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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung für Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau CD90 – ein Marker der Transdiferenzierung von Makrophagen? Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2007 von Florian Kim Kollert geboren in Uelzen 2 Dekan: Professor Dr. Christoph Peters Erster Gutachter: Professor Dr. Joachim Müller-Quernheim Zweiter Gutachter: Professor Dr. Ulrich Walker Jahr der Promotion: 2009 3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 13 1.1 Krankheitsbilder der Lungenfibrose 13 1.1.1 Idiopathische interstitielle Pneumonien (IIP): Klinik und Klassifikation 13 1.1.1.1 Idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) 14 1.1.1.2 Nichtspezifische interstitielle Pneumonie (NSIP) 14 1.1.1.3 Bronchiolitis obliterans organisierende Pneumonie (BOOP) 15 1.2 Die Pathogenese der Lungenfibrose 16 1.2.1 Der fehlgeleitete Wundheilungsprozess und die Rolle der Fibroblasten und Myofibroblasten in Interaktion mit dem Alveolarepithel 16 Fibroblasten 17 1.2.2.1 Fibrozyten 17 1.2.2.2 Fibroblasten-Vorläuferzellen in der BAL 19 Alveolarmakrophagen 19 1.2.3.1 Alternativ-aktivierte Alveolarmakrophagen 20 1.3 Fibroblasten- und Makrophagenmarker 21 1.3.1 Kollagen Typ I 21 1.3.2 CD90 23 1.3.3 Vimentin 24 1.3.4 CD68 24 1.3.5 CCL18 24 1.3.6 CD206 25 1.4 Fragestellung 26 2 Materialien und Methoden 27 2.1 Materialien 27 2.1.1 Geräte 27 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 27 1.2.2 1.2.3 4 2.1.3 Chemikalien, Biochemikalien und Medien 28 2.1.4 Puffer und Lösungen 29 2.1.5 Antikörper 31 2.2 Methoden 31 2.2.1 Auswahl der Probanden 31 2.2.2 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) 32 2.2.2.1 Durchführung 32 2.2.2.2 BAL-Aufarbeitung 32 2.2.3 Isolation und Kultur der Fibroblasten 32 2.2.4 Durchflusszytometrie/Fluorescence-activated-cell-sorter (FACS) 33 2.2.4.1 Hintergrund 33 2.2.4.2 Durchflusszytometrische Versuchsanleitung 34 Enzym-linked-immunosorbent-assay (ELISA) 35 2.2.5.1 Hintergrund 35 2.2.5.2 CCL18-ELISA 35 Immunzytologische Färbungen 36 2.2.6.1 Hintergrund 36 2.2.6.2 Immunzytologische Versuchsanleitung 36 Kollagenexposition von BAL-Zellen 37 2.2.7.1 Hintergrund 37 2.2.7.2 Versuchsanleitung 37 2.2.8 Statistische Auswertung 37 3 Resultate 38 3.1 Studienpopulation 38 3.1.1 Differentialzytologie 39 3.1.2 Lungenfunktion 39 3.1.2.1 Totale Lungenkapazität (TLC) 40 3.1.2.2 Vitalkapazität (VC) 40 3.1.2.3 Diffusionskapazität (TLCOc/VA) 40 3.2 Antigenexpression von Alveolarmakrophagen aus der BAL 41 3.2.1 Kollagen Typ I 42 2.2.5 2.2.6 2.2.7 5 3.2.1.1 Intrazelluläres Kollagen Typ I 42 CD90 44 3.2.2.1 Messung mit Saponin 45 Übersicht der CD90- und Kollagen Typ I-Expression der verschiedenen Formen der Lungenfibrose 47 3.2.4 Vimentin 48 3.2.5 CD68 48 3.2.6 CCL18 49 3.2.7 CD206 50 3.2.8 Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen aus der BAL 51 3.3 Antigenexpression von Fibroblasten 53 3.3.1 Kollagen Typ I 53 3.3.2 CD90 53 3.3.3 Vimentin 53 3.3.4 CD68 53 3.4 Kollagen Typ I-Bindung von Alveolarmakrophagen aus der BAL 55 3.5 Immunzytologische Färbungen 56 3.5.1 Kollagen Typ I-Expression auf BAL-Zellen und Fibroblasten 57 3.5.2 CD90-Expression auf BAL-Zellen und Fibrolasten 58 3.6 CCL18 in der zellfreien BAL 60 3.7 Korrelationen und Doppelfärbungen 60 3.7.1 Korrelation der Kollagen Typ I-Expression (mit Saponin) mit dem Anteil neutrophiler Granulozyten in der BAL 61 Korrelation und Koexpression von Kollagen Typ I (mit Saponin) mit CD90 in der BAL 61 3.7.3 Korrelation und Koexpression von CCL18 mit Kollagen Typ I in der BAL 62 3.7.4 Korrelation von CD90+ Zellen mit der Expressionsdichte von CCL18 in der BAL 63 3.7.5 Korrelation von CD68 mit CCL18 in der BAL 63 3.7.6 Korrelation von Kollagen Typ I mit CD68 in der BAL 63 3.2.2 3.2.3 3.7.2 6 3.7.7 Korrelation von CD68 mit CD206 in der BAL 64 3.7.8 Korrelation und Koexpression von CD206 mit CCL18 in der BAL 64 3.7.9 Korrelation und Koexpression von CD206 mit Kollagen Typ I in der BAL 65 4 Diskussion 66 4.1 Kollagen Typ I 67 4.2 Vimentin 69 4.3 CD68 69 4.4 CXCR4 und -SMA 70 4.5 CD90 71 4.6 Biomarker der Fibrose 78 4.7 Ausblick 79 5 Zusammenfassung 81 6 Literaturverzeichnis 82 7 Danksagung 94 8 Publikationen 95 9 Lebenslauf 96 7 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Studienpopulation 38 Abbildung 2: Differentialzytologie 39 Abbildung 3: Ausgewählte Parameter der Lungenfunktion 40 Abbildung 4: Exemplarische Orginalabbildung (DotPlot) einer Kontroll-FACS-Messung 41 Abbildung 5.0: Kollagen I-FACS-Messungen (Prozent) 43 Abbildung 5.1: Kollagen I-FACS-Messungen (RFI) 43 Abbildung 5.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer Kollagen I-FACS-Messung 43 Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung 43 Abbildung 5.4: Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin (Prozent) 43 Abbildung 5.5: Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin (RFI) 43 Abbildung 5.6: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin 43 Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin 43 Abbildung 6.0: Expressionsdichte von intrazellulärem Kollagen Typ I 44 Abbildung 6.1: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung mit und ohne Saponin 44 Abbildung 7.0: CD90-FACS-Messung (Prozent) 45 Abbildung 7.1: CD90-FACS-Messung (RFI) 45 Abbildung 7.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD90-FACS-Messung 45 Abbildung 7.3: Exemplarisches Histogramm einer CD90-FACS-Messung 45 Abbildung 8.0: CD90-FACS-Messung mit Saponin 46 Abbildung 5.3: Abbildung 5.7: 8 Abbildung 8.1: Exemplarische Orginalabbildung (DotPlot) einer CD90-FACS-Messung ohne und mit Saponin 46 Exemplarisches Histogramm einer CD90-FACS-Messung mit und ohne Saponin 46 Abbildung 9.0: Vimentin-FACS-Messung mit Saponin (Prozent) 48 Abbildung 9.1: Vimentin-FACS-Messung mit Saponin (RFI) 48 Abbildung 10.0: CD68-FACS-Messung mit Saponin (Prozent) 49 Abbildung 10.1: CD68-FACS-Messung mit Saponin (RFI) 49 Abbildung 10.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD68-FACS-Messung mit Saponin 49 Exemplarisches Histogramm einer CD68-FACS-Messung mit Saponin 49 Abbildung 11.0: CCL18-FACS-Messung mit Saponin 50 Abbildung 11.1: CCL18-FACS-Messung mit Saponin 50 Abbildung 11.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CCL18-FACS-Messung mit Saponin 50 Exemplarisches Histogramm einer CCL18-FACS-Messung mit Saponin 50 Abbildung 12.0: CD206-FACS-Messung (Prozent) 51 Abbildung 12.1: CD206-FACS-Messung (RFI) 51 Abbildung 12.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD206-FACS-Messung 51 Abbildung 12.3: Beispielhistogramm einer CD206-FACS-Messung 51 Abbildung 13: Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen 52 Abbildung 14.0: 3h Kollagen Typ I-Exposition der Alveolarmakrophagen 55 Abbildung 14.1: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer Kollagen Typ I-FACS-Messung vor und nach Kollagenexposition 56 Abbildung 8.2 Abbildung 10.3: Abbildung 11.3: Abbildung 14.2: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen Typ I-FACS-Messung vor und nach Kollagenexposition 56 Abbildung 15: Fibroblasten 57 Abbildung 16: Morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten 57 9 Abbildung 17: BAL-Zytologie einer Normalperson 57 Abbildung 18: BAL-Zytologie eines Patienten mit Lungenfibrose 57 Abbildung 19: Fibroblasten 58 Abbildung 20: Morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten 58 Abbildung 21: BAL-Zytologie einer Normalperson 58 Abbildung 22: BAL-Zytologie eines Patienten mit Lungenfibrose 59 Abbildung 23: CCL18 in der zellfreien BAL-Flüssigkeit 60 Abbildung 24: Korrelation von RFI Kollagen Typ I mit neutrophilen Granulozyten 61 Korrelation von CD90 [%] mit RFI Kollagen Typ I (mit Saponin) 61 Exemplarische FACS-Doppelfärbung von Kollagen Typ I und CD90 61 Abbildung 25.0: Abbildung 25.1: Abbildung 26.0: Korrelation von RFI CCL18 mit RFI Kollagen Typ I 62 Abbildung 26.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung mit Saponin von Kollagen Typ I und CCL18 62 Abbildung 27: Spearman-Korrelation von CD90 [%] mit RFI CCL18 63 Abbildung 28: Korrelation von RFI CD68 mit RFI CCL18 63 Abbildung 29: Korrelation von RFI Kollagen Typ I mit RFI CD68 63 Abbildung 30: Spearman-Korrelation von RFI CD68 mit RFI CD206 64 Abbildung 31.0: Korrelation von RFI CD206 mit RFI CCL18 64 Abbildung 31.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung mit Saponin von CCL18 und CD206 64 Abbildung 32.0: Spearman-Korrelation von RFI CD206 mit RFI Kollagen Typ I 65 Abbildung 32.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung ohne Saponin von Kollagen Typ I und CD206 65 10 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Antikörper und komplexbildende Moleküle 31 Tabelle 2: Exzitations- und Fluoreszenzwellenlänge der verwendeten Fluorochrome 33 Tabelle 3: BAL-Differentialzytologie und Lungenfunktionsparameter im Detail 41 Tabelle 4: Kollagen Typ I- und CD90-FACS-Messungen im Detail 47 Tabelle 5: Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen 52 Tabelle 6: Vergleich der Antigenexpression von Fibroblasten mit Alveolarmakrophagen 54 Vereinfachte Darstellung der Antigenexpression von Fibroblasten und Alveolarmakrophagen 54 Tabelle 7: 11 Abkürzungen AAM Alternativ-aktivierte Makrophagen AM Alveolarmakrophagen AO Adhäsionsobjektträger ATS American Thoracic Society BAL Bronchoalveoläre Lavage BM Basalmembran BOOP Bronchiolitis obliterans organisierende Pneumonie BSA Bovine serum albumin CCL18 AMAC-1, MIP-4, DC-CK-1, PARC CCL2 MCP-1 CD206 Makrophagen-Mannose-Rezeptor CD90 Thy-1 Collagen R Rattenschwanz-Kollagen CTGF-1 Bindegewebe Wachstumsfaktor 1 CXCL12 SDF-1 DAB Diaminobenzidin DotPlot Punktediagramm EG Eosinophile Granulozyten ELISA Enzym-linked immunosorbent assay ERS European Respiratory Society FACS Fluorescence-activated-cell-sorter FCS Fötales Kälberserum FGF-1 Fibroblasten Wachstumsfaktor 1 FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC Vorwärtsstreulicht GM-CSF Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor HR-CT Hochauflösende Computertomographie 12 ICAM-1 Intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1 IIP Idiopathische interstitielle Pneumonie IL Interleukin IPF Idiopathische pulmonale Fibrose kDa Kilo Dalton Kol I Kollagen Typ I LZ Lymphozyten MNC Mononukleäre Zellen MZ Mastzellen NAG N-Acetyl D-Glucosamin NG Neutrophile Granulozyten NP Normalpersonen NSIP Nichtspezifische interstitielle Pneumonie PDGF BB (AA) Thrombozytärer Wachstumsfaktor BB (Dimer aus zwei A/B-Ketten) PE Phycoerythin r Korrelationskoeffizient RF Reaktionsfeld RS Kollagen Typ I Rattenschwanz-Kollagen Typ I RT Raumtemperatur s. Abb. Siehe Abbildung sCD90 Lösliches CD90 SSC Seitwärtsstreulicht SSC Sklerodermie TGF- Tumor-Wachstumsfaktor beta TLC Totale Lungenkapazität TLCOc/VA Diffusionskapazität TNF- Tumor-Nekrosefaktor alpha UIP Usual interstitial pneumonia VC Vitalkapazität VCAM Vaskuläres Adhäsionsmolekül -SMA Alpha Smooth Muscle Actin 13 1 Einleitung 1.1 Krankheitsbilder der Lungenfibrose Jene Arten von Lungenerkrankungen, die zu einer Lungenfibrose führen, bilden eine heterogene und prognostisch ungünstige Krankheitsgruppe. Das Erkrankungsalter der Patienten ist variabel, liegt jedoch zumeist im höheren Erwachsenenalter (11;61). Die meisten Patienten versterben an respiratorischer Insuffizienz. Das Voranschreiten der Fibrose lässt sich derzeit therapeutisch kaum beeinflussen. Eine die Fibrose auslösende Entzündung kann jedoch mittels Immunsuppressiva unterdrückt werden (1). Einmal stattgefunden, gilt die fibrotische Umwandlung des Lungenparenchyms als irreversibel (1). Umso wichtiger erscheint es, jene zellbiologischen Prozesse besser zu verstehen, welche der Lungenfibrose zugrunde liegen. Die vorliegende Arbeit möchte dazu beitragen. Im Folgenden werden zunächst die verschiedenen in dieser Arbeit untersuchten Lungenerkrankungen näher beschrieben. Anschließend werden anhand der aktuellen Literatur die diskutierten pathogenetischen Konzepte sowie die für diese Arbeit relevanten Zellmarker vorgestellt. Das Kapitel schließt mit der Fragestellung. 1.1.1 Idiopathische Interstitielle Pneumonien (IIP): Klinik und Klassifikation 2001 wurden die idiopathischen Lungenfibrosen neu klassifiziert. Sie werden nun als idiopathische interstitielle Pneumonien (IIP) im Sinne von fibrosierenden Lungenerkrankungen mit unklarer Ätiologie zusammengefasst. Ihnen gemeinsam ist der fibrotische Umbau des Lungenparenchyms, der von einer Entzündung variablen Ausmaßes begleitet ist (2). Die Erstbeschreibung einer IIP erfolgte 1944 durch Hamman und Rich. Sie definierten anhand von vier Patienten die bis dahin unbekannte akute interstitielle Pneumonie (AIP) (48). Die IIP wurden auf der Grundlage radiologischer, klinischer, histologischer und therapeutischer Differenzen in verschiedene Gruppen unterteilt. Liebow entwickelte 1975 die erste histologische Klassifikation (95). Die Pathologen Katzenstein und Myers klassifizierten die IIP 1998 anhand von histopathologischen Merkmalen neu (62). Es konnte gezeigt werden, dass diese Einteilung auch klinisch bedeutsam ist (11). So lassen sich die histopathologischen Formen der IIP durch ihr Ansprechen auf Steroide, durch den Krankheitsverlauf sowie die Mortalität unterscheiden (11;33). Im Folgenden werden die für diese Arbeit relevanten Formen der IIP anhand der Klassifikation von Katzenstein und Myers kurz beschrieben. 14 1.1.1.1 Idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) 2001 wurden in einem ATS/ERS „Consensus Statement“ Artikel die diagnostischen Kriterien für die IPF neu definiert. Dementsprechend zeigt die IPF das pathologische Muster einer Usual Interstitial Pneumonia (UIP) (2). Die Histologie der UIP ist charakterisiert durch ein Nebeneinander von Arealen mit interstitieller Fibrose, Infiltrationen von Entzündungszellen, wabenartig umgebautem Lungengewebe und normalem Lungenparenchym sowie durch das Vorkommen charakteristischer Ansammlungen von proliferierenden Fibroblasten und Myofibroblasten, so genannter Fibroblasten-Foci (129). Der histologische Nachweis von Fibroblasten-Foci gilt als Bedingung für die Diagnosestellung einer UIP, ist aber nicht pathogonomisch. Die Anzahl der Foci korreliert negativ mit der Überlebenszeit (126). Die Foci sind Ausdruck der anhaltenden Aktivität einer IPF und implizieren, dass es sich bei der IPF nicht um einen fixen Endzustand, sondern um einen progressiven Prozess handelt. Eine Theorie besagt, dass das auftretende morphologische Bild nach Art eines Flickenteppichs für den wiederholten Reiz, durch einen entweder persistierenden oder mehrfach auftretenden Stimulus, spricht. Die IPF ist prognostisch ungünstig. Eine komplette Remission tritt nie auf. Bjoraker et al. fanden eine mittlere Überlebenszeit unter drei Jahren (11). Die Krankheit verläuft meist schleichend. Initiale Symptome sind Belastungsdyspnoe und trockener Husten. Die Lungenfunktion ist im Sinne einer restriktiven Ventilationsstörung eingeschränkt. Die Diagnose IPF ist eine Ausschlussdiagnose. Sie muss gegen exogen hervorgerufene Lungenfibrosen und systemische Erkrankungen mit pulmonaler Beteiligung abgegrenzt werden. Das typische konventionelle Röntgenbild einer IPF zeigt diffuse, beidseitige zum Teil retikuläre Verschattungen, die peripher betont sind und charakteristisch von kranial nach kaudal zunehmen. Einen festen Platz in der Diagnostik der IPF nimmt die HR-CT ein. In der bronchoalveolären Lavage (BAL) findet sich selten eine geringgradig ausgeprägte Lymphozytose vom CD8-Typ. Häufig ist eine Neutrophilie oder Eosinophilie erkennbar. Beide korrelieren mit einer ungünstigen Prognose (12;143). 1.1.1.2 Nichtspezifische interstitielle Pneumonie (NSIP) Die radiologischen und klinischen Befunde sind ähnlich wie bei der IPF. Eine Fibrose mit dem pathologischen Muster der NSIP tritt gehäuft bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen im Sinne einer Lungenbeteiligung auf. Dementsprechend ist das häufigste histopathologische Erscheinungsbild einer Lungenfibrose bei Sklerodermie das einer NSIP (65). Im HR-CT findet sich ein homogenes retikuläres Verschattungsmuster mit basaler Betonung. Die für die UIP typische subpleurale Betonung fehlt. Histologisch zeigt sich eine homogene Inflam- 15 mation in Form von Lymphozyten und Plasmazellen innerhalb der Alveolarsepten mit mehr oder weniger fibrotischem Umbau der Lungenarchitektur. Fibroblastenfoci fehlen. Die histologische Differentialdiagnose zur UIP kann insofern problematisch sein, da auch die UIP stellenweise das Bild einer NSIP zeigen kann. Hinweisend auf eine NSIP ist, wenn fibrotische und inflammative Prozesse zusammen vorkommen, aber in sich einheitlich sind und trotz ausgeprägter Fibrose ein wabenartiger Umbau fehlt. Die Prognose der NSIP-Patienten ist weitaus günstiger als die der Patienten mit IPF. Die mittlere Überlebenszeit liegt bei 13,5 Jahren (11). Die Patienten sprechen typischerweise gut auf systemische Steroide an. In der BAL findet sich eine mehr oder weniger ausgeprägte Lymphozytose mit begleitender Neutro- oder Eosinophilie. Je höher der Anteil an Lymphozyten ist, umso besser ist die Prognose (11;143). 1.1.1.3 Bronchiolitis obliterans organisierende Pneumonie (BOOP) Die BOOP ist durch fokale alveoläre Infiltrate, Husten, Luftnot und Allgemeinsymptome gekennzeichnet. Sie kann durch diverse Ursachen, wie Kollagenosen und Vaskulitiden, hämatologische Systemerkrankungen, Transplantationen (Herz, Lunge, hämatologische Stammzellen), Inhalationstraumen, Arzneimittelexpositionen oder Infektionen bedingt sein. Die Diagnose idiopathische BOOP wird gestellt, wenn keine dieser Ursachen identifiziert werden kann. Dies trifft in den häufigsten Fällen zu (27). Das histomorphologische Bild besteht aus zwei Komponenten. Zum einen die „Bronchiolitis obliterans“ – inflammative und fibrotische Prozesse in den terminalen und respiratorischen Bronchiolen in Form von Pfropfen aus Granulationsgewebe und Fibrin. Diese setzen sich bis zu den Ductuli alveolares fort und bilden so die zweite Komponente, die „organisierende Pneumonie“. Typischerweise fehlt ein wabenartiger Umbau der Lungenarchitektur. Die Diagnose wird meist mittels offener Lungenbiopsie gestellt. In mehr als der Hälfte der Fälle kann mit einer Kortikosteroidmonotherapie eine lang anhaltende Remission mit vollständigem Rückgang der Fibrose erreicht werden (27). Die BAL zeigt eine gemischte Zytologie mit Lymphozytose, Neutrophilie oder beidem (95). 16 1.2 Die Pathogenese der Lungenfibrose 1.2.1 Der fehlgeleitete Wundheilungsprozess und die Rolle der Fibroblasten und Myofibroblasten in Interaktion mit dem Alveolarepithel Die zerstörte Lungenarchitektur von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose ist durch eine erhöhte beziehungsweise veränderte Ablagerung von extrazellulärer Matrix, insbesondere von fibrillärem Kollagen, gekennzeichnet (129). Fibroblasten und Myofibroblasten sind von zentraler Bedeutung für den Aufbau und Abbau dieser extrazellulären Matrix und somit für das Remodelling des Bindegewebes. Fibroblasten-Foci, kleine Agglomerationen von sich profilierenden Fibroblasten und Myofibroblasten (129), sind diagnoseweisend und prognostisch für die IPF (126). Bis circa 1999 galt die paradigmatische Hypothese, dass eine initiale Verletzung unbekannter Ursache einen chronischen Entzündungsprozess auslöst, der wiederum zur chronischen Traumatisierung des Lungengewebes und damit zur Entwicklung der Lungenfibrose führt. Es wurde angenommen, dass dieser Pathomechanismus allen fibrotischen Lungenerkrankungen zugrunde liegt (63). Es folgte ein Paradigmenwechsel. Da bei der IPF in der Lavage und in der Histologie kaum Lymphozyten nachzuweisen sind, und sie zudem nur in geringem Ausmaß mittels immunsuppressiver Therapie behandelbar ist (5;25;26;54;113;127), folgerten einige Autoren, dass die Inflammation nur eine untergeordnete Rolle spielt. Selman et al. stellten die pathologische Interaktion zwischen Alveolarepithelzellen und Fibroblasten im Sinne einer gestörten Wundheilung in den Vordergrund (129). Normalerweise wird ein Schaden des Alveolarepithels, wie er zum Beispiel bei einer Pneumonie auftritt, zur Wahrung der epithelialen Integrität schnell repariert. Bei der IPF jedoch erscheint dieser Prozess verlangsamt und inadäquat. Bei Patienten mit IPF besteht das Alveolarepithel vermehrt aus Alveolarepithelzellen Typ 2 (AEC2), der Anteil der Alveolarepithelzellen Typ 1 (AEC1) ist dagegen verringert – man spricht von einer AEC2-Hyperplasie. Histologisch sind kuboide Zellen zu erkennen, welche hyperplastisch und teilweise mehrreihig angeordnet sind. Die Fähigkeit der AEC2, in AEC1 zu differenzieren, scheint gestört zu sein (60). AEC2 exprimieren Zytokine und Wachstumsfaktoren wie TGF- und TNF- , welche unter anderem profibrotische Eigenschaften aufweisen (58;64;96). Die AEC2-Hyperplasie resultiert außerdem in Abnormalitäten des Surfactant-Proteins (85;86). Zudem konnte festgestellt werden, dass Fibroblasten und Myofibroblasten in vitro die Apoptose von AEC1 verursachen (138), und dass in vivo apoptotische AEC1 vor allem in der Nähe von Fibroblasten-Foci vorkommen (137). Die Basalmembran (BM) des Alveolarepithels besteht aus einer komplexen Proteinstruktur. Sie enthält Kollagen IV, Entactin, Fibronektin und Heparansulfat-Proteoglykane (151). Die BM ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Integrität des Alveolarepithels und die Differenzierung der 17 AEC. Zudem scheint ihre Ruptur ein wichtiges Element in der Pathogenese der IPF darzustellen (98;100;115). Gelatinase A und B, zwei Komponenten der Matrix-Metalloproteasen-Familie, können Bausteine der BM, wie Kollagen IV, degradieren (99). Interessanterweise exprimieren bei IPFPatienten subepitheliale Myofibroblasten in Lungengewebsarealen mit ruptierter BM Gelatinasen (51;128) – was vermuten lässt, dass Fibroblasten und Myofibroblasten die Degradation der BM verursachen können und sich somit selbstständig einen Weg in den Alveolarraum bahnen. 1.2.2 Fibroblasten Im fibrosierten Lungenparenchym umfasst die Population der mesenchymalen Zellen Fibroblasten, Myofibroblasten, Perizyten, Zellen der glatten Muskulatur sowie undifferenzierte Zellen (20). Der Anteil mesenchymaler Zellen ist im Lungengewebe von Patienten mit IPF etwa verdoppelt (20). Fibroblasten sind primär durch ihre spindelförmige Morphologie, ihre Kern/ZytoplasmaRelation und die Synthese von Kollagen charakterisiert. Fries et al. postulieren, dass Fibroblasten, ähnlich wie Lymphozyten, eine heterogene, dynamische Population von Zellen darstellen. Die Autoren beschreiben Unterschiede der Morphologie, der Expression von Oberflächenmolekülen und Zytokinen, der Kollagensynthese sowie des Proliferationsverhalten von Fibroblasten (35). Die Proliferation von Fibroblasten im Verlauf der Entwicklung einer Lungenfibrose wurde bisher auf die Zellteilung residueller Fibroblasten zurückgeführt (90;114;116). Es konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten isoliert aus dem Lungengewebe von Patienten mit Lungenfibrose signifikant schneller proliferieren als diejenigen von Normalpersonen (56;112). Jordana et al. beobachteten ein heterogenes Proliferationsmuster, das durch das Vorhandensein einzelner schnell wachsender Klone bestimmt war (56). 1.2.2.1 Fibroz yten 1994 konnten Bucala et al. nach Kultur von mononukleären Zellen (MNC) aus dem peripheren Blut Zellen mit einem Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp gewinnen. Sie fanden die Existenz einer Population von Fibroblasten-Vorläuferzellen (16). Diese als „Fibrozyten“ bezeichneten Zellen bilden eine kleine Fraktion (<1%) der zirkulierenden Leukozyten-Population und exprimieren Kollagen Typ I, Vimentin, CD34 und CD45. Sie konnten in Bindegewebsnarben nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sie in Verletzungsareale einwandern und in Kultur zu spindelförmigen Zellen ausdifferenzieren (16). Abe et al. fanden, dass adhärente MNC aus dem peripheren Blut (>70%CD14+/Kollagen Typ I–) nach zweiwöchiger Kultur in eine Kollagen Typ I+/CD14– Zellpopulation ausdifferenzieren. Die Autoren postulierten, dass diese Differenzierung nur bei Kontakt zu T-Zellen erfolgt. Sie beob- 18 achteten zudem, dass diese Fibrozyten nach weiterer Differenzierung -SMA exprimierten, ein für Myofibroblasten charakteristisches Protein. Außerdem konnten sie zeigen, dass Fibrozyten die Chemokin-Rezeptoren CXCR4, CCR7, CCR5 und CCR3 exprimieren, und dass der CCR7-Ligand SLC die Migration der Fibrozyten in Verletzungsareale steuert (3). Eine Arbeit über Asthma bronchiale beschreibt die Akkumulation von Kollagen Typ I+/CD34+/ -SMA+ Zellen in der murinen Bronchialschleimhaut. Die Autoren konnten im Mausmodell zeigen, dass im Blut zirkulierende Fibrozyten nach Allergenexposition in die Lunge einwandern, und dass Fibrozyten nach Stimulation mit TGF- -SMA exprimieren (125). Schmidt et al. postulie- ren, dass Fibrozyten im Blut zirkulieren, bei Asthma bronchiale nach Allergenstimuli die Lungen infiltrieren und dort zu Myofibroblasten ausdifferenzieren (125). Eine Arbeitsgruppe um Roderick J. Phillips konnte 2004 zeigen, dass aus dem humanen Blut isolierte Kollagen I+/CD45+/CXCR4+ Zellen im Mausmodell der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose in die Lunge einwandern, und dass die Zahl der eingewanderten Fibrozyten mit der Kollagenablagerung korreliert. Zudem konnten sie zeigen, dass die chemotaktische Wirkung des CXCR4-Ligandens, CXCL12 (SDF-1), für die Migration der Fibrozyten in die murine Lunge mitverantwortlich ist. 2004 konnte für die Lungenfibrose im chimären Mausmodell gezeigt werden, dass FibroblastenVorläuferzellen aus dem Knochenmark in die Lunge einwandern. Die eingewanderten Fibroblasten repräsentierten 80% aller Kollagen Typ I+ Zellen aus den mit Bleomycin behandelten Lungen (50). Hashimoto et al. konnten außerdem analog zu Ergebnissen von Abe et al. und Phillips et al. feststellen, dass Fibrozyten die Chemokin-Rezeptoren CXCR4 und CCR7 tragen und auf die zugehörigen Liganden CXCL12 (SDF-1) und SLC chemotaktisch reagieren (50). Moore et al. konnten in der BAL von Mäusen mit FITC induzierter Lungenfibrose CD45+/CD13+ /Kollagen Typ I+/CD34– Fibrozyten identifizieren (92). Sie konnten zudem die chemotaktische Wanderung von murinen Fibrozyten beobachten, die durch die Interaktion des Chemokin-Rezeptors CCR2 mit seinem Liganden CCL2 (MCP-1) vermittelt wird. Die Autoren stellten weiterhin fest, dass die CCR2 Knock-out Maus eine mildere Form der FITC induzierten Lungenfibrose entwickelt, und die Differenzierung von Fibrozyten zu Fibroblasten mit einer verminderte Expression von CCR2 einhergeht (92). Eine Relevanz von einwandernden Fibrozyten für die Entstehung einer Fibrose konnte auch für andere Organsysteme gezeigt werden. So konnten Kisseleva et al. 2006 für das Mausmodell der durch Ligation der Gallenwege bedingten Leberfibrose zeigen, dass Kollagen Typ I+ Fibrozyten aus dem Knochenmark ins Leberparenchym einwandern, Kollagen synthetisieren und in vitro nach Stimulation mit TGF- zu Myofibroblasten differenzieren (67). Parallelen sind in der Transplantationsmedizin bekannt. Im Mausmodell der Knochenmarkstransplantation konnten Spenderfibroblasten in der Empfängerlunge nachgewiesen werden (24;69;103). 19 Dies stützt die Hypothese, dass Lungenfibroblasten aus Knochenmarkszellen beziehungsweise zirkulierenden Vorläuferzellen generiert werden können. Beim Menschen konnte gezeigt werden, dass im Rahmen der chronischen Abstoßung, Empfängerfibroblasten in das transplantierte Organ einwandern und eine interstitielle Fibrose mit konsekutivem Organfunktionsverlust auslösen (42;131). Die chronische Abstoßung von Lungentransplantaten erfolgt meist durch die Fibrosierung der Bronchioli. Auch hier konnten ins Lungenparenchym eingewanderte mesenchymale Vorläuferzellen entdeckt werden (14;15). Kapanci et al. konnten zeigen, dass das Auftreten von -SMA positiven Myofibroblasten in der Lunge die chronische Abstoßung begleitet beziehungsweise dieser sogar vorangeht (59). Neuere Arbeiten zeigen, dass dem Entstehen einer Lungenfibrose ein fehlgeleiteter Wundheilungsprozess mit ontogenetischen Pathomechanismen zugrunde liegt (129). Die Einwanderung peripherer Fibroblasten-Vorläuferzellen oder Fibrozyten würde gut in dieses Konzept passen. 1.2.2.2 Fibroblasten-Vorläuferzellen in der bronchoalveolären Lavage Die Differentialzytologie der BAL wird routinemäßig zur Diagnostik von interstitiellen Lungenerkrankungen eingesetzt. Der Anteil von Alveolarmakrophagen, Lymphozyten, neutrophilen, basophilen und eosinophilen Granulozyten wird mittels der May-Grünwald-Färbung, anhand von morphologischen Kriterien bestimmt. In der BAL kommen keine spindelförmige Zellen vor. Fireman et al. gelang es 1991 erstmals, Fibroblasten aus der BAL von Patienten mit Lungenfibrose in dreiwöchiger Kultur zu züchten (32). Eine Arbeitsgruppe um Anna Ludwicka konnte 1992 Zellen aus der BAL von Sklerodermie-Patienten isolieren, die in Kultur zu Fibroblasten differenzieren (82). Dies lässt den Schluss zu, dass in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose eine bislang nicht näher beschriebene Population von Fibroblasten-Vorläuferzellen existiert. 1.2.3 Alveolarmakrophagen Makrophagen kommen weit verteilt im menschlichen Körper vor, reagieren sensibel sowohl auf endogene wie auf exogene Stimulantien und weisen eine große Plastizität auf (40). Alveolarmakrophagen (AM) sind im Durchschnitt 40 μm groß. Sie sind in den Alveolen luftseitig lokalisiert. Ihre Funktion ist unter anderem die Phagozytose von Fremdkörpern, die sich im Flüssigkeitsfilm der Alveolenoberfläche ansammeln (57). Makrophagen sind für die angeborene, unspezifische Immunantwort von zentraler Bedeutung (53). Sie können diverse Krankheitserreger ohne die Unterstützung der adaptiven Immunantwort erkennen, aufnehmen und eliminieren (53). Makrophagen werden im Lichtmikroskop anhand ihrer Größe sowie anhand von inkorporierten Fremdkörpern 20 von anderen Zellen unterschieden (57). AM dominieren unter den frei beweglichen Zellen im Alveolarraum (70). Insofern bilden sie in der BAL von Normalpersonen den größten Anteil an Zellen. Pathogene werden von Phagozyten über Rezeptoren erkannt. Zu diesen Rezeptoren gehören die Scavenger-Rezeptoren, der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (CD206) und der CD14-Rezeptor. Zudem exprimieren Makrophagen und neutrophile Granulozyten Komplementrezeptoren, welche mit opsonierten Antigenen interagieren und so deren Phagozytose einleiten können (53). Makrophagen und Monozyten exprimieren Integrinrezeptoren. Diese Rezeptoren bestehen aus einer - und einer -Untereinheit und beeinflussen die Adhäsion der Zellen an der extrazellulären Matrix (83). AM erneuern sich unter normalen Bedingungen durch Zellteilung sowie durch die Extravasation von Monozyten aus dem peripheren Blut. Krombach et al. unterscheiden zwischen kleineren Monozyten-ähnlichen AM und großen AM. Auf den großen AM wird vermehrt HLA-DR exprimiert, die Rezeptoren CD11b und CD14 werden vermehrt von den Monozyten-ähnlichen Zellen getragen (70). Die Monozyten-ähnlichen Zellen gelten als frisch aus dem Blut eingewandert (79). Bei interstitiellen Lungenerkrankungen ist der Anteil der CD14+ Monozyten-ähnlichen AM erhöht (9). Insofern werden AM im Verlauf interstitieller Lungenerkrankung vermutlich vermehrt aus dem Blut rekrutiert. AM gehören zu der Gruppe der Antigen-präsentierenden Zellen und stellen damit, neben ihrer Funktion für die unspezifische Abwehr, auch einen wichtigen Teil der adaptiven Immunantwort dar. 1.2.3.1 Alternativ-aktivierte Alveolarmakrophagen Klassischerweise werden Makrophagen über T-Helfer-1 (TH1) Zellen und Natürliche Killerzellen (NKZ) aktiviert. Insbesondere durch das von TH1-Zellen synthetisierte Zytokin INF- (22). IL-4, IL-13 und IL-10, Zytokine der T-Helfer 2 (TH2)-Immunantwort, aktivieren Makrophagen auf dem alternativen Weg (68). Die Stimulation von Makrophagen mit IL-4 und IL-13 führt zu einer erhöhten Expression von MHCII und CD206 (40) und induziert die Synthese von CCL22 (MDC), CCL17 (TARC) und Arginase (40). Immature dendritische Zellen, die mit IL-10 stimuliert werden, sowie Makrophagen nach IL-4 Stimulation nehmen einen alternativ-aktivierten Phänotyp an und exprimieren CCL18 und IL-1-Rezeptorantagonist (39). Mit IL-4, IL-13 und IL-10 (alternativ-)aktivierte Makrophagen synthetisieren CCL18. Dagegen wird nach Stimulation mit INF- die CCL18-Expression der Makrophagen gehemmt (68). Hancock et al. konnten in der BAL von Patienten mit IPF erhöhte IL-13 Spiegel feststellen (49). BAL-Zellen von Patienten mit Sklerodermie exprimieren IL-4 und IL-5, diejenigen von Lungen- 21 gesunden nicht (8). Prior et al. konnten feststellen, dass im Rahmen von fibrosierenden Lungenerkrankungen das TH1-Zytokin INF- vermindert exprimiert wird (109). Diese Resultate implizieren eine zentrale Bedeutung der TH-2 Zytokine in der Pathogenese der Lungenfibrose. Diesbezügliche Experimente unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass mit IL-4/IL-13 und IL-10 stimulierte Alveolarmakrophagen den Phänotyp einer alternativ-aktivierten Zelle annehmen, und dass dieser Phänotyp, anders als bei Normalpersonen und Sarkoidose-Patienten mit Röntgentyp I-II, bei Patienten mit Lungenfibrose vorherrscht. Alternativ-aktivierte Makrophagen (AAM) produzieren Fibronektin und regen Fibroblasten zur Synthese von extrazellulärer Matrix an (130). AAM sind unter anderem durch die Synthese des Chemokins CCL18 charakterisiert (39;68). CCL18 regt Fibroblasten aus der Lunge zur Produktion von Kollagen an (7). Unsere Arbeitsgruppe konnte zudem zeigen, dass die CCL18-Produktion von AM durch den Kontakt zu nativem Kollagen Typ I verstärkt wird. Auch die Kokultivierung von Fibroblasten mit AM zeigte diesen Effekt (108). Diese Ergebnisse zeigen einen sich selbst verstärkenden Regelkreis, der in einer erhöhten Ablagerung von extrazellulärer Matrix resultiert und damit einen Schlüsselmechanismus in der Pathogenese fibrotischer Lungenerkrankungen darstellen könnte. 1.3 Fibroblasten- und Makrophagenmarker 1.3.1 Kollagen Typ I Kollagen ist das häufigste Protein im menschlichen Körper. Unter den mehr als zwanzig verschiedenen Kollagen-Untergruppen sind die vier wichtigsten Kollagen Typ I, II, III und IV. Kollagen Typ I macht etwa 90% des menschlichen Kollagens aus. Es setzt sich aus zwei -1 und einer -2 Polypeptidkette zusammen. Man findet es vor allem in Sehnen, Muskeln, Faszien, Organkapseln, Knochen und im Stroma aller Organe. Kollagen wird überwiegend von Fibroblasten produziert. Die Synthese verläuft folgendermaßen: Membrangebundene Ribosomen translatieren die mRNA, wobei eine Kollagen-Vorstufe entsteht, welche in die Zisternen des rauen endoplasmatischen Retikulums abgegeben wird. Im nächsten Schritt wird ein Signalpeptid abgespalten, und es entsteht Prokollagen. Prokollagen wird zum Golgi-Apparat transportiert und mittels Vesikeln in den extrazellulären Raum sekretiert. Dort spalten Prokollagen-Peptidasen Aminosäure-Sequenzen ab, wodurch sich Tropokollagen bildet. Dieses verbindet sich zu Mikrofibrillen, Kollagenfasern und schließlich zu Faserbündeln (57). Kollagen macht 20% des Trockengewichts der Lunge aus (111). In den Alveolarwänden der Lunge findet man vor allem Kollagen Typ I und Kollagen Typ III 22 (81). Kollagen Typ I ist der Hauptgarant für die Steifigkeit des Gewebes und hält die Architektur der Alveolen aufrecht (81). Synthese und Abbau von Kollagen stehen unter physiologischen Bedingungen in Homöostase zueinander (75;84). Ein Ungleichgewicht führt entweder zu erhöhtem Kollagenabbau und damit zum Emphysem oder zu vermehrter Kollagenablagerung und so zur Lungenfibrose (74;97). In den Lungen von Patienten mit IPF konnte im Vergleich zu Normalpersonen eine erhöhte Prokollagen Typ I-Expression nachgewiesen werden (87). Eine andere Arbeit zeigte, dass in fibrotischen Lungen vor allem Kollagen Typ I und Typ III vorkommt, wobei in fortgeschrittenen Stadien Kollagen Typ I dominiert (115). Kollagen wird entweder auf dem intrazellulären oder auf dem extrazellulären Weg abgebaut (29). Extrazellulär wird das Protein durch Matrix-Metalloproteasen degradiert. Andererseits können Fibroblasten, Makrophagen und Osteoklasten Kollagen phagozytieren und dem lysosomalen Abbau zuführen (29). Diverse Autoren nutzen Kollagen Typ I als Marker für Fibroblasten-ähnliche Zellen. So definierten Buccala et al. Fibrozyten unter anderem durch ihre Kollagenexpression (16). Auch Hashimoto et al., Abe et al., Moore et al., Phillips et al. und Schmidt et al. nutzen die Kollagen Typ I-Oberflächenexpression zum Nachweis aus dem peripheren Blut gewonnener Fibrozyten (3;50;92;106;125). Fireman et al. und Ludwicka et al. definieren aus der BAL generierte Fibroblasten unter anderem durch die Expression von Kollagen Typ I (32;82). Die Produktion von Kollagen ist zwar ein Fibroblasten-spezifisches Merkmal, dennoch gibt es Arbeiten, die zeigen, dass die Oberflächenexpression von Kollagen Typ I nicht explizit den Fibroblasten zuzuordnen ist. Lucattelli et al. beobachteten 2006 im murinen Modell des Lungenemphysems die Phagozytose von Kollagen durch Alveolarmakrophagen. Die Autoren konnten intrazytoplasmatische Einschlüsse erkennen, die sich im Elektronenmikroskop als von Kollagen abstammende Proteine darstellten (81). Everts et al. beschrieben bereits 1996 die intrazelluläre Verdauung von Kollagen durch Makrophagen (29). Ebenso ist bekannt, dass murine Makrophagen sich mittels Scavenger-Rezeptoren an denaturiertes Kollagen Typ I binden können (41). Zudem konnte gezeigt werden, dass der IntegrinRezeptor CD11c/CD18 die Adhäsion von Monozyten an Kollagen Typ I reguliert (37). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Makrophagen Kollagen auf ihrer Zelloberfläche binden können und somit Makrophagen und Fibroblasten allein durch die Oberflächenexpression von Kollagen Typ I schwierig zu differenzieren sind. Neue Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass Kollagen Typ I zur alternativen Aktivierung von Alveolarmakrophagen führen kann. So konnten wir nachweisen, dass Alveolarmakrophagen im Kontakt zu nativem Kollagen signifikant mehr CCL18 exprimieren (108). CCL18 ist ein für AAM charakteristisches Chemokin (39), das zudem Fibroblasten zur Kollagensynthese anregt (7). 23 1.3.2 CD90 In der Zellbiologie ist die Identifizierung von Fibroblasten wichtig. Die Präsenz von Fibroblasten in Zellkulturen führt häufig dazu, dass man die Kultur verwerfen muss. Saalbach et al. konnten 1996 einen monoklonalen Antikörper (Klon: AS02) entwickeln, welcher eine spezifische Reaktion gegen Fibroblasten zeigt (119). Die Identifizierung des Epitops erfolgte zwei Jahre später. Die Autoren fanden, dass der Antikörper ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 30-35 kDa erkennt. Alle Peptide des Antigens waren homolog zu humanem CD90 (120). Das Protein CD90 (Thy-1) wurde erstmalig auf murinen Thymuszellen entdeckt (118). Beim Menschen ist die CD90Expression auf neuronale Zellen, Fibroblasten, aktivierte Endothelzellen sowie CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen beschränkt (19;21;120). Durchflusszytometrische Messungen ergaben, dass CD90 auf Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten nicht exprimiert wird (120). Über die Funktion von CD90 ist wenig bekannt. Die Adhäsion von Fibroblasten an Proteine der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin und Kollagen Typ I, war nach 24-stündiger Inkubation mit Anti-CD90-Antikörpern (AS02) verstärkt (120). Wetzel et al. zeigten, dass CD90+ Endothelzellen mit dem Integrin-Rezeptor CD11b/CD18 auf Leukozyten interagieren, und dass diese Interaktion die transendotheliale Migration der Leukozyten auslöst (144). Diverse Autoren unterscheiden CD90+ und CD90– Fibroblasten (47;88;152). CD90+ Fibroblasten repräsentieren einen weniger fibrogenen Phänotyp. Während CD90– Fibroblasten auf fibrogene Stimuli, wie IL-4, IL-1 , PDGF BB und Bleomycin, mit einer erhöhten TGF- -Aktivität und der Expression von Fibronektin und -SMA reagierten, zeigten CD90+ Fibroblasten diesbezüglich keine Reaktion (152). Die Verminderung der TGF- -Aktivität begründet sich allerdings nicht in einem Defizit in der Signaltransduktion (exogenes TGF löst eine Reaktion aus), sondern in der fehlenden Aktivierung von latentem TGF (152). In Rattenstämmen mit Neigung zur Lungenfibrose konnten vermehrt CD90– Fibroblasten gefunden werden (88). Hagood et al. fanden, dass innerhalb von Fibroblasten-Foci von Patienten mit IPF keine CD90+ Zellen vorhanden sind. In Lungenbiopsien von Normalpersonen dominierten dagegen CD90+ Fibroblasten (46). Weiterhin konnten die Autoren zeigen, dass in der CD90 Knock-out Maus eine induzierte Lungenfibrose schwerer verläuft (47). Hier ist allerdings in Betracht zu ziehen, dass murine T-Zellen anders als humane CD90 exprimieren, und somit auch ein Unterschied im Entzündungsprozess zum schwereren Verlauf der Lungenfibrose führen könnte. 1993 wurde entdeckt, dass in der fetalen Leber, im Nabelschnurblut und im Knochenmark des Menschen eine kleine Zellpopulation CD34+ CD90+ hämatopoetischer Vorläuferzellen auftritt (19). 24 Das Protein CD90 ist ein Vermittler der transendothelialen Migration sowie ein Regulator von Adhäsionsprozessen. Des Weiteren zeigt sich, dass CD90+ Fibroblasten einen weniger fibrogenen beziehungsweisen aktiveren Fibroblasten-Phänotyp darstellen. Möglicherweise stellen CD90+ Zellen eine Art Fibroblasten-Vorläuferzelle dar. 1.3.3 Vimentin Intermediäre Filamente sind die stabilsten Bausteine des Zellskeletts. Sie haben einen Durchmesser von ungefähr 10 nm und stehen mit Strukturen der Zelloberfläche, den Desmosomen und Hemidesmosomen, in Verbindung (57). Intermediärfilamente breiten sich vom Zellkern in den peripheren intrazellulären Raum aus (133). Ihre Funktion besteht darin, die Zelle gegenüber Zug- und Scherkräften zu stabilisieren. Jede Zelle besitzt intermediäre Filamente, jedoch in erheblich unterschiedlicher Ausstattung. Das Filament Vimentin ist typisch für mesenchymale Zellen, insbesondere für Fibroblasten (76). Doch wurde gezeigt, dass es auch von AM exprimiert wird (28). Somit ist die Vimentin-Expression alleine nicht zur Differenzierung zwischen AM und Fibroblasten geeignet. 1.3.4 CD68 Das Protein CD68 ist ein glykosilierter 110 kDa schwerer transmembranöser Rezeptor. Es kommt vor allem auf lysosomalen Membranen vor. Ein kleiner Anteil wird allerdings auch auf der Zelloberfläche exprimiert (134;139). Die Funktion von CD68 ist weitgehend unklar. Es gilt als Scavenger-Rezeptor für oxidiertes Low Densitiy Lipoprotein (LDL) (117) und ist möglicherweise in Zell-Zell-Interaktionen involviert. Diverse Arbeitsgruppen verwendeten CD68 als Makrophagenmarker. Kunisch et al. entdeckten in immunhistochemischen Färbungen die Koexpression von CD68 zusammen mit den Fibroblastenmarkern CD90 und Prolyl-4-Hydroxylase. Zudem fanden die Autoren, dass CD68 von synovialen Fibroblasten, Gingivafibroblasten und Fibroblasten aus der Haut exprimiert wird (71). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass auch CD68 zur Differenzierung zwischen FibroblastenVorläuferzellen und Alveolarmakrophagen nur begrenzt geeignet ist. 1.3.5 CCL18 Über die Expression des Chemokins CCL18 und über seine Rolle in der Pathogenese von Lungenerkrankungen ist bislang, abgesehen von dem Umstand, dass es in der Lunge entdeckt wurde, wenig bekannt (101). CCL18 wird von alternativ-aktivierten Makrophagen synthetisiert (39;40;68). Diverse Autoren beschreiben den Zusammenhang zwischen TH2-Zytokinen und Erkrankungen, 25 die mit einer Lungenfibrose einhergehen (102). Unsere Arbeitsgruppe konnte vor kurzem feststellen, dass Makrophagen von Patienten mit Lungenfibrose einen alternativ-aktivierten Phänotyp aufweisen (102). Alternativ-aktivierte Makrophagen synthetisieren unter anderem CCL18. Wir konnten zeigen, dass mit IL-4/IL-13 und IL-10 stimulierte Alveolarmakrophagen vermehrt CCL18 synthetisieren. Außerdem war festzustellen, dass auch der Kontakt zu nativem Kollagen und die Kokultivierung mit Fibroblasten eine vermehrte CCL18-Synthese hervorrufen. Da CCL18 Fibroblasten zur Kollagenproduktion (7) anregt, handelt es sich hier möglicherweise um einen sich selbstverstärkenden Regelkreis mit zentraler Bedeutung für die Entstehung einer Lungenfibrose. 1.3.6 CD206 1990 konnte die Struktur des Makrophagen-Mannose-Rezeptors (CD206) vollständig entschlüsselt werden (30). Der Rezeptor ist ein transmembranöses Glykoprotein und hat ein Molekulargewicht von 175 kDa. Verschiedene Autoren vermuten, dass CD206 in die Phagozytose von glykosylierten Pathogenen sowie in die Endozytose von Glykoproteinen involviert ist und außerdem die Antigenpräsentation beeinflusst (17;124;135). CD206 wird als Marker für Makrophagen und immature dendritsche Zellen (DZ) genutzt. Auf Monozyten und maturen DZ kommt CD206 nicht vor (148). CD206 ist einer der ersten dokumentierten Marker für alternativ-aktivierte Makrophagen (46;132). Erkrankungen, die zu einer Lungenfibrose führen, sind mit einem dominierenden TH2-Zytokinmilieu assoziiert (8;49;149). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass humane Alveolarmakrophagen nach Stimulation mit IL-4/IL-13 und IL-10 den Phänotyp von alternativaktivierten Makrophagen annehmen (108). In diesem Kontext zielte die vorliegende Arbeit unter anderem darauf ab, native Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und von Patienten mit Lungenfibrose hinsichtlich ihrer CD206-Oberflächenexpression zu untersuchen. 26 1.4 Fragestellung Ziel dieser Arbeit war es Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose und von Normalpersonen systematisch hinsichtlich der Expression von Zellmarkern zu untersuchen. Hierbei ergaben sich im Detail folgende Fragen: 1. Welcher Zellmarker eignet sich zur Identifikation von Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der bronchoalveolären Lavage? 2. Sind mittels dieser Zellmarker Fibroblasten-Vorläuferzellen in der bronchoalveolären Lavage zu identifizieren? 3. Exprimieren Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose vermehrt Marker der alternativen Immunantwort? 27 2 Materialien und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Geräte Begasungsbrutschrank Heraeus Stuttgart, D Computer Power Macintosh G3 Apple, Cork, IRL Counter AC-12 Karl Hecht, Sondheim, D Durchflusszytometer FACScan/FACSCalibur Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ELISA-Reader Bio-Tek Instruments Inc., Gödenstorf, D Mikroskop Axiolab Carl Zeiss, Oberkochem, D Mikroskop CK2 Olympus, Hamburg, D Multichannel Pipette 12-Kanal (200 μl) Brand.Wertheim/Main, D Neubauer-Zählkammer, verbessert Brand.Wertheim/Main, D pH-Meter pH535 MultiCal WTW, Weilheim, D Pipetten (10, 50, 200, 1000 ml) Ratiolab, Dreieich, D Pipetten (20, 100, 1000 ml) Labsystems, Helsinki, FIN Pipetus akku Hirschmann, Eberstadt, D Präzisionswaage Scaltec SBC52 Scalted, Heiligenstadt, D Software CellQuest 3.2.1 Becton Dickinson, San Jose, CA, USA Software SigmaStat Version 3.1 SPSS, Erkrath, D Stepper Eppendorf, Hamburg, D Whirler REAX 2000 Heidolph, Kelheim, D Werkbank Hera Safe Typ HS18 Heraeus, Stuttgart, D Zentrifuge Centrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg, D Zentrifuge LaboFuge 400R Heraeus, Stuttgart, D Zentrifuge Rotixa/RP Hettich, Tuttlingen, D 2.1.2 Verbrauchsmaterialien Adhäsionsobjektträger Marienfeld, Bad Mergentheim, D Chamber Slide Nalge Nunc International, Rochester, USA 28 Deckgläser 24x60 Engelbrecht, Edermünde, D FACS Flow TM BectonDickinson, San Jose, CA, USA FACS Rinse TM BectonDickinson, San Jose, CA, USA FACS Clean TM BectonDickinson, San Jose, CA, USA FACS-Röhrchen (0,6ml) Greiner Labortechnik, Frickenhausen, D Handschuhe Sensiclean Latex/Nitratex Ansell, München, D Kulturplatten costar 6 Well Culture ClusterComing Inc., Corning, NY, USA Kulturplatten costar 24 Well Culture ClusterComing Inc., Corning, NY, USA Pipettenspitzen Brand, Wertheim/Main, D Polystyrol Rundbodenröhrchen 14ml BectonDickinson, Franklin Lakes, USA Polystyrol Pipette Stripette (5, 10, 20 ml) Corning Inc., Corning, NY, USA Reagenzröhrchen Falcon (15, 50 ml) BectonDickinson, Lincoln Park, NY, USA Reaktionsgefäße (1;5 und 2 ml) Eppendorf, Hamburg, D Rundbodenplatten 96 Well NUNC Brand Products, DK Zellkulturflaschen (175 cm²) BD Falcon, Bedford, USA 2.1.3 Chemikalien, Biochemikalien und Medien Avidin-Peroxidase Labeled Sigma, Deisenhofen, D Bovine serum albumin (BSA) Sigma, Dreisenhofen, D Collagen-R (Rattenschwanz) SERVA, Heidelberg, D D-PBS Gibco Life Technologies, Paisley, GB DAB (Diaminobenzidin) DakoCytomation, DK Fetal Calf Serum (FCS) Sigma, Deisenhofen, D Glutaraldehyd Merck, Darmstadt, D Glycergel DakoCytomation, DK HEPES Carl Roth, Karlsruhe, D Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt, D NAG (N-Acetyl-D-Glucosamin) Merck, Darmstadt, D Natriumazid (NaN3) Merck, Darmstadt, D Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt, D Paraformaldehyd Merck, Darmstadt, D Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, D Quantum Makrophagen Medium PAA-Laboratories, Pasching, A Quantum Fibroblasten Medium PAA-Laboratories, Pasching, A 29 Saponin Fluka, Buchs, CH Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt, D Schwefelsäure (H2SO4) Merck, Darmstadt, D Sucrose Sigma, Deisenhofen, D Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma, Deisenhofen, D Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Merck-Schuchard, Hohenbrunn, D Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt, D Zitronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt, D 2.1.4 Puffer und Lösungen a) Antikörperverdünnungslösung PBS mit 0,1% Natriumazid und 2% FCS b) Permeabilisierungslösung für die FACS-Messungen PBS mit 1% FCS und 0,1% Saponine c) Fixationslösung für die FACS-Messungen PBS mit 4% Paraformaldehyd d) Fixationslösung für die immunzytologischen Färbungen PBS mit 0,04% Glutaraldehyd e) Waschpuffer für die FACS-Messungen PBS mit 1% FCS 30 f) NKH (Natrium-Kalium-HEPES)-Waschpuffer für die immunzytologischen Färbungen 998 ml destilliertes H2O mit 8,0 g NaCl 0,4 g KCL 2 ml HEPES (auf den pH-Wert 7,4 eingestellt) g) Eiweißfreier NAG (N-Acetyl-D-Glucosamin)-Blockpuffer für die immunzytologischen Färbungen 10 ml NAG mit 9 ml NKH-Waschpuffer 400 μl 5% Gelatine 400 μl HEPES (auf den pH-Wert 8,0 eingestellt) h) ELISA-Waschpuffer PBS mit 0,05% Tween 20 i) ELISA-Blockpuffer PBS mit 1% BSA 0,5% Natriumazid 5% Sucrose j) ELISA-Substratpuffer 500 ml destilliertes Wasser mit 3,15 g Zitronensäure-Monohydrat 31 2.1.5 Antikörper Für diese Arbeit wurden die folgenden Antikörper und komplexbildende Moleküle verwendet (s. Tab. 1). Tabelle 1: Antikörper und komplexbildende Moleküle Antigen Wirt Konjugat Firma Anti-CCL18 Hase Biotin R&D, Minneapolis, USA Anti-CCL18 Ziege unkonjugiert R&D, Minneapolis, USA Anti-CD68 Maus FITC Dako A/S DK Anti-CD68 Maus PE Santa Cruz USA Anti-CD206 Maus FITC BD, Pharmigen Anti-Hase-IgG Ziege Peroxidase Jackson ImmunoResearch, USA Anti-Maus-IgG Hase Peroxidase Jackson ImmunoResearch, USA Anti-Kollagen Typ I Hase Biotin Biomol D Anti-Kollagen Typ I Maus unkonjugiert Biomol, D Anti- SMA Maus FITC Acris, Hiddenhausen, D Anti-Thy1 (Klon ASO2) Maus FITC Dianova, Hamburg Anti-Vimentin Maus FITC Santa Cruz USA IgG (Isotypkontrolle) Hase FITC Dako A/S DK IgG (Isotypkontrolle) Maus FITC Dako A/S DK IgG (Isotypkontrolle) Hase PE Dako A/S DK IgG (Isotypkontrolle) Maus PE Dako A/S DK IgG (Isotypkontrolle) Hase unkonjugiert Dako A/S DK IgG (Isotypkontrolle) Maus unkonjugiert Dako A/S DK Streptavidin (bindet Biotin) – PE Dako A/S DK Streptavidin (bindet Biotin) – FITC Dako A/S DK 2.2 Methoden 2.2.1 Auswahl der Probanden Die Normalpersonen sowie die Patienten mit Lungenfibrose waren Teilnehmer einer Studie der Firma Boehringer-Ingelheim und wurden entsprechend aufgeklärt und entlohnt. Für die Studie liegt ein Ethikvotum vor. 32 2.2.2 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) 2.2.2.1 Durchführung Nach der intramuskulären Injektion von Atropin und Dicodid sowie der suprapharyngealen Applikation eines Lokalanästhetikums (Novesin-Spray®) erfolgte die Intubation des Probanden mit dem Bronchoskop. Es wurden 300 ml sterile, angewärmte Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) über einen Katheter in 25 ml Portionen in den Mittellappen instilliert und unmittelbar folgend wieder aspiriert. Die gewonnene Flüssigkeit wurde auf Eis gelagert und der weiteren Aufarbeitung zugeführt. 2.2.2.2 BAL-Aufarbeitung Um die BAL von Schleim und groben Verunreinigungen zu befreien, wurde sie zunächst durch eine zweilagige Gaze filtriert und anschließend bei 500 G und 4° C für zehn Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt, und das verbliebene Zellsediment mit PBS aufgewirbelt und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Dieser Arbeitsschritt wurde noch einmal wiederholt. Anschließend wurden in der Regel zwei Millionen Zellen mit 200 μl 4%igem Paraformaldehyd versetzt und für zehn Minuten auf Eis inkubiert. Es erfolgten zwei Waschschritte mit PBS, um die fixierten Zellen schließlich in 200 μl PBS aufzunehmen und für die durchflusszytometrischen Messungen im Kühlschrank (4° C) bereitzustellen. 2.2.3 Isolation und Kultur der Fibroblasten Von sechs Patienten, drei davon mit Tumorerkrankungen und drei mit Lungenfibrose, wurde Lungengewebe verwendet. Sie waren im Rahmen einer Teilresektion beziehungsweise Biopsie in der Lungenchirurgie behandelt worden. Das Lungengewebe wurde dreimal mit 4° C kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Gewebeproben in 6-Well-Kulturplatten in Quantum Fibroblasten Medium und 1% Penicillin/ Streptomycin aufgenommen. Das Gewebe wurde bei 37° C für zwei bis drei Wochen im Begasungsbrutschrank kultiviert. Daraufhin wurden die auf dem Gewebsschnitten gewachsenen Zellen in 175 cm² große Zellkulturflaschen instilliert, um nach mehreren Passagen eine möglichst reine Population von Fibroblasten zu erhalten. Nach vier bis fünf Passagen wurden die Zellen abgelöst und mit 4%igem Paraformaldehyd auf Eis für zehn Minuten inkubiert. Nach zwei Waschgängen mit PBS bei 500 G und RT und anschließender Resuspension in 200 μl PBS wurden die Fibroblasten im Kühlschrank für die durchflusszytometrischen Messungen bereitgestellt. 33 2.2.4 Durchflusszytometrie/Fluorescence-activated-cell-sorter (FACS) 2.2.4.1 Hintergrund Das Durchflusszytometer ist ein optisches Messinstrument, mit dem sich die charakteristische Lichtemission, Streulicht wie Fluoreszenzlicht, einzelner Zellen erfassen lässt. Das Zytometer besteht aus drei Untereinheiten, der optischen Einheit (Laser), dem Flüssigkeitssystem (Trägersystem) und der Signalverarbeitung. Die Zellen werden in einer Trägerflüssigkeit durch eine Quarzküvette am Messpunkt vorbeigeführt. An dieser Stelle werden sie von einem Argonlaser mit einer Emissionswellenlänge von 488 nm bestrahlt. Vor dem Auftreffen auf die Zellen wird das blaugrüne monochromatische Laserlicht mit einem Linsensystem fokussiert (optische Einheit). Das Laserlicht wird an den Zellen „elastisch“, also ohne Energieverlust, in verschiedene Richtungen gestreut. An markierten Zellen findet zusätzlich inelastische Streuung (Fluoreszenz) statt. Vom Streulicht erfasst die Messapparatur sowohl das „Vorwärtsstreulicht“ (Forwardscatter, FSC) als auch das „Seitwärtsstreulicht“, welches etwa im 90°-Winkel abgestrahlt wird (Sidescatter, SSC). Die Intensität des Vorwärtsstreulichts ist ein Maß für die Größe der Zellen, die des Seitwärtsstreulichts für ihre Granularität. Bei der inelastischen Streuung wird das einstrahlende Licht zunächst auf den markierten Zellen absorbiert und in Form von Fluoreszenzlicht emittiert. Da bei den Absorbtions- beziehungsweise Anregungsprozessen ein Teil der Lichtenergie verbraucht wird, hat das abgestrahlte Fluoreszenzlicht eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte Laserlicht. Fluoreszenz findet nur bei jenen Zellen statt, die zuvor mit fluoreszierenden Farbstoffen (Fluorochromen) markiert worden sind. Die verwendbaren Fluorochrome müssen Exzitationswellenlängen im Bereich des eingestrahlten Laserlichts aufweisen. Ihre jeweilige Fluoreszenzwellenlänge ist charakteristisch, das heißt, die zuvor spezifisch markierten Zellen lassen sich anhand ihres Fluoreszenzlichts identifizieren. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird im Zytometer sowohl qualitativ (Wellenlänge) wie quantitativ (Lichtintensität) erfasst. In der vorliegenden Arbeit wurden zur Zellmarkierung zwei Fluorochrome verwendet. Ihre jeweilige Exzitations- und Fluoreszenzwellenlänge zeigt die Tabelle 2. Tabelle 2: Exzitations- und Fluoreszenzwellenlänge der verwendeten Fluorochrome Fluorochrom Exzitationswellenlänge (nm) Emmissionswellenlängenbereich (nm) Fluoreszein (FITC) 488 505-530 R-Phycoerythrin (PE) 488 560-585 34 Das Durchflusszytometer erfasst sowohl das Streulicht (488nm) als auch das Fluoreszenzlicht (Emissionswellenlänge des jeweiligen Fluorochroms). Es sortiert das Licht aus der Küvette über ein System aus Spiegeln und Filtern nach seiner Wellenlänge (spektrale Zerlegung) und führt jeweils ein benutzerdefiniertes Wellenlängenband der Signalverarbeitung beziehungsweise Intensitätsmessung zu. Da sich die Bänder der Emissionswellenlängen der beiden hier verwendeten Fluorochrome überlappen, muss der Überlappungsbereich rechnerisch herausdifferenziert beziehungsweise kompensiert werden. Die grafische Darstellung der Zellen auf dem Computer erfolgt als Punkte in einem zweiachsigen Koordinatensystem. Dies bezeichnet man als „Punktediagramm“ (Dot Plot). In einem FSC/SSC Dot Plot werden die Zellen anhand ihrer Größe und Granularität (Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht) dargestellt. Die Zellen können anhand ihrer Koordinaten einer Population zugeordnet, eingegrenzt und separat auf ihre Fluoreszenzmarker (Fluorochrome) hin untersucht werden. 2.2.4.2 Durchflussz ytometrische Versuchsanleitung 10 μl der zu messenden Probe (zwei Millionen/200 μl, also 100.000 Zellen) wurden mit 10 μl der Antikörperlösung (1:25 oder 1:50 in PBS 10% FCS 1%NaN3) für 20 Minuten bei RT im Dunkeln in einem Rundbodenröhrchen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 200 μl FACSWaschpuffer bei 500 G und RT für fünf Minuten zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand abgesaugt und derselbe Schritt noch einmal durchgeführt. Schließlich wurden die Zellen in 100 μl PBS aufgenommen und im Durchflusszytometer gemessen. Falls eine Doppelfärbung gewünscht oder ein biotinylierter Antikörper notwendig war, wurde der oben aufgeführte Versuchsablauf anschließend mit dem zweiten Antikörper beziehungsweise dem fluoreszenzmarkierten Streptavidin wiederholt. Insbesondere für die Kollagen- und CCL18-Färbung wurde die Streptavidin-Biotin-Methode verwendet. Der primäre Antikörper bindet an ein spezifisches Antigen und trägt das Molekül Biotin. Im zweiten Schritt wird fluoreszenzmarkiertes Streptavidin zugesetzt, welches wiederum hochaffin an Biotin bindet. Wenn es erforderlich war, intrazelluläre Antigene zu detektieren, wurde gleichzeitig mit dem ersten Antikörper 20 μl Permeabilisierungslösung (0,1% Saponin in PBS) zugegeben. Beim Waschen wurde anstelle des Waschpuffers Permeabilisierungslösung verwendet. Diese Lösung gewährleistet eine Steigerung der Membranpermeabilität und damit das Eindringen der fluoreszenzmarkierten Antikörper in das Zellkompartiment. Als Negativkontrolle diente sowohl der sekundäre Komplex (fluoreszenzmarkiertes Streptavidin) im Rahmen der Streptavidin-Biotin-Methode als auch die Färbung mit der fluoreszenzmarkierten (je nach verwendetem Fluorochrom) IgG-Isotypkontrolle. Je nachdem, ob intra- oder extrazellulär, wurde permeabilisiert oder nicht. 35 2.2.5 Enzym-linked-immunosorbent-assay (ELISA) 2.2.5.1 Hintergrund Das Prinzip der Immunoassays beruht auf der Antigen-Antikörper-Reaktion. Der primäre Antikörper (Fänger-Antikörper) bindet mit der Fc-Region direkt an die Rundbodenplatte (feste Phase). Anschließend wird die zu untersuchende Lösung auf die Platte gegeben. Das gesuchte Antigen bindet an die Epitope des Fängerantikörpers. Daraufhin wird der Detektionsantikörper aufgetragen, er bildet nun mit dem Antigen und dem Fängerantikörper einen Immunkomplex. Der Detektionsantikörper trägt das Molekül Biotin. Nun wird der Streptavidin-Peroxidase-Komplex zugesetzt, dieser bindet wiederum hochaffin an Biotin und löst unter Substratzugabe eine Farbreaktion aus, welche photometrisch mit dem ELISA-Reader gemessen werden kann. Um die Daten zu quantifizieren, werden Standardlösungen mit einer definierten Konzentration des Antigens parallel untersucht. 2.2.5.2 CCL18-ELISA Um die CCL18-Konzentration in der zellfreien BAL-Flüssigkeit (BALF) von Patienten mit Lungenfibrose und Normalpersonen zu messen, wurden ELISA-Messungen durchgeführt. 100 μl des Fängerantikörpers (Anti-CCL18, unkonjugiert, R&D, USA) (Konzentration 1 : 200 in PBF) wurden in jedes Well einer Rundbodenplatte pipettiert, bei RT über Nacht inkubiert. Anschließend wurde die ELISA-Platte fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Um unspezifische Bindungen zu vermeiden, wurde in jedes Well 100 μl Blockpuffer pipettiert und eine Stunde bei RT inkubiert. Nun wurde fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Nach dem Blocken wurden 50 μl der 1 : 10 verdünnten BALF, die verschiedenen Verdünnungen der Standardlösung und der Leerwert (PBS/BSA[1%]) aufgetragen und über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Daraufhin wurde fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Nun wurde der Detektionsantikörper (Anti-CCL18, biotinyliert, R&D, USA) (Konzentration 1 : 300 in PBF/1% BSA) in die Wells pipettiert, die Rundbodenplatte zwei Stunden bei RT inkubiert und danach fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Im nächsten Schritt wurde der Streptavidin-Peroxidase-Komplex 1 : 400 mit PBS verdünnt, aufgetragen, eine halbe Stunde bei RT inkubiert und daraufhin fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Die Farbreaktion wurde mit 100 μl TMB pro Well, 1 : 20 in Substratpuffer verdünnt, entwickelt und mit Schwefelsäure abgestoppt. Schließlich wurden die Proben im ELISA-Reader gemessen. 2.2.6 Immunzytologische Färbungen 2.2.6.1 Hintergrund Die immunzytologischen Färbungen wurden durchgeführt, um Kollagen und CD90 auf BALZellen und Fibroblasten zu identifizieren. Sie dienten sowohl als Redundanz zur FACS-Messung 36 als auch dazu, das Verteilungsmuster der Kollagen- beziehungsweise CD90-Expression sowie die Morphologie der positiven Zellen zu untersuchen. Bei der immunzytologischen Färbung werden die Zellen an einen Objektträger gebunden und anschließend mit dem primären Antikörper inkubiert. Der primäre Antikörper bindet an das gesuchte Antigen. Jetzt wird ein sekundärer, beispielsweise mit dem Enzym Peroxidase konjugierter, Antikörper aufgetragen (zum Intensivieren der Farbreaktion kann noch ein tertiärer Antikörper verwendet werden). Dieser wiederum bindet an den primären (der tertiäre an den sekundären) Antikörper. Schließlich wird mit einem Substrat die Farbreaktion ausgelöst. 2.2.6.2 Immunz ytologische Versuchsanleitung Für die Adhäsion der Zellen wurden Adhäsionsobjektträger (AO) verwendet. Die Zellen adhärieren aufgrund elektrostatischer Kräfte auf den Reaktionsfeldern (RF). Für die Färbung der morphologisch ausdifferenzierten Fibroblasten wurden 50.000 Fibroblasten in 100 μl Quantum Medium auf jedes Feld eines Kammerobjektträgers pipettiert und für 24 Stunden im Kulturschrank inkubiert. Der Adhäsions- beziehungsweise Kammerobjektträger wurde zunächst fünf Minuten bei RT in NKH-Puffer gelegt. Nach leichtem Abklopfen wurden 10-20 μl der zu messenden Probe auf jedes RF aufgetragen, und der Objektträger zur Sedimentation und Adhäsion 15 Minuten lang in einer feuchten Kammer gelagert. Auch alle folgenden Inkubationsschritte erfolgten in einer feuchten Kammer. Nach dem Abklopfen wurde jedes RF mit 10-20 μl Fixationslösung (0,04% Glutaraldehyd) benetzt und für 15 Minuten inkubiert. Nach drei Waschgängen mit NKH-Puffer wurde, um unspezifische Bindungen zu vermeiden, auf jedes RF eiweißfreier NAG-Puffer pipettiert und wiederum für 15 Minuten inkubiert. Daraufhin wurde der primäre Antikörper (Anti-Collagen Typ 1, Hase, biotinyliert, Biomol, D) 1 : 50 in eiweißfreiem NAG-Blockpuffer verdünnt und in 10 μl Portionen auf die entsprechenden Wells pipettiert. Als Kontrolle dienten 10 μl des NAGBlockpuffers ohne Antikörper. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wurden die RF mit NKH-Puffer und einer Pipette abgespült. Der sekundäre Antikörper (Anti-Maus, Hase, Peroxidase, Jackson ImmunoResearch, USA) wurde 1 : 50 mit eiweißfreiem NAG-Puffer verdünnt. Anschließend wurden 10 μl der Verdünnung auf jedes Reaktionsfeld pipettiert und 30 Minuten inkubiert. Nun wurden die RF wieder mit NKH abgespült und darauf folgend derselbe Schritt mit dem tertiären Antikörper (Anti-Hase, Ziege, Peroxidase, Jackson ImmunoResearch, USA) wiederholt. Nach dem Abspülen mit NKH-Puffer wurde DAB mit 1% H2O2 versetzt und 10 μl der Lösung auf jedes RF aufgetragen. Nach zehn Minuten wurde das DAB/H2O2 (1%) entsorgt, der AO/Chamberslide unter dem Abzug abgespült und daraufhin mit Glycergel und einem Deckglas abgedeckt. Zur intrazellulären immunzytologischen Färbung wurden dem NKH-Puffer und dem NAG-Puffer sowie den Antikörperverdünnungslösungen jeweils 0,1% Saponin hinzugefügt. 37 2.2.7 Kollagenexposition von BAL-Zellen 2.2.7.1 Hintergrund Die Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe hatten gezeigt, dass sich in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose Kollagen Typ I positive Zellen befinden. Um zu untersuchen, ob Alveolarmakrophagen Kollagen Typ I auf ihrer Oberfläche binden können, wurden BAL-Zellen für drei Stunden mit Kollagen Typ I inkubiert und nachfolgend hinsichtlich der Kollagen-Expression im FACS untersucht. 2.2.7.2 Versuchsanleitung Es wurden entsprechende Wells einer 24 Well-Kulturplatte mit einer Lösung aus destilliertem Wasser und 10% Rattenschwanz-Kollagen Typ I (Collagen-R, SERVA, Heidelberg, D) für 24 Stunden im Kulturschrank gecoated. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und verworfen. Nun wurden 500.000 native BAL-Zellen in 500 μl Makrophagen Medium in je ein mit Collagen-R gecoatetes und ein ungecoatetes Well (als Negativ-Kontrolle) gegeben. Nach drei Stunden im Kulturschrank wurden die Zellen abgesaugt und bei 500 G für fünf Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, die Zellen in 200 μl 4%igem Paraformaldehyd aufgenommen und für zehn Minuten auf Eis gelagert. Nach der Fixation wurden die Zellen für fünf Minuten bei 500 G zentrifugiert und mit 200 μl PBS resuspendiert. Dieser Schritt wurde noch einmal wiederholt. Schließlich wurden die Zellen in 100 μl PBS aufgenommen und der FACSAnalyse zugeführt. 2.2.8 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Computerprogramm „Sigma Stat3.1“. Alle Werte wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf eine Normalverteilung geprüft. Normalverteilte Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben und als Balkendiagramm mit Fehlerbalken dargestellt. Nicht-normalverteilte Daten wurde als Median + Range angegeben und in Form von „BoxPlots“ dargestellt. Die Mittellinie zeigt den Median an. Der Balken umfasst die 25-75 Perzentile, die senkrechten Linien zeigen die 10-90 Perzentile. Die Korrelation nicht-normalverteilter Daten wurde mit Hilfe des Spearman-Test berrechnet. Die Kollektive wurde mit dem t-test, paired t-test, Mann-Withney U Test und Wilcoxon Test verglichen. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Zwei Parameter wurden als korrelant angesehen, wenn der Korrelationskoeffizient (r) größer 0,5 oder kleiner –0,5 und der p-Wert <0,05 war. 38 3 Resultate 3.1 Studienpopulation Das untersuchte Probandenkollektiv bestand aus 17 Normalpersonen (10 Männer, 7 Frauen) und 26 Patienten mit Lungenfibrose (17 Männer, 9 Frauen). Alle Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben. Die Normalpersonen waren 24,3 ± 2,6 Jahre alt. Das Alter der Patienten mit fibrosierender Lungenerkrankung war 62,8 ± 12,3 Jahre. Das Kollektiv der Normalpersonen bestand aus 13 Rauchern und vier Nichtrauchern. Unter den Patienten mit Lungenfibrose waren 21 Nichtraucher und fünf Raucher. Das Kollektiv der Patienten mit Lungenfibrose setzte sich aus fünf Patienten mit BOOP (5 Nichtraucher), neun Patienten mit IPF (6 Nichtraucher, 3 Raucher), sechs Patienten mit SSC (5 Nichtraucher, 1 Raucher) und fünf Patienten mit NSIP (5 Nichtraucher und ein Raucher) zusammen (s. Abb. 1). a) Frauen Männer 40 35 b) BOOP; 5 IPF; 9 30 Anzahl 25 20 15 10 NSIP; 6 5 0 Normalpersonen Kontrolle SSC; 6 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose c) 30 Anzahl 25 Nichtraucher Raucher 20 15 10 5 0 Normal- Patienten mit IPF personen Lungenfibrose SSC NSIP BOOP Abbildung 1: Studienpopulation. a) Die Anzahl der Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose sowie die Verteilung von Männern und Frauen (schwarz = Männer; weiß = Frauen). b) Die verschiedenen Formen der Lungenfibrosen (Farbkodierung siehe Legende). c) Der Rauchstatus der zwei Versuchsgruppen, ebenfalls aufgeschlüsselt in die verschiedenen Formen der Lungenfibrose (schwarz = Nichtraucher; weiß = Raucher). 39 3.1.1 Differentialzytologie Dieser Abschnitt zeigt die BAL-Differentialzytologie für beide Versuchsgruppen. Die Differentialzytologie ist ein Verfahren, welches zur Routinediagnostik von interstitiellen Lungenerkrankungen eingesetzt wird. Alveolarmakrophagen (AM), neutrophile (NG), eosinophile (EG) und basophile Granulozyten, Lymphozyten (LZ) und Mastzellen (MZ) werden anhand ihrer Morphologie lichtmikroskopisch und mit Hilfe der May-Grünwald-Färbung unterschieden. Alle Werte sind im Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. Die BAL der Normalpersonen enthielt 19,2 ± 11,5 Millionen Zellen/100 ml, diejenige der Patienten mit Lungenfibrose 17,7 ± 12,5 Millionen Zellen/100 ml. Somit differierte die Zellzahl nicht signifikant. In der BAL der Normalpersonen waren enthalten: 95,9 ± 2,0% AM, 3,4 ± 1,9% LZ, 0,7 ± 0,6% NG, 0,1 ± 0,2% EG und 0,0 ± 0,0% MZ. Die BAL der Patienten mit Lungenfibrose bestand aus 68,1 ± 24,7% AM, 15,2 ± 18,3% LZ, 11,6 ± 17,7% NG, 4,4 ± 6,7% EG und 0,5 ± 0,9% MZ. Der Anteil der NG (p<0,001) und der LZ (p<0,001) war in der BAL der Patienten mit Lungenfibrose signifikant höher als in der BAL der Normalpersonen. Die BAL der Normalpersonen enthielt signifikant mehr AM (p<0,001) (s. Abb. 2 und Tab. 3). LZ NG EG MZ EG NG AM LZ AM Abbildung 2: Differentialzytologie. Links: Die Differentialz ytologie der Normalpersonen. Rechts: Die Differentialz ytologie der Patienten mit Lungenfibrose. AM = Alveolarmarkophagen; LZ = Lymphoz yten; NG = neutrophile Granuloz yten; EG = eosinophile Granuloz yten; MZ = Mastzellen. 3.1.2 Lungenfunktion Charakteristisch für interstitielle Lungenerkrankungen ist eine restriktive Ventilationsstörung und eine Verminderung der Diffusionskapazität. Die restriktive Ventilationsstörung lässt sich sowohl über die ganzkörperplethysmographisch gemessene totale Lungenkapazität (TLC) als auch über die Messung der Vitalkapazität (VC) erfassen. Sowohl die TLC als auch die VC sind im Falle einer interstitiellen Lungenerkrankung vermindert. Zudem ist bei einer Verminderung der Diffusionska- 40 pazität, wie sie im Rahmen einer interstitiellen Lungenerkrankung auftritt, auch der Transferfaktor für Kohlenstoffmonoxid (TLCOc/VA) verringert. Die Parameter sind im Folgenden in Prozenten der Norm angegeben. 3.1.2.1 Totale Lungenkapazität (TLC) Die TLC der Normalpersonen betrug 102,1 ± 7,8%, die der Patienten mit Lungenfibrose 65,5 ± 15,9%. Dieser Unterschied war statistisch signifikant (p<0,001) (s. Abb 3). 3.1.2.2 Vitalkapazität (VC) Die VC der Normalpersonen betrug 99,7 ± 9,8%, die der Patienten mit Lungenfibrose 64,2 ± 21,1%. Die VC der Normalpersonen war signifikant höher (p<0,001) als die der Patienten mit Lungenfibrose (s. Abb. 3). 3.1.2.3 Diffusionskapazität (TLCOc/VA) Die TLCOc/VA der Normalpersonen betrug 86,9 ± 16,0%, die der Patienten mit fibrosierender Lungenerkrankung 62,6 ± 16,5%. Der Unterschied zwischen den Versuchsgruppen war signifikant (p<0,001) (s. Abb. 3). a) p<0,001 120 b) 60 40 p<0,001 80 60 40 20 20 0 c) 120 100 80 VC [%] TLC [%] 100 Normalpersonen Kontrolle 120 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose 0 Normalpersonen Kontrolle 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose p<0,001 TLCOc/VA [%] 100 80 60 40 20 0 Kontrolle Normalpersonen 1 Lungenfibrose Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 3: Ausgewählte Parameter der Lungenfunktion. a) Die totale Lungenkapazität (TLC) in Prozent der Norm. b) Die Vitalkapazität (VC) in Prozent der Norm. c) Die Diffusionskapazität (TLCOc/VA) in Prozent der Norm. Es sind jeweils Patienten mit Lungenfibrose und Normalpersonen gegenübergestellt. Die Messungen sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. 41 Tabelle 3: BAL-Differentialzytologie und Lungenfunktionsparameter im Detail. NP = Normalpersonen; IPF = idiopathische pulmunale Fibrose; SSC = Sklerodermie; NSIP = nichtspezifische interstitielle Pneumonie; BOOP = Bronchiolitis obliterans organisierende Pneumonie; AM = Alveolarmakrophagen; NG = neutrophile Granuloz yten; LZ = Lymphoz yten; EG = eosinophile Granuloz yten; MZ = Mastzellen; TLC = totale Lungenkapazität in Prozent der Norm; VC = Vitalkapazität in Prozent der Norm; TLCOc = Diffusionskapazität in Prozent der Norm. AM [%] NG [%] LZ [%] EG [%] MZ [%] TLC [%] VC [%] TLCOc/VA [%] NP 95,8±2,0 0,7±0,6 3,4±1,9 0,1±0,2 0,0±0,0 102,1±7,8 99,7±9,8 86,9±16,0 IPF 65,0±28,8 11,3±9,8 15,9±27,1 7,2±9,4 0,3±0,5 55,9±19,4 49,8±23,1 53,8±24,6 SSC 79,8±21,8 10,3±19,0 6,7±6,1 2±1,8 0,8±1,6 71,9±8,9 69,1±18,6 64,8±19,0 NSIP 75,3±16,6 3,3±1,9 17,3±12,4 3,4±5,3 0,6±0,5 69,1±14,1 73,4±18,5 62,7±11,1 BOOP 50,8±22,8 23,6±32,0 21,8±14,3 3,2±6,058 0,4±0,548 69,6±14,9 73,2±13,5 67,3±13,4 3.2 Antigenexpression von Alveolarmakrophagen aus der BAL In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression verschiedener Antigene auf und in BAL-Zellen von Normalpersonen und von Patienten mit Lungenfibrose bestimmt. Als Messinstrument diente das Durchflusszytometer. Die Zellen wurden mit 4%iger Paraformaldehyd-Lösung fixiert, anschließend mit Fluoreszenz-Antikörpern markiert und im FACS gemessen. Als Negativkontrolle diente sowohl die in der spezifischen Fluoreszenz markierte IgG-Isotypkontrolle als auch der sekundäre Komplex (fluoreszierendes Streptavidin) (s. Abb. 4). Die folgenden Messwerte beziehen sich auf Zellen, welche aufgrund ihrer Granularität und Größe im „FSC/SSC-DotPlot“ des Durchflusszytometers in der für Alveolarmakrophagen charakteristischen Region anzutreffen sind (s. Abb. 4). Es wurde die Expression von Kollagen Typ I, CD68, CCL18, CD90, CD206 und Vimentin untersucht. R1 Abbildung 4: Exemplarische Orginalabbildung (DotPlot) einer Kontroll-FACS-Messung. Links: Die umrandeten Zellen befinden sich in der für Alveolarmakrophagen typischen Region (R1) im SSC/FSC–Dot-Plot. Mitte: IgG-FITC/PE-Isotypkontrolle; rechts: Streptavidin-PE Kontrolle. 42 Angegeben ist im Folgenden sowohl der Prozentsatz positiver Zellen als auch die relative Fluoreszenzintensität (RFI). Die RFI ist ein Maß für die Expressionsdichte des Moleküls auf beziehungsweise in den Zellen. Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. 3.2.1 Kollagen Typ I Kollagen Typ I ist ein Protein der extrazellulären Matrix mit einem Molekulargewicht von circa 285 kDa. Fibroblasten exprimieren charakteristischerweise Kollagen Typ I auf ihrer Oberfläche. Der Kontakt von nativem Kollagen zu AM resultiert in einer erhöhten Sekretion von CCL18, einem Chemokin der alternativen Immunantwort. Die BAL-Zellen der Normalpersonen waren zu 9,1 ± 24,1% mit einer RFI von 6,9 ± 14,3 positiv für Kollagen Typ I. In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose waren 83,1 ± 25,2% Kollagen Typ I+ Zellen vorhanden. Die RFI betrug 37,2 ± 32,3. Die Werte beider Versuchsgruppen unterschieden sich sowohl hinsichtlich des prozentualen Anteils Kollagen Typ I+ Zellen (p<0,001) als auch bezüglich der RFI (p<0,001) hoch signifikant (s. Abb. 5.0-5.3). 3.2.1.1 Intrazelluläres Kollagen Typ I Um Kollagen Typ I intrazellulär messen zu können, wurden die BAL-Zellen mit Saponin behandelt. Saponin perforiert die Zellmembran und ermöglicht damit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern den Eintritt in den intrazellulären Raum. In der BAL der Normalpersonen waren 16,1 ± 33,9% der AM Kollagen Typ I+. Die RFI betrug 6,9 ± 8,7. Die Zellen aus der BAL der Patienten mit Lungenfibrose waren zu 92,2 ± 16,8% mit einer RFI von 54,6 ± 34,6 positiv für Kollagen Typ I. Auch für die Messungen nach Saponin-Behandlung waren somit in der BAL der Patienten mit Lungenfibrose signifikant mehr Kollagen Typ I+ Zellen (p<0,001) sowie eine signifikant höhere RFI für Kollagen Typ I zu finden (p<0,001) (s. Abb. 5.4-5.7). 43 p<0,001 120 100 100 80 80 RFI Kol I Kol I [%] 120 60 40 20 0 60 40 20 Normalpersonen Kontrolle 0 Patienten mit Lungenfibrose 1 Lungenfibrose Abbildung 5.0: Kollagen I-FACS-Messungen (Prozent). Prozentsatz [%] Kollagen Typ I (Kol I) positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Pati-enten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Normalpersonen Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 5.3: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung. Die gestrichelte Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für Kollagen Typ I (Kol I), die durchgezogene Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für Kollagen Typ I. RFI Kol I mit Saponin 120 100 80 60 40 20 0 100 1 Lungenfibrose Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 5.4: Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin (Prozent). Prozentsatz [%] Kollagen Typ I (Kol I) positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. p<0,001 80 60 40 20 0 Kontrolle Normalpersonen Normalpersonen 1 Abbildung 5.1: Kollagen I-FACS-Messungen (RFI). Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für Kollagen Typ I (Kol I). Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. p<0,001 120 Normalpersonen Kontrolle Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 5.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer Kollagen I-FACS-Messung. Kollagen Typ I (Kol I) wurde auf BAL-Zellen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. Kol I mit Saponin [%] p<0,001 Normalpersonen Kontrolle 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 5.5: Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin (RFI). Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für Kollagen Typ I (Kol I). Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 5.6: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin. Kollagen Typ I (Kol I) wurde auf und in Alveolarmakrophagen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. Abbildung 5.7: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung mit Saponin. Die gestri-chelte Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für Kollagen Typ I (Kol I), die durchgezogene Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für Kollagen Typ I. 44 Unter der Verwendung von Saponin wird sowohl intrazellulär lokalisiertes als auch an der Zelloberfläche gebundenes Kollagen Typ I erfasst. Bildet man die Differenz der Expressionsdichte (RFI) von Kollagen mit und ohne Saponin, erhält man ein Maß für die intrazelluläre Akkumulation von Kollagen Typ I. Die intrazelluläre RFI für Kollagen Typ I lag für die Patienten mit Lungenfibrose bei 13,6 ± 16,3 und für die Normalpersonen bei 3,4 ± 5,9. Der Unterschied zwischen den zwei Versuchsgruppen war statistisch signifikant (p=0,011) (s. Abb. 6.0-6.1). Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose tragen Kollagen Typ I sowohl auf der Zelloberfläche als auch intrazellulär. Die BAL-Zellen der Normalpersonen hingegen exprimieren äußerst wenig Kollagen Typ I. 35 p=0,011 RFI Kol I 30 25 20 15 10 5 0 Normalpersonen Kontrolle 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 6.0: Expressionsdichte von intrazellulärem Kollagen Typ I (RFI). Differenz in der relativen Fluoreszenzintensität (RFI) zwischen Messung mit Saponin und ohne Saponin. Rechts die Alveolarmakrophagen der Normalpersonen, links die Patienten mit Lungenfibrose. Abbildung 6.1: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen I-FACS-Messung mit und ohne Saponin. Die gestrichelte Linie steht für die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen, welche ohne Saponin gemessen wurden. Die durchgezogene Linie steht für die Alveolarmakrophagen, welche mit Saponin gemessen wurden. 3.2.2 CD90 Das Protein CD90 hat ein Molekulargewicht von circa 30-35 kDa und gilt als Fibroblasten-Marker. Die BAL-Zellen der Normalpersonen waren zu 2,2 ± 3,6% mit einer RFI von 1,2 ± 2,1 positiv für CD90. In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose waren 23,3 ± 20,8% CD90+ Zellen. Die RFI betrug 8,8 ± 7,5. Der prozentuale Anteil CD90+ BAL-Zellen war bei den Patienten mit Lungenfibrose signifikant höher als bei den Normalpersonen (p<0,001). Ebenso die RFI für CD90 (p<0,001) (s. Abb. 7.0-7.3). 45 Die Messergebnisse zeigen, dass bei Patienten mit Lungenfibrose jene Zellen aus der BAL, die hinsichtlich Größe und Granularität charakteristisch für AM sind, den Fibroblasten-Marker CD90 exprimieren. CD90 wird normalerweise nicht von Makrophagen oder Monozyten exprimiert (120). p<0,001 p<0,001 18 45 16 40 14 35 RFI CD90 CD90 [%] 50 30 25 20 15 12 10 8 6 10 4 5 2 0 0 Normalpersonen Kontrolle Kontrolle Lungenfibrose Normalpersonen 1 Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 7.0: CD90-FACS-Messung (Prozent). Prozentsatz [%] CD90 positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Normalpersonen Normalpersonen 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 7.1: CD90-FACS-Messung (RFI). Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für CD90. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Personen Patientenmit mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 7.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD90-FACS-Messung. CD90 wurde auf Alveolarmakrophagen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. Abbildung 7.3: Exemplarisches Histogramm einer CD90-FACS-Messung. Die durchgezogene Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für CD90, die gestrichelte Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für CD90. 3.2.2.1 Messung mit Saponin In weiteren FACS-Analysen sollte die intrazelluläre Expression von CD90 in BAL-Zellen untersucht werden. Saponin perforiert die Zellmembran und lässt Fluoreszenz-Antikörper in den intrazellulären Raum eintreten. Hierbei stellte sich heraus, dass CD90 in der BAL-Zellpopulation der Normalpersonen (n=3) sowohl in der Messung ohne Saponin (s. oben) als auch in der mit Saponin mit 1,54 + 2,7% (Median + Range) nicht signifikant exprimiert wird. Die Zellen der Patienten mit Lungenfibrose (n=5) exprimierten zu 97,0 + 35,8% (Median + Range) intrazelluläres CD90 (s. Abb. 8.0-8.2). Der Unterschied zwischen den Normalpersonen und den Patienten mit Lungenfibrose war statistisch signifikant (p=0,036). 46 Bei Patienten mit Lungenfibrose kommen in der Population der AM somit Zellen vor, die nicht nur extrazellulär CD90 exprimieren, sondern auch intrazellulär positiv für CD90 sind. p=0,036 CD90 [%] Intrazellulär 100 Kontrolle Lungenfibrose Abbildung 8.0: CD90-FACS-Messung mit Saponin. Dargestellt als BoxPlot. ohne Saponin mit Saponin Abbildung 8.1: Exemplarische Orginalabbildung (DotPlot) einer CD90-FACS-Messung ohne und mit Saponin. Abbildung 8.2 Exemplarisches Histogramm einer CD90-FACS-Messung mit und ohne Saponin. Die durchgezogene Linie repräsentiert die Messung mit Saponin. Die gestrichelte Linie steht für die Messung ohne Saponin. 47 3.2.3 Übersicht der CD90- und Kollagen Typ I-Expression der verschiedenen Formen der Lungenfibrose Die Tabelle 4 zeigt die Oberflächenexpression von CD90 und Kollagen Typ I, bei verschiedenen Formen der Lungenfibrose. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit unterschiedlichen Formen der Lungenfibrose. Tabelle 4: Kollagen Typ I- und CD90-FACS-Messungen im Detail. Die Tabelle zeigt die Oberfl ächenexpression von CD90 und Kollagen Typ I (Kol I) sowohl hinsichtlich der relativen Fluoreszenzintensität (RFI) als auch dem Prozentsatz positiver Zellen [%]. NP = Normalpersonen; IPF = idiopathische pulmunale Fibrose; SSC = Sklerodermie; NSIP = nichtspezifische interstitielle Pneumonie; BOOP = Bronchiolitis obliterans organisierende Pneumonie. CD90 [%] RFI CD90 Kol I [%] RFI Kol I NP 0,51 + 10,14 0,33 + 7,7 1,11 + 91,92 0,86 + 53,83 IPF 17,76 + 76,65 8,68 + 23,7 94,44 + 67,92 17,41 + 46,08 SSC 26,88 + 77,42 6,09 + 123,18 70,93 + 41,63 36,25 + 87,76 NSIP 14,08 + 48,7 9,23 + 26,93 98,1 + 3,68 33,8 + 57,52 BOOP 35,64 + 39,13 5,5 + 15,51 78,17 + 76,6 50,07 + 89,57 48 3.2.4 Vimentin Vimentin ist ein für mesenchymale Zellen charakteristisches Intermediärfilament und fungiert insofern unter anderem als Marker für Fibroblasten. Die intrazelluläre Expression von Vimentin wurde ebenfalls mit Hilfe von Saponin bestimmt. Der prozentuale Anteil Vimentin+ BAL-Zellen betrug für die Normalpersonen 97,4 ± 1,7%. Die RFI (relative Fluoreszenzintensität) der AM für Vimentin war 116,3 ± 128,8. Der Prozentsatz positiver Zellen für die Patienten mit fibrosierender Lungenerkrankung betrug 94,9 ± 2,8%. Die RFI lag bei 61,9 ± 50,1. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Lungenfibrose-Patienten und Normalpersonen festgestellt werden (s. Abb. 9.0-9.1). Vimentin mit Saponin [%] 99 98 97 96 95 94 93 140 RFI Vimentin mit Saponin (nicht signifikant) 100 100 80 60 40 20 0 92 Normalpersonen Kontrolle Patienten mit Lungenfibrose 1 Lungenfibrose Abbildung 9.0: Vimentin-FACS-Messung mit Saponin. Prozentsatz [%] Vimentin positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. (nicht signifikant) 120 Normalpersonen Kontrolle 1 Patienten mit Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 9.1: Vimentin-FACS-Messung mit Saponin. Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für Vimentin. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. 3.2.5 CD68 CD68 ist ein glykosyliertes Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 119 kDa. Das Molekül wird vor allem intrazellulär auf lysosomalen Membranen exprimiert. Die BAL-Zellen wurden mittels Saponin perforiert und anschließend mit Fluoreszenz-Antikörpern markiert. Die Zellen der Normalpersonen waren zu 67,9 ± 39,3% positiv für CD68. Die RFI betrug 33,7 ± 40,2. In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose waren 83,5 ± 27,2% der BAL-Zellen mit einer RFI von 124,3 ± 77,7 positiv für CD68. Der Anteil CD68+ Zellen in der BAL beider Versuchsgruppen differierte nicht signifikant. Jedoch war die RFI für CD68 in der Gruppe der Patienten mit Lungenfibrose signifikant höher als bei den Normalpersonen (p=0,003) (s. Abb. 10.0-10.3). 49 Die Messwerte für CD68 zeigten, dass AM von Patienten mit Lungenfibrose signifikant mehr intrazelluläres CD68 exprimieren als die AM der Normalpersonen. Jedoch unterschied sich der prozentuale Anteil CD68+ Zellen nicht signifikant. (nicht signifikant) 250 RFI CD68 mit Saponin CD68 mit Saponin [%] 120 100 80 60 40 20 0 Normalpersonen Kontrolle 150 100 50 0 Patienten mit Lungenfibrose 1 Lungenfibrose Abbildung 10.0: CD68-FACS-Messung mit Saponin. Prozentsatz [%] CD68 positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Normalpersonen p=0,003 200 Patienten mit Lungenfibrose 1 Lungenfibrose Abbildung 10.1: CD68-FACS-Messung mit Saponin. Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für CD68. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 10.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD68-FACS-Messung mit Saponin. CD68 wurde auf Alveolarmakrophagen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. 3.2.6 Normalpersonen Kontrolle Abbildung 10.3: Exemplarisches Histogramm einer CD68-FACS-Messung mit Saponin. Die gestrichelte Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für CD68, die durchgezogene Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für CD68. CCL18 CCL18 ist ein Chemokin mit einem Molekulargewicht von circa 7,8 kDa. Es wurde ebenfalls nach Behandlung mit Saponin gemessen. Die Zellen der Normalpersonen waren zu 14,6 ± 28,7% mit einer RFI von 9,9 ± 13,9 positiv. In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose kamen 82,0 ± 27,6% CCL18+ Zellen vor. Die RFI betrug 69,9 ± 60,0. Der prozentuale Anteil CCL18+ BAL-Zellen war somit bei den Patienten mit Lungenfibrose signifikant höher als bei den Normalpersonen (p<0,001). Die RFI für CCL18 unterschied sich ebenfalls statistisch signifikant (p<0,001) (s. Abb. 11.0-11.3). 50 Die AM der Patienten mit Lungenfibrose zeigten eine deutlich erhöhte Expressionsdichte des Chemokins CCL18. 140 p<0,001 RFI CCL18 mit Saponin CCL18 mit Saponin [%] 140 120 100 80 60 40 20 120 100 80 60 40 20 0 0 Kontrolle Normalpersonen 1 Lungenfibrose Patienten mit Lungenfibrose Kontrolle Normalpersonen Abbildung 11.0: CCL18-FACS-Messung mit Saponin. Prozentsatz [%] CCL18 positiver Avleolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Normalpersonen 1 Lungenfibrose Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 11.1: CCL18-FACS-Messung mit Saponin. Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für CCL18. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 11.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CCL18-FACS-Messung mit Saponin. CCL18 wurde auf Alveolarmakrophagen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. 3.2.7 p<0,001 Abbildung 11.3: Exemplarisches Histogramm einer CCL18-FACSMessung mit Saponin. Die durchge-zogene Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für CCL18, die gestrichelte Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für CCL18. CD206 CD206 ist ein transmembranöses Protein, das auch als Makrophagen-Mannose-Rezeptor bezeichnet wird. In der BAL der Normalpersonen waren 15,1 ± 32,6% CD206+ Zellen. Die RFI betrug 4,2 ± 2,5. Die AM der Patienten mit Lungenfibrose waren zu 89,5 ± 9,3% mit einer RFI von 54,8 ± 43,9 positiv für CD206. Der Anteil CD206+ Zellen differierte zwischen den beiden Versuchsgruppen statistisch signifikant (p=0,005). Auch die RFI für CD206 unterschied sich signifikant (p<0,001) (s. Abb. 12.0-12.3). 51 Die Expressionsdichte von CD206 auf AM von Patienten mit Lungenfibrose ist signifikant erhöht. 120 120 (p=0,005) RFI CD206 CD206 [%] 80 60 40 80 60 40 20 20 0 p<0,001 100 100 0 Normalpersonen Patienten mit Kontrolle 1 Lungenfibrose Lungenfibrose Normalpersonen Patienten mit Kontrolle 1 Lungenfibrose Lungenfibrose Abbildung 12.0: CD206-FACS-Messung. Prozentsatz [%] CD206 positiver Alveolarmakrophagen bei Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Normalpersonen Abbildung 12.1: CD206-FACS-Messung. Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose für CD206. Die Messergebnisse sind mit Standardabweichungen und p-Wert angegeben. Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 12.2: Exemplarische Originalabbildung (DotPlot) einer CD206-FACS-Messung. CD206 wurde auf Alveolarmakrophagen von Normalpersonen (linke Abbildung) und Patienten mit Lungenfibrose gemessen. Abbildung 12.3: Beispielhistogramm einer CD206-FACS-Messung. Die gestrichelte Linie steht für die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen einer Normalperson für CD206, die durchgezogene Linie für die RFI eines Patienten mit Lungenfibrose für CD206. 3.2.8 Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen aus der BAL Dieser Abschnitt fasst die oben vorgestellten Messwerte der Antigenexpression auf und in Alveolarmakrophagen von Normalpersonen und Patienten mit fibrosierender Lungenerkrankung zusammen. Die Daten sind in den folgenden Abbildungen und Tabellen separiert nach den zwei Versuchsgruppen zusammengestellt (s. Abb. 13 und Tab. 5). 52 Kol I Kol I m.S. CD90 Vimentin m.S. 1 CD68 CCL18 CD206 Normalpersonen 0 20 40 60 80 100 120 Patienten mit Lungenfibrose Prozent Kol I Kol I m.S. CD90 Vimentin m.S. 1 CD68 CCL18 CD206 0 50 100 150 200 250 RFI Abbildung 13: Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen. Schwarz = Kontrolle; Weiß = Normalpersonen. Oben ist der Prozentsatz positiver Zellen dargestellt, unten die relative Fluoreszenzintensität (RFI). Kol I = Kollagen Typ I; m.S. = mit Saponin. Die Werte sind mit Standardabweichung angegeben. Tabelle 5: Übersicht der Antigenexpression von Alveolarmakrophagen. Es ist sowohl die Relative Fluoreszenzintensität (RFI) als auch der prozentuale Anteil positiver Zellen dokumentiert. Die Werte sind ± Standardabweichung angegeben. Kol I = Kollagen Typ I; m.S. = mit Saponin. Normalpersonen [%] RFI Normalpersonen Lungenfibrose [%] RFI Lungenfibrose Kol I 9,1±24,1 6,9±14,3 83,1±25,2 37,2±32,3 Kol I m.S. 16,1±33,9 6,9±8,7 92,2±16,8 54,6±34,6 CD90 2,2±3,6 1,2±2,1 23,3±20,8 8,8±7,5 Vimentin 97,4±1,7 116,3±128,8 94,9±2,8 61,9±50,1 CD68 67,9±39,3 33,7±40,2 83,5±27,2 124,3±77,7 CCL18 14,6±28,7 9,9±13,9 82,0±27,6 69,9±60,0 CD206 15,1 ± 32,6 4,2 ± 2,5 89,5 ± 9,3 54,8 ± 43,9 53 3.3 Antigenexpression von Fibroblasten Im FACS wurde die Antigenexpression von sechs Fibroblastenzelllinien hinsichtlich Kollagen Typ I, CD68, Vimentin und CD90 untersucht. Die Zelllinien wurden aus Gewebeproben isoliert und kultiviert. Als Negativkontrolle diente sowohl die in der spezifischen Fluoreszenz markierte IgG-Isotypkontrolle als auch der sekundäre Komplex (fluoreszierendes Streptavidin). Die Expression der Fibroblasten wurde mit der der Alveolarmakrophagen aus der BAL verglichen. Am Ende des Kapitels ist in den Tabellen 6.0 und 7.0 die Antigenexpression von Fibroblasten und Alveolarmakrophagen gegenübergestellt. 3.3.1 Kollagen Typ I 71,9 ± 17,5% der Fibroblasten waren mit einer RFI von 68,3 ± 15,5 positiv für Kollagen Typ I (s. Tab. 6 und 7). Um die Zellmembran der Fibroblasten zu perforieren, wurden sie mit Saponin behandelt. Unter Zugabe von Saponin waren 82,1 ± 9,0% der Zellen positiv für Kollagen Typ I. Die RFI lag bei 76,3 ± 12,3 (s. Tab. 6 und 7). 3.3.2 CD90 Der Fibroblasten-Marker CD90 wurde ohne Saponin-Zugabe gemessen. 95,1 ± 6,5% der Zellen waren positiv für CD90. Die RFI lag bei 282,2 ± 108,7 (s. Tab. 6 und 7). 3.3.3 Vimentin Vimentin ist ein Intermediärfilament und Bestandteil des Zytoskeletts der Zelle. Es wurde ebenfalls unter Zugabe von Saponin gemessen. Der prozentuale Anteil Vimentin+ Zellen lag bei 92,5 ± 14,1%. Die RFI für Vimentin war 708,72 + 1340,06 (Median + Range) (s. Tab. 6 und 7). 3.3.4 CD68 CD68 wird vor allem auf lysosomalen Membranen exprimiert. Die Messungen erfolgten unter Zugabe von Saponin. 52,6 ± 35,4% der Zellen waren mit einer RFI von 10,8 ± 7,0 positiv für CD68 (s. Tab. 6 und 7). 54 Bemerkenswert erscheinen die hohe RFI der Fibroblasten für Vimentin und die relativ niedrige RFI für Kollagen Typ I. CD68 konnte analog zu aktuellen Forschungsergebnissen (63) auf Fibroblasten nachgewiesen werden. Der Marker für fibroblastäre Zellen, CD90 (106), konnte, mit einer hohen Expressionsdichte, ebenfalls auf den Fibroblasten nachgewiesen werden. Tabelle 6: Vergleich der Antigenexpression von Fibroblasten mit Alveolarmakrophagen. Es ist der prozentuale Anteil positiver Zellen und die relative Fluoreszenzintensität dokumentiert. Alle Werte sind mit ± Standardabweichung angegeben. Kol I = Kollagen Typ I; m.S. = mit Saponin; AMf= Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose; AMn = Alveolarmakrophagen von Normalpersonen; FB = Fibroblasten. Kol I Kol I m.S. CD90 Vimentin CD68 AMn [%] 9,1±24,1 16,1±33,9 2,2±3,6 97,4±1,7 67,9±39,3 RFI AMn 6,9±14,3 6,9±8,7 1,2±2,1 116,3±128,8 33,7±40,2 AMf [%] 83,1±35,3 92,2±16,8 23,3±20,8 94,9±2,8 83,5±27,2 RFI AMf 37,2±32,3 54,6±34,6 8,8±7,5 61,9±50,1 124,3±77,7 FB [%] 71,9±17,5 82,1±9,0 95,1±6,5 92,5±14,1 52,6±35,4 RFI FB 68,3±29,3 76,3±12,3 282,2±108,7 708,72+1340,06 10,8±7,0 Tabelle 7: Vereinfachte Darstellung der Antigenexpression von Fibroblasten und Alveolarmakrophagen. Kol I = Kollagen Typ I; m.S. = mit Saponin; AMf = Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose; AMn = Alveolarmakrophagen von Normalpersonen; FB = Fibroblasten. Kol I Kol I m.S. CD90 Vimentin CD68 AMn [%] (+) + – +++ ++ RFI AMn (+) (+) – +++ + AMf [%] +++ +++ + +++ +++ RFI AMf + ++ + ++ +++ FB [%] ++ +++ +++ +++ ++ RFI FB ++ ++ +++ ++++ + 55 3.4 Kollagen Typ I-Bindung von Alveolarmakrophagen aus der BAL Die oben dargestellten Messergebnisse zeigen, dass Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose, in geringerem Ausmaß auch die von Normalpersonen, auf ihrer Oberfläche Kollagen Typ I exprimieren. Unter der Annahme, dass bei Patienten mit Lungenfibrose Kollagen Typ I vermehrt im Alveolarraum vorhanden ist, wurde folgender Versuch angestellt: Native BAL-Zellen von Normalpersonen (n=6) wurden im Brutschrank für drei Stunden mit beziehungsweise ohne Zugabe von Rattenschwanz (RS)-Kollagen Typ I inkubiert. Danach wurden die BAL-Zellen gewaschen und fixiert, mit fluoreszierenden Anti-Kollagen Typ I-Antikörpern (Biomol, D) markiert und mit dem FACS untersucht. Der prozentuale Anteil Kollagen Typ I+ Zellen betrug in der Kontrolle 20,75 + 68,41% (Median + Range). Die RFI lag bei 3,63 + 26,25 (Median + Range). Die unter Zugabe von RS-Kollagen Typ I inkubierten BAL-Zellen waren zu 43,95 + 76,97% (Median + Range) positiv für Kollagen Typ I. Die RFI betrug 11,83 + 142,63 (Median + Range). Nach drei Stunden Inkubationszeit mit RS-Kollagen Typ I trugen signifikant mehr BAL-Zellen extrazellulär Kollagen Typ I (p=0,026). Die Dichte der Kollagen Typ I-Expression (RFI) unterschied sich nach Inkubation (mit und ohne RS-Kollagen Typ I) nicht signifikant. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Alveolarmakrophagen aus der BAL die Fähigkeit besitzen, Kollagen Typ I auf ihrer Zelloberfläche zu binden. 100 p=0,026 150 90 135 80 120 70 105 60 90 50 75 40 60 30 45 20 30 10 15 0 0 Kol1 [%] 3h Kontrolle. Koll1 [%] 3h Kollagenexposition n.s. RFI Kol1 3h Kontrolle RFI Kol1 3h Kollagenexposition Abbildung 14.0: 3h Kollagen Typ I-Exposition der Alveolarmakrophagen. Links ist die Veränderung der Kollagen I-Expression hinsichtlich des prozentualen Anteils positiver Zellen dokumentiert. Rechts hinsichtlich der relativen Fluoreszenzintensität (RFI). Die p-Werte sind in der Abbildung vermerkt (n=6). 56 Kontrolle 3h Kollagenexposition 3h Abbildung 14.1: Exemplarische Orginalabbildung (DotPlot) einer Kollagen Typ I-FACS-Messung vor und nach Kollagenexposition. Links die Kontrolle. Rechts: BAL-Zellen nach 3h Kollagen Typ I-Exposition hinsichtlich ihrer Expression von Kollagen Typ I. 3.5 Abbildung 14.2: Exemplarisches Histogramm einer Kollagen Typ I-FACS-Messung vor und nach Kollagenexposition. Die durchgezogene Linie enspricht der Kontrolle, die gestrichelte Linie entspricht der relativen Fluoreszenzintensität nach 3h Kollagen Typ I-Exposition. Immunzytologische Färbungen Um die Kollagen Typ I/CD90 exprimierenden Zellen näher zu charakterisieren, wurden immunzytologische Färbungen angefertigt. Das an die Sekundär- und Tertiärantikörper gebundene Enzym Peroxidase färbt, durch eine Reaktion mit dem Chromogen DAB und H2O2 als Substrat, das gebundene Antigen braun. Die vor allem bei BAL-Zellen vorkommende unspezifische Färbung durch endogene Peroxidase konnte durch den Vergleich mit der Negativkontrolle von der AntigenFärbung abgegrenzt werden. Die folgenden Abbildungen zeigen die typischen Verteilungsmuster von Kollagen Typ I und CD90 auf BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose und Normalpersonen sowie auf wenig morphologisch differenzierten und morphologisch ausdifferenzierten Fibroblasten. Die Fibroblasten stellten sich wenig morphologisch differenziert dar, wenn sie mittels Cytospin-Präparation verarbeitet wurden. Die Abbildungen sind bei 40,000facher Vergrößerung aufgenommen. Sie sind jeweils der Negativkontrolle gegenübergestellt (linksseitig). 57 3.5.1 a) Kollagen Typ I-Expression auf BAL-Zellen und Fibroblasten b) Abbildung 15: Fibroblasten. a) = Negativkontrolle; b) = Kollagen Typ I Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. a) b) Abbildung 16: Morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten. a) = Negativkontrolle; b) = Kollagen Typ I Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. a) b) Abbildung 17: BAL-Zytologie einer Normalperson. a) = Negativkontrolle; b) = Kollagen Typ I Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. a) b) Abbildung 18: BAL-Zytologie eines Patienten mit Lungenfibrose. a) = Negativkontrolle; b) = Kollagen Typ I Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. 58 Alle Fibroblasten zeigten eine deutliche Farbreaktion für Kollagen Typ I (s. Abb. 15-16). Die BAL-Zellen der Normalpersonen waren negativ für Kollagen Typ I (s. Abb. 17). In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose waren Zellen erkennbar mit typischen ringförmigen Farbreaktionen für Kollagen Typ I, im Sinne einer extrazellulären Verteilung des Proteins (s. Abb. 18). 3.5.2 a) CD90-Expression auf BAL-Zellen und Fibrolasten b) Abbildung 19: Fibroblasten. a) = Negativkontrolle; b) = CD90 Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. a) b) Abbildung 20: Morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten. a) = Negativkontrolle; b) = CD90 Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. a) b) Abbildung 21: BAL-Zytologie einer Normalperson. a) = Negativkontrolle; b) = CD90 Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. 59 a) b) Abbildung 22: BAL-Zytologie eines Patienten mit Lungenfibrose. a) = Negativkontrolle; b) = CD90 Peroxidase-Färbung. In 40.000facher Vergrößerung. Die wenig morphologisch differenzierten Fibroblasten zeigten eine massive ringförmige Farbreaktion für CD90 (s. Abb. 19). Die ausdifferenzierten Fibroblasten zeigten eine geringe diffuse Peroxidase-Färbung (s. Abb. 20). Um die Antigenexpression der BAL-Zellen auch für das intrazelluläre Kompartiment darzustellen, wurden sie mit Saponin behandelt. In der BAL der Normalpersonen waren keine CD90+ Zellen erkennbar (s. Abb. 21). In der BAL der Patienten mit Lungenfibrose stellten sich Zellen mit einer deutlichen zytoplasmatischen Farbreaktion für CD90 dar (s. Abb. 22). 60 3.6 CCL18 in der zellfreien BAL Alternativ-aktivierte Makrophagen (AAM) sind unter anderem durch die Produktion von CCL18 charakterisiert. Mit einem ELISA-System wurde die Konzentration von CCL18 in der zellfreien BAL-Flüssigkeit (BALF) von Normalpersonen und von Patienten mit Lungenfibrose gemessen. Alle Werte sind im Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. Die BALF der Normalpersonen enthielt 164,2 ± 244,9 pg/ml CCL18. Die BALF der Patienten mit Lungenfibrose enthielt 2572,0 ± 2652,1 pg/ml CCL18. Die CCL18-Konzentration in der BALF der Patienten mit Lungenfibrose war signifikant höher (p<0,001) als in der BALF der Normalpersonen (s. Abb. 23). 6000 p<0,001 5000 4000 3000 2000 1000 0 3.7 Kontrolle Normalpersonen 1 Lungenfibrose Patienten mit Lungenfibrose Abbildung 23: CCL18 in der zellfreien BAL-Flüssigkeit. Die Konzentration von CCL18 [pg/ml] in der BAL-Flüssigkeit von Normalpersonen und Patienten mit Lungenfibrose. Alle Werte sind mit Standardabweichung und p-Wert angegeben. Korrelationen und Doppelfärbungen In diesem Abschnitt ist die Korrelation der Expression verschiedener Antigene von Alveolarmakrophagen untereinander sowie mit Parametern der Differentialzytologie dargestellt. Zudem ist, mittels exemplarischer Fluoreszenz-Doppelfärbung im FACS, die Antigen-Koexpression der Alveolarmakrophagen hinsichtlich der korrelierten Antigene abgebildet. Für die Doppelfärbungen wurden BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose verwendet. 61 3.7.1 Korrelation der Kollagen Typ I-Expression (mit Saponin) mit dem Anteil neutrophiler Granulozyten in der BAL Neutrophile Granulozyten (NG) sind polymorphkernige Zellen, welche sich weder durch eosinophile noch durch basophile Farbstoffe signifikant anfärben lassen. Sie spielen eine zentrale Rolle in der unspezifischen Abwehr und sind für die Aktivitätskontrolle interstitieller Lungenerkrankungen von Bedeutung. Der Prozentsatz neutrophiler Granulozyten in der BAL-Zellpopulation korrelierte positiv mit der Expressionsdichte der Alveolarmakrophagen für Kollagen Typ I (s. Abb. 24) (r=0,513; p=0,002; n=36). 100 r=0,513 r=0,728 p=0,002 p<0,001 NG [%] 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 RFI Kol I m.S. 3.7.2 Abbildung 24: Korrelation von RFI Kollagen Typ I mit neutrophile Granulozyten [%]. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität der Alveolarmakrophagen für Kollagen Typ I (Kol I) mit Saponin gemessen (m.S.), auf der y-Achse der prozentuale Anteil neutrophiler Granuloz yten in der BAL aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=36). Korrelation und Koexpression von Kollagen Typ I (mit Saponin) mit CD90 in der BAL Die relative Fluoreszenzintensität der BAL-Zellen für extrazelluläres CD90 korrelierte positiv (r=0,529; p=0,001; n=29) mit der relativen Fluoreszenzintensität für Kollagen Typ I. Die FACSDoppelfärbung zeigte, dass 55,14% der BAL-Zellen eines Patienten mit Lungenfibrose auf der Oberfläche Kollagen Typ I sowie den Fibroblastenmarker CD90 koexprimieren. 38,32% exprimierten hingegen nur Kollagen Typ I und 0,15% explizit CD90 (s. Abb. 25.0-25.1). 100 r=0,529 r=0,695 p=0,001 p<0,001 CD90 [%] 80 38,23% 55,14% 6,48% 0,15% 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 RFI Kol I m.S. Abbildung 25.0: Korrelation von CD90 [%] mit RFI Kollagen Typ I (mit Saponin). Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für CD90, auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für Kollagen Typ I aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=29). Abbildung 25.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung von Kollagen Typ I und CD90. 38,23% der Zellen tragen nur Kollagen Typ I, 55,14% der Zellen tragen CD90 und Kollagen Typ I, 0,15% der Zellen tragen nur CD90, 6,48% der Zellen tragen weder Kollagen Typ I noch CD90. 62 3.7.3 Korrelation und Koexpression von CCL18 mit Kollagen Typ I in der BAL Korreliert man das Vorkommen von CCL18+ Alveolarmakrophagen mit dem von Zellen, die Kollagen Typ I exprimieren, ergab sich ebenfalls eine positive Korrelation (r=0,556; p=0,008; n=21). Bei einer Doppelfärbung zeigte sich, dass 53,10% der BAL-Zellen eines Patienten mit Lungenfibrose Kollagen Typ I und CCL18 koexprimierten, während 16,79% nur CCL18 und 4,16% nur Kollagen Typ I exprimierten (s. Abb. 26.0-26.1). RFI CCL18 250 r=0,556 r=0,690 p=0,008 p<0,001 200 4,16% 53,10% 25,94% 16,79% 150 100 50 0 0 20 40 60 80 100 120 RFI Kol I Abbildung 26.0: Korrelation von RFI CCL18 mit RFI Kollagen Typ I. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für Kollagen Typ I (Kol I), auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für CD206 aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=21). Abbildung 26.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung mit Saponin von Kollagen Typ I und CCL18. 4,16% der Alveolarmakrophagen tragen nur Kollagen Typ I, 53,1% der Zellen Kollagen Typ I und CCL18, 16,79% tragen nur CCL18 und 25,94% der Zellen tragen weder Kollagen Typ I noch CCL18. 63 3.7.4 Korrelation von CD90 positiven Zellen mit der Expressionsdichte von CCL18 in der BAL Die relative Fluoreszenzintensität der Alveolarmakrophagen für CCL18 korrelierte auch positiv mit dem prozentualen Anteil CD90 exprimierender Zellen (r=0,582; p=0,009; n=19) (s. Abb. 27). r=0,582 p=0,009 100 CD90 [%] 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 RFI CCL18 3.7.5 Abbildung 27: Spearman-Korrelation von CD90 [%] mit RFI CCL18. Auf der xAchse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für CCL18, auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für CD68 aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=19). Korrelation von CD68 mit CCL18 in der BAL Die relative Fluoreszenzintensität der Alveolarmakrophagen für CD68 korrelierte positiv mit der für CCL18 (r=0,757; p<0,001; n=18) (s. Abb. 28). 300 RFI CD68 250 200 150 r=0,757 r=0,853 p<0,001 p<0,001 100 50 0 0 50 100 150 200 250 RFI CCL18 3.7.6 Abbildung 28: Korrelation von RFI CD68 mit RFI CCL18. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für CD68, auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für CCL18 aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=18). Korrelation von Kollagen Typ I mit CD68 in der BAL Die relative Fluoreszenzintensität der Alveolarmakrophagen für CD68 korrelierte positiv mit der für Kollagen Typ I (r=0,773; p<0,001; n=17) (s. Abb. 29). 100 RFI Kol I 80 60 r=0,773 r=0,668 p<0,001 p=0,003 40 20 0 0 50 100 150 RFI CD68 200 250 300 Abbildung 29: Korrelation von RFI Kollagen Typ I mit RFI CD68. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für CD68, auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für Kollagen Typ I (Kol I) aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=17). 64 3.7.7 Korrelation von CD68 mit CD206 in der BAL Die relative Fluoreszenzintensität der Alveolarmakrophagen für CD68 korrelierte positiv mit der für CD206 (r=0,929; p<0,001; n=7) (s. Abb. 30). 120 RFI CD206 100 80 60 r=0,929 p<0,001 40 20 0 0 50 100 150 200 250 Abbildung 30: Spearman-Korrelation von RFI CD68 mit RFI CD206. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität (RFI) der Alveolarmakrophagen für CD68, auf der y-Achse die relative Fluoreszenzintensität (RFI) für CD206 aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=7). RFI CD68 3.7.8 Korrelation und Koexpression von CD206 mit CCL18 in der BAL CD206 sowie CCL18 sind Marker für AAM. Die relative Fluoreszenzintensität von Alveolarmarkophagen für CD206 korrelierte positiv mit der für CCL18 (r=0,576; p=0,039; n=13). Die FACSDoppelfärbung zeigte, dass 60,42% der BAL-Zellen eines Patienten mit fibrotischer Lungenerkrankung CCL18 und CD206 koexprimieren, während 5,17% nur Kollagen Typ I sowie 14,47% RFI CD206 nur CD206 exprimieren (s. Abb. 31.0-31.1). r=0,576 r=0,925 p=0,039 p<0,001 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 5,17% 60,42% 19,94% 14,47% 120 RFI CCL18 Abbildung 31.0: Korrelation von RFI CD206 mit RFI CCL18. Auf der x-Achse ist der prozentuale Anteil CD206 positiver Zellen, auf der y-Achse der prozentuale Anteil CCL18 positiver Zellen aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=13). Abbildung 31.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung mit Saponin von CCL18 und CD206. 5,17% der Zellen tragen nur CCL18, 60,42% der Zellen tragen CCL18 und CD206, 14,47% der Zellen tragen nur CD206 und 19,94% der Zellen tragen weder CCL18 noch CD206. 65 3.7.9 Korrelation und Koexpression von CD206 mit Kollagen Typ I in der BAL CD206 ist ein transmembranöses Protein, welches vermehrt auf AAM nachgewiesen wurde. Der prozentuale Anteil CD206+ Zellen korrelierte positiv (r=0,755; p=0,002; n=13) mit dem prozentualen Anteil Kollagen Typ I+ Zellen. Die Fluoreszenz-Doppelfärbung zeigte, dass die BALZellen eines Patienten mit Lungenfibrose zu einem Anteil von 78,6% Kollagen Typ I und CD206 koexprimieren, während 10,68% nur Kollagen Typ I und 3,2% nur CD206 exprimierten (s. Abb. RFI CD206 32.0-32.1). 140 120 100 80 60 40 20 0 10,68% 78,60% 7,53% 3,20% r=0,755 p=0,002 0 10 20 30 40 50 RFI Kol I Abbildung 33.0: Spearman-Korrelation von RFI CD206 mit RFI Kollagen Typ I. Auf der x-Achse ist der prozentuale Anteil Kollagen Typ I positiver Alveolarmakrophagen, auf der y-Achse der prozentuale Anteil CD206 positiver Alvoelarmakrophagen aufgetragen. Die Korrelation ist mit Korrelationskoeffizient (r) und p-Wert angegeben (n=13). Abbildung 33.1: Exemplarische FACS-Doppelfärbung ohne Saponin von Kollagen Typ I und CD206. 10,68% der Zellen tragen nur Kollagen Typ I, 78,6 % der Zellen Kollagen Typ I und CD206, 3,20% der Zellen tragen nur CD206, 7,53% der Zellen tragen weder Kollagen Typ I noch CD206. 66 4 Diskussion Die Lungenfibrose ist eine Erkrankung, welche durch die Akkumulation von Fibroblasten und Myofibroblasten und die konsekutiv vermehrte Ablagerung von Bindegewebsproteinen in der Lunge charakterisiert ist. Fibroblasten und Myofibroblasten sind die Hauptquellen extrazellulärer Matrix in der Entstehung der Lungenfibrose (104;105). Die Anzahl Fibroblasten-ähnlicher Zellen im Lungengewebe von Patienten mit IPF ist gegenüber Normalpersonen in etwa verdoppelt (20). Bislang wurde angenommen, dass die Anhäufung von Fibroblasten in den Lungen von Patienten mit Lungenfibrose explizit aus der Proliferation intrapulmonaler Zellen resultiere (90;114;116). 1994 entdeckten Bucala et al. am Picower Institut for Medical Research eine zirkulierende Population von Fibroblasten-Vorläufer-Zellen, so genannten Fibrozyten, im peripheren Blut des Menschen (16). In mehreren Arbeiten zum Mausmodell der Lungenfibrose konnte in den Jahren 2004 und 2005 gezeigt werden, dass Fibrozyten aus dem Knochenmark über den Blutkreislauf in die Lunge einwandern und die Progression der Lungenfibrose fördern (50;92;106). Diese Arbeiten zeigen erstmalig, dass die Akkumulation von Fibroblasten im Entstehungsprozess einer Lungenfibrose durch die vermehrte Zuwanderung von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark verursacht werden könnte. Möglicherweise handelt es sich mit dieser die Lunge infiltrierenden Zelle um eine Art „Keimzelle“ der Fibroblasten-Foci. Diese gelten als Hauptcharakteristikum der IPF (129). Fireman et al. und Ludwicka et al. konnten bereits Anfang der 90er Jahre Fibroblasten aus BALZellen von Patienten mit Lungenfibrose züchten (32;82). Die BAL von Patienten mit Lungenfibrose wird am Universitätsklinikum Freiburg routinemäßig untersucht. Lichtmikroskopische, zytologische Untersuchungen geben keinen Hinweis auf die Anwesenheit von Fibroblasten in der BAL. Da sich jedoch aus BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose Fibroblasten züchten lassen, muss in der BAL, so die Arbeitshypothese, eine Art Fibroblasten-Vorläuferzelle existieren. Ziel dieser Arbeit war es, einen Zellmarker zu finden, welcher die Identifikation von BAL-Fibroblasten-Vorläuferzellen ermöglicht. Weiterhin sollten mit Hilfe dieses Markers eventuelle Unterschiede im Auftreten dieser Zellen bei verschiedenen Erkrankungen untersucht werden. Langfristig erschien es ebenfalls interessant, aus erzielten Befunden ein mögliches Verfahren zur Früherkennung von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose beziehungsweise mit sekundärer Lungenbeteiligung bei rheumatischen Erkrankungen abzuleiten. 67 Als aussichtsreichster Zellmarker zur Identifizierung von Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der BAL erschien zunächst Kollagen Typ I. 4.1 Kollagen Typ I Diverse Autoren definieren Fibroblasten und Fibrozyten anhand der Oberflächenexpression von Kollagen Typ I. Fibroblasten lassen sich hinsichtlich Größe und Granularität durchflusszytometrisch nicht von Alveolarmakrophagen unterscheiden. Sie kommen im selben Bereich des „SSC/ FSC-DotPlot“ des Durchflusszytometers zur Darstellung. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmalig, dass in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose eine Kollagen Typ I+ Zellpopulation vorhanden ist. Die durchflusszytometrische Untersuchung der BAL zeigte für Zellen, die hinsichtlich Größe und Granularität in der Region der Alveolarmakrophagen liegen, bei Patienten mit Lungenfibrose durchschnittlich 83,1%, und in Einzelfällen bis zu 100%, Kollagen Typ I+ Zellen. Im Gegensatz dazu waren in der BAL der Normalpersonen durchschnittlich nur 9,1% Kollagen Typ I+ Alveolarmakrophagen zu finden. Der Unterschied zwischen den zwei Versuchsgruppen war hoch signifikant, auch hinsichtlich der Expressionsdichte von Kollagen Typ I. Um die Kollagen Typ I+ Zellpopulation genauer zu untersuchen, wurden die Zellen immunzytologisch gefärbt. Sowohl BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose beziehungsweise Normalpersonen als auch morphologisch wenig differenzierte Fibroblasten sowie morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten wurden mittels einer Peroxidase-Färbung auf die Expression von Kollagen Typ I untersucht. Die BAL-Zellen der Normalpersonen waren negativ für Kollagen Typ I. Die Morphologie und das Kollagen Typ I-Verteilungsmuster der BAL-Zellen der Patienten mit Lungenfibrose und der morphologisch wenig differenzierten Fibroblasten zeigte große Ähnlichkeiten. In beiden Zellpopulationen konnten Zellen mit deutlichen extrazellulären Farbreaktionen in typischer Ringform gefunden werden. Kontrollexperimente ergaben, dass morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten mit erkennbarer Spindelform ebenfalls eine deutlich positive Reaktion für Kollagen Typ I zeigen. Dagegen stellten sich Lymphozten und neutrophile Granulozyten negativ dar. Die Diskrepanz zwischen den durchflusszytometrischen Messungen der Alveolarmakrophagen von Normalpersonen, die bis zu 10% Kollagen Typ I+ Zellen ergaben, und den eindeutig negativen immunzytologischen Färbungen, ist wahrscheinlich mit der geringeren Sensitivität der Peroxidase-Färbung zu erklären. Zudem ist eine gewisse Artefaktgrenze bei der FACS-Messung von Paraformaldehyd-fixierten Zellen zu berücksichtigen. Insbesondere aufgrund der ausgesprochen hohen Expressionsrate von Kollagen Typ I, teilweise traten bis zu 100% positive Alveolarmakrophagen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose auf, war zu vermuten, dass es sich mit der Kollagen Typ I+ Zellfraktion nicht ausschließlich um 68 Fibroblasten-ähnliche Zellen handelt. 2003 konnten Lucatelli et al. im Mausmodell des Lungenemphysems Alveolarmakrophagen mit inkorporierten Kollagenabbauprodukten nachweisen (81). Everts et al. vermuteten bereits 1996, dass Makrophagen mittels eines Rezeptors an Kollagen binden und so dessen intrazelluläre Verdauung initiieren (29). Eine Arbeitsgruppe um Brian B. Gowen konnte 2000 zeigen, dass murine Makrophagen mittels Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren an denaturiertes Kollagen Typ I binden (41). Ebenso seit dem Jahr 2000 ist bekannt, dass Monozyten mit dem Integrin-Rezeptor CD11c-CD18 Kollagen Typ I auf ihrer Zelloberfläche binden können (37). Zur weiteren Untersuchung, ob Alveolarmakrophagen Kollagen Typ I auf ihrer Oberfläche binden können, wurde folgender Versuch in die Wege geleitet: Die BAL-Zellen der Normalpersonen enthielten nach routinediagnostischen Analysen im Durchschnitt 95,9% Alveolarmakrophagen. Nach dreistündiger Inkubation dieser Zellen mit Kollagen Typ I stieg die Zahl extrazellulär Kollagen Typ I tragender Alveolarmakrophagen von 26,5% auf 48,9% an (n=6). Diese Messungen lassen darauf schließen, dass Alveolarmakrophagen möglicherweise im Rahmen eines Phagozytose-Prozesses Kollagen Typ I an ihre Zelloberfläche binden können. Aus diesem Grund erwies sich extrazellulär gebundenes Kollagen Typ I für die Identifizierung von Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der BAL als unzureichend. Nun stellte sich die Frage, ob die Messung von intrazellulärem Kollagen Typ I die Differenzierung zwischen Fibroblasten-ähnlichen Zellen und Alveolarmakrophagen in der BAL ermöglicht. Um die Kollagen Typ I-Expression mittels FACS auch intrazellulär messen zu können, wurden die BAL-Zellen mit Saponin behandelt. Saponin perforiert die Zellmembran und ermöglicht somit Fluoreszenz-Antikörpern das Eindringen in den intrazellulären Raum. Hinsichtlich der Expressionsdichte von Kollagen Typ I ergaben die Messungen, dass BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose nicht nur extrazellulär, sondern auch intrazellulär eine signifikant höhere Kollagendichte als diejenigen von Normalpersonen aufweisen. Bezüglich dem prozentualen Anteil ausschließlich intrazellulärer Kollagen Typ I+ Zellen ergab sich allerdings, dass in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose beziehungsweise von Normalpersonen mit jeweils unter 10% positiver Zellen keine signifikanten Unterschiede vorhanden waren. Aufgrund dieses Ergebnisses und einer Forschungsarbeit, die zeigt, dass sowohl Fibroblasten als auch Makrophagen zur intrazellulären Verdauung von Kollagen Typ I befähigt sind (29), erschien die Vorgehensweise, ausschließlich intrazellulär Kollagen Typ I+ Zellen zur Erkennung von Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der BAL zu verwenden, ebenfalls als unzureichend. Dass vornehmlich in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose Kollagen Typ I+ Zellen vorhanden sind, könnte möglicherweise an einer im Alveolarraum von fibrotisch umgebauten Lungen vorherrschenden höheren Konzentration von Kollagen Typ I und der folglich vermehrten Bindungen und Degradation des Proteins durch Alveolarmakrophagen liegen. 69 Der nächste Arbeitsschritt ging der Frage nach, ob eventuell Marker für Zellen mesenchymalen Ursprungs zur weiteren Differenzierung zwischen Alveolarmakrophagen und Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der BAL beitragen können. 4.2 Vimentin Vimentin, ein Protein des Zytoskeletts, erfüllt in der Zelle wichtige Stütz- und Stabilisierungsfunktionen. Das Intermediärfilament gilt als spezifisch für Zellen mesenchymalen Ursprungs (76). Analog dazu zeigten sich in der vorliegenden Arbeit bei durchflusszytometrischen Analysen von sechs Fibroblastenzelllinien im Durchschnitt 92,5% positive Zellen mit einer extrem hohen Expressionsdichte (RFI=708,72). Bei weiteren Messungen konnte festgestellt werden, dass die Alveolarmakrophagen der Normalpersonen durchschnittlich zu 97,4% Vimentin+ waren (RFI=116,3). Die Alveolarmakrophagen der Patienten mit Lungenfibrose waren im Mittel zu 94,9% positiv für Vimentin (RFI=61,9). Die Werte der beiden Versuchsgruppen unterschieden sich nicht signifikant. Dies entspricht dem Befund von Evensen et al., die 1993 ebenfalls herausfanden, dass Alveolarmakrophagen Vimentin exprimieren (28). Somit reiht sich das Intermediärfilament in eine Reihe von Gemeinsamkeiten von Alveolarmakrophagen und Fibroblasten ein. Fibroblasten allerdings könnten dank ihrer ausgesprochen hohen Expressionsdichte (Vimentinhigh) von Alveolarmakrophagen mit niedriger Expressionsdichte (Vimentinlow) unterschieden werden. Zur Differenzierung von Fibroblasten-Vorläuferzellen in der BAL mittels Durchflusszytometer erwies sich dieses Protein jedoch als ungeeignet. Im weiteren Verlauf der Untersuchungen stellte sich die Frage, wie innerhalb dieser Kollagen Typ I+ Vimentin+ Zellfraktion Alveolarmakrophagen und Fibroblasten-ähnliche Zellen voneinander abgegrenzt werden können? In diesem Zusammenhang wurden auch Zellmarker für Makrophagen interessant. 4.3 CD68 CD68 ist ein transmembranöser Rezeptor und wird hauptsächlich auf lysosomalen Membranen exprimiert (134;139). Die zellbiologische Funktion von CD68 ist weitgehend unklar. Es gilt als Scavenger-Rezeptor für oxidiertes Low Densitiy Lipoprotein (LDL) (117). Da dieses Molekül in der Literatur als Zellmarker für Makrophagen beschrieben wird (89), erschien es als hilfreich zur Unterscheidung von Fibroblasten-ähnlichen Zellen und Makrophagen. 70 Positiv für CD68 zeigten sich durchschnittlich 83,5% der Alveolarmakrophagen der Patienten mit Lungenfibrose und 67,9% der Alveolarmakrophagen der Normalpersonen. Der Unterschied zwischen den Versuchsgruppen war statistisch nicht signifikant. Die durchflusszytometrische Analyse ergab, dass nahezu alle Kollagen Typ I+ Zellen CD68 koexprimierten. Die Kontrolluntersuchung von sechs Fibroblastenzelllinien zeigten, dass durchschnittlich 52,6% der Fibroblasten für CD68 positiv waren. Eine diesbezügliche Literaturrecherche ergab, dass CD68 auch von synovialen Fibroblasten, Gingivafibroblasten und Fibroblasten aus der Haut exprimiert wird (71). Die Autoren konnten eine Überlappung von CD68 mit den Fibroblastenmarkern CD90 und Prolyl-4-Hydroxylase feststellen (71). Die Koexpression mit CD90 konnte durch eigene Messungen bestätigt werden. Diese Befunde legen nahe, dass CD68 nicht zur Differenzierung von Fibroblasten und Alveolarmakrophagen in der BAL geeignet ist. 4.4 CXCR4 und α-SMA 2001 konnte eine Arbeitsgruppe um Riichiro Abe den Chemokinrezeptor CXCR4 auf humanen Fibrozyten des peripheren Blutes nachweisen (3). Eine weitere Arbeit zeigte 2004, dass humane CXCR4+ Fibrozyten, im Mausmodell der bleomycin-induzierten Lungenfibrose, unter anderem unter der chemotaktischen Wirkung des Chemokins CXCL12 (SDF-1) über das Blut in die Lunge einwandern (106). Diese Ergebnisse ließen die Frage aufkommen, ob mittels dieses Markers Fibroblasten-Vorläuferzellen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose zu finden sind. Jedoch zeigten die durchflusszytometrischen Messungen von Alveolarmakrophagen aus der BAL der Patienten mit Lungenfibrose keine CXCR4+ Zellen (n=5). Myofibroblasten produzieren genau wie Fibroblasten Bindegewebsproteine und tragen somit zur Entstehung der Lungenfibrose bei (104;105). Der Myofibroblast ist durch die Expression von -SMA definiert und Bestandteil der Fibroblasten-Foci von Patienten mit Lungenfibrose (105). Schmidt et al. konnten feststellen, dass Fibrozyten aus dem peripheren Blut in vitro nach Stimulation mit TGF- , -SMA exprimieren (125). Auch in einer Arbeit zur Migration von Fibrozyten im Mausmodell der Leberfibrose konnte gezeigten werden, dass Fibrozyten aus dem peripheren Blut nach TGF- -Stimulation -SMA exprimieren (67). In diesem Kontext erschien es denkbar, dass Fibroblasten-Vorläuferzellen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose -SMA exprimieren. Es konnten jedoch keine -SMA+ Zellen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose entdeckt werden (n=5). 71 4.5 CD90 CD90 gilt als Zellmarker für Fibroblasten (31;71;77;91;120;123;154). Die Expression von CD90 ist jedenfalls beim Menschen auf vergleichsweise wenige Zelltypen beschränkt, neben Fibroblasten auf neuronale Zellen, aktivierte Endothelzellen sowie hämatopoetische Vorläuferzellen (19;21;120). Hagood et al. konnten zeigen, dass CD90 sowohl in der Lunge von Normalpersonen als auch in nicht pathologisch veränderten Lungenarealen von Patienten mit Lungenfibrose konkordant zu dem Fibroblasten-spezifischen Enzym Prolyl-4-Hydroxylase (Enzym der Kollagen-Synthese) exprimiert wird, und zwar in einem Muster, das der anatomischen Lokalisation von Fibroblasten (Bindegewebe, interstitielle Septen, Blutgefäße) entspricht (47). Durchflusszytometrische Messungen der vorliegenden Arbeit zeigten, dass humane Lungenfibroblasten mit einer sehr hohen Expressionsdichte positiv für CD90 sind. Aus diesen Gründen erschien CD90 geeignet, die BAL auf Fibroblasten-ähnliche Zellen zu untersuchen. Durchschnittlich 23,3% der BAL-Zellen der Patienten mit Lungenfibrose waren positiv für CD90 (RFI=8,8). In der BAL der Normalpersonen fanden sich nur 2,2% CD90+ Zellen. Bei der angewendeten Messmethode muss jedoch eine Artefaktgrenze von circa 3% angenommen werden. Die Expression von CD90 auf Alveolarmakrophagen korrelierte weder im Kollektiv der Normalpersonen noch in dem der Patienten mit Lungenfibrose mit dem Alter. Weitere durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten, dass in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose nicht nur extrazellulär CD90+ Zellen auftraten, sondern dass die Alveolarmakrophagen auch intrazellulär hoch positiv für CD90 sind (n=5). Dagegen konnte in der BAL der Normalpersonen kein intrazelluläres CD90 gefunden werden (n=3). Die immunzytologischen Färbungen für CD90 zeigten für morphologisch wenig differenzierte Fibroblasten eine überaus deutliche extrazelluläre Farbreaktion mit typischer Ringbildung. Die morphologisch ausdifferenzierten Fibroblasten zeigten eine diffuse und geringe extrazelluläre Farbreaktion. Die Alveolarmakrophagen der Patienten mit Lungenfibrose zeigten nach Peroxidase-Färbung eine deutliche zytoplasmatische Farbreaktion und somit intrazelluläres CD90. Es konnte allerdings nur eine geringe extrazelluläre Farbreaktion für CD90 auf BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose erkannt werden. Erklärbar ist dies durch die, im FACS ermittelte, relativ niedrige extrazelluläre Expressionsdichte von CD90 auf BAL-Zellen. In der BAL der Normalpersonen konnten, analog zu den durchflusszytometrischen Messungen, auch mittels immunzytologischer Färbung keine CD90+ Zellen gefunden werden. Eine exemplarische, durchflusszytometrische Fluoreszenz-Doppelfärbung konnte zeigen, dass 55,14% aller Alveolarmakrophagen aus der BAL eines Patienten mit fibrotischer Lungenerkran- 72 kung Kollagen Typ I und CD90 koexprimierten. Der Anteil an Zellen, die ausschließlich CD90 exprimierten, war so niedrig, dass er dem Artefaktbereich zugerechnet werden musste. Die Fluoreszenz-Doppelfärbung sowie die hohe Expressionsdichte von Kollagen Typ I auf Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose lassen vermuten, dass alle CD90+ BAL-Zellen ebenfalls Kollagen Typ I auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die statistische Untersuchung der Studienpopulation ergab außerdem, dass die RFI von CD90, ein Maß der Expressionsdichte, hochsignifikant mit der RFI von Kollagen Typ I korrelierte. Diese Arbeit zeigt erstmalig, dass in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose, innerhalb der Population der Alveolarmakrophagen Zellen auftreten die sowohl intra- wie auch extrazellulär CD90 tragen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose keine Zellen mit einer charakteristischen Fibroblasten-Morphologie. Monozytäre Zellen und Makrophagen exprimieren normalerweise kein CD90 (120). 1993 wurde entdeckt, dass in der fetalen Leber, im Nabelschnurblut und im Knochenmark des Menschen eine kleine Zellpopulation CD34+ CD90+ hämatopoetischer Vorläuferzellen auftritt (19). Die Autoren postulieren, dass es sich bei den CD90+ hämatopoetischen Vorläuferzellen um pluripotente Zellen handeln muss, denn mit der weiteren Zelldifferenzierung beziehungsweise mit dem Auftreten von Markern wie CD45RA, CD38 oder CD71 konnte eine Abnahme der CD90 Expression festgestellt werden (19). Dieses Ergebnis stimmt mit einer weiteren Arbeit zu murinen CD90+ Knochenmarkszellen überein (147). Dan et al. fanden 2006 in der humanen fetalen Leber CD90+ Vimentin+ CD34+ Zellen mit der Fähigkeit, in Hepatozyten, Zellen des Gallengangs, sowie in mesenchymale Zellarten wie beispielsweise Osteoblasten, Endothelzellen und Fettzellen zu differenzieren. Die Autoren definierten diese Zellart als multipotente Vorläuferzellen der humanen fetalen Leber (23). Eine Untersuchung über die Differenzierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen aus CD90+ Vorläuferzellen fand im Laufe der mechanisch induzierten Differenzierung eine Abnahme der CD90-Expression und eine Zunahme der Kollagen Typ I- und Osteonectin-Expression (146). Die Autoren postulieren CD90 als Marker einer multipotenten Vorläuferzelle, dessen Expressionsdichte mit dem Erreichen eines höheren Differenzierungsgrades abnimmt (146). Fibroblasten lassen sich in eine CD90+ und eine CD90– Subpopulation unterteilen. CD90+ Fibroblasten aus der Ratte zeigen im Vergleich zu CD90– Fibroblasten eine Resistenz gegenüber folgenden fibrogenen Stimulanzien: IL-4, IL-1 , PDGF BB und Bleomycin (152). Während CD90– Fibroblasten mit der Aktivierung von latentem TGF- , Smad3 Phosphorylierung und der Expression von Fibronektin und -SMA reagieren, zeigen CD90+ Fibroblasten diesbezüglich keine Reaktion (152). McIntosh et al. konnten ebenfalls CD90+ und CD90– Fibroblasten unterscheiden, wobei sie in Rattenstämmen mit verstärkter Neigung zur Ausbildung der Lungenfibrose 73 deutlich mehr CD90– Fibroblasten nachwiesen (88). Hinsichtlich der Histopathologie des Menschen zeigten Hagood et al., dass innerhalb der Fibroblasten-Foci von Patienten mit IPF keine CD90+ Fibroblasten anzutreffen sind. Dagegen dominieren in Lungenbiopsien von Normalpersonen CD90+ Fibroblasten (47). Nach 24 bis 72 Stunden Inkubation von humanen Lungen- und Hautfibroblasten von Normalpersonen mit TGF- , IL-1 , TNF- oder FGF-1 vermindert sich sowohl der Prozentsatz CD90+ Fibroblasten als auch die Expressionsdichte von CD90. Gleichzeitig mit dem Abfall der CD90 Expressionsdichte konnte eine vermehrte Expression von -SMA und eine erhöhte TGF- -Aktivität nachgewiesen werden (47). Dieselbe Arbeitsgruppe zeigte auch, dass bei CD90 Knock-out Mäusen die bleomycin-induzierte Lungenfibrose gravierender verläuft. Zwei Wochen nach der intratrachealen Applikation von Bleomycin fanden die Wissenschaftler eine vermehrte Akkumulation von Kollagen Typ I im Lungenparenchym der Mäuse sowie Indizien für eine erhöhte TGF- -Aktivität (47). Diese Ergebnisse sind allerdings mit Vorsicht zu betrachten, da speziell in der Maus CD90 auf der Zelloberfläche von T-Zellen exprimiert wird und insofern auch einhergehende Unterschiede im inflammativen Prozess zu den genannten Befunden beitragen können. Zumindest konnten die Autoren keine histopathologischen Differenzen in der Bleomycin assoziierten Entzündungsreaktion zwischen dem Wildtyp und der CD90 Knockout Maus feststellen (47). Die Fibroblasten-Subpopulationen differieren auch hinsichtlich des Proliferationsverhaltens. Stimuliert man CD90– und CD90+ Fibroblasten mit CTGF-1, PDGF-AA oder IL-1 zeigt sich, dass die CD90– Fibroblasten signifikant stärker proliferieren. Der Wachstumsfaktor PDGF-AA induziert sogar lediglich bei den CD90– Fibroblasten einen proliferativen Effekt (43-45). Weitere Differenzen zwischen CD90+ und CD90– Fibroblasten finden sich hinsichtlich den antigenpräsentierenden Eigenschaften. In einer Untersuchung zu Fibroblasten aus der murinen Milz exprimierten CD90+ und CD90– Fibroblasten konstitutiv MHC I, während lediglich CD90– Fibroblasten nach der Stimulation mit INF- MHC II exprimierten und zur Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen befähigt waren (13). Eine weitere Arbeit über murine Lungenfibroblasten hinsichtlich der Antigenpräsentation und der MHC II Expression zeigte vergleichbare Ergebnisse (107). Die referierten Untersuchungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass CD90+ Fibroblasten einen weniger fibrogenen und geringer proliferierenden beziehungsweise inaktiveren Fibroblasten-Phänotyp darstellen. Eigene immunzytologische Färbungen zeigten zudem, dass morphologisch ausdifferenzierte Fibroblasten im Gegensatz zu morphologisch wenig differenzierten Fibroblasten eine geringere Farbreaktion für CD90 aufweisen. CD90 ist nicht nur ein Marker der weniger differenzierten beziehungsweise inaktiveren Fibroblasten, sondern ist auch in Adhäsions- bezie- 74 hungsweise Zellmigrations-Mechanismen involviert. Die Adhäsion von Fibroblasten an Matrixproteinen, wie Kollagen Typ I und Fibronektin, nimmt in Folge der 24-stündigen Inkubation mit Anti-CD90-Antikörpern zu (120). Aktivierte Endothelzellen exprimieren CD90 und interagieren über dieses mit dem Integrin-Rezeptor CD11b/CD18 auf Leukozyten (144). Diese Interaktion lässt Leukozyten an aktivierte Endothelzellen adhärieren und löst damit deren transendotheliale Migration aus (144). Zudem fanden Saalbach et al. auf Melanom-Zellen mit dem Integrin-Rezeptor CD51/CD61 ein CD90-Liganden, welcher für die Adhäsion und die transendotheliale Migration von Melanomzellen und somit für das invasive Wachstum und die Metastasierung des malignen Melanoms mitverantwortlich ist (121). In einer Arbeit zu Psoriasis konnte festgestellt werden, dass die Adhäsion und die folgende Migration von Neutrophilen Granulozyten in Areale pathologischer Hautveränderungen mit über die Bindung des Integrin-Rezeptors Mac-1 an CD90 auf aktivierten Endothelzellen eingeleitet wird (145). Es kann zusammengefasst werden, dass CD90 eine wichtige Funktion hinsichtlich der Zelladhäsion und der transendothelialen Migration ausübt und somit Zellwanderungsprozesse beeinflusst. Die referierten Untersuchungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass CD90+ Fibroblasten einen weniger fibrogenen und geringer proliferierenden Fibroblasten-Phänotyp darstellen. Des Weiteren suggerieren die Ergebnisse, dass es sich möglicherweise um jüngere, nicht ausdifferenzierte Zellen handelt, die im Gegensatz zu reiferen noch ein erhebliches Potenzial zur Migration aufweisen. Betrachtet man den aktuellen Stand der Literatur und die Ergebnisse dieser Arbeit, kann postuliert werden, dass CD90+ Fibroblasten eine Art migratorische Fibroblasten-Vorläuferzellen beziehungsweise Fibrozyten darstellen. Möglicherweise wandern CD90+ Vorläuferzellen im Rahmen der Ausbildung einer Lungenfibrose in die Lunge, differenzieren zu CD90– fibrotisch aktiveren und stark proliferierenden Fibroblasten und akkumulieren in den charakteristischen Foci. Aufgrund der dargestellten Literatur lassen sich folgende Hypothesen bezüglich des Vorkommens CD90+ BAL-Zellen bei Patienten mit Lungenfibrose herleiten: 1. Im Rahmen der Lungenfibrose gelangen CD90+ Fibroblasten in den Alveolarraum. Diese werden nach Apoptose oder Nekrose durch Makrophagen phagozytiert. In den Makrophagen lassen sich die CD90+ ingestierten Zellen nachweisen. Hierdurch wäre die Expression von CD90 im intrazellulären Raum von Alveolarmakrophagen erklärbar. Ebenfalls denkbar wäre, dass CD90 nach Ablösung von der Zelloberfläche von Fibroblasten (nach Aktivierung durch TGFß) in den Alveolarraum gelangt und als lösliches CD90 (sCD90) von Makrophagen gebunden und internalisiert werden kann. 75 2. Alveolarmakrophagen beziehungsweise myeloide Zellen können unter Bedingungen, wie sie im Alveolarraum von Patienten mit Lungenfibrose herrschen – etwa unter der Einwirkung spezifischer Wachstumsfaktoren oder Zytokinen – zu Fibroblasten transdifferenzieren und exprimieren im Rahmen dieses Differenzierungs-Prozesses CD90 auf ihrer Zelloberfläche. Ad 1. Im Prozess der Wundheilung wurde die Phagozytose von apoptotischen Fibroblasten durch Makrophagen beschrieben (80). Dies lässt die Hypothese ableiten, dass Alveolarmakrophagen in den Alveolarraum eindringende CD90+ Fibroblasten möglicherweise unmittelbar phagozytieren, und im Rahmen dieses Phagozytose-Prozesses CD90 auf ihre Oberfläche und besonders in den intrazellulären Raum tragen. Des Weiteren könnte die CD90-Expression der Makrophagen auch durch das im Folgenden näher beschriebene lösliche CD90 (sCD90) bedingt sein: Diverse Oberflächenmoleküle, so intrazelluläres ICAM-1, E-selectin, VCAM sowie Zytokin-Rezeptoren wie IL-1R und IL-2R können von der Zelloberfläche abgelöst werden (78). In vitro konnte bereits in den 70er Jahren gezeigt werden, dass murine T-Zellen und lymphoblastäre Zellen CD90 spontan von der Zelloberfläche ablösen können (34;142). Im Liquor cerebrospinalis konnte erstmals humanes sCD90 entdeckt werden (4). 1999 konnten Saalbach et al. ein ELISA-System etablieren, mit dem sCD90 zu quantifizieren war. Die Autoren entdeckten sCD90 im humanen Serum und verglichen die sCD90 Konzentration in Seren von Patienten mit SSC und von Normalpersonen. Sie fanden zwar keinen statistisch signifikanten Unterschied (n=12), doch beobachteten sie im Serum eines Patienten mit besonders stark ausgeprägter SSC einen sCD90-Anstieg um das Dreifache gegenüber Normalpersonen (122). Zudem fand dieselbe Arbeitsgruppe in Arealen lokal pathologischer Veränderungen, wie in der Wundflüssigkeit von venösen Ulzera sowie in der Synovia von Rheumatoider Arthritis befallener Gelenke, erhöhte Werte für sCD90 (122). Saalbach et al. konnten außerdem mittels Western Blot im Überstand von unstimulierten, humanen Fibroblasten sCD90 nachweisen (120). Fibroblasten lösen nach Stimulation mit TGF- , FGF-1, IL1- und TNF- CD90 von ihrer Oberfläche (47). Die hohe Anzahl von intrazellulär CD90+ Alveolarmakrophagen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose könnte insofern durch einen Phagozytoseprozess von sCD90 erklärt sein. Es kann vermutet werden, dass CD90+ Fibroblasten im Lauf der Ausbildung einer Lungenfibrose in die Lunge einwandern, etwa unter dem Einfluss von Zytokinen wie TGF- zu aktiven CD90– Fibroblasten ausdifferenzieren und im Rahmen dieses Vorgangs CD90 von ihrer Oberfläche ablösen. Dieses gelangt wiederum als sCD90 in den Alveolarraum und wird dort von Alveolarmakrophagen phagozytiert. Die vorliegende Untersuchung lässt erstmalig darauf schließen, dass ent- 76 sprechend der Befunde bei Rheumatoider Arthritis, auch im Alveolarraum fibrotisch umgebauter Lungen möglicherweise ein erhöhter sCD90-Spiegel vorhanden ist. Ad 2. Im Kontext der Arbeiten von Fireman et al. und Ludwicka et al., die aus BAL-Zellen von Patienten mit Lungenfibrose Fibroblasten züchten konnten, stellt sich die Frage, ob in der Population der CD90+ Alveolarmakrophagen Fibroblasten-Vorläuferzellen enthalten sind. Da sich in der konfokalen Mikroskopie sowie in der Elektronenmikroskopie und im Lichtmikroskop zeigte, dass in der BAL keine Zellen mit einer Fibroblasten-ähnlichen Morphologie zu finden sind, erklärt die Hypothese 1. nur unzureichend die Herkunft der aus der BAL von Lungenfibrose-Patienten in Kultur wachsenden Fibroblasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit und andere Forschungsarbeiten zeigen, dass Alveolarmakrophagen und Fibroblasten diverse phänotypische Merkmale teilen. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmalig, dass Alveolarmakrophagen von Patienten mit Lungenfibrose CD90 und Kollagen Typ I exprimieren. Möglicherweise können Makrophagen beziehungsweise myeloide Zellen unter der Einwirkung von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen zu Fibroblasten transdifferenzieren. Diverse, im Folgenden näher beschriebene, Arbeiten zeigten, dass Makrophagen unter bestimmten Umständen eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie entwickeln und Kollagen synthetisieren können (10;18;38;72;140;141). Bereits 1989 fanden Godoy et al. erstmals die in vitro Transdifferenzierung von peritonealen Makrophagen aus Mäusen mit chronischer Schistosomiasis zu Fibroblasten-ähnlichen Zellen (38). Betrand et al. konnten 1992 zeigen, dass Makrophagen aus der Peritonealhöhle von Mäusen mit Schistosmiasis nach Kultur sowohl Pro-Kollagen Typ I als auch die Makrophagen-Marker Mac-1 und Mac-2 exprimieren (10). 1994 fanden Labat et al. für einen Patienten, der nach Herztransplantation unter Cyclosporin-Therapie eine Lungenfibrose entwickelte, in einer Monozyten-Population aus dem peripheren Blut in vitro mittels Elektronenmikrosokopie und Fluoreszenz-Färbungen Neo-Fibroblasten. Des Weiteren konnten die Autoren die Transdifferenzierung von HLA-DR+ Monozyten/Makrophagen zu Neo-Fibroblasten, mittels all-trans-Retinsäure inhibieren (72). 1997 konnte in einer weiteren Arbeit von Labat et al. gezeigt werden, dass in vitro aus HLA-DR+ Monzyten aus dem Blut eines Patienten mit Chondrosarkom direkt Fibroblasten transdifferenzieren können. Zudem fanden die Autoren, dass Monzyten von Normalpersonen ebenfalls die Fähigkeit besitzen, zu Fibroblasten zu transdifferenzieren, die Neo-Fibroblasten aber unter normalen Bedingungen nach T-Zellkontakt sterben. Die Autoren leiten die Hypothese ab, dass die Pathogenese des Chondrosarkoms möglicherweise in nekrotischen Zonen beginnt. HLA-DR+ Monozyten wandern in diese Areale ein, transdifferenzieren zu Neo-Fibroblasten und überleben aufgrund 77 eines Defektes der T-Zellen oder der Monozyten selbst. Die Autoren schließen eine retrovirale Ursache dieses Defektes nicht aus (73). Vaage et al. konnten in Arbeiten zur Kapselbildung von Tumoren zeigen, dass murine peritoneale Makrophagen zur Kollagen-Synthese fähig sind und die Anwesenheit von T-Zellen stimulierend auf die Kollagen-Synthese durch Makrophagen wirkt (140;141). Arlein et al. untersuchten 1998 anhand der Phagozytose die Transdifferenzierung zwischen Makrophagen und Fibroblasten (6). Makrophagen gehören zu den professionellen Phagozyten, während Fibroblasten den nicht-professionellen Phagozyten zugerechnet werden. Fibroblasten besitzen keine Fc-Rezeptoren und phagozytieren somit opsonierte Antigene nicht mit der gleichen Effizienz wie Makrophagen (110). Zudem produzieren Fibroblasten im Rahmen der Phagozytose keine freien Radikale (110). Die Arbeitsgruppe um Wes J. Arlein konnte 1998 zeigen, dass Fibroblasten aus Wundarealen IgG-opsonierte Partikel gleichermaßen phagozytieren wie die restlichen in der Wunde ansäßigen Phagozyten und analog zu Makrophagen zur Bildung von Sauerstoffradikalen befähigt sind (6). Eine Arbeitsgruppe um Alexander Jabs zeigte 2005, das Fluoreszenz-markierte Mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut der Ratte im Rahmen der Entstehung von Granulationsgewebe zu -SMA+ spindelförmigen Zellen differenzieren. Die Autoren fanden auf diesen Zellen die Expression der Ratten-Makrophagen-Markern ED1 und ED2 (52). Allerdings muss hierbei beachtet werden, dass es sich mit ED1 um das Homolog zu humanem CD68 handelt, dessen Expression unter anderem in dieser Arbeit auf Fibroblasten nachgewiesen werden konnte. Es kann vermutet werden, dass der Transdifferenzierung von Makrophagen zu Fibroblasten möglicherweise eine zentrale Rolle in der Entstehung der Lungenfibrose zukommt. Die Expression von CD90 und möglicherweise von Kollagen Typ I auf BAL-Zellen könnten Anzeichen einer Transdifferenzierung von Makrophagen im Alveolarraum von Patienten mit Lungenfibrose darstellen. Inwiefern Immundefekte eine solche Transdifferenzierung zulassen oder Zytokine beziehungsweise Wachstumsfaktoren ein Milieu bedingen, in dem sie stattfinden kann, bedarf weiterer Untersuchungen. Die Transdifferenzierung zwischen Fibroblasten und Makrophagen wurde, insbesondere anhand morphologischer Kriterien, bereits in diversen Arbeiten beschrieben. Dennoch gibt es bisher keinen adäquaten Zellmarker, der diesen Prozess kennzeichnet. Die Expression von CD90 könnte ein initiales Zeichen einer beginnenden Transdifferenzierung darstellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen somit erstmalig Evidenz für einen potenziellen Marker der Transdifferenzierung zwischen Makrophagen und Fibroblasten. Ein solcher Marker würde die präzisere Untersuchung der Transdifferenzierung zum Fibroblasten erlauben, nicht nur für die Lungenfibrose, sondern für die Pathogenese diverser fibrotischer Erkrankungen. 78 4.6 Biomarker der Fibrose Die erhöhte Deposition von extrazellulären Bindegewebsproteinen, hauptsächlich von Kollagen Typ I, mit konsekutivem Verlust der funktionellen alveokapillären Einheiten und nachfolgender respiratorischen Insuffizienz, gilt als Hauptmerkmal des fatalen Umbaus der Lungenarchitektur bei Lungenfibrose. Die Lungenfunktion gilt insbesondere in Zusammenhang mit der Klinik und der Radiologie als prognoseweisend für die IPF (66). In diesem Kontext erschien es interessant, ob die Kollagen-Expression mit Parametern der Lungenfunktion korreliert. Vorgenommene statistische Untersuchungen zeigten, dass der prozentuale Anteil Kollagen Typ I+ Zellen hochsignifikant negativ sowohl mit der TLC (in Prozent vom Soll) als auch mit der VC (dito) korrelierte. Doch scheint der Parameter „prozentualer Anteil positiver Zellen“ insofern wenig geeignet zu sein, als die Korrelation vor allem durch Extremwerte zustande kam. Die Expressionsdichte (RFI) von Kollagen Typ I auf Alveolarmakrophagen korrelierte mit einem Korrelationskoeffizienten von knapp <0,5 nur niedrig mit der Lungenfunktion. Ebenso wie die Lungenfunktion hat die Anzahl neutrophiler Granulozyten (NG) prognostische Bedeutung für Patienten mit fibrosierender Lungenerkrankung (143). Ziegenhagen et al. konnten für Patienten mit IPF zeigen, dass eine erhöhte IL-8 Konzentration in der zellfreien BAL mit dem prozentualen Anteil der NG in der BAL sowie mit einer Verminderung der Lungenfunktion korreliert (153). Die vorliegende Arbeit fand in der BAL einen klaren Zusammenhang zwischen der Expressionsdichte von Kollagen Typ I auf Alveolarmakrophagen und der Zahl an NG in der BAL. Die Werte korrelierten hochsignifikant (r=0,728). Es ist möglich, dass CD90 im Rahmen der Ausdifferenzierung von Fibroblasten beziehungsweise der weiteren Transdifferenzierung von Makrophagen von der Zelloberfläche abgelöst wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen erstmalig nahe, dass im Alveolarraum fibrotisch umgebauter Lungen ein erhöhter sCD90-Spiegel existiert. Insofern kann nach weiteren Untersuchungen möglicherweise auch sCD90 als Äquivalent für Fibroblasten-Aktivität beziehungsweise als Marker der Fibrose in Betracht gezogen werden. 4.7 Ausblick Das Auftreten von Kollagen Typ I+ CD90+ Alveolarmakrophagen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose lässt in der Zusammenschau die folgenden Hypothesen ableiten: 79 1. Im Rahmen der Lungenfibrose gelangen CD90+ Fibroblasten in den Alveolarraum. Diese werden nach Apoptose oder Nekrose durch Makrophagen phagozytiert. In den Makrophagen lassen sich die CD90+ ingestierten Zellen nachweisen. Hierdurch wäre die Expression von CD90 im intrazellulären Raum von Alveolarmakrophagen erklärbar. Ebenfalls denkbar wäre, dass CD90 nach Ablösung von der Zelloberfläche von Fibroblasten (nach Aktivierung durch TGFß) in den Alveolarraum gelangt und als lösliches CD90 (sCD90) von Makrophagen gebunden und internalisiert werden kann. 2. Alveolarmakrophagen beziehungsweise myeloide Zellen können unter Bedingungen, wie sie im Alveolarraum von Patienten mit Lungenfibrose herrschen – etwa unter der Einwirkung spezifischer Wachstumsfaktoren oder Zytokinen – zu Fibroblasten transdifferenzieren und exprimieren im Rahmen dieses Differenzierungs-Prozesses CD90 auf ihrer Zelloberfläche. Um diese beiden Hypothesen weiter zu prüfen, sollten in einem ersten Schritt CD90+ und CD90– Alveolarmakrophagen aus der BAL von Lungenfibrose-Patienten separiert, isoliert kultiviert und in vitro auf die Transdifferenzierung zu Fibroblasten-ähnlichen Zellen untersucht werden. Präzisere zytologische Untersuchungen, etwa mit Hilfe der konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskopie, könnten genauere Informationen über die CD90-Expression auf BAL-Zellen geben. So könnte mittels einer dreidimensionalen Rekonstruktion aus konfokalen Schichtaufnahmen die Verteilung von CD90 in der BAL-Zelle, beispielsweise nach Stimulation mit TGF- , analysiert werden. Weiterhin wäre es interessant, die Wirkung von Wachstumsfaktoren wie FGF-1 oder PDGF-AA, Zytokinen wie TGF- oder Chemokinen wie CCL18 auf BAL-Zellen zu untersuchen, insbesondere hinsichtlich der CD90-Expression beziehungsweise der Transdifferenzierung. Um die Wechselwirkungen zwischen dem Immunssystem und einer möglichen Transdifferenzierung näher zu untersuchen, könnte die Wirkung von T-Zellen auf transdifferenzierte Alveolarmakrophagen beziehungsweise CD90+ Neo-Fibroblasten aus der BAL analysiert werden. Auch Zytokine der alternativen Immunantwort üben eventuell einen modulatorischen Effekt auf das Überleben von Neo-Fibroblasten oder auf die Transdifferenzierung von Alveolarmakrophagen aus. Des Weiteren könnten CD90– Alveolarmakrophagen von Normalpersonen in Anwesenheit von löslichem CD90 (sCD90) kultiviert werden und nachfolgend durchflusszytometrisch auf die Oberflächenbindung beziehungsweise Phagozytose von CD90 untersucht werden. Begleitend sollte die Konzentration von sCD90 in der zellfreien BAL von Patienten mit Lungenfibrose und Normalpersonen gemessen werden. Saalbach et al. konnten 1998 mittels Anti-CD90-Antikörpern die Adhäsion von Fibroblasten an Kollagen verstärken (120). Fujita et al. fanden 1996, dass maligne Zellen aus dem T-Zell-Lymphom 80 der Maus – anders als humane T-Zellen exprimieren T-Zellen der Maus CD90 – nach Behandlung mit Anti-CD90-Antikörpern den programmierten Zelltod sterben (36). Die Injektion von AntiCD90-Antikörpern in den Blutkreislauf der Ratte induziert den Zelltod von mesangialen Zellen und eine konsekutive Glomerulonephritis. Inwiefern die Antikörper Apoptose oder Nekrose dieser Zellen auslösen, wird kontrovers diskutiert (93;94). Jedenfalls wird aus diesem Mechanismus in der Forschung ein Tiermodell der mesangioproliferativen Glormerulonephritis abgeleitet (55;150). Es wäre wichtig, den Einfluss von Anti-CD90-Antikörper auf das Verhalten von Fibroblasten beziehungsweise Fibroblasten-Vorläuferzellen genau zu untersuchen. Sollten diese Antikörper Migrationsprozesse und/oder das Apoptose-Verhalten beziehungsweise den Zelltod beeinflussen oder steuern, ließen sich daraus eventuell neue Ansätze für eine zukünftige Therapie der Lungenfibrose gewinnen. In einem ersten Schritt könnte mittels einer Calcium-Messung die Wirkung verschiedener CD90-Antikörper auf BAL-Zellen beziehungsweise Lungenfibroblasten untersucht werden. Hier könnte eine Calcium-Messung lebender Zellen unter konfokaler Laser-Fluoreszenzmikroskopie beitragen, die Wirkung der Antikörper auf die einzelne Zelle zu untersuchen. Auch Auswirkungen auf die Zellbewegung könnten analysiert werden. Die Kollagen-Konzentrationsmessung in der zellfreien BAL sollte hinsichtlich ihrer prognostischen Aussagekraft beziehungsweise ihrer Suffizienz als Biomarker der Fibrose untersucht werden. Das Auftreten von sCD90 beziehungsweise von CD90+ Alveolarmakrophagen in der BAL charakterisiert möglicherweise ein Initialstadium von fibrosierenden Lungenerkrankungen und könnte insofern in einzelnen Fällen ein gezieltes, frühzeitiges, therapeutisches Vorgehen erlauben. Die Analyse der sCD90-Konzentration in der BAL könnte nicht nur diagnostische, sondern auch prognostische Schlüsse erlauben. Die beiden vorgeschlagenen Untersuchungen hinsichtlich eines Biomarkers der Fibrose könnten es in der Zukunft möglich machen, bei diversen fibrotischen Lungenerkrankungen die bislang hauptsächlich klinische, radiologische und lungenphysiologische Verlaufsbeurteilung des Fibroseprozesses durch ein vergleichsweise einfaches und kostengünstiges laborchemisches Diagnose- und Prognoseverfahren zu ergänzen. 81 5 Zusammenfassung 1991 konnten Fireman et al. am Tel Aviv Medical Center aus der BAL von Sarkoidose-Patienten mit Lungenfibrose nach dreiwöchiger Kultur Fibroblasten züchten. Einer Arbeitsgruppe um Anna Ludwicka gelang es 1992 ebenfalls, aus der BAL von Patienten mit Sklerodermie und sekundärer Lungenbeteiligung Fibroblasten zu züchten. Seit Bucala et al. 1994 zirkulierende Fibroblasten-Vorläuferzellen, so genannte „Fibrozyten“, im peripheren Blut entdecken konnten, existieren verschiedenste Arbeiten zum Mausmodell, welche, nicht nur für die Lungenfibrose, sondern auch für die Fibrose der Leber, die Migration dieser Vorläuferzellen in das betreffende Organ und ihre Beteiligung an der fibrotischen Zerstörung der Organarchitektur beschreiben. Ziel dieser Arbeit war es, Fibroblasten-Vorläuferzellen in der BAL von Patienten mit Lungenfibrose zu identifizieren. Hierzu wurden Alveolarmakrophagen von 26 Patienten mit Lungenfibrose und 17 Normalpersonen sowie Zelllinien humaner Lungenfibroblasten hinsichtlich ihrer Antigen-Expression untersucht. Des Weiteren wurden Lungenfunktionsparameter und die BAL-Differentialzytologie des gesamten Probandenkollektivs erfasst. Die Alveolarmakrophagen der Patienten mit Lungenfibrose zeigten eine deutlich gesteigerte Kollagen Typ I-Expression gegenüber den Zellen der Normalpersonen, die nur wenig Kollagen Typ I exprimierten. Die Expressionsdichte von Kollagen Typ I korrelierte positiv mit der Expressionsdichte von CCL18 und anderen Markern der alternativen Aktivierung von Makrophagen (CD68 und CD206). Weitere Messungen ergaben, dass Alveolarmakrophagen dazu fähig sind, Kollagen Typ I auf ihrer Oberfläche zu binden. Kollagen Typ I schied insofern als Marker für Fibroblasten-ähnliche Zellen in der BAL aus. Vimentin, CD68, CXCR4 und -SMA erwiesen sich ebenfalls als ungeeignet. Mittels des Zellmarkers CD90 konnten jedoch Fibroblasten-ähnliche Zellen in der BAL identifiziert werden. Die BAL der Patienten mit Lungenfibrose zeigte durchschnittlich 23% CD90+ Alveolarmakrophagen, während in der BAL der Normalpersonen keine CD90+ Zellen gefunden werden konnten. Der Anteil CD90+ Zellen korrelierte mit der Expressionsdichte von Kollagen Typ I und CCL18 auf Alveolarmakrophagen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen erstmalig Evidenz für einen potenziellen Marker der Transdifferenzierung zwischen Makrophagen und Fibroblasten. 82 6 Literaturverzeichnis 1. 2000. American Thoracic Society. Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS). Am. J. Respir. Crit Care Med. 161:646-664. 2. 2002. American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS) was adopted by the ATS board of directors, June 2001 and by the ERS Executive Committee, June 2001. Am. J. Respir. Crit Care Med. 165:277-304. 3. 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Antje Prasse, für die Einarbeitung in die experimentelle Medizin, die geduldige Beantwortung zahlreicher Fragen, die Korrektur dieses Manuskriptes und dafür, dass sie mir die Freiheit gelassen hat, eigene Ideen zu verwirklichen. Bei Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. Gernot Zissel bedanke ich mich für die Bereitstellung seines Labors und die stetige Hilfsbereitschaft und Geduld. Herrn Dr. med. Dimitri Pechkovsky danke ich für die Einführung in die Immunologie und Pathogenese von Lungenfibrosen. Für etliche Ratschläge hinsichtlich der Durchflusszytometrie und das Interesse an meiner Arbeit bedanke ich mich bei Herrn Dr. rer. nat. Daniel Myrtek. Frau Stefanie Hahn und Frau Sieglinde Bock danke ich für die Einarbeitung in die experimentelle Methodik und ihre freundliche Unterstützung. Außerdem möchte ich mich bei Frau Sofia Kamenker für ihre außerordentliche Hilfsbereitschaft, die Schokolade und die Geschichten aus der Zeit und der Zeitung bedanken. Ganz herzlich danke ich allen Mitarbeiter(inne)n des Labors, Diplomant(inn)en, Doktorand(inn)en und Freund(inn)en für die sehr gute Stimmung im und außerhalb des Labors. Am Schluss bedanke ich mich ganz besonders bei meinen Eltern für ihre Unterstützung. 95 8 Publikationen 1. Prasse, A., Pechkovsky, D.V., Toews, G.B., Jungraithmayr, W., Kollert, F., Goldmann, T., Vollmer, E., Muller-Quernheim, J. and Zissel, G. 2006. A Vicious Circle of Alveolar Macrophages and Fibroblasts Perpetuates Pulmonary Fibrosis via CCL18. Am. J. Respir. Crit Care Med. 173:781-792. 2. Dmitri V. Pechkovsky1*, Antje Prasse1, Florian Kollert1, Kathrin Engel2, Jan Dentler1, Werner Luttmann3, Karlheinz Friedrich2, Joachim Müller-Quernheim1, Gernot Zissel1. Pattern of Mediators Released in Pulmonary Fibrosis Indicate Alternatively Activated Macrophages. Submitted. 3. Antje Prasse*1, Dmitri V. Pechkovsky1, Galen B. Toews2, Markus Schäfer1, Stephan Eggeling3, Corinna Ludwig3, Martin Germann1, Florian Kollert1, Gernot Zissel1, Joachim Müller-Quernheim1. CC-Chemokine Ligand 18 (CCL18) is an Indicator of Pulmonary Fibrotic Activity in Idiopathic Interstitial Pneumonias and Systemic Sclerosis. Submitted. Die Seite 96 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.
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