchführen.

Als nächstes erfolgt ein Blockieren von Bindestellen um unspezifische Bindung des
folgenden Antikörpers zu unterbinden. Hierfür in jedes Well 300 µl Blocklösung
pipettieren und für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach erfolgter Inkubation wird erneut dreimal mit 300 µl Waschpuffer gewaschen.

Im nächsten Schritt erfolgt die Bindung des für hCG spezifischen Antikörpers. Hierfür in
jedes Well 200 µl hCG-Antikörperlösung pipettieren und die Platte für 30 min
bei
Raumtemperatur inkubieren.

Nach erfolgter Inkubation wird erneut dreimal mit 300 µl Waschpuffer gewaschen

Zum Nachweis des gebundenen spezifischen hCG-Antikörpers wird mit einem, gegen
diesen ersten Antikörper gerichteten, Zweitantikörper inkubiert. Dafür je 200 µl der 2.
Antikörperlösung. in jedes Well pipettieren und für weitere 60 min inkubieren.
Nach erfolgter Inkubation wird erneut zweimal mit 300 µl Waschpuffer und zweimal mit 200
µl H2O gewaschen.
Der Nachweis des gebundenen Zweitantikörpers erfolgt enzymatisch. Hierfür ist der
Zweitantikörper mit Peroxidase konjugiert. Zum Starten der Reaktion je 100 µl SubstratLösung (Tetramethybenzidin-Lösung) in jedes Well pipettieren und 2 min stehen lassen.
Nun fügt man 100 µl Stopplösung (Schwefelsäure) hinzu. Es kommt zu einem Farbumschlag
von blau nach gelb. Im Anschluss wird die Absorption der Wells bei 450nm im
Plattenlesegerät gemessen.
29
Die ermittelten Messwerte sind zu notieren und das Ergebnis zu interpretieren.
1
2
3
4
5
A
Urin A
Unverd.
Urin A
1: 2 verd.
Urin A
1: 4 verd.
Urin A
1: 8 verd.
Urin A
1: 16 verd.
B
Urin B
Unverd.
Urin B
1: 2 verd.
Urin B
1: 4 verd.
Urin B
1: 8 verd.
Urin B
1: 16 verd.
C
Urin C
Unverd.
Urin C
1: 2 verd.
Urin C
1: 4 verd.
Urin C
1: 8 verd.
Urin C
1: 16 verd.
4
5
Ergebnistabelle: gemessen am Plattenlesegerät bei 450 nm:
1
2
3
A
B
C
AFFINITÄTSCHROMATOGRAFISCHE REINIGUNG VON ANTIKÖRPERN
1.
Puffer für die affinitätschromatografische Reinigung von Antikörpern (stehen am
Arbeitsplatz):
2.
10 x Waschpuffer (10 x PBS-T 500) NaCl 5 M, KCl 27 mM, Na2HPO4 81 mM,
KH2PO4 17,6 mM, 1 % Tween20, pH 7,4
3.
Waschpuffer (PBS-T 500) (Glasflasche mit blauem Deckel): NaCl 500 mM, KCl 2,7
mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,76 mM, 0,1 % Tween20, pH 7,4
4.
Elutionspuffer (blau/roter Deckel): 0,2 M Glycin, pH 2,8
5.
Neutralisationspuffer (weißer Deckel): 1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
6.
Probenpuffer (gelbes, kleines Eppi): 250mM Tris/HCl, pH 6,8, 40% Glycerin,
7.
20% β - Mercaptoethanol, 0,4% Orange G
8.
Coomassie-Färbelösung: 0,2% Coomassie Brilliant Blau R250, 7,5% Essigsäure,
9.
20 % Ethanol
30
VORBEREITEN DER SÄULE
Die Protein-A-Agarose ist bereits in der Säule vorgelegt. Zunächst die in der Säule
befindliche Flüssigkeit (20 % Ethanol) auslaufen lassen. Im Anschluss wird die Säule 2-mal
mit je 10 ml Waschpuffer (mit der Plastikpipette pipettieren) äquilibriert. Beim zweiten
Durchlauf die Säule am Ende mit einem gelben Stopfen verschließen, so dass ein kleiner
Rest Puffer über dem Säulenmaterial verbleibt.
VORBEREITEN DES SERUMS: (WIRD TEILWEISE VOM ASSISTENTEN DURCHGEFÜHRT!!)
Bevor das Serum auf das Säulenmaterial gegeben wird, wurde es zunächst den
Pufferbedingungen angepasst. Dazu hat der Assistent zu 2 ml Serum 200 µl 10-fach
Waschpuffer gegeben und danach gemischt. Die Probe steht mit „S“ beschriftet auf dem
Platz
Von dem Serum werden 10 µl in ein frisches Eppi gegeben und mit 90 µl Waschpuffer Säule,
(nicht der Waschpuffer Elisa!!) versetzt (T= Totalprotein). Dieses Eppi wird zur Seite gestellt.
Das restliche Serum wird auf die Säule gegeben.
AFFINITÄTSCHROMATOGRAFIE:
Das Rest-Serum wird in die äquilibrierte und verschlossene Säule gegeben und für 15 min.
inkubiert. Während der Inkubation wird das am Boden der Säule befindliche Säulenmaterial
durch vorsichtiges Schütteln mehrmals aufgeschwemmt.
Nach der Inkubation den Stopfen der Säule entfernen und das Serum auslaufen lassen.
Dabei den Durchlauf (DL) in einem 2,2ml Eppi auffangen.
Im Anschluss erfolgen 5 Waschschritte. Hierfür jeweils 10 ml Waschpuffer (mit der
Plastikpipette pipettieren) in die Säule geben und auslaufen lassen. Auch hier die Durchläufe
(W1-W5) je in einem Reagenzglas auffangen.
Nach dem letzten Waschschritt die Säule erneut verschließen.
Für die Elution der gebundenen Antikörper wird zunächst ein Eppi mit 50 µl
Neutralisationspuffer versetzt. Im Anschluss wird auf die noch verschlossene Säule 250 µl
Elutionspuffer gegeben und für 5 min inkubiert. Danach den Stopfen der Säule entfernen und
das Eluat in das vorbereitete Eppi tropfen lassen. Direkt im Anschluss wird ein zweiter
Elutionsschritt wie zuvor durchgeführt und im selben Eppi aufgefangen (Probe E).
31
SDS-PAGE ODER PROTEINELEKTROPHORESE:
Pipettierplan (Angaben in µl) (wird direkt in das Eppi pipettiert!!!)
Name der Probe
Probenmenge
Waschpuffer Säule
Probenpuffer
T (Totalserum)
10 µl
90 µl
25µl
DL (Durchlauf)
10µl
90µl
25µl
W1 (Waschschritt 1)
100µl
25µl
W5 (Waschschritt 5)
100µl
25µl
E (Eluat)
100µl
25µl
Schon fertig!!!
Siehe Vorbereitung
des Serums
Alle mit Probenpuffer versetzten Proben (T, verdünnter DL, W1, W5, E) werden für 5 min bei
95 °C erhitzen.
STARTEN DES SDS-GELS:
Von jeder Probe werden 5 µl auf das Gel aufgetragen. Dabei sollte folgende Reihenfolge
verwendet werden:
Marker, Total, DL, W1, W5, E
Wenn alle Proben auf das Gel aufgetragen sind, wird der Deckel auf die Gel-Kammer
gesetzt und ein konstanter Strom von 40 mA pro Gel angelegt. Sobald die farbige Bande aus
dem Gel ausgelaufen ist, wird der Strom ausgestellt (ca. 30 - 40 min).
32
FÄRBEN DES GELS:
Nach erfolgter Elektrophorese wird das Gel aus der Kammer entnommen (Handschuhe
tragen, da Acrylamid krebserregend ist). Um das Gel aus den Glasplatten zu bekommen mit
einem Spatel vorsichtig die kleinere Glasplatte nach oben hebeln und entfernen. Danach
kann das Sammelgel vorsichtig entfernt werden. Im Anschluss das Gel mit Hilfe eines
Spatels vorsichtig von der Großen Platte lösen, in eine Plastikschale legen und mit
Coomassie-Färbelösung überschichten. Kurz in der Mikrowelle aufkochen (ca. 30 sec.) und
für 5 min auf einem Schüttler inkubieren. Nach erfolgter Inkubation die Färbelösung zurück
gießen und das Gel mit Wasser abspülen. Danach das Gel mit Wasser überschichten und
erneut in der Mikrowelle aufkochen (30 sec). Nach dem Aufkochen einige Spritzer Ethanol
hinzugeben und auf dem Schüttler inkubieren bis das Gel entfärbt ist, diesen Schritt
mehrfach wiederholen.
PROTEINMARKER:
Ein wichtiges Verfahren in der Protein-Biochemie ist die Analyse von
Proteinen anhand
ihrer unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld.
Dazu werden Eichproteine mitgeführt, mit deren Hilfe die Molekulargewichte
der zu analysierenden Proteine bestimmt werden können.
33
LERNZIELE
Inhaltlich:

Definition von Antigenen

Prinzip der zellulären und humoralen Immunantwort

Antikörper:

A.
Struktur von IgG-Molekülen
B.
Aufbau der Moleküle der einzelnen Immunglobulinklassen
C.
Funktion der einzelnen Antikörperklassen
D.
Wechselwirkungen zwischen Antigen und Antikörper
E.
Polyklonale und monoklonale Antikörper
F.
Prinzip der Gewinnung von polyklonalen Antikörpern
Physiologie des humanen Choriongonadotropins (hCG)
Methodisch:

Enzymgekoppelte Immunadsorptionstests

Affinitätschromatographie, Protein-A-Agarose

SDS-PAGE, Färbemethoden
Herunterladen