Charakterisierung der Verteilung lysosomaler Zystein

Aus dem Institut für Pathologie
an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil -Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. K. M. Müller
___________________________________
Charakterisierung der Verteilung lysosomaler Zystein- und
Asparaginproteasen in der menschlichen Lunge und ihre Bedeutung
bei der Prozessierung des Surfactant Proteins B
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Falkultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Nadja Riemann
aus Herford
2001
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. K. M. Müller
Koreferent:
Prof. Dr. Albrecht Bofe
Tag der mündlichen Prüfung:
17.12.2002
-3-
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen................................................................................ 6
1 Einleitung ................................................................................7
1.1
Kathepsine ......................................................................................... 7
1.2
Surfactant......................................................................................... 10
1.3
Fragestellung und Zielsetzung ......................................................... 11
2 Material und Methoden ........................................................12
2.1
Untersuchungsgut ............................................................................ 12
2.2
Untersuchungsmethoden ................................................................. 12
2.2.1 Konventionelle Histologie.............................................................. 12
2.2.2 Immunhistochemie ........................................................................ 12
2.2.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung .......................... 16
2.2.4 Biochemische Untersuchung ........................................................ 17
3 Ergebnisse ............................................................................19
3.1
Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung ................... 19
3.1.1 Verteilung der Zysteinproteasen B, K, L und S in der humanen
Lunge..................................................................................................... 19
3.1.2 Nachweis von Kathepsin H in der humanen Lunge und seine
Kolokalisation mit Surfactant Protein B ................................................. 21
3.1.3 Verteilung der Asparaginproteasen Kathepsin D und E in der
humanen Lunge ..................................................................................... 23
3.1.4 Verteilung von Kathepsin E in den Clara-Zellen............................ 25
3.1.5 Verteilung der Asparaginprotease Napsin A in der humanen Lunge
............................................................................................................... 27
3.1.6 Verteilung von SP-B und seinen Vorstufen (NPROSP-B und
CPROSP-B) in den Clara-Zellen............................................................ 29
4 Diskussion ............................................................................31
4.1
Kathepsin B...................................................................................... 32
4.1.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 32
4.1.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 32
4.1.3 Aufbau........................................................................................... 32
-4-
Inhaltsverzeichnis
4.1.4 Funktion ........................................................................................ 34
4.1.5 Die Bedeutung von Kathepsin B in der menschlichen Lunge........ 36
4.2
Kathepsin D ..................................................................................... 36
4.2.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 36
4.2.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 37
4.2.3 Aufbau........................................................................................... 37
4.2.4 Funktion ........................................................................................ 38
4.2.5 Die Bedeutung von Kathepsin D in der menschlichen Lunge ....... 39
4.3
Kathepsin E...................................................................................... 39
4.3.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 39
4.3.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 40
4.3.3 Aufbau........................................................................................... 40
4.3.4 Funktion ........................................................................................ 42
4.3.5 Die Bedeutung von Kathepsin E in der menschlichen Lunge........ 43
4.4
Kathepsin H ..................................................................................... 43
4.4.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 43
4.4.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 44
4.4.3 Aufbau........................................................................................... 44
4.4.4 Funktion ........................................................................................ 45
4.4.5 Kathepsin H und die Prozessierung von SP-B.............................. 46
4.5
Kathepsin K (Synonym: Kathepsin O2) ............................................ 47
4.5.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 47
4.5.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 47
4.5.3 Aufbau........................................................................................... 47
4.5.4 Funktion ........................................................................................ 48
4.5.5 Die Bedeutung von Kathepsin K in der menschlichen Lunge........ 50
4.6
Kathepsin L ...................................................................................... 50
4.6.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 50
4.6.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 50
4.6.3 Aufbau........................................................................................... 51
4.6.4 Funktion ........................................................................................ 52
4.6.5 Die Bedeutung von Kathepsin L in der menschlichen Lunge ........ 53
4.7
Kathepsin S...................................................................................... 54
4.7.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 54
-5-
Inhaltsverzeichnis
4.7.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 54
4.7.3 Aufbau........................................................................................... 55
4.7.4 Funktion ........................................................................................ 56
4.7.5 Die Bedeutung von Kathepsin S in der menschlichen Lunge........ 56
4.8
Napsin A .......................................................................................... 57
4.8.1 Untersuchungsergebnis ................................................................ 57
4.8.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................... 57
4.8.3 Aufbau........................................................................................... 57
4.8.4 Funktion ........................................................................................ 58
4.8.5 Napsin A und die Prozessierung von Surfactant Protein B ........... 59
4.9
Surfactant......................................................................................... 60
4.10 Surfactant Protein B ......................................................................... 61
4.10.1 Untersuchungsergebnis ............................................................. 61
4.10.2 Allgemeine Charakteristika ........................................................ 61
4.10.3 Aufbau........................................................................................ 61
4.10.4 Funktion ..................................................................................... 63
4.11 Die Bedeutung von Kathepsin H und Napsin A in der Prozessierung
des Surfactant Proteins B ......................................................................... 65
4.12 Clara-Zellen ..................................................................................... 67
4.12.1 Allgemeine Charakteristika ........................................................ 67
4.12.2 Aufbau des „Clara-Cell specific“ Proteins CC10 ........................ 68
4.12.3 Funktion der Clara-Zellen........................................................... 69
4.13 Die Prozessierung des Surfactant Proteins B in den Clara-ZellGranula .................................................................................................. 70
5 Zusammenfassung...............................................................71
6 Literatur ................................................................................. 73
-6-
AMP
Adenosinmonophosphat
ATP
Adenosintriphosphat
APAAP
alkalische Phosphatase anti-alkalische Phosphatase
AS
Aminosäure
BAL
Broncho-Alveoläre-Lavage
CRD
carbohydrate recognition domain
DNA
Desoxyribonukleinsäure (-acid)
DPPC
Dipalmitoylphosphatidylcholin
EDTA
ethylene diamine tetraacetic acid =
Äthylendiamintetraessigsäure
EvG
Elastica-van-Gieson
HLA
Human Leucocyte Antigen
HE
Hämatoxylin-Eosin
HNF-3α
Hepatozellulärer nukleärer Faktor-3α
HIV
human immunodeficiency virus
INF
Interferon
LPS
Lipopolysaccharid
MHC
major histocompatibility complex
PAS
Perjodsäure (-acid) Schiff
PDGF
Plättchen (-derived) wachstums (-growth) faktor
RDS
respiratory distress syndrom (Atemnotsyndrom)
RNA
Ribonukleinsäure (-acid)
SP-A/B/C/D Surfactant Protein A/B/C/D
TCA
Trichloressigsäure (-acid)
TNF
Tumornekrosefaktor
TGF
transforming growth factor
TTF
Thyroidaler Transkriptionsfaktor
Abkürzungen
1. Einleitung
-7-
1 Einleitung
1.1
Kathepsine
Die Kathepsine stellen eine Gruppe von lysosomalen Enzymen dar, die die
proteolytische Prozessierung von Proteinen katalysieren. Eine Unterteilung
der lysosomalen Enzyme in die Familie der Pepsin- und Papainproteasen ist
aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminosäuren im katalytischen Zentrum
möglich.
Barrett (1992) verdeutlichte diese Unterschiede in der folgenden Tabelle:
Die Tabelle verdeutlicht die unterschiedliche Zugehörigkeit der Kathepsine
zur Familie der Pepsin- und Papainproteasen in Abhängigkeit von den
Aminiosäuren im katalytischen Zentrum.
Tabelle 1: Darstellung der Enzyme sowie ihrer katalytischen Aktivität und Familienzugehörigkeit
Enzyme
Katalytische
Aktivität
Familie
Kathepsin D
Asparagin
Pepsin
Kathepsin B
Zystein
Papain
Kathepsin H
Zystein
Papain
Kathepsin L
Zystein
Papain
Kathepsin S
Zystein
Papain
Zu den Asparaginproteasen werden heute noch die Napsine und Kathepsin
E, zu den Zysteinproteasen Kathepsin K gezählt (Fowler et al. 1995, Gelb et
al. 1996, Schauer-Vukasinovic et al. 2000).
Die Kathepsine zeigen einen ähnlichen Aufbau. Von der Zelle wird ein
Präprokathepsin gebildet, das posttranslational in ein Prokathepsin und das
mature Kathepsin prozessiert wird. Folgende Sequenzen konnten lokalisiert
werden:
1. eine ca. 12-16 Aminosäuren lange Signalsequenz am NH2-terminalen
Ende
2. eine sich daran anschließende ca. 100 Aminosäuren lange Proregion und
3. das mature Enzym mit dem COOH-terminalen Ende.
Nach der Synthese an den membranassoziierten Ribosomen erfolgt der
Transport
des
Präproproteins
mit
Hilfe
der
Signalsequenz
in
das
endoplasmatische Retikulum, wo die Signalsequenz meist im Bereich der
1. Einleitung
-8-
Position Ala-X-Ala abgespalten wird. Das Proenzym gelangt dann in den
Golgi-Apparat, wo den Kathepsinen auf der cis-Seite des Golgi-Komplexes
Oligosaccharide in Form von Mannose-6-Phosphat angehängt werden,
welche auf der trans-Seite des Golgi-Komplexes von dem M-6-P-Rezeptor
erkannt und gebunden werden. Diese Rezeptoranbindung ermöglicht den
Weitertransport zu den Lysosomen, in denen die maturen Kathepsine die
Degradation ihrer Substrate vornehmen (Bohley et al. 1992, Bossard et al.
1996, von Heijne 1983).
Die genauen Prozessierungsschritte und die möglicherweise beteiligten
Enzyme, die zur Bildung des maturen Kathepsins führen, sind noch nicht
bekannt. Einzig vom Kathepsin E weiß man, daß es teilweise über
autokatalytische Prozesse aktiviert wird (Kageyama et al.1992).
Als charakteristisches Merkmal findet man im katalytischen Zentrum der
Familie der Pepsinproteasen Asparaginsäurereste und im katalytischen
Zentrum der Familie der Papainproteasen Zysteinsäurereste (Barrett 1992).
Der Abbau der Substrate durch die einzelnen Kathepsine dagegen erfolgt auf
unterschiedliche Weise, so daß hierin kein familienspezifisches Merkmal
besteht (Barrrett 1992).
Das pH-Optimum für die meisten Enzyme der Familie der Pepsin- und
Papainproteasen liegt im sauren Bereich. Basierend auf theoretischen
Überlegungen in Bezug auf die Aminosäuresequenz der Zysteinproteasen
liegt das pH-Optimum für diese Enzyme normalerweise im neutralen pHBereich. Hier hat also im Laufe der Jahre ein Adaptationsprozeß an das
saure Milieu der Lysosomen stattgefunden (Barrett 1992).
Eine weitere Unterscheidung der beiden Kathepsinfamilien ist auch in Bezug
auf ihre Inhibition im katalytischen Zentrum möglich. Die Zysteinproteasen
werden durch E-64 (irreversibel) und Kininogen, die Asparaginproteasen
durch Pepstatin (reversibel) gehemmt. Bei neutralen und basischen pHWerten sind für beide Familien keine proteolytischen Aktivitäten mehr
nachweisbar (Barrett 1992).
Biochemisch sind die Kathepsine in nahezu allen Organen des humanen
Organismus lokalisiert. Kathepsin E zum Beispiel findet sich in besonders
hohen Konzentrationen in den Organen, die in die Degradation von
Antigenen involviert sind (Langehanszellen der Haut, Milz, Tonsillen etc.)
1. Einleitung
-9-
(Solcia et al. 1993, Finzi et al. 1993). Kathepsin K zeigt dagegen besonders
hohe Konzentrationen im Knochengewebe (Inaoka et al.1995). Die
Kathepsine B, D und L lassen sich in fast allen Organen des menschlichen
Organismus nachweisen, wohingegen Kathepsin S nur in wenigen Organen
(Lunge, Leber, Milz) lokalisiert werden konnte (Joseph et al. 1988, Furuhashi
et al. 1991, Bohley et al. 1992, Shi et al. 1994, Brömme et al. 1996). Napsin
A, die bislang jüngste Asparaginprotease, konnte nur in der Lunge und in der
Niere nachgewiesen werden (Schauer-Vukasinovic et al. 1999 und 2000).
Es wird auch ein extrazelluläres von den Lysosomen unabhängiges
Vorkommen diskutiert (Gabrijelcic et al. 1990).
Matsuba et al. (1989) wiesen die Kathepsine B, H und L in den
sekretorischen Granula der juxtaglomerulären Zellen der Rattenniere nach,
was auf eine mögliche Mitbeteiligung an der Prozessierung von Renin aus
seinen inaktiven Vorstufen hindeutet (Matsuba et al. 1989).
Weiterhin zeigte sich, daß die Kathepsine unter anderem bei der
Tumorinfiltration
und
Metastasierung,
bei
Entzündungsprozeßen,
Demyelinisierungserkrankungen, Muskeldystrophien und bei der Destruktion
von Knorpel- und Knochengewebe im Rahmen der Arthrose eine Rolle
spielen (Turk et al. 1986).
1. Einleitung
1.2
- 10 -
Surfactant
Der Surfactant wird von den cuboiden Alveolarepithelzellen, den Typ-IIPneumozyten, synthetisiert und sezerniert. Die Abgabe aus diesen Zellen
erfolgt über eine regulierte Sekretion. Im Alveolarraum verteilt sich der
Surfactant wie ein Film gleichmäßig auf der Innenfläche der Alveolen. Seine
Hauptaufgabe liegt in der Reduktion der Oberflächenspannung, um ein
Kollabieren der Alveole am Ende der Expiration zu verhindern (Blümcke et al.
1995).
Der von ihm gebildete Film dient ferner als „Schutzschicht“. Der Surfactant ist
in
der
Lage,
mit
der
Inspiration
aufgenommenes
Material
wie
Mikroorganismen und Proteine einzuhüllen und so den Alveolarmakrophagen
besser zugänglich zu machen. Weiterhin fördert er den intrazellulären Abbau
von Mikroorganismen (Blümcke et al. 1995).
Der Surfactant besteht aus einem Lipid-Protein-Gemisch, dessen wichtigster
Bestandteil das Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) darstellt. Im Surfactant
sind weiterhin neutrale Lipide (Cholesterol) nachweisbar, deren genaue
Bedeutung noch nicht bekannt ist (King et al. 1972, Haagsmann et al. 1991).
Die Lipide des Surfactant werden von den Typ-II-Pneumozyten synthetisiert,
in den Lamellenkörperchen gespeichert und aus diesen in den Alveolarraum
freigesetzt. Weiterhin findet eine Wiederaufnahme der Lipide aus dem
Alveolarraum in den Typ-II-Pneumozyten statt. Ein Teil der Lipide wird erneut
in den Lammellenkörperchen gespeichert und auf entsprechende Reize
wieder in die Alveole freigesetzt. Ein anderer Teil wird in den Typ-IIPneumozyten degradiert und seine Abbauprodukte teilweise zur de novo
Synthese von Surfactant herangezogen (Wright et al. 1990).
Als weitere Bestandteile des Surfactant konnten bisher die vier Surfactant
assoziierten Proteine A, B, C und D nachgewiesen werden. Ihre Benennung
in Form von SP-A, SP-B, SP-C und SP-D erfolgte in alphabetischer
Reihenfolge abhängig vom Zeitpunkt ihrer Entdeckung (Possmayer et al.
1988).
1. Einleitung
1.3
- 11 -
Fragestellung und Zielsetzung
Ziel
dieser
Studie
ist
es,
an
Hand
von
immunhistochemischen,
biochemischen und elektronenmikroskopischen Methoden die Verteilung der
Zysteinproteasen B, H, K, L und S sowie der Asparaginproteasen D, E und
Napsin A in der humanen Lunge und im Material der Broncho-AlveolärenLavage (BAL) zu charakterisieren. Weiterhin soll ermittelt werden, welche der
Kathepsine aufgrund einer Kolokalisation mit dem Surfactant Protein B
möglicherweise in die bislang ungeklärte proteolytische Prozessierung dieses
Proteins involviert sind.
Von Interesse sind hierbei folgende Fragestellungen:
Zur Verteilung der Zystein- und Asparaginproteasen in der menschlichen
Lunge (immunhistochemisch und immunelektronenmikroskopisch):
-
In welchen Zellen und Zellorganellen sind die Zysteinproteasen B, H, K,
L
und S sowie die Asparaginproteasen D, E und Napsin A in der
menschlichen Lunge lokalisiert?
Zur Kolokalisation der Zystein- und Asparaginproteasen mit dem Surfactant
Protein B in der menschlichen Lunge (immunhistochemisch):
-
In welchen Zellen und Zellorganellen liegt eine Kolokalisation des
Surfactant Proteins B mit einem oder mehreren Angehörigen der Zysteinund/oder Asparaginproteasen in der menschlichen Lunge vor?
2. Material und Methoden
- 12 -
2 Material und Methoden
2.1
Untersuchungsgut
Zur Untersuchung kamen acht humane Lungengewebsproben aus einem
Kollektiv von Spenderlungen Verstorbener ohne Hinweis für wesentliche
pulmonale Vorerkrankungen. Es handelt sich hierbei um Lungen, für die
entweder über das Eurotransplant Foundation Center, Leiden, kein
geeigneter Empfänger gefunden werden konnte oder die aus klinischen
Gründen nicht der Transplantation zugeführt werden durften. Die Fixierung
und
Einbettung
der
eingesetzten
Präparate
erfolgte
für
die
Immunhistochemie mit 4%igem gepufferten Formalin und Paraffin. Für die
Immunelektronenmikroskopie
wurde
ein
Gemisch
aus
4%igem
Paraformaldehyd und 0.5%igem Glutaraldehyd in 0.2M Hepes-Puffer
eingesetzt.
2.2
Untersuchungsmethoden
2.2.1 Konventionelle Histologie
Die Färbung der in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte erfolgte nach
histologischen Standard-Protokollen. Zum Einsatz kamen die HE-Färbung
(Hämatoxylin-Eosin, Übersichtsfärbung), die EvG-Färbung (Elastica-vanGieson) und die PAS-Färbung (Perjod-Säure-Schiff).
2.2.2 Immunhistochemie
Bei den immunhistologischen Untersuchungen kamen polyklonale Antikörper
gegen die Kathepsine B, D, E, H, K, L und S, Napsin A sowie das Surfactant
Protein B und das Clara-Zell-spezifische Protein CC10 zum Einsatz. Bei den
für die Kathepsine verwendeten Antikörpern handelt es sich um polyklonale
Antikörper aus dem Kaninchen (Kathepsin D, H, K und S) und der Ziege
(Kathepsin B, L und E).
In Bezug auf das Surfactant Protein B wurden nicht nur Antikörper gegen die
mature Form von SP-B verwendet, sondern auch gegen das N- und C-
2. Material und Methoden
terminale
Ende
von
- 13 -
Surfactant-Protein-B-Vorstufen
(NPROSP-B
und
CPROSP-B).
Der nachstehenden Tabelle 2 können die entsprechenden Vorbehandlungen,
Verdünnungen und die Bezugsquelle für die Kathepsine entnommen werden.
Tabelle 2: Charakterisierung der verwendeten Antikörper (Kathepsine)
Antikörper
Art
Verdünnung
Bezugsquelle
Vorbehandlung
Kathepsin B
Ziege
1:400
Dr. F. Bühling
Keine
Kathepsin D
Polyklonal
1:500
Dr. F. Bühling
MW und E
Ziege N19 und
1:70
C20
1:60
Dr. F. Bühling
Keine
Kathepsin H
Polyklonal
1:600
Dr. F. Bühling
Keine
Kathepsin K
Polyklonal
1:300
Dr. F. Bühling
MW
Kathepsin L
Ziege
1:1000
Dr. F. Bühling
MW
Kathepsin S
Polyklonal
1:400
Dr. F. Bühling
MW und E
Kathepsin E
MW:
Mikrowelle
E:
Enzymatische Vorbehandlung
Bei den Antikörpern für das Surfactant Protein B handelt es sich um
polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen. Der folgenden Tabelle 3 können
die
entsprechenden
Vorbehandlungen,
Verdünnungen
sowie
die
Bezugsquelle entnommen werden.
Tabelle 3: Charakterisierung der verwendeten Antikörper (Surfactant Proteine)
Antikörper
Art
Verdünnung
Bezugsquelle
Vorbehandlung
SP-B
Polyklonal
1:3000
Fa. Chemicon
Keine
NPROSP-B
Polyklonal
1:200
CPROSP-B
Polyklonal
1:200
Prof. S.
Hagwood
Prof. S.
Hagwood
Keine
Keine
Die immunhistochemischen Schnitte wurden mit Hilfe der APAAP-Methode
(alkalische
Phosphatase
anti-alkalische
Phosphatase)
und
den
2. Material und Methoden
- 14 -
entsprechenden Antikörpern gefärbt, wobei die Schritte 1 bis 3 manuell und
die Schritte 4 bis 9 automatisch mit Hilfe des Chem Mate 500 der Firma
DAKO erfolgten.
1) 3-4 µm dicke Schnittpräparate des in Formalin fixierten und in Paraffin
eigebetteten Gewebes wurden auf einen speziellen Kapillarspaltobjektträger der Firma DAKO aufgezogen. Anschließend wurden die
Präparate über Nacht bei 37°C im Wärmeschrank getrocknet.
2) Die Schnittpräparate wurden in Xylol entparaffiniert und in einer
absteigenden
Alkoholreihe
(100%,
96%
und
70%)
rehydriert.
Anschließend wurden die Präparate für 10 Min. in Tris-Puffer (pH 7.2)
gespült.
3) Die Vorbehandlung der Schnittpräparate erfolgt in Abhängigkeit des
verwendeten Primärantikörpers:
-
Mikrowelle: Die Schnitte wurden in Puffer (Antigen Retrieval Buffer)
entweder mit 10 mM Citratpuffer, pH 6.0 (Firma Quartett) oder in 1 mM
EDTA, pH 8.0 für 15 Minuten bei 600 Watt in der Mikrowelle gekocht
und anschließend für weitere 10 Minuten in warmem Puffer
stehengelassen.
-
Enzymatische Vorbehandlung: Die Schnitte wurden mit Protease
(Firma Sigma) 3.3 mg in 50 ml Tris-Puffer bei 37°C für 10 Minuten
inkubiert.
4) Die Schnitte wurden mit den jeweiligen Primärantikörpern in der
entsprechenden Verdünnung (siehe Tabelle 2 und 3) für 25 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Antikörperverdünnung erfolgte mit Hilfe
eines Diluents der Firma Zymed. Zwischen den einzelnen Inkubationen
erfolgten Waschvorgänge mit Puffern aus einem Puffer-Kit der Firma
DAKO (K5006).
2. Material und Methoden
- 15 -
5) Zwischenbehandlung für die Kathepsine B, L und E
Diese Kathepsine werden mit RAG- (rabbit-anti-goat) Antikörpern
behandelt, um sie den weiteren Schritten der APAAP-Methode zugänglich
zu machen. Der Antikörper wurde für die einzelnen Kathepsine in
folgender Verdünnung eingesetzt.
-
Kathepsin B:
1:1000
-
Kathepsin L:
1:1000
-
Kathepsin E N19 und N20: 1:2000
6) Hieran schloß sich eine weitere 25minütige Inkubation mit MAR (mouseanti-rabbit)-Serum an, das mit dem Diluent 1:300 verdünnt wurde.
7) Es erfolgte eine erneute Spülung der Präparate und eine weitere
Inkubation
bei
Raumtemperatur
Sekundärantikörper
=
Link
von
(APAAP-Kit
25
Minuten
K5000,
mit
Firma
einem
DAKO,
gebrauchsfertig). Bei diesem Brückenantikörper handelt es sich um
Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobuline aller Isotope.
8) Nach erneuter Spülung erfolgte eine weitere Inkubation von 25 Minuten
bei Raumtemperatur mit einem APAAP-Komplex (APAAP-Kit K5000,
Firma DAKO, gebrauchsfertig). Der APAAP-Komplex besteht aus
monoklonalen Maus-IgG1-Antikörpern, die spezifisch an die alkalische
Phosphatase aus der Kälberdarmmukosa gebunden waren.
9) Zur Verstärkung der Reaktion erfolgte eine Wiederholung der Schritte 5
und 6 für jeweils 10 Minuten.
10) Zur Farbentwicklung wurde ebenfalls das APAAP-Kit benutzt. Als
Chromogen-Substrat kam Neufuchsin zur Anwendung. Die endogene AP
wurde durch Zugabe von Levamisol (0.2 mmol), ebenfalls im APAAP-Kit
enthalten, geblockt. Die Inkubationszeit betrug 4x5 Minuten, wobei
zwischendurch Spülvorgänge mit Tris-Puffer stattfanden.
2. Material und Methoden
- 16 -
11) Die Gegenfärbung erfolgte mit Mayers-Hämatoxylin für 2 Minuten.
Anschließend wurden die Schnittpräparate erst für 2 Minuten in Wasser
gebläut und dann für weitere 2 Minuten in Tris-Puffer gegeben. Durch die
aufsteigende Alkoholreihe wurden die Schnitte zunächst dehydriert, um
dann über Xylol mit Eukitt oder Eindeckfolie (Eindeckautomat der Firma
Vogel) abgedeckt zu werden.
Die Auswertung der histologischen Präparate erfolgte über Mikroskope und
den Computer. Mit Hilfe eines Lichtmikroskopes (Axioskop, Carl Zeiss, Jena)
wurden
die
Präparate
der
konventionellen
Histologie
und
der
Immunhistochemie ausgewertet. Die Dokumentation erfolgte mittels einer
CCD-Kamera (HV-C20M, Hitachi Denshi Ltd., Japan) am Lichtmikroskop und
über ein Dokumentationssystem (Diskus V4.20, Technisches Büro Hilgers,
Königswinter).
2.2.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung
1) Fixierung des Lungengewebes mit einem Gemisch aus 4%igem
Paraformaldehyd und 0,5%igem Glutaraldehyd in 0.2M Hepes-Puffer mit
einem pH-Wert von 7.4.
2) Infiltration der angefertigten Blöckchen mit 2.3M Sucrose über Nacht und
Einfrierung in flüssigem Stickstoff
3) Transfer der eingefrorenen Blöckchen in 0.5% Uranylazetat in Methanol
bei –80°C für weitere 36 Stunden
4) Temperaturerhöhung auf –45°C, wobei die Erhöhung in Schritten von
jeweils 5°C pro Stunde erfolgt
5) Mehrmaliges
Waschen
der
Präparate
mit
purem
Methanol
und
anschließende Gabe der Blöckchen in Lomikryl HM 20 über HM20Methanol 1:1 und 2:1 für jeweils 2 Stunden
6) Polymerisation der Blöckchen mit UV-Licht für 2 Tage bei –45°C
2. Material und Methoden
- 17 -
7) Beschriftung der Ultradünnschnitte über folgende Prozedur:
Aufziehen der Schnitte auf mit Kupfer oder Nickel überzogene Formvar
Netzgitter („mesh grids“). Zur Blockierung freier Aldehydgruppen und
unspezifischer Bindungsstellen werden die „grids“ zunächst auf einen
Tropfen 0.02% Glyzin/TBS für 15 Min und dann auf einen Tropfen
Blockierungspuffer (FCS/Tween20/TBS) gelegt. Im nächsten Schritt werden
die „grids“ auf einen Tropfen primären Antikörper gegen Napsin A oder
Kathepsin H verdünnt in Blockierungspuffer für 60 Minuten gelegt. Daran
schließt sich ein 6 maliges Spülen der „grids“ für jeweils 5 Minuten in
Blockierungspuffer an. Die Immunreaktion wird durch Inkubation mit einem
sekundären, mit 10 nm Gold beschichteten Antikörper sichtbar gemacht.
Hieran schließt sich ein erneutes Spülen an, diesmal mit Blockierungspuffer
(4 mal für jeweils 5 Minuten), TBS (5 mal für jeweils 5 Minuten) und
destilliertem Wasser (3 mal). Abschließend werden die „grids“ mit einem
Tropfen 4% wässrigen Uranylazetat kontrastiert, 3 mal kurz mit destilliertem
Wasser gespült und über Nacht bei 40°C getrocknet.
Die Auswertung erfolgte mit dem Zeiss Elektronenmikoskop 900 (Zeiss,
Oberkochen, Deutschland) bei 50 kV.
2.2.4 Biochemische Untersuchung
Bei der weiterführenden Western blot Untersuchung an Material aus einer
Broncho-Alveolären-Lavage kamen polyklonale und auch ein monoklonaler
Antikörper gegen Surfactant Protein B und seine Vorstufen (NPROSP-B,
CPROSP-B) zum Einsatz. Die polyklonalen Antikörper gegen das N- und Cterminale Ende des SP-B wurden teilweise bereits in der Immunhistochemie
verwendet. Die Charakterisierung der eingesetzten AK ist aus der folgenden
Tabelle 4 zu entnehmen, wobei sich Art und Angriffsdomäne auf den jeweils
vorangestellten Antikörper beziehen:
Tabelle 4: Charakterisierung der verwendeten Antikörper (Surfactant Proteine)
Antikörper
Art
Angriffsdomäne
Verdünnung
Bezugsquelle
NPROSP-B
Polyklonal
N-Terminus
1:1000
Prof. S. Hagwood
CPROSP-B
Polyklonal
C-Terminus
1:1000
Prof. S. Hagwood
SP-B
Monoklonal
SP-B
1:20000
Dr. Suzuki
2. Material und Methoden
- 18 -
Die biochemischen Analysen wurden mit dem NuPAGE Elektrophorese
System der Firma Novex/Invitrigon (Carlsbad, CA, USA) entsprechend
dem Standardprotokoll durchgeführt:
1) Beladung der Gele (4-12% NuPAGE Bis-Tris Gel) mit einem Aliquot der
BAL und einem Laufpuffer (NuPAGE MES/SDS Running Buffer);
Ladepuffer: 2X NuPAGE LDS Sample Buffer; Elektrophorese: 200 Volt,
nicht-reduzierende Bedingungen, 50-60 Minuten; Größenstandard: Mark
12 (Fa. Novex/Invitrigon) und Prestained Precision (Fa. Bio-RAD,
Hercules, CA, USA)
2) Transfer der Proteine auf Nitrozellulose-Membranfilterpapier der Stärke
0,2 µm mittels Transfer-Puffers (NuPAGE Transfer Buffer) mit 20%
Methanol bei einer Spannung von 35 Volt über 120 Minuten
3) Inkubation
für
zwei
Stunden
in
TBS-Puffer-Lösung
mit
5%
Magermilchpulver
4) Inkubation mit verdünnten Primärantikörpern über Nacht (Verdünnung
siehe Tabelle 4) in 10 ml der jeweiligen Antikörper / 5% Milch-TBS-PufferLösung
5) Dreimal Waschen in jeweils 20-30 ml 5% Milch-TBS-Pufferlösung
6) Inkubation
mit
den
Sekundärantikörpern
(bei
polyklonalem
Primärantikörper: anti-rabbit IgG, AP-(alkalische Phosphatase) gekoppelt
(Fa. Promega, Madison, WI, USA); bei monoklonalem Primärantikörper:
anti-mouse IgG, AP-gekoppelt (Fa. Promega)) verdünnt 1:5000 in 10 ml
5% Milch-TBS-Pufferlösung über eine Stunde
7) Dreimal Waschen in jeweils 20-30 ml TBS-Pufferlösung und einmal in 10
ml AP-Puffer (100 mmol Tris (pH 9,5), 100 mmol NaCl, 5 mmol MgCl2)
8) Färbung unter Sichtkontrolle mit einem Gemisch aus 66 µl NBT und 33 µl
BCIP (Fa. Promega)
3. Ergebnisse
- 19 -
3 Ergebnisse
3.1
Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung
3.1.1 Verteilung der Zysteinproteasen B, K, L und S in der humanen Lunge
Die Kathepsine B, K und L zeigten eine stark positive Reaktion im
zilientragenden Bronchialepithel und in den Alveolarmakrophagen, wohingegen die Reaktion in den Pneumozyten negativ ausfiel (siehe hierzu
Abbildung 1a-f).
Für Kathepsin S fand sich eine positive Reaktion ausschließlich in den
Alveolarmakrophagen. Kathepsin S ließ sich im zilientragenden Bronchialepithel und den Pneumozyten immunhistochemisch nicht nachweisen (siehe
hierzu Abbildung 1g und h).
Abbildung 1: Verteilung der Zysteinproteasen
a) Nachweis von Kathepsin B im zilientragenden Bronchialepithel
b) Nachweis von Kathepsin B in den Alveolarmakrophagen sowie negativer
Nachweis in den Pneumozyten
c) Nachweis von Kathepsin K im zilientragenden Bronchialepithel
d) Nachweis von Kathepsin K in den Alveolarmakrophagen sowie negativer
Nachweis in den Pneumozyten
e) Nachweis von Kathepsin L im zilientragenden Bronchialepithel
f) Nachweis von Kathepsin L in den Alveolarmakrophagen sowie negativer
Nachweis in den Pneumozyten
g) Nachweis von Kathepsin S in den Alveolarmakrophagen
h) Kein Nachweis von Kathepsin S im zilientragenden Bronchialepithel und
den Pneumozyten
3. Ergebnisse
- 20 -
a)
b)
Kathepsin B
Kathepsin B
c)
d)
Kathepsin K
Kathepsin K
e)
f)
Kathepsin L
Kathepsin L
g)
h)
Kathepsin S
Kathepsin S
Abbildung 1: Verteilung der Zysteinproteasen
3. Ergebnisse
- 21 -
3.1.2 Nachweis von Kathepsin H in der humanen Lunge und seine
Kolokalisation mit Surfactant Protein B
Kathepsin H zeigte immunhistochemisch eine stark positive Reaktion im
zilientragenden Bronchialepithel und in den Alveolarmakrophagen. Als
einziges Kathepsin konnte es zusätzlich in den Typ-II-Pneumozyten
lokalisiert werden (siehe hierzu Abbildung 2a und b).
Ein Double-Labeling zeigte eine Kolokalisation von Kathepsin H mit dem
Surfactant Protein B in den Typ-II-Pneumozyten (siehe hierzu Abbildung 2c
und d).
Immunelektronenmikroskopisch ließ sich Kathepsin H in den Lysosomen des
Bronchialepithels sowie in den primären und sekundären Lysosomen der
Alveolarmakrophagen darstellen (siehe hierzu Abbidung 2e und f). Weiterhin
zeigte sich eine positive Reaktion im Bereich der Typ-II-Pneumozyten in den
multivesikulären Körperchen und entlang der „limiting membrane“ sowie des
„projection core“ der Lamellenkörperchen (siehe hierzu Abbildung 2g und h).
Für
die
immunelektronenmikroskopische
Darstellung
wurde
für
die
Abbildungen e) bis g) eine Primärvergrößerung von 30000 sowie für die
Abbildung h) von 50000 gewählt.
Abbildung 2: Lokalisation von Kathepsin H und Surfactant Protein B
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Nachweis von Kathepsin H im zilientragenden Bronchialepithel
Nachweis von Kathepsin H in den Makrophagen und in den Pneumozyten
Nachweis von Kathepsin H in den Pneumozyten bei starker Vergrößerung
Nachweis von SP-B in den Pneumozyten bei starker Vergrößerung
Lokalisation von Kathepsin H in Lysosomen des Bronchialepithels
Lokalisation von Kathepsin H in primären und sekundären Lysosomen
(Phagolysosomen) von Alveolarmakrophagen
g) Ausschnitt eines Typ-II-Pneumozyten mit Lokalisation von Kathepsin H im
äußeren Abschnitt und entlang der „limiting membrane“ eines
Lamellenkörperchens
h) Lokalisation von Kathepsin H über der Matrix eines multivesikulären
Körperchens
3. Ergebnisse
- 22 -
a)
b)
Kathepsin H
Kathepsin H
c)
d)
Kathepsin H
SP-B
e)
f)
Kathepsin H
Kathepsin H
g)
h)
Kathepsin H
Kathepsin H
Abbildung 2: Lokalisation von Kathepsin H und Surfactant Protein B
3. Ergebnisse
- 23 -
3.1.3 Verteilung der Asparaginproteasen Kathepsin D und E in der
humanen Lunge
Kathepsin D zeigte eine positive Reaktion im zilientragenden Bronchialepithel
und in den Alveolarmakrophagen. In den Typ-II-Pneumozyten konnte es
immunhistochemisch nicht lokalisiert werden (siehe hierzu Abbildung 3b und
c).
Kathepsin E zeigte eine positive Reaktion in nicht zilientragenden
Bronchialepithelzellen, den Clara-Zellen. In Aveolarmakrophagen und Typ-IIPneumozyten ließ es sich immunhistochemisch nicht nachweisen (siehe
hierzu Abbildung 3e und f).
Immunelektronenmikroskopisch konnte Kathepsin D in den Lysosomen des
kinozilientragenden Bronchialepithels nachgewiesen werden (siehe hierzu
Abbildung
3d).
Die
Darstellung
erfolgte
mit
einer
20000fachen
Primärvergrößerung.
Abbildung 3: Verteilung der Asparaginproteasen
a) Übersicht Kathepsin D
b) Nachweis von Kathepsin D in den Alveolarmakrophagen, aber kein
Nachweis in den Pneumozyten
c) Nachweis von Kathepsin D im zilientragenden Bronchialepithel
d) Lokalisation von Kathepsin D in den Lysosomen des kinozilientragenden
Bronchialepithels
e) Nachweis von Kathepsin E in den Clara-Zellen
f) Kein Nachweis von Kathepsin E in den Pneumozyten und den
Alveolarmakrophagen
3. Ergebnisse
- 24 -
a)
b)
Kathepsin D
Kathepsin D
c)
d)
Kathepsin D
Kathepsin D
e)
f)
Kathepsin E
Kathepsin E
Abbildung 3: Verteilung der Asparaginproteasen
3. Ergebnisse
- 25 -
3.1.4 Verteilung von Kathepsin E in den Clara-Zellen
Für den Nachweis von Kathepsin E und CC10 in Clara-Zellen wurde ein
Double-Labeling an Serienschnitten durchgeführt. Kathepsin E konnte
immunhistochemisch ausschließlich in CC10-negativen Clara-Zellen im
Übergangsbereich der Bronchioli terminalis in die Bronchioli respiratorii
lokalisiert werden. Eine Kolokalisation von Kathepsin E mit dem „Clara-cell
specific“ Protein CC10 gelang nicht (siehe hierzu Abbildung 4a-h).
Abbildung 4: Verteilung von Kathepsin E auf CC10-positive und -negative
Zellen
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Nachweis von Kathepsin E in CC10-negativen Clara-Zellen
Nachweis von CC10-positiven Clara-Zellen
Nachweis von Kathepsin E in CC10-negativen Clara-Zellen
Nachweis von CC10-positiven Clara-Zellen
Nachweis von Kathepsin E in CC10-negativen Clara-Zellen
Nachweis von CC10-positiven Clara-Zellen
Nachweis von Kathepsin E in CC10-negativen Clara-Zellen
Nachweis von CC10-positiven Clara-Zellen
3. Ergebnisse
- 26 -
a)
b)
Kathepsin E
Clara-Zelle CC10
c)
d)
Kathepsin E
Clara-Zelle CC10
e)
f)
Kathepsin E
Clara-Zelle CC10
g)
h)
Kathepsin E
Clara-Zelle CC10
Abbildung 4: Verteilung von Kathepsin E auf CC10-positive und -negative Zellen
3. Ergebnisse
- 27 -
3.1.5 Verteilung der Asparaginprotease Napsin A in der humanen Lunge
Napsin A konnte immunhistochemisch in den Pneumozyten und den
Alveolarmakrophagen lokalisiert werden (siehe hierzu Abbildung 5a und b).
Immunelektronenmikroskopisch ließ sich Napsin A in Typ-II-Pneumozyten,
Alveolarmakrophagen und Clara-Zellen nachweisen. Die Abbildungen sind in
einer 30000fachen Primärvergrößerung dargestellt.
In den Typ-II-Pneumozyten konnte es in den Lamellenkörperchen im Bereich
des „projection core“ sowie den multivesikulären Körperchen lokalisiert
werden (siehe hierzu Abbildung 5c und d).
In den Alveolarmakrophagen war Napsin A in den Lysosomen nachweisbar
(siehe hierzu Abbildung 5e).
In den Clara-Zellen fand sich Napsin A in den typischen Clara-Zell-Granula
(siehe hierzu Abbildung 5f).
Abbildung 5: Verteilung von Napsin A
a) Nachweis von Napsin A in Pneumozyten
b) Nachweis von Napsin A in Alveolarmakrophagen
c) Typisches Lamellenkörperchen mit Lokalisation des Napsins A über dem
„projektion core“
d) Lokalisation von Napsin A in multivesikulären Körperchen der Typ-IIPneumozyten bei starker Vergrößerung
e) Lokalisation von Napsin A in primären und sekundären Lysosomen
(Phagolysosomen) in Alveolarmarkophagen
f) Lokalisation von Napsin A in Clara-Zell-Granula
3. Ergebnisse
- 28 -
a)
b)
Napsin A
Napsin A
c) Napsin A
d) Napsin A
Lamellenkörperchen
multivesikuläres Körperchen
e) Napsin A
f) Napsin A
Alveolarmakrophage
Clara-Zelle
Abbildung 5: Verteilung von Napsin A
3. Ergebnisse
- 29 -
3.1.6 Verteilung von SP-B und seinen Vorstufen (NPROSP-B und
CPROSP-B) in den Clara-Zellen
Für den Nachweis von maturem SP-B, seinen Vorstufen und CC10 in den
Clara-Zellen wurde ein immunhistochemisches „Labeling“ an Serienschnitten
durchgeführt.
Abbildung 6a zeigt die Lokalisation von CC10-positiven Clara-Zellen in einem
Brochiolus.
Stark positive Reaktionen zeigten sich in der Kolokalisation für NPROSP-B
und CPROSP-B mit dem „Clara-cell-specific“ Protein CC10 in den ClaraZellen im Bereich des Bronchiolus (siehe hierzu Abbildung 6b und c).
Matures SP-B zeigte im Gegensatz dazu nur eine ganz schwach positive
Reaktion (siehe hierzu Abbildung 6d).
Biochemisch ließ sich im Immunoblot der BAL partiell prozessiertes proSP-B
mit einem Molekulargewicht von 24 kDa, der N-Terminus des proSP-B mit
einem Molekulargewicht von 19 kDa nach TCA-Präzipitation und matures
SP-B mit einem Molekulargewicht von 18 kDa nachweisen (siehe hierzu
Abbildung 6e).
Abbildung 6: Verteilung von NPROSP-B, CPROSP-B und SP-B auf die
CC10-positive Clara-Zelle, Western blot einer BaL
a) CC10-positive Zelle im terminalen Bronchiolus
b) Nachweis von NPROSP-B in der CC10-positiven Zelle im terminalen
Bronchiolus
c) Nachweis von CPROSP-B in der CC10-positiven Zelle im terminalen
Bronchiolus
d) Nachweis von SP-B in der CC10-positiven Zelle im terminalen
Bronchiolus
e) Western blot Auswertung von BAL Material:
Bahnen 1,3,5: Molekulargewichtstandard
Bahnen 2,4,6: BAL eines Patienten ohne Lungenerkrankung
Bahn 2:
Nachweis eines ca. 24 kDa partiell prozesssierten SP-B
Bahn 4:
Nachweis eines ca. 19 kDa N-Terminus
Bahn 6:
Nachweis des 18 kDa maturen SP-B
3. Ergebnisse
- 30 -
a) Clara-Zelle CC10
b) NPROSP-B
terminaler Bronchiolus
terminaler Bronchiolus
c) CPROSP-B
d) SP-B
terminaler Bronchiolus
terminaler Bronchiolus
CPROSP-B
NPROSP-B
SP-B
TCA Precipitation
e)
BAL
BAL
BAL
BAL
Abbildung 6: Verteilung von NPROSP-B, CPROSP-B und SP-B auf die CC10-positive
Clara-Zelle, Western blot einer BAL
4. Diskussion
- 31 -
4 Diskussion
In der vorliegenden Dissertationsschrift wird die Charakterisierung der
Kathepsine B, D, E, H, K, L und S und Napsin A in der humanen Lunge in
Bezug auf das Expressionsmuster in den Zellen und Zellorganellen sowie
ihre möglichen physiologischen Funktionen behandelt. Von besonderer
Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Fragestellung, ob und welche
der Proteasen aufgrund ihrer Lokalisationen möglicherweise in die
Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert sind.
Bei den Zysteinproteasen (B, H, K, L und S) und den Asparaginproteasen (D,
E und Napsin A) erfolgt die Unterscheidung in die Familien der Pepsin- und
Papainproteasen aufgrund unterschiedlicher Aminosäuren im katalytischen
Zentrum.
In
den
katalytischen
Zentren
der
Pepsinproteasen
sind
Asparaginreste und in denen der Papainproteasen Zysteinreste lokalisiert.
Bezogen
auf
die
Prozessierungsschritte
Synthese
zum
des
maturen
Präproproteins
Kathepsin
finden
und
sich
die
keine
spezifischen Unterschiede innerhalb der beiden Familien. Im Rahmen der
Diskussion werden die einzelnen Kathepsine und ihre physiologischen
Aufgaben im humanen Organismus beschrieben, wobei die Ausarbeitung der
Zystein- und Asparaginproteasen alphabetisch erfolgt. Wesentliche Aspekte
dieser Arbeit liegen im Nachweis der Kolokalisation von Kathepsin H und
Napsin A mit dem Surfactant Protein B und einer möglichen Involvierung der
beiden Proteine in die Prozessierung von SP-B, so daß im Anschluß an die
Kathepsine
die Prozessierung des Surfactant assoziierten Proteins B
diskutiert wird. Abschließend erfolgt die Diskussion zur Funktion der ClaraZellen, da auch in diesen Zellen Surfactant Protein B exprimiert wird. Bislang
ist unklar, ob auch in den Clara-Zellen eine Prozessierung des proSP-B
erfolgt und welche Proteasen involviert sind.
4. Diskussion
4.1
- 32 -
Kathepsin B
4.1.1 Untersuchungsergebnis
In der Lunge konnte Kathepsin B immunhistochemisch im zilientragenden
Bronchialepithel und in den Alveolarmakrophagen lokalisiert werden.
4.1.2 Allgemeine Charakteristika
Das mature Kathepsin B, dessen kodierende Gene auf Chromosom acht
lokalisiert sind, setzt sich aus einer monomeren und einer dimeren Form
zusammen, die sich hinsichtlich einer unterschiedlichen Aminosäure in
Position 228 und dem Verlust eines Dipeptids unterscheiden (Chan et al.
1986, Shi et al. 1994).
Kathepsin B, welches ein Angehöriger der Papainproteasen ist, spaltet seine
Substrate durch Exopeptidase- und nur zu einem geringen Prozentsatz durch
Endopeptidaseaktivität. Entscheidendes Charakteristikum für Kathepsin B ist
seine Aktivität als Peptidyldipeptidase, die eine Spaltung der Substrate vom
C-terminalen Ende beinhaltet (Barrett et al. 1981, Bohley et al. 1992, Barrett
1992). Das pH-Optimum für die Kathepsinaktivität liegt bei 6.0 (Barrett
1972).
4.1.3 Aufbau
Vorstufe des maturen Kathepsins B ist das aus folgenden Sequenzen
bestehende
339
Aminosäuren
lange
und
ca.
40
kDa
schwere
Präprokathepsin:
1. eine aus 17 Aminosäuren bestehende Signalsequenz am NH2-terminalen
Ende (Position 1-17)
2. das sich daran anschließende aus 62 Aminosäuren bestehende
Propeptid (Position 18-79) und
3. das aus 254 Aminosäuren bestehende und ca. 27-29 kDa schwere,
monomere Kathepsin B (Position 80-333) mit einer aus sechs
Aminosäuren bestehenden Extension am COOH-terminalen Ende
(Position 334-339) (Chan et al. 1986, Heidtmann et al. 1997).
Die dimere Form von Kathepsin B entsteht durch Spaltung zwischen den
Resten 126 und 129, die über den Verlust eines Dipeptids miteinander
verbunden werden. Sie besitzt somit nur eine Länge von 252 Aminosäuren
4. Diskussion
- 33 -
und setzt sich aus einer 22.4 kDa schweren und einer 5.2 kDa leichten Kette
zusammen (Chan et al. 1986, Sloane 1990). Weiterhin unterscheiden sich
die monomere und die dimere Form noch durch den Tausch von αAminobernsteinsäuremonoamid gegen α-Aminobernsteinsäure in Position
228. Sowohl bei der monomeren als auch der dimeren Form kommt es,
wahrscheinlich in den Lysosomen, zum Verlust des Hexapeptids am COOHterminalen Ende. Die Transformation der monomeren in die dimere Form
erfolgt vermutlich in den Lysosomen, da beide Formen in dieser Zellorganelle
lokalisiert werden konnten. Weiterhin zeigte sich, daß beide Formen
enzymatisch aktiv sind (Takio et al. 1983, Chan et al. 1986).
Matures Kathepsin B verfügt über eine Glykolysierungseinheit im Bereich des
Asparagins in Position 228. Im trans-Golgi Bereich binden die Zucker der
Glykolysierungseinheit an den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor und es erfolgt
der Transport zu den Lysosomen (Sly et al. 1982, Chan et al. 1986).
Im katalytischen Zentrum des maturen Kathepsins B ist ein Zysteinrest
lokalisiert, weshalb Kathepsin B zu den Zysteinproteasen gezählt wird. Das
katalytische Zentrum setzt sich aus Seitenketten unterschiedlicher Herkunft
zusammen. Eine der Seitenketten entstammt einem Zysteinrest im Nterminalen Ende des Enzyms. Die andere Seitenkette leitet sich von einem
Histidinrest im C-terminalen Ende des Enzyms ab (Takio et al. 1983). Im
dimeren Kathepsin B ist die katalytisch wirksame Einheit in der leichten Kette
lokalisiert (Sloane 1990).
Inhibitoren für die enzymatische Aktivität des humanen Kathepsins B sind
Stefin A und B (sie sind im Intrazellularraum lokalisiert), Cystatin C
(Lokalisation in interstitialen Körperflüssigkeiten), E-64, Leupeptin, CA-074
(in vitro ein selektiver Inhibitor für Kathepsin B) und Antipain (Erdel et al.
1990, Warfel et al. 1991, Mizuochi et al. 1994, Heidtmann et al. 1997). Die
Verteilung
der
Extrazellularraum
Stefine
ist
und
auf
des
das
Cystatins
auf
unterschiedliche
den
Intra-
bzw.
Molekulargewicht
zurückzuführen (Heidtmann et al. 1997). Eine Inhibition über den α1Proteinase Inhibitor findet nicht statt (Starkey et al. 1973).
Die Transformation von Präprokathepsin B, welches von maligne entarteten
Geweben exprimiert wird, zum maturen Monomer kann in vitro durch
Pepstatin gehemmt werden. Eine in vitro ablaufende Aktivierung erfolgt über
4. Diskussion
- 34 -
Kathepsin D. In vivo sind an der Aktivierung möglicherweise extrazelluläre
Metalloproteinasen oder ebenfalls Kathepsin D beteiligt (Nishimura et al.
1988, Sloane et al. 1990).
4.1.4 Funktion
Matures Kathepsin B ist in fast allen Organen des menschlichen Körpers
lokalisiert.
Über seine Peptidyldipeptidaseaktivität ist es an der Prozessierung
biologisch aktiver Peptide aus ihren inaktiven Vorstufen beteiligt. Beispiele
für die Abspaltung basischer Aminosäurereste in Form von Dipeptiden vom
C-terminalen Ende sind die Prozessierung von Proinsulin zu Insulin, von
Proalbumin zu Albumin, von Proparathyrin zu Parathyrin sowie die Bildung
von Glukagon und Muskelaldolase. Diese Prozesse finden in den GolgiVesikeln der Zellen statt (Chance 1972, Hamilton et al. 1974, Russell und
Geller 1975, Barrett et al. 1981).
Furuhashi et al. (1991) wiesen Kathepsin B in den Lysosomen aller
gastroduodenalen Mukosazellen mit Ausnahme der Becherzellen nach. Sie
gehen ebenfalls von der Annahme aus, daß dieses Enzym nicht nur an der
enzymatischen Degradation von Proteinen und Peptiden, sondern auch an
der Prozessierung aktiver Peptide aus ihren Vorstufen beteiligt ist (Furuhashi
et al. 1991).
Zu diesem Ergebnis kamen auch Watanabe et al. (1988) und Matsuba et al.
(1989) an Hand von Tierstudien. Sie konnten, bei Ratten, eine Lokalisation
von Kathepsin B in den α-Zellen des Pankreas und den juxtaglomerulären
Zellen der Niere nachweisen (Watanabe et al. 1988, Matsuba et al. 1989).
Kathepsin B ist möglicherweise auch an pathologischen Prozessen beteiligt,
wie zum Beispiel Entzündungsprozesse, Tumorinfiltration und Metastasierung, Erkrankungen die mit Demyelinisierungserscheinungen einhergehen,
Knorpeldestruktionen bei der rheumatoiden Arthritis und Muskeldystrophien
(Turk et al. 1986). Diese Erkrankungen gehen mit erhöhten Kathepsin B
Konzentrationen
und einer entsprechend erhöhten mRNA Konzentration
einher (Gabrijelcic et al. 1990, Moin et al. 1989).
In Bezug auf die rheumatoide Arthritis konnten als Substrate für matures
Kathepsin B Kollagen, Proteoglykane und Fibronektin nachgewiesen werden
(Barret 1977, Isemura et al. 1981).
4. Diskussion
- 35 -
Weiterhin zeigte sich, daß für einen begrenzten Zeitraum der Abbau von
Substraten bei pH-Werten von 7.0-7.5 noch möglich ist, bevor die irreversible
Denaturierung des Enzyms erfolgt (Mort et al. 1984). Werle et al. (1997)
versuchten eine Erklärung für dieses Phänomen zu finden und kamen zu
mehreren Ansätzen:
1. dem Vorliegen unterschiedlicher Isoformen (Deval et al. 1990)
2. der Veränderung des katalytischen Zentrums in Bezug auf die Endo- und
Exopeptidaseaktivität
3. dem Nachweis von Mutanten des maturen Kathepsins B (Hasnain et al.
1992)
4. eine erhöhte Variationsbreite durch unterschiedliche Glykolysierung,
Phosphorylierung und Prozessierung des COOH-terminalen Endes von
Kathepsin B und
5. die Bindung an endogene Inhibitoren (zum Beispiel α2-Makroglobulin) zur
Stabilisierung des Enzyms (Starkey et al. 1973) (Werle et al. 1997).
Desweiteren ist Kathepsin B in die Tumorinfiltration und Metastasierung
involviert. Matures Kathepsin B zeigt eine Assoziation zu den Membranen
des Tumorgewebes und entgeht so einer Inhibition durch neutrale pH-Werte
und entsprechende Inhibitoren. Es ist möglicherweise über drei Schritte an
der Tumorinfiltration beteiligt:
1. Lösung der Tumorzellen von der Basalmembran des umgebenden
Gewebes durch die Fähigkeit von Kathepsin B Substanzen, wie
Fibronektin, Glykoproteine und Laminin abzubauen
2. Destruktion der Basalmembran durch den durch Kathepsin B gesteuerten
Abbau von Kollagen Typ 4 und von Glykoproteinen und
3. durch Kathepsin B bedingte Freisetzung chemotaktischer Substanzen
aus der Basalmembran, die eine Invasion der malignen Zellen in das
umgebende Gewebe herbeiführen (Sloane 1990).
Diese These wird untermauert von Mori et al. (1997), die ein ähnliches
Modell für die Tumorinfiltration und Metastasierung von nicht kleinzelligen
malignen pulmonalen Tumoren beschrieben (Mori et al. 1997).
Ein weiterer Wirkungskreis von humanem Kathepsin B liegt in seiner
Involvierung in immunologische Prozesse. Mizuochi et al. (1994) wiesen eine
Mitbeteiligung an der Degradation der invarianten Kette des MHC Klasse 2
4. Diskussion
- 36 -
αβ-Heterodimers in den Endosomen unter Bildung eines funktionalen MHCMoleküls der Klasse 2 nach. Dieses besitzt die Möglichkeit, Antigene zu
binden und sie den T4-Helferzellen zu präsentieren. Mit Hilfe spezifischer
Inhibitoren ließ sich als weitere Aufgabe eine in vitro Involvierung in die
Prozessierung und Präsentation von Antigenen nachweisen (Mizuochi et al.
1994).
4.1.5 Die Bedeutung von Kathepsin B in der menschlichen Lunge
Padilla et al. (1988) und Lesser et al. (1992) konnten in Tierversuchen mit
Hamsterlungen zeigen, daß hohe Konzentrationen an Kathepsin B in den
Alveolarmakrophagen zur Entstehung von Lungenemphysemen beitrugen
(Padilla et al. 1988, Lesser et al. 1992). Diese „Fähigkeit“ ist auf das hohe
Elastin-abbauende Potential von Kathepsin B zurückzuführen. Inwieweit es
an der Entstehung von Emphysemen in der humanen Lunge involviert ist, ist
noch nicht näher beschrieben worden.
Weiterhin ist Kathepsin B möglicherweise an der Tumorinfiltration und
Metastasierung von nicht kleinzelligen malignen Lungentumoren beteiligt
(Mori et al. 1997). In ihnen lassen sich höhere Konzentrationen von
Kathepsin B nachweisen, wohingegen die Menge an Zysteinproteaseinhibitoren erniedrigt ist. Das Ungleichgewicht zwischen der Protease und
ihrem spezifischen Inhibitor könnte einen möglichen Faktor für die
Tumorinfiltration und -metastasierung darstellen (Heidtmann et al. 1997).
Bezogen auf die Fragestellung der vorliegenden Dissertation hat sich
gezeigt, daß Kathepsin B nicht in die Prozessierung von Surfactant Protein B
involviert ist, da es immunhistochemisch weder in Typ-II-Pneumozyten noch
in Clara-Zellen lokalisiert werden konnte.
4.2
Kathepsin D
4.2.1 Untersuchungsergebnis
Kathepsin D konnte immunhistochemisch in den Alveolarmakrophagen und
im zilientragenden Bronchialepithel nachgewiesen werden. Sich daran
anschließende immunelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten
eine Lokalisation von Kathepsin D in den Lysosomen der kinozilientragenden
Bronchialepithelien und den Alveolarmakrophagen.
4. Diskussion
- 37 -
4.2.2 Allgemeine Charakteristika
Matures Kathepsin D, dessen kodierendes Gen auf Chromosom 11p15 liegt
und über Östrogen reguliert wird, ist eine Endoprotease mit einem pHOptimum zwischen 3.0 und 5.0, die der Pepsinfamilie angehört (Cavailles et
al. 1991, Bohley et al. 1992, May et al. 1993, Kasper et al. 1996).
Im Gegensatz zu den anderen Angehörigen der Pepsinfamilie liegt Kathepsin
D als Dimer und nicht als Monomer vor (Tang et al. 1987, Yonezawa et al.
1988).
4.2.3 Aufbau
Vorläufer des 45 kDa schweren maturen Kathepsins D ist ein 53 kDa
schweres Präpropolypeptid und ein 47 kDa schweres Propeptid. Das
Präpropolypeptid besitzt 412 Aminosäuren und setzt sich aus folgenden
Komponenten zusammen:
1. der Signalsequenz im Bereich des NH2-terminalen Endes (Position 1-20)
2. einem sich daran anschließenden Propeptid (Position 21-44) und
3. dem maturen Kathepsin D (Position 45-412).
Im Bereich der Endosomen kommt es zur Prozessierung der 46
Aminosäuren langen Prosequenz am NH2-terminalen Ende (Faust et al.
1985, Diment et al. 1988, Metcalf et al. 1993). Die mature Form, die als
Glykoprotein vorliegt, besteht aus einer 14 kDa und einer 31 kDa schweren
Untereinheit, die über eine Disulfidbrücke in Position 97 und 98 miteinander
verbunden ist (Reid et al. 1986, Tang et al. 1987, Diment et al. 1988).
Bei Schweinen kommt es zum Verlust von einem kDa im Bereich der
schweren Kette, was auf eine Abspaltung von sieben Aminosäuren im NH2terminalen
und
von
zwei
Aminosäuren
im
COOH-terminalen
Ende
zurückzuführen ist (Erickson et al. 1983). Über die Bedeutung dieser
Aminosäureabspaltungen liegen noch keine Erkenntnisse vor.
Das humane Kathepsin D verfügt im Gegensatz zum Schweinekathepsin
über neun zusätzliche Aminosäuren, von denen sieben in den Positionen 98104 und zwei im COOH-terminalen Bereich lokalisiert sind (Faust et al.
1985).
Die Glykolysierungseinheiten des Kathepsins D liegen in Position 67 mit fünf
Oligosacchariden und in Position 183 mit drei Oligosacchariden über welche
4. Diskussion
- 38 -
die Bindung an den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor und der Transport zu
den Lysosomen erfolgt (Sly et al. 1982, Takahashi et al. 1983, Tang et al.
1987).
Weiterhin konnte eine membran-assoziierte und eine aktive lösliche Form
nachgewiesen werden. Die membran-assoziierte Form ist in den Endosomen
lokalisiert und stellt das Präpropolypeptid dar, wohingegen es sich bei der
aktiven löslichen Form, die zum Teil noch in den Endosomen und ansonsten
überwiegend in den Lysosomen lokalisiert ist, um das mature Kathepsin D
handelt (Diment et al. 1988).
Der Prozessierungsvorgang wird über einen sauren pH-Bereich unter
Abspaltung eines Teiles der Prosequenz katalysiert. Es ist noch nicht geklärt,
warum die Prozessierung der Prosequenz in zwei Teilschritten erfolgt (Hasilik
et al. 1982).
Ein reversibler Inhibitor für das mature Kathepsin D ist Pepstatin (Kirschke et
al. 1987, Beynon et al. 1989).
4.2.4 Funktion
Matures Kathepsin D ist an der Degradation von Proteinen beteiligt, die in
Position P1 und P1` des Substrates hydrophobe Reste aufweisen und länger
als fünf Aminosäuren sind (Imoto et al. 1987, van Noort et al. 1989). Zu
diesen
Substraten
gehören
unter
anderem
Hämoglobin,
Myosin,
Angiotensinogen, Proteoglykane, Myelin, Endorphine und zytosolische
Proteine. Serumalbumin, Kollagen und Gelatine werden nur zu einem
geringen Prozentsatz abgebaut (Kirschke et al. 1987).
Die Prozessierung von Angiotensinogen belegt eine Beteiligung von
Kathepsin D an der Bildung von aktiven Enzymen aus ihren inaktiven
Metaboliten (Kirschke et al. 1987). Diese Beobachtung wird durch eine
Studie von Takaoka et al. (1990) untermauert. Sie wiesen die Prozessierung
des maturen Endothelins 1 aus seinem inaktiven Propeptid durch Spaltung
zwischen den Aminosäuren Trp21 und Val22 mit Hilfe von Kathepsin D nach.
Hieraus ergibt sich möglicherweise eine Involvierung des Enzyms in
pathologische
Prozesse
wie
zum
Beispiel
die
portale
und
renale
Hypertension sowie die durch eine Hypertension ausgelösten vaskulären
Veränderungen über die erhöhte Bildung vasokonstriktorisch wirksamer
Substanzen (Takaoka et al. 1990).
4. Diskussion
- 39 -
Weitere Aufgaben von Kathepsin D sind die Stimulation der DNA-Synthese
und der Mitose während der Gewebsregeneration, die physiologische
Regulation von Kathepsin B- und L-ähnlichen Zysteinproteasen sowie die
Degradation extra- und intrazellulärer Proteine. Hieraus ergibt sich ebenfalls
eine mögliche Involvierung dieses Kathepsins in pathologische Prozesse, wie
zum
Beispiel
die
Wundheilungsstörungen
Leberzirrhose,
im
Bereich
der
myokardiale
Haut,
Erkrankungen,
Tumorinfiltration
und
Metastasierung und interstitiale pulmonale Erkrankungen, die gemeinsam mit
erhöhten Kathepsin D-Werten einhergehen (Ryvniak et al. 1990, Leto et al.
1992, Hernandez-Cueto et al. 1993, Solovyeva et al.1995).
Mizuochi et al. (1994) berichteten über eine Involvierung von Kathepsin D in
immunologische Prozesse. Sie zeigten zum einen, daß Kathepsin D den
ersten Schritt der Degradation der invarianten Kette des αβ-Heterodimers
der MHC-Moleküle der Klasse 2 unter Bildung eines funktionalen MHCMoleküles katalysiert und zum anderen, daß es eine wichtige Rolle bei der
Prozessierung von Antigenen spielt (Mizuochi et al. 1994).
4.2.5 Die Bedeutung von Kathepsin D in der menschlichen Lunge
Studien von Chang et al. (1986 und 1989) zeigten, daß man bei Rauchern
erhöhte Werte von Kathepsin D in den Alveolarmakrophagen und der BAL
nachweisen konnte. Sie folgerten hieraus, daß Kathepsin D möglicherweise
an der Entstehung von Erkrankungen beteiligt ist, die durch das Rauchen
von Zigaretten ausgelöst werden (Chang et al. 1986 und 1989).
Im Rahmen dieser Studie konnte Kathepsin D als möglicher Kandidat für die
Prozessierung von Surfactant Protein B ausgeschlossen werden, da es
immunhistochemisch weder in Typ-II-Pneumozyten noch in Clara-Zellen
lokalisiert werden konnte.
4.3
Kathepsin E
4.3.1 Untersuchungsergebnis
Kathepsin E konnte immunhistochemisch im Rahmen dieser Studie
ausschließlich in den Clara-Zellen lokalisiert werden. Double-LabelingUntersuchungen zeigten, daß sich Kathepsin E nur in den CC10-negativen
4. Diskussion
- 40 -
Clara-Zellen im Übergangsbereich der Bronchioli terminalis in die Bronchioli
respiratorii lokalisieren ließ. Die CC10-positive Clara-Zelle, die sich überwiegend im Bereich der Bronchiolen nachweisen ließ, war Kathepsin E-negativ.
4.3.2 Allgemeine Charakteristika
Kathepsin E, dessen kodierende Gene auf Chromosom eins lokalisiert sind,
liegt im humanen Organismus als Homodimer vor (Azuma et al. 1989, Fowler
et al. 1995). Es setzt sich aus zwei Monomeren mit einem Molekulargewicht
von jeweils ca. 42 kDa zusammen, die über eine Disulfidbrücke verbunden
sind. Es ist ein Angehöriger der Pepsinfamilie, das als einziges Kathepsin
nicht in den Lysosomen lokalisiert ist. Matures Kathepsin E ist unter
physiologischen Bedingungen nur im Intrazellularraum nachweisbar und
zählt somit auch nicht zu den sekretorischen Enzymen (Fowler et al. 1995)
4.3.3 Aufbau
Matures
Kathepsin
Präpropolypeptid
E
geht
hervor,
aus
das
einem
sich
379
aus
Aminosäuren
folgenden
langen
Abschnitten
zusammensetzt:
1. einer 19 Aminosäuren langen Signalsequenz (Position1-19)
2. dem sich daran anschließenden Propeptid (Position 20-39) und
3. dem maturen Kathepsin (Position 40-379) (Azuma et al. 1989, Rao-Naik
et al. 1995, Azim et al. 1999).
Es verfügt, wie die anderen Kathepsine auch, über Glykolysierungseinheiten.
Beide Einheiten sind beim Kathepsin E im maturen Enzym in den Positionen
Asn67 und Asn311 lokalisiert (Kageyama et al. 1992).
Das Propeptid wickelt sich im dreidimensionalen Molekül um den zentralen
Anteil des Enzyms, die basischen Aminosäuren der Seitenketten bilden
Ionenbindungen mit den negativ geladenen Aminosäuren des maturen
Kathepsins. Weiterhin findet die Stabilisierung des Propeptids mit dem
maturen
Kathepsin
über
Wasserstoffbrückenbindungen,
hydrophobe
Interaktionen und Ionenpaare statt. Die zwölf nachweisbaren Ionenpaare
entstehen über Anziehungskräfte zwischen den benachbarten positiv und
negativ geladenen Seitenketten, von denen acht der Stabilität zwischen dem
Propeptid und dem maturen Enzym und vier der intramolekularen Stabilität
des maturen Kathepsins E dienen.
4. Diskussion
- 41 -
Das Propeptid (Position 1-39) liegt als Strang in β-Konformation im Nterminalen Bereich vor, dem sich drei α-helikale Bereiche anschließen. Die
Aminosäuren in den Positionen P2-P9 bilden Wasserstoffbrückenbindungen
mit den Aminosäuren in den Positionen P162-P168 des maturen Kathepsins.
Die Reste in den Positionen P11-P39 bilden α-helikale Strukturen (α1:P11P19, α2:P22-P29 und α3:P33-P37), die der Stabilität der Sekundärstruktur
dienen.
Den Trigger für die Konformationsänderung der dreidimensionalen Struktur
und die Prozessierung des Propeptids stellt ein Absinken des pH-Wertes in
den sauren Bereich dar. Hierdurch kommt es zur Protonierung der in den
Seitenketten
lokalisierten
karboxylierten
Aspartat-
und
Glutamatreste
(Position 6, 8, 12, 36-38) und dadurch bedingt zur Destabilisierung der
Ionenbindungen und zur Abspaltung des Propeptids (Azim et al. 1999).
Im N-terminalen Bereich des maturen Kathepsins E ist die Sequenz Thr-GluSer-Cys4-Ser lokalisiert, die für die Dimerisation zweier 42 kDa schwerer
Dimere über eine intermolekulare Disulfidbrücke mit Hilfe von Cys4
(entspricht bezogen auf das gesamte Molekül der Position Cys37) zum 84
kDa schweren Homodimer verantwortlich ist. Die in dieser Sequenz
enthaltene
Aminosäure
Cys
in
Position
vier
ist
weiterhin
an
der
autokatalytischen Aktivierung des Kathepsins bei pH-Werten zwischen 4.0
und 6.0 beteiligt (Kageyama et al. 1992, Rao-Naik et al. 1995, Fowler et al.
1995). Kathepsin E liegt sowohl als Monomer als auch als Dimer vor.
Übergänge zwischen beiden Formen sind möglich. Durch die Anwesenheit
eines reduzierenden Agens, wie zum Beispiel Glutathion, kann die dimere
Form in die monomere Form umgewandelt werden. Die Abwesenheit eines
reduzierenden Agens führt dagegen zur Transformation der monomeren in
die dimere Form. Die dimere Form scheint für die Stabilität des Moleküls
unter alkalischen Bedingungen wichtig zu sein. Die monomere Form ist
dagegen eher für die enzymatische Aktivität von Kathepsin E in vivo nötig
(Kageyama et al. 1992).
Für die katalytische Aktivität des Enzyms sind die Asparaginsäuren Asp32
und Asp215 (sie sind in ihrer Numerierung vom Zymogen abgeleitet und
liegen beim Kathepsin E beide im maturen Anteil) relevant. Sie sind im
dreidimensionalen Molekül auf einem Schleifenpaar lokalisiert, zwischen dem
4. Diskussion
- 42 -
sich der am katalytischen Zentrum beteiligte aktive Spalt befindet. Im
Präpropolypeptid sind Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Lys36, Asp32
und Asp215 lokalisiert, desgleichen zwischen Tyr9, Tyr37, Asp32 und Asp215.
Die Aktivierung der katalytischen Einheit erfolgt über die Spaltung der
Wasserstoffbrückenbindungen
sowie
eine
Konformationsänderung
der
Sekundärstruktur im Bereich der α1-helikalen Struktur (Azim et al. 1999).
Kathepsin E wird über Pepstatin inhibiert (Kageyama et al. 1992).
4.3.4 Funktion
Kathepsin E baut Substrate ab, die über eine charakteristische Anordnung
ihrer Aminosäuren in entsprechenden Positionen verfügen müssen:
1. in Position P1 und P1` ist das Vorliegen von hydrophoben Aminosäuren
mit einer aromatischen oder aliphatischen Seitenkette notwendig, Valund Ile-Reste können nur abgebaut werden, wenn sie in Position P1`,
nicht aber in Position P1 vorliegen
2. in Position P2` ist die Spezifität geringer; hier können zum Beispiel auch
kleine und polare Aminosäuren degradiert werden
3. in Position P4 und P3`-P5` wird bevorzugt Pro gebunden und
4. die Positionen P4-P7 sind wichtig für die Interaktion mit dem Enzym.
Das katalytische Zentrum von Kathepsin E verfügt über eine Länge von vier
nm und degradiert Substrate mit ca. sieben bis neun Aminosäuren (Arnold et
al. 1997).
Eine Involvierung von Kathepsin E findet sich bei der Prozessierung von
Antigenen und Prohormonen sowie der Infektion humaner Zellen mit dem HIVirus (Lees et al. 1990, Clements et al. 1991, Bennett et al. 1992).
Eine Studie von Clements et al. (1991) zeigte, daß Kathepsin E an der
Spaltung von gp 120 im HI-Virus 1 und von gp 105 im HI-Virus 2 beteiligt ist.
Über diesen Vorgang ist das Virus in der Lage, in die CD4+-Lymphozyten
einzudringen (Clements et al. 1991).
Die Beteiligung von Kathepsin E an der Umwandlung von Prohormonen aus
ihren inaktiven Vorstufen verdeutlicht eine Studie von Lees et al. (1990), die
nachwiesen, daß Kathepsin E die Prozessierung von Endothelin aus seiner
inaktiven Vorstufe katalysiert (Lees et al. 1990).
Matures Kathepsin E konnte in den Endosomen der Langehanszellen der
Haut, den interdigitierenden Retikulumzellen von Lymphknoten, Milz,
4. Diskussion
- 43 -
Tonsillen und Niere sowie den Clara-Zellen der Lunge nachgewiesen
werden. In diesen Zellen ist es an der intrazellulären Prozessierung von
Antigenen beteiligt, die dann an der Oberfläche dieser Zellen präsentiert
werden. In Alveolarmakrophagen, die ebenfalls in die Prozessierung von
Antigenen involviert sind, konnte Kathepsin E nicht lokalisiert werden (Reid et
al. 1986, Solcia et al. 1993, Finzi et al. 1993, Bosi et al.1993, Arbustini et al.
1994).
Pathologische Prozesse, wie zum Beispiel chronisch interstitiale pulmonale
Erkrankungen, chronische Gastritis und chronische Darmerkrankungen
gehen mit einer erhöhten de novo Bildung von Kathepsin E einher (Arbustini
et al. 1994).
Der Nachweis von Kathepsin E in den Foveolarzellen des Magens stellt eine
mögliche
weitere
Aufgabe
dieses
Enzyms
dar,
die
sich
auf
Regenerationsprozesse der Magenschleimhaut bezieht (Sakai et al. 1989).
4.3.5 Die Bedeutung von Kathepsin E in der menschlichen Lunge
Arbustini et al. (1994) konnten Kathepsin E in den Clara-Zellen der humanen
Lunge nachweisen, wo es an der intrazellulären Prozessierung von
Antigenen beteiligt ist, die anschließend an der Oberfläche von Antigenpräsentierenden Zellen präsentiert werden. Ihre Studie zeigte weiterhin, daß
eine de novo Synthese von Kathepsin E und HLA-DR durch hyperplastische
Typ-II-Pneumozyten im transplantierten Lungengewebe möglicherweise den
Auslöser
zur
Tansplantatabstoßung
darstellt.
Diese
Reaktion
ist
wahrscheinlich über Antigenprozessierung und -präsentation gesteuert
(Arbustini et al. 1994).
Kathepsin E konnte in dieser Studie immunhistochemisch nur in den CC10negativen Clara-Zellen lokalisiert werden. Es kommt somit als Kandidat für
die Prozessierung des Surfactant Proteins B nicht in Betracht, da diese in
den Typ-II-Pneumozyten und den CC10-positiven Clara-Zellen abläuft.
4.4
Kathepsin H
4.4.1 Untersuchungsergebnis
Kathepsin
H
ist
immunhistochemisch
neben
seiner
Lokalisation
in
Alveolarmakrophagen und im zilientragenden Bronchialepithel im Rahmen
4. Diskussion
dieser
Studie
- 44 -
als
einziges
Kathepsin
in
den
Typ-II-Pneumozyten
nachgewiesen worden. Immunelektronenmikroskopisch fand sich Kathepsin
H in den Lamellenkörperchen im Bereich des „projection core“ und der
„limiting membrane“ und in den multivesikulären Körperchen der Typ-IIPneumozyten. In den Alveolarmakrophagen und den Bronchialepithelien
konnte Kathepsin H in den Lysosomen lokalisiert werden.
4.4.2 Allgemeine Charakteristika
Das mature Kathepsin H, dessen kodierendes Gen auf dem humanen
Chromosom 15 lokalisiert ist, liegt als glykolysierte Polypeptidkette mit einem
Molekulargewicht von 28 kDa vor (Barret et al. 1981, Quian et al. 1990, Shi
et al. 1994).
Kathepsin H verfügt neben seiner Endopeptidase- als einziges Kathepsin
auch noch über eine Aminopeptidaseaktivität (Wiederanders et al. 1992).
4.4.3 Aufbau
Die Prozessierung zum maturen Kathepsin H erfolgt, wie bei den anderen
Kathepsinen auch, über ein Präpropeptid und ein Propeptid. Für die humane
Form
sind
die
genauen
Aminosäuresequenzen,
an
denen
die
Prozessierungsprozesse ablaufen, noch nicht bekannt (Bohley et al. 1992).
Quian et al. (1990) untersuchten die Synthese und Prozessierung
von
Kathepsin H aus der Rattenleber. Vorläufer der maturen Form ist ein 313
Aminosäuren langes Präprokathepsin, das über Aminosäureabspaltungen
vom N-terminalen Ende zum 220 Aminosäuren langem aktiven Enzym
umgesetzt wird. Modifikationen am C-terminalen Ende finden nicht statt
(Quian et al. 1990).
Im Propeptid sind zwei Glykolysierungseinheiten lokalisiert, die in die
intrazellulären
Transportprozesse
involviert
sind.
Eine
weitere
Glykolysierungseinheit findet sich im maturen Kathepsin H. Die Funktion
dieser dritten Glykolysierungseinheit ist noch nicht geklärt.
Das mature Kathepsin H der Rattenleber liegt als Monomer und als Dimer
vor. Die dimere Form entsteht aus der monomeren Form durch
endoproteolytische Spaltung
in der Nähe des carboxyterminalen Endes
zwischen den Aminosäuren Asn177 und Gly178, wobei es im Gegensatz zum
4. Diskussion
- 45 -
Kathepsin B nicht zum Verlust von Aminosäuren kommt (Fuchs et al. 1988,
Qian et al. 1990).
Humanes Kathepsin H setzt sich aus einer 22 kDa schweren (Position 1-169)
und einer sechs kDa leichten (Position 170-220) Kette zusammen. Für die
Aktivität der katalytischen Einheit ist das Vorhandensein beider Ketten
notwendig. Es werden sowohl die in der schweren Kette lokalisierten
Aminosäuren Cys26 und His als auch die in der leichten Kette lokalisierten
Aminosäuren Asn175, Ser176 und Trp177 benötigt. Sie bilden gemeinsam die
dreidimensionale Struktur des katalytischen Zentrums (Kirschke et al. 1987,
Fuchs et al. 1988).
Eine Inhibition der Enzymaktivität des maturen Kathepsins H erfolgt über
basische pH-Werte (über eine irreversible Destruktion der Sekundärstruktur),
Diazomethane (sie führen zu einer langsamen Hemmung), Peptidaldehyde
(sie stellen einen relativ schwachen reversiblen Inhibitor mit einer Wirkung
von Ki ~ 3.7 x 10-8 M dar), α2-Makroglobulin und E-64. (Barrett et al. 1981,
Barrett 1992)
4.4.4 Funktion
Matures
Kathepsin
H
verfügt
sowohl
über
Endo-
als
auch
Aminopeptidaseaktivität.
Die Aminopeptidaseaktivität beruht auf der Abspaltung von Aminosäuren
vom N-terminalen Ende der Substrate, wobei diese über eine freie αAminogruppe verfügen müssen. Nα-acetylierte Aminogruppen können nicht
gespalten
werden.
Im
Gegensatz
zu
der
eher
unspezifischen
Aminopeptidaseaktivität, die nur an das Vorhandensein einer freien αAminogruppe gebunden ist, ist die Aktivität der Endopeptidase sehr viel
spezifischer. Sie favorisiert Substrate, die in Position P2 und P3 eine
hydrophobe Aminosäure aufweisen. Dieses konnte zum Beispiel für die βKette des Insulins nachgewiesen werden (Koga et al. 1992).
Die Hauptfunktion von Kathepsin H liegt vermutlich im intralysosomalen
Abbau von Peptiden, die von
Kathepsin L und D durch den Abbau aus
größeren Proteinen gebildet werden (Bohley et al. 1992).
Eine weitere Aufgabe des Enzyms ist die Prozessierung biologisch aktiver
Peptide
aus
den
entsprechenden
Propeptiden.
Diese
Erkenntnisse
4. Diskussion
- 46 -
resultieren aus dem Nachweis von Kathepsin H in den sekretorischen
Granula endokriner Zellen, wie zum Beispiel den gastrointestinalen und den
thyroidal follikulären Zellen der Ratte sowie den humanen α- und β-Zellen
des Pankreas (Uchiyama et al. 1989, Im et al. 1989, Furuhashi et al. 1991).
Gabrijelcic et al. (1990) wiesen erhöhte Kathepsin H-Konzentrationen in der
Synovialflüssigkeit von Arthritispatienten nach (Gabrijelcic et al. 1990). Es ist
bislang spekulativ, ob auch Kathepsin H extrazellulär wirksam ist und bei der
Arthritis mit einer Entzündung und Destruktion des Gelenkes einhergeht.
Eine Involvierung des maturen Kathepsins H in die Tumorprogression und
Metastasierung konnte im Gegensatz zu den anderen Kathepsinen nicht
belegt werden (Quian et al. 1990).
4.4.5 Kathepsin H und die Prozessierung von SP-B
Kathepsin H konnte immunhistochemisch als einzige Zysteinpotease in den
Typ-II-Pneumozyten lokalisiert werden. Ein ebenfalls immunhistochemisch
durchgeführtes
„Double-Labeling“
von
Kathepsin
H
mit
SP-B
an
Serienschnitten zeigte eine Kolokalisation in den Typ-II-Pneumozyten.
Zur exakten Lokalisation von Kathepsin H in Bezug auf die einzelnen
Zellorganellen im Typ-II-Pneumozyten wurden immunelektronenmikroskopische Untersuchungen angeschlossen. Diese erbrachten den Nachweis von
Kathepsin H in den multivesikulären Körperchen und den Lamellenkörperchen der Typ-II-Pneumozyten.
Voorhout et al. (1992) und Brasch et al. konnten zeigen, daß die
multivesikulären
Körperchen
in
den
Typ-II-Pneumozyten
nicht
nur
Transportvesikel sind, sondern daß in diesen Körperchen die Prozessierung
des proSP-B stattfindet. Aufgrund seiner Lokalisation ist die Zysteinprotease
Kathepsin H ein möglicher Kandidat, der in den multivesikulären Körperchen
in die Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert ist. Weitere
Erläuterungen folgen nach der Abhandlung über SP-B.
4. Diskussion
4.5
- 47 -
Kathepsin K (Synonym: Kathepsin O2)
4.5.1 Untersuchungsergebnis
Kathepsin K ließ sich immunhistochemisch in Alveolarmakrophagen und im
zilientragenden Bronchialepithel nachweisen.
4.5.2 Allgemeine Charakteristika
Kathepsin K ist eine in den Lysosomen vorkommende Zysteinprotease, die
der Papainfamilie angehört. Das Gen, das dieses Enzym kodiert, liegt auf
Chromosom 1q21 (Gelb et al. 1996).
Das mature Kathepsin K liegt intralysosomal als Monomer mit einem
Molekulargewicht von 29 kDa und einer Länge von 215 Aminosäuren vor.
Die
Stabilisierung
erfolgt
mit
Hilfe
von
sechs
Zysteinresten,
die
intramolekulare Disulfidbrücken bilden (Gelb et al. 1996).
Weiterhin findet man im maturen Kathepsin K drei Aminosäuren, die in die
Bildung des katalytischen Zentrums involviert sind. Es handelt sich hierbei
um die Aminosäuren in den Positionen Cys139, His276 und Asn296 (Bossard et
al. 1996).
4.5.3 Aufbau
Vorläufer des maturen Kathepsins K ist ein 329 Aminosäuren langes
Präpropolypeptid, das folgende Abschnitte enthält:
1. ein 15 Aminosäuren langes Signalpeptid am N-terminalen Ende (Position
1-15)
2. eine 99 Aminosäure lange, sich daran anschließende Proregion (Position
16-114) und
3. das 215 Aminosäuren lange mature Kathepsin K mit dem C-terminalen
Ende (Position 115-329) (Gelb et al. 1996).
Die Signalsequenz besitzt eine positiv geladene Aminosäure (Lys5) in der
Nähe des initialen Methionin, woran sich hydrophobe Aminosäuren
anschließen. Terminiert wird die Signalsequenz von Ala15. Die Abspaltung
der Proregion erfolgt zwischen Arg114 und Ala115 (Bossard et al. 1996).
Das mature Kathepsin K ist ein monomeres 215 Aminosäuren langes Protein
mit einem Molekulargewicht von ca. 29 kDa (Gelb et al. 1996). Brömme et al.
(1996) konnten im Kathepsin K noch keine Glykolysierungseinheiten
4. Diskussion
- 48 -
nachweisen (Brömme et al. 1996), wohingegen Gelb et al. (1996) von drei
Glykolysierungseinheiten ausgehen. Jeweils eine dieser Einheiten ist im
Propeptid und im maturen Enzym lokalisiert. Im trans-Golgi-Bereich bindet
der Zucker Mannose-6-Phosphat der Glykolysierungseinheit
Mannose-6-Phosphat-Rezeptor,
mit
dessen
Hilfe
der
an den
Transport
des
Propeptids zu den Lysosomen erfolgt (Gelb et al. 1996).
Die Bildung des maturen Kathepsins K aus dem Präpropolypeptid kann in
vitro in Anwesenheit von Pepsin bei einem pH-Wert von 4.0 katalysiert
werden (Brömme et al. 1996). Mc Queney et al. (1997) konnten in vivo eine
autokatalytische Umwandlung nachweisen, die an das Vorhandensein der
AS Cys139 gebunden ist. In ihrem Versuch ersetzten sie Cys139 durch einen
Serinrest in der gleichen Position. Unter Zugabe von 1% exogenem maturen
Wildtyp Kathepsin K ließen sich nur Intermediärprodukte, aber kein matures
Kathepsin nachweisen (Mc Queney et al. 1997).
In
Mäusen
wird
Kathepsin
K
überwiegend
von
Osteoklasten
und
Chondroklasten und nur in einem geringen Maße von Monozyten und
Makrophagen exprimiert (Rantakokko et al. 1996).
Im menschlichen
Lungengewebe konnte, im Gegensatz zu den Ergebnissen an Mäusen,
Kathepsin K im Rahmen dieser Studie immmunhistochemisch in den
Alveolarmakrophagen
und
den
zilientragenden
Bronchialepithelien
nachgewiesen werden.
Die Enzymaktivität kann über E-64, Leupeptin (langsam bindend), Aldehyde,
Diazomethane
Enzymaktivität
und
über
Cystatin
gehemmt
spezifische
werden,
Inhibitoren
wohingegen
der
Serin-
die
und
Asparaginproteasen unbeeinflußt bleibt (Brömme et al. 1996, Bossard et al.
1996). Eine Erhöhung der Genexpression in Osteoklasten konnte durch
einen Vitamin A Metaboliten („retinoic acid“) nachgewiesen werden
(Saneshige et al. 1995).
4.5.4 Funktion
Die bisherigen Untersuchungen zeigen, daß Kathepsin K eine wichtige Rolle
im Knochenstoffwechsel spielt. Es ist in hohen Konzentrationen in
Osteoklasten, in anderen Organen wie Herz, Skelettmuskel, Kolon, Ovar und
Plazenta aber nur in geringen Mengen nachweisbar (Inaoka et al. 1995,
Brömme et al. 1996, Gelb et al. 1996).
4. Diskussion
- 49 -
Unter physiologischen Bedingungen finden am Knochen laufend Auf- und
Abbauprozesse
statt,
die
eine
normale
Belastung
des
Knochens
ermöglichen.
Die Degradation des Knochens beinhaltet zwei Mechanismen:
-
Demineralisation der Knochenmatrix, die zu über 90% Kollagen Typ 1
enthält (Delaisse et al. 1992, Krane et al. 1994)
-
Abbau extrazellulärer Matrixproteine (Delaisse et al. 1992)
Eine Lokalisation von Kathepsin K hat man in den Lysosomen der
Osteoklasten gefunden, die den knochenabbauenden Anteil darstellen.
Kathepsin K ist in vitro in der Lage, bei sauren pH-Werten Kollagen Typ 1
intralysosomal abzubauen (Brömme et al. 1996). Weiterhin ist es an der
Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt. Die Osteoklasten schaffen
bei der Knochendegradation ein saures Umgebungsmilieu mit pH-Werten
zwischen 5.0 und 6.0, so daß Kathepsin K auch extrazellulär, in den
Knochennischen die Knochenmatrix abbauen kann (Reilly et al. 1989,
Bossard et al. 1996, Brömme et al. 1996). Der genaue Mechanismus wie,
das Enzym aus den intrazellulären Lysosomen in den Extrazellularraum
gelangt, ist bislang noch nicht geklärt.
Am Beispiel der Pyknodysostose soll exemplarisch die Rolle des Kathepsins
K erläutert werden.
Bei der Pyknodysostose handelt es sich um eine hereditäre autosomalrezessive Erkrankung, die durch kleine Statur, kraniale Suturen und erhöhte
Knochendichte und -fragilität gekennzeichnet ist. Das fehlerhafte Gen liegt
auf
dem
humanen
Chromosom
1q21
und
führt
zu
einem
nicht
funktionsfähigen mutierten Kathepsin K. Die Translation der mRNA stoppt im
Bereich der Aminosäure 241 unter dem Verlust der letzten 89 Aminosäuren
des carboxyterminalen Endes. Dies führt zu einem Verlust der katalytischen
Aktivität, da zwei der drei benötigten Aminosäuren der katalytischen Einheit
verlorengehen. Weiterhin ist die Stabilität des maturen Kathepsins nicht mehr
erhalten,
da
zwei
der
hierfür
benötigten
Aminosäuren
ebenfalls
verlorengehen (Johnson et al.1996).
Kathepsin K favorisiert Substrate, die in Position P1 eine hydrophile
Seitenkette mit enthaltenem Arg oder Lys und einer sich in Position P2
anschließenden hydrophoben Seitenkette besitzen (Bossard et al. 1996). Zu
4. Diskussion
- 50 -
diesen Substraten gehören Kollagen Typ 1, Elastin, Gelatine und
Osteonektin (Brömme et al.1996, Gelb et al. 1996, Johnson et al. 1996).
Substrate mit einer hydrophoben Seitenkette in Position P1 werden nicht
katalysiert (Bossard et al. 1996).
4.5.5 Die Bedeutung von Kathepsin K in der menschlichen Lunge
Es
hat
sich
gezeigt,
daß
Papain,
eine
Zysteinprotease,
die
der
Papayapflanze entstammt, bei intratrachealer Gabe in der Lage ist, ein
Lungenemphysem bei Hamstern auszulösen. Der Auslöser für diese
Erkrankung ist das Elastin-abbauende Potential dieser Zysteinprotease
(Goldring et al. 1968). Kathepsin K ist eine Zysteinprotease mit
elastinolytischer Aktivität. Zu ihren Substraten gehört unter anderem Elastin.
Möglicherweise ist Kathepsin K ebenfalls an der Entstehung eines
Lungenemphysems beteiligt (Brömme et al. 1996).
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Kathepsin K nicht an
der
Prozessierung
von
Surfactant
Protein
B
beteiligt
ist,
da
es
immunhistochemisch nur in Alveolarmakrophagen und im zilientragenden
Bronchialepithel, nicht aber in den Typ-II-Pneumozyten und den Clara-Zellen
lokalisiert werden konnte.
4.6
Kathepsin L
4.6.1 Untersuchungsergebnis
Kathepsin
L
konnte
immunhistochemisch
in
der
Lunge
in
den
Alveolarmakrophagen sowie dem zilientragenden Bronchialepithel nachgewiesen werden.
4.6.2 Allgemeine Charakteristika
Das mature Kathepsin L, dessen kodierende Gene auf Chromosom 9q21-22
lokalisiert sind, liegt intralysosomal mit einem Molekulargewicht von 25 kDa
vor (Reilly et al. 1989, Chauhan et al. 1993). Es verfügt über eine Variation
seiner Karbohydratanteile, aus denen Formen mit unterschiedlichen
isoelektrischen Punkten resultieren (Bohley et al. 1992).
In den Lysosomen weist Kathepsin L von allen Kathepsinen die stärkste
proteolytische Wirkung auf verschiedene Substrate auf. Die Substrate
werden über Endopeptidaseaktivität gespalten (Bohley et al. 1992).
4. Diskussion
- 51 -
4.6.3 Aufbau
Der Synthesevorgang von Kathepsin L umfaßt eine 43 kDa schwere
Präproform, ein 34 kDa schweres Intermediärprodukt und das 25 kDa
schwere mature Enzym (Reilly et al.1989). Die Präproform
besitzt 334
Aminosäuren und enthält folgende Abschnitte:
1. eine 17 Aminosäuren lange Präproregion am N-terminalen Ende (Position
1-17)
2. eine sich daran anschließende 96 Aminosäuren lange Proregion (Position
18-113) und
3. das mature Kathepsin (Position 114-334) mit dem C-terminalen Ende
(Portnoy et al. 1986).
Die Prozessierung des Präpropolypeptids zum Propolypeptid erfolgt gemäß
einer Studie von Wiederanders et al. (1989) mit Hilfe von Kathepsin D, was
durch den Nachweis von aktivem Kathepsin D im Bereich der GolgiMembranen und der Verlangsamung des Prozessierungsschrittes in
Abwesenheit des Enzyms noch unterstützt wird (Wiederanders et al. 1989).
Mason et al. (1985 und 1986) beschrieben ein 30 kDa schweres matures
Kathepsin L, welches sich aus einer schweren Kette und einer leichten Kette
zusammensetzt. Die schwere Kette, mit einem Molekulargewicht von 25 kDa,
entstammt dem N-terminalen Ende des einkettigen Vorläuferproteins. Die
leichte Kette, mit einem Molekulargewicht von fünf kDa, entstammt dagegen
dem C-terminalen Ende des einkettigen Vorläuferproteins. In der schweren
Kette liegt die für die Enzymwirkung wichtige katalytische Einheit im Bereich
der AS Cys25. Über eine intramolekulare Disulfidbrücke erfolgt die
Verbindung zur leichten Kette (Mason et al. 1985 und 1986). Konträr zu
Mason et al. konnten Reilly et al. (1989) die Exprimierung der leichten Kette
nicht nachweisen und gehen somit von einem maturen Kathepsin von 25 kDa
aus (Reilly et al. 1989).
Zur Synthese von maturem Kathepsin L sind Alveolarmakrophagen,
Osteoklasten und die Sertolizellen des Hodens befähigt. In ihnen sind
entsprechende mRNA Korrelate lokalisiert (Reilly et al. 1989, EricksonLawrence et al. 1991, Page et al. 1993). Die Expression von Kathepsin L
durch
menschliche
Alveolarmakrophagen
läuft
voraussichtlich
über
Regulationsprozesse, die aber noch nicht weiter charakterisiert sind. Im
4. Diskussion
- 52 -
Gegensatz zu den Alveolarmakrophagen sind Monozyten nicht in der Lage,
Kathepsin L zu exprimieren. Die Fähigkeit zur Bildung von Kathepsin L kann
nicht durch die Transformation eines Monozyten zur Makrophage induziert
werden (Reilly et al. 1989). In Bezug auf die Exprimierung von Kathepsin L
scheint es Unterschiede innerhalb der einzelnen Makrophagenpopulationen
zu geben.
In Bezug auf die Synthese der mRNA kann man zwei unterschiedliche
Formen nachweisen, die aber beide aus dem Gen auf Chromosom 9q21-22
hervorgehen. Die Unterschiede entstehen durch alternatives Splicen der
cDNA und sind im Bereich des 5` translationalen Endes des Moleküls
lokalisiert. Die verschiedenen Spliceprodukte beziehen sich auf die
Transkription und die Stabilität des Kathepsins L. Ein weiteres Ergebnis
dieser Studie ist der Nachweis von humaner Kathepsin L cDNA auf
Chromosom 10q23-24, die aber bisher als „stumm“ gilt, da von dieser Region
kein matures Enzym exprimiert wird (Chauhan et al. 1993).
Kathepsin L wird weiterhin von malignen Zellen synthetisiert (Heidtmann et
al. 1993). Denhardt et al. (1987) zeigten eine negative Korrelation zwischen
der
Menge
der
synthetisierten
mRNA
und
der
Ausprägung
von
Tumorprogression und -metastasierung auf (Denhardt et al. 1987).
Die enzymatische Aktivität von maturem Kathepsin L wird durch einen
neutralen und basischen pH-Wert gehemmt, da die α-helikalen Anteile der
Sekundärstruktur irreversibel zerstört werden. Weitere Inhibitoren sind
Cystatin C und Kininogen, die ihre Wirkung im Extrazellularraum entfalten
sowie Stefin B. Dieses bildet mit Kathepsin L im neutralen pH-Bereich
reversible Komplexe, die sich im sauren Bereich wieder voneinander lösen
und eine erneute katalytische Aktivität des Enzyms ermöglichen (Barrett et
al. 1984, Dufour et al. 1987, Turk et al. 1993). Ein relativ spezifischer Inhibitor
ist Z-Phe-Phe-CHN2 sowie die Peptidaldehyde (zum Beispiel Leupeptin)
(Leary et al. 1977, Watanabe et al. 1979, Green et al. 1980). Leupeptin ist
ein reversibler Inhibitor für Kathepsin L. (Umezawa 1976).
4.6.4 Funktion
Kathepsin L ist an der intralysosomalen Spaltung unterschiedlichster
Proteine beteiligt, was aus der Vielzahl der Substrate ersichtlich wird. Es
ermöglicht den Abbau von Myosin, Aktin, Troponin, Calmodulin, Tubulin,
4. Diskussion
- 53 -
Vimetin, Kollagen, Elastin, Hämoglobin, Albumin, Histonen, Insulin, Glukagon
und einigen zytosolischen Enzymen mit Ausnahme der Laktatdehydrogenase
(LDH) (Bohley et al. 1987). Diesen Substraten ist gemeinsam, daß sie in den
Positionen P2 und P3 die für den Abbauprozeß nötigen hydrophoben
Aminosäuren aufweisen. Hilfreich, aber nicht notwendig ist eine zusätzliche
apolare Aminosäure in Position P1.
Kathepsin L ist in Niere, Lunge, Leber, Milz, Gehirn, Magen und Herz sowie
in Muskel- und Knochengewebe nachweisbar (Joseph et al. 1988, Furuhashi
et al.1991, Bohley et al.1992, Brömme et al. 1996).
Kathepsin L ist auch in pathologische Prozesse wie die Nekrose der
Myofibrillen bei Myopathien, die myokardiale Ischämie und die renal-tubuläre
Proteinurie involviert (Olbricht et al. 1986, Tsuchida et al. 1986, Kominami et
al. 1987).
Brömme et al. (1996) erbrachten den Nachweis der Lokalisation von
Kathepsin L in Osteoklasten und extrazellulären Knochennischen. Der Abbau
des Knochens durch dieses Enzym geht allerdings in sehr viel geringerem
Maße vonstatten als der durch Kathepsin K (Brömme et al. 1996).
Einschränkend ist hierbei jedoch auszuführen, daß Kathepsin L nur dann in
der Lage ist extrazellulär tätig zu werden, wenn das Vorliegen eines sauren
pH-Wertes gewährleistet ist.
In malignen Tumoren lassen sich erhöhte Konzentrationen an Kathepsin L
mRNA nachweisen (Denhardt et al. 1987). Diese Ergebnisse legen die
Vermutung nahe, daß Kathepsin L aufgrund seiner Eigenschaft, die
Matrixproteine abzubauen, in die Invasion von Tumorzellen involviert sein
könnte. (Guinec et al. 1993).
Furuhashi et al. (1991) zeigten, daß Kathepsin L nicht nur in den Abbau von
intralysosomalen Substraten involviert ist, sondern weiterhin auch noch über
die Fähigkeit verfügt, die Prozessierung biologisch aktiver Peptide aus ihren
Vorstufen zu katalysieren (Furuhashi et al. 1991).
4.6.5 Die Bedeutung von Kathepsin L in der menschlichen Lunge
Eine Studie von Heidtmann et al. (1993) zeigte, daß die Bildung einer
„späten“ Form von Prokathepsin L möglicherweise eine wichtige Rolle bei der
Tumorinvasion und Metastasierung von nicht kleinzelligen, malignen
Lungentumoren zu spielen scheint. Das Prokathepsin L verfügt im
4. Diskussion
- 54 -
Gegensatz zum maturen Kathepsin L über Eigenschaften, die für die
Tumorzellen „nützlich“ sind:
1. eine Akkumulation von Prokathepsin L im Extrazellularraum ist auch bei
neutralem pH-Wert möglich, ohne daß die Aktivität des Enzyms verloren
geht
2. Extrazelluläres Prokathepsin L wäre möglicherweise in der Lage,
Zielstrukturen der extrazellulären Matrix zu durchdringen, um dann
aktiviert zu werden
3. Prokathepsin L kann von immunkompetenten Zellen aufgenommen
werden, in Interaktion mit der Antigenprozessierung treten, und so die
Immunkompetenz des Wirtes unterdrücken
Ein ähnliches Modell konnte für kleinzellige Lungentumoren, die über ein
noch höheres Metastasierungspotential verfügen, nicht beschrieben werden.
In ihnen ließen sich auch keine erhöhten Werte von Kathepsin L nachweisen.
Weitere Studien über die Involvierung eines „späten“ Prokathepsins L in die
Tumorinfiltration und Metastasierung sollten angeschlossen werden, da es
sich bislang nur um Vermutungen handelt (Heidtmann et al. 1993).
Bezogen auf die vorliegende Arbeit hat sich gezeigt, daß Kathepsin L als
möglicher Kandidat für die Prozessierung von Surfactant Protein B nicht in
Betracht kommt, da es immunhistochemisch weder in Typ-II-Pneumozyten
noch in den Clara-Zell-spezifischen Granula lokalisiert werden konnte.
4.7
Kathepsin S
4.7.1 Untersuchungsergebnis
Diese Untersuchung erbrachte immunhistochemisch den Nachweis, daß
Kathepsin S ausschließlich in den Alveolarmakrophagen der menschlichen
Lunge lokalisiert ist.
4.7.2 Allgemeine Charakteristika
Humanes Kathepsin S, dessen kodierende Gene auf dem Chromosom 1q21
lokalisiert sind, ist eine Zysteinprotease mit einem Molekulargewicht von ca.
24 kDa und einer Länge von 217 Aminosäuren (Wideranders et al. 1991). Im
Gegensatz zu den Kathepsinen B, H und L, die auch als Dimere vorliegen
4. Diskussion
- 55 -
können, konnte vom Kathepsin S nur ein Monomer nachgewiesen werden
(Wiederanders et al. 1992, Shi et al. 1992).
Das pH-Optimum für matures Kathepsin S liegt zwischen 5.0 und 8.0, womit
es das einzige Kathepsin ist, das auch im basischen pH-Bereich noch aktiv
ist (Kirschke et al. 1994).
4.7.3 Aufbau
Die
Gensequenzen
für
die
Kodierung
von
Kathepsin
S
enthalten
Informationen über
1. Exon eins bis fünf
2. Intron eins bis vier
3. Teile von Intron fünf und
4. einen ca. sieben Kilobasen schweren Anteil der 5` begrenzenden Region,
der nicht über eine an der Genregulation beteiligte TATA- oder CAAT-Box
verfügt.
In die Genregulation involviert sind wahrscheinlich zwei SP1 und achtzehn
AP1 Abschnitte im Kathepsin S, an welche die Transkriptionsfaktoren
gebunden werden. Über die Transkriptionsfaktoren, die an der Regulation
der Expression des humanen Kathepsins S beteiligt sind, ist noch nichts
bekannt (Shi et al. 1994).
Vorläufer des maturen humanen Kathepsins S ist ein aus 331 Aminosäuren
und einem Molekulargewicht von 37 kDa bestehendes Präpropolypeptid mit
folgenden Sequenzen:
1. einem 15 Aminosäuren langem Signalpeptid am NH2-terminalen Ende
(Position 1-15)
2. einem 99 Aminosäuren langem Propeptid (Position 16-114) und
3. dem maturen ca. 24 kDa schweren und 217 Aminosäuren langem
Kathepsin S (Position 115-331) (Wiederanders et al.1992).
Im Gegensatz zu den anderen Kathepsinen ist im humanen Kathepsin S nur
eine Glykolysierungseinheit nachweisbar, die im Bereich der Signalsequenz
lokalisiert ist. Sie umfaßt die Aminosäuren Asn11, Ile10 und Thr9. Hieraus
ergibt sich, daß die Modifikation zum maturen Kathepsin S erst nach Bindung
an Mannose-6-Phosphat-Rezeptor und Transport zu den Lysosomen
erfolgen kann (Wiederanders et al. 1992).
4. Diskussion
- 56 -
Die Aktivierung und Prozessierung zum maturen Kathepsin S erfolgt
autokatalytisch bei einem pH-Wert von 4.0 (Brömme et al. 1993).
Zur Synthese befähigt sind in hohem Maße die Alveolarmakrophagen der
Lunge, die Milz und in einem geringeren Umfang das Gehirn, das Ileum, die
Thyroidea sowie das Ovar. In ihnen lassen sich entsprechende mRNA
Konzentrationen nachweisen (Quian et al. 1989, Petanceska et al. 1992).
Inhibitoren für das katalytische Zentrum des maturen Kathepsins S sind E64, Cystatin C, Cbz-Phe-Phe-CHN2, Cbz-Tyr-Ala-CHN2 und Cbz-Tyr-Tyr(οbutyl)-CHN2 (Shi et al. 1992).
4.7.4 Funktion
Kathepsin S konnte bisher nur in sehr wenigen Organen des humanen
Organismus nachgewiesen werden. Erhöhte Konzentrationen finden sich in
der Lunge, der Milz und dem Herzen. Die alleinige Expression von Kathepsin
S in den Alveolarmakrophagen sowie die hohen Konzentrationen in der Milz,
könnten
auf
eine
mögliche
Involvierung
dieses
Kathepsins
in
immunologische Prozesse hindeuten (Shi et al. 1994). Zu diesem Ergebnis
kamen auch Riese et al. (1998), die eine Prozessierung der invarianten Kette
vom
αβ-Heterodimer
des
Endoproteinaseaktivität
MHC-Moleküls
unter
Bildung
der
eines
Klasse
zwei
funktionalen
über
Moleküls
nachweisen konnten. Aus einer Inhibition von maturem Kathepsin S resultiert
somit die Akkumulation von Klasse zwei assoziierten Intermediärprodukten
der invarianten Kette, eine attenuierte Komplexbildung von MHC-Proteinen
der Klasse zwei und ihren Antigenpeptiden sowie eine aufgehobene
Antigenpräsentation. Eine Inhibition von Kathepsin S hat allerdings nur eine
Modifikation und nicht eine vollständige Unterdrückung der Immunantwort zur
Folge (Riese et al. 1998).
4.7.5 Die Bedeutung von Kathepsin S in der menschlichen Lunge
In den Alveolarmakrophagen der Lunge besitzt Kathepsin S ein hohes,
Elastin-abbauendes Potential. Über die Fähigkeit, Elastin abzubauen ist es,
wie
auch
Kathepsin
K,
möglicherweise
in
die
Entstehung
von
Lungenemphysemen involviert (Shi et al. 1992, Brömme et al. 1996).
Im Rahmen dieser Studie konnte gezeigt werden, daß Kathepsin S
immunhistochemisch
ausschließlich
in
den
Alveolarmakrophagen
4. Diskussion
- 57 -
nachweisbar war. Es ist somit als möglicher Kandidat, der in die
Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert ist, auszuschließen.
4.8
Napsin A
4.8.1 Untersuchungsergebnis
Napsin A konnte immunhistochemisch sowohl in den Typ-II-Pneumozyten,
Alveolarmakrophagen, als auch in den Clara-Zellen der Lunge lokalisiert
werden.
Sich
daran
anschließende
immunelektronenmikroskopische
Untersuchungen zeigten die ultrastrukturelle Verteilung von Napsin A in den
einzelnen Zellorganellen. In den Typ-II-Pneumozyten ließ sich Napsin A in
den multivesikulären Körperchen und in den Lamellenkörperchen über dem
„projection core“ lokalisieren. In den Makrophagen fand es sich in
Lysosomen. In den Clara-Zellen wurde eine Reaktion in den Clara-ZellGranula gefunden.
4.8.2 Allgemeine Charakteristika
Die Napsine gehören wie die Kathepsine D und E zur Gruppe der
Asparaginproteasen.
Zwei Isoformen werden voneinander unterschieden:
1. Napsin A, das von der Lunge und der Niere und
2. Napsin B, das nur von immunkompetenten Zellen exprimiert wird
(Schauer-Vukasinovic et al. 2000).
Matures Napsin A liegt als Monomer mit einem Molekulargewicht von ca. 38
kDa vor (Schauer-Vukasinovic 1999). Sein pH-Optimum liegt zwischen 5.0
und 6.0, wobei eine gewisse Stabilität auch noch bei einem pH-Wert von 7.0
zu beobachten ist (Schauer-Vukasinovic et al. 2000)
4.8.3 Aufbau
Vorläufer des maturen Napsins A ist das aus 420 Aminosäuren bestehende
Präpropolypeptid, das sich aus folgenden Abschnitten zusammensetzt:
1. einem 24 Aminosäuren langem Signalpeptid im Bereich des NH2terminalen Endes (Position 1-24)
2. einem sich daran anschließenden Propeptid (Position 25-64)
3. dem maturen Enzym (Position 65-402) und
4. Diskussion
- 58 -
4. einer C-terminalen Extension (Position 403-420) (Tatnell et al.1998).
Unter Abspaltung des N- und C-terminalen Endes entsteht das einkettige, ca.
38 kDa schwere mature Napsin A (Schauer-Vukasinovic et al. 1999).
Weiterhin besitzt humanes Napsin A drei Glykolysierungseinheiten und drei
Disulfidbrücken. Die Glykolysierungseinheit in Position Asn26-Phe27-Thr28
entspricht der Einheit im Kathepsin E und die in Position Asn67-Gly68-Thr69
der im Kathepsin D und Renin. Die dritte Einheit ist von den anderen
Asparaginproteasen unabhängig (Tatnell et al. 1998). Die unterschiedliche
Glykolysierung dieser Einheiten führt wahrscheinlich zum Auftreten der
Isoformen des Napsins A. Die Isoformen besitzen zum Teil ein höheres,
teilweise
auch
ein
niedrigeres
Molekulargewicht,
bezogen
auf
das
Molekulargewicht des maturen Napsins A (Chuman et al. 1999).
Napsin A zeigt die größte Strukturhomologie mit Kathepsin D. In Bezug auf
die cDNA und die Aminosäuresequenz findet man eine 47.1%ige und
48.3%ige Übereinstimmung (Tatnell et al. 1998, Schauer-Vukasinovic et al.
1999).
Napsin B unterscheidet sich von Napsin A zum einen durch das Fehlen eines
translationalen Stop-Codons und zum anderen durch eine andersartige
Aminosäuresequenz (Tatnell et al. 1998, Schauer-Vukasinovic et al. 1999).
Das aktive Zentrum der Asparaginproteasen enthält zwei Asp-Reste, die in
unterschiedlichen Domänen des Enzyms lokalisiert und an der katalytischen
Funktion beteiligt sind (Wingo et al. 1999). Diese lassen sich möglicherweise
auch im Napsin nachweisen, da es sich hierbei ebenfalls um eine
Asparaginprotease handelt.
4.8.4 Funktion
Napsin A läßt sich nur in der Niere und in der Lunge lokalisieren. In der Niere
ist es überwiegend im Epithel des proximalen Tubulus nachweisbar, was zu
der Vermutung führte, daß es an den aktiven Transportprozessen, die in
diesem Nierenabschnitt stattfinden, beteiligt ist (Schauer-Vukasinovic et al.
1999 und 2000).
In der Lunge konnten Schauer-Vukasinovic et al. (1999) Napsin A
immunhistochemisch in Pneumozyten, Alveolarmakrophagen sowie in nicht
näher charakterisierten Epithelien der terminalen und respiratorischen
Brochioli nachweisen (Schauer-Vukasinovic et al. 1999).
4. Diskussion
- 59 -
Bereits 1992 vermuteten Weaver et al., daß entweder Kathepsin D oder eine
Aspartyl-Protease in die Prozessierung von Surfactant Protein B involviert ist.
Sie stützten ihre Vermutung auf die Ergebnisse ihrer Studie, die zeigte, daß
die Prozessierung des PräproSp-B zum 25 kDa schweren Intermediärprodukt
nur bei sauren pH-Werten ablief und über Inhibitoren des katalytischen
Zentrums der Asparaginproteasen gehemmt werden konnte (Weaver et al.
1992). Chuman et al. (1999) zeigten über in situ Hybridisierung, daß Napsin
A in den Typ-II-Pneumozyten lokalisiert ist. Sie spekulierten aufgrund der
Ergebnisse von Weaver et al. (1992), daß es sich bei der an der
Prozessierung von SP-B beteiligten Aspartyl-Protease möglicherweise um
Napsin A handeln könnte (Chuman et al. 1999).
Weiterhin
zeigt
sich,
daß
Napsin
A
in
über
90%
der
primären
Adenokarzinomen der Lunge nachweisbar ist. Bislang ist es noch spekulativ,
ob Napsin A möglicherweise in der Zukunft als Marker zur Unterscheidung
zwischen primären und sekundären Adenokarzinomen der Lunge eingesetzt
werden kann (Chuman et al. 1999).
4.8.5 Napsin A und die Prozessierung von Surfactant Protein B
Napsin A konnte immunhistochemisch in den Typ-II-Pneumozyten und den
Alveolarmakrophagen lokalisiert werden. Zur exakten Lokalisation von
Napsin A in Bezug auf die einzelnen Zellorganellen in den Typ-IIPneumozyten wurden immunelektronenmikroskopische Untersuchungen
angeschlossen. Hierüber konnte Napsin A im Typ-II-Pneumozyten in den
multivesikulären Körperchen und den Lamellenkörperchen nachgewiesen
werden. Weiterhin konnte Napsin A immunelektronenmikroskopisch in den
Clara-Zell-spezifischen
Granula
lokalisiert
werden.
Aufgrund
seiner
Lokalisation ist Napsin A ein möglicher Kandidat, der in den Typ-IIPneumozyten
im
Bereich
der
multivesikulären
Körperchen
und
möglicherweise auch in den Clara-Zellen in die Prozessierung des Surfactant
Proteins B involviert ist. Weitere Erläuterungen folgen nach der Abhandlung
über SP-B.
4. Diskussion
4.9
- 60 -
Surfactant
Die Hauptfunktion des Surfactants ist es, die Oberflächenspannung der
Alveolen-Luft-Grenze herabzusetzen.
Er setzt sich zu 90% aus Lipiden und zu 10% aus Proteinen zusammen. Der
Lipidanteil besteht zu 80-90% aus Phospholipiden, deren Hauptanteil mit ca.
60% das Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ausmacht (Haagsmann et al.
1991). Seine Aufgabe ist es, bei niedrigem pulmonalem Volumen, die
Oberflächenspannung der Alveolen-Luft-Grenze auf Werte unter 10mN/m
herabzusetzen (Clements 1977). Ebenfalls im Surfactant nachweisbar sind
Phosphatidylglycerol (PG) und neutrale Lipide, von denen das Cholesterol
den größten Anteil stellt (Haagsmann et al. 1991).
Bislang sind vier Surfactant assoziierte Proteine charakterisiert: SP-A, SP-B,
SP-C und SP-D (Haagsman et al. 1991).
Der Surfactant wird in den Typ-II-Pneumozyten synthetisiert und in den
Lamellenkörperchen der Typ-II-Pneumozyten gespeichert (Ballard et al.
1989). Auf einen entsprechenden Reiz hin (zum Beispiel ein tiefer Atemzug)
erfolgt die Freisetzung der Lamellenkörperchen in die Alveole und es kommt
zur Bildung des tubulären Myelins, aus dem sich ein „Monolayer“ bildet, der
die Alveole auskleidet (Haagsman et al. 1991).
Eine Studie von Williams et al. (1991) zeigte, daß die Bildung des tubulären
Myelins mit Hilfe von SP-A, SP-B, Lipiden sowie Kalziumionen erfolgt und
daß SP-C nicht in der Lage ist, SP-B oder SP-A bei der Bildung dieses
Myelins zu ersetzen. In Abwesenheit von SP-B und in Anwesenheit von SPC konnten nur multilamelläre Aggregate und einzelne diskoide Partikel
nachgewiesen werden. Auch in einer Mischung von Lipiden mit SP-B und
SP-C fanden sich nur diskoide Partikel. Hieraus ergibt sich, daß SP-A und
SP-B die entscheidenden Komponenten für die Bildung des tubulären
Myelins darstellen (Williams et al. 1991).
4. Diskussion
- 61 -
4.10 Surfactant Protein B
4.10.1 Untersuchungsergebnis
Surfactant Protein B konnte immunhistochemisch in den Typ-II-Pneumozyten
und den Clara-Zellen der Lunge nachgewiesen werden. In den Typ-IIPneumozyten fand sich eine Kolokalisation mit Kathepsin H und Napsin A. In
den Clara-Zellen dagegen konnte nur eine Kolokalisation mit Napsin A
gezeigt werden.
4.10.2 Allgemeine Charakteristika
Humanes matures Surfactant Protein B ist ein acht kDa schweres und 79
Aminosäuren langes hydrophobes Protein, dessen kodierende Gene auf
Chromosom zwei lokalisiert sind (Emrie et al. 1988, Johansson et al. 1992).
Im intraalveolären Surfactant liegt es als 18 kDa schwerer Dimer vor, der
durch die Verbindung zweier Monomere über eine Disulfidbrücke entsteht.
An
der
Stabilität
des
Moleküls
sind
weitere
drei
intramolekulare
Disulfidbrücken beteiligt (Johansson et al. 1991 und 1992).
4.10.3 Aufbau
Surfactant Protein B wird von Typ-II-Pneumozyten und von den Clara-Zellen
der Lunge exprimiert, in denen sich entsprechende mRNA Korrelate
lokalisieren lassen (Phelps und Floros 1991).
Vorläufer des maturen Surfactant Proteins B ist ein 381 Aminosäuren langes
und 40 kDa schweres Präproprotein, das sich aus folgenden Abschnitten
zusammensetzt:
1. einer 20-23 Aminosäuren langen Signalsequenz am N-terminalen Ende
(Position 1-23)
2. einem sich daran anschließenden ca. 176 Aminosäuren langem Propeptid (Position 24-199)
3. dem maturen SP-B (Position 200-279) und
4. dem 102 Aminosäuren langem Peptid am C-terminalen Ende (Position
280-381) (O`Reilly et al. 1989).
Mit Hilfe der Signalsequenz erfolgt der Transport des Präproproteins in das
Lumen des endoplasmatischen Retikulums, wo es zur Abspaltung dieses
Peptids und zur Glykolysierung von Asparagin311 im COOH-terminalen
4. Diskussion
- 62 -
Propeptid unter Bildung eines 42 kDa schweren Intermediärproduktes kommt
(O`Reilly et al. 1989, Weaver et al. 1992, Whitsett et al. 1995). Über die
funktionelle Bedeutung des glykolysierten Asparagins liegen noch keine
Erkenntnisse vor (Whitsett et al.1995).
In zwei weiteren Teilschritten erfolgt die Abspaltung des Propeptids am Nterminalen Ende. Es kommt zunächst zur Prozessierung der Kette im Bereich
der Aminosäure Gly190, wobei ein Intermediärprodukt mit einem Molekulargewicht von 25 kDa entsteht. Dieser Schritt ist im Golgi-Komplex
lokalisiert (Guttentag et al. 1998). Der noch verbleibende Anteil im Bereich
des N-terminalen Endes dient als „Wegweiser“ für SP-B zu den
Lamellenkörperchen und wird erst im Bereich der multivesikulären
Körperchen nach Prozessierung des COOH-terminalen Endes (im Bereich
der AS Met279) abgespalten. Die Prozessierung des COOH-terminalen Endes
erfolgt zwischen den AS Gln200 und Phe201 (Pryhuber et al. 1998, Guttentag
1998, Korimilli et al. 2000).
Eine in vitro Untersuchung von Weaver et al. (1992) zeigte, daß die
Prozessierung zur 25 kDa schweren Intermediärform durch Kathepsin D oder
eine Kathepsin D ähnliche Aspartyl-Protease katalysiert wird (Weaver et al.
1992).
Die Prozessierung des COOH- und des verbleibenden NH2-terminalen
Endes unterliegen wahrscheinlich einer hormonellen Regulation (Guttentag
et al.1998). Angaben über mögliche beteiligte Enzyme liegen noch nicht vor.
Das mature SP-B liegt intraalveolär als 18 kDa schwerer Dimer vor, der
durch die Verbindung zweier Monomere über eine intermolekulare
Disulfidbrücke in der Position Cys48 gebildet wird (Guttentag et al. 1998, Lin
et al.1999). Gespeichert wird SP-B in den Lamellenkörperchen der Typ-IIPneumozyten, aus denen es in die Alveole freigesetzt wird. Im Rahmen des
„Recycling“ kommt es zu einer Wiederaufnahme des SP-B durch die Typ-IIPneumozyten. Die Endozytose verläuft über einen rezeptorunabhängigen
Vorgang. Ein Teil des wiederaufgenommenen SP-B wird degradiert und der
andere Teil wird bei Bedarf erneut in die Alveole abgegeben (Pryhuber et al.
1998).
Die Vorstufen des maturen Surfactant Proteins B lassen sich im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Komplex und den multivesikulären
4. Diskussion
- 63 -
Körperchen der Typ-II-Pneumozyten nachweisen. Matures SP-B ist dagegen
nur in den multivesikulären Körperchen und den Lamellenkörperchen
lokalisiert. Synthese und Prozessierung des PräproSP-B zum maturen SP-B
sind also auf Stufe der multivesikulären Körperchen abgeschlossen
(Voorhout et al. 1992).
Die Expression wird über Glukokortikoide (zum Beispiel Dexamethason)
forciert.
Sie
bewirken
eine
Induktion
der
Transkription
und
über
posttranslatorische Modifikationen die erhöhte Synthese der SP-B mRNA
(O`Reilly
et
al.
1991).
Über
einen
ähnlichen,
wenn
auch
eher
abgeschwächten Wirkungsmechanismus verfügt auch cAMP (Ballard et al.
1989). Der hepatozytäre nukleäre Faktor 3α (HNF3α) und der thyroidale
Transkriptionsfaktor 1 (TTF1) binden dagegen im Bereich des Promotors und
bewirken auf diesem Wege eine Erhöhung der Transkriptionsrate (Bohinski
et al. 1994).
Inhibitoren für den Syntheseweg sind unter anderem Phorbolester und der
Tumornekrosefaktor-α. Sie entfalten vermutlich ihre Wirkung über eine
Modifikation der mRNA Rate (Whitsett et al. 1992).
4.10.4 Funktion
SP-B ist zusammen mit SP-A, Lipiden und Ca2+-Ionen in der Lage, tubuläres
Myelin auszubilden, welches intraalveolär zur Bildung eines „Monolayers“
führt, der die Alveole auskleidet (Suzuki et al. 1989, Williams et al. 1991).
Weiterhin ist SP-B in der Lage, seine positiv geladenen Aminosäuren an die
negativ
geladenen
Aminosäuren
der
Surfactantlipide
(zum
Beispiel
Phosphatidylcholin, DPPG) zu binden. Über diesen Mechanismus wird die
Surfactantfunktion, die in der Herabsetzung der Oberflächenspannung
zwischen Alveole und Luft liegt, verbessert. Erreicht wird dieser Effekt durch
die verbesserte Adsorption, Spreizung und Insertion der Surfactantlipide in
den Surfactant (Baatz et al. 1990, Whitsett et al. 1995, Nag et al. 1999).
Dieser Effekt wird noch unterstützt durch die Fähigkeit von SP-B, der
Zerstörung der Surfactantlipide durch
Plasmaproteine (zum Beispiel
Fibrinogen) entgegenzuwirken (Venkitaraman et al. 1991, Seeger et al.
1992).
4. Diskussion
- 64 -
In vitro Studien haben gezeigt, daß SP-B die Wiederaufnahme der
Surfactantlipide in den Typ-II-Pneumozyten stimuliert (Rice et al. 1989).
Anhand einer Studie mit Mäusen von Clark et. al. (1995) konnte der
Nachweis erbracht werden, daß ein absoluter Mangel von SP-B mit dem
Leben nicht vereinbar ist. SP-B -/- negative Mäuse starben kurz nach der
Geburt, ohne daß es zur Entfaltung der Lunge kam, wohingegen SP-B +/positive Mäuse nach der Geburt eine normale Belüftung des pulmonalen
Gewebes mit einer allerdings verminderten Lungencompliance und „air
trapping“ aufwiesen (Clark et al. 1995, Yusen et al.1999). Weiterführende
Studien von Lin et al. (1999) ergaben, daß die selektive Bildung von SP-B in
den Clara-Zellen bei SP-B -/- Mäusen nicht zum postnatalen Überleben
dieser Tiere führte, da es nur zur Bildung des 25 kDa schweren
Intermediärproduktes, nicht aber zur Bildung eines funktionalen maturen SPB durch die Clara-Zellen kam. Die Aufnahme des von den Clara-Zellen in die
Alveole sezernierten Intermediärproduktes durch die Typ-II-Pneumozyten zur
weiteren Prozessierung zum maturen SP-B war nicht möglich (Lin et al.
1999).
Bei Neugeborenen führt ein Mangel an SP-B, der zum Beispiel durch die
Insertion von zwei Basenpaaren in das Codon 121 der SP-B mRNA
(Mutation 121 ins2) ausgelöst wird, postnatal zu einer respiratorischen
Insuffizienz
(„infant
respiratory
distress
syndrom“),
die
ohne
eine
Lungentransplantation innerhalb der ersten Lebenswochen zum Tode führt
(Nogee et al. 2000).
Eine weitere Aufgabe von SP-B ist seine Involvierung in die Prozessierung
von SP-C. Das COOH-terminale Ende scheint an der Prozessierung von
proSP-C beteiligt zu sein, da ein Fehlen dieser Domäne in der Mäuselunge
zur Akkumulation eines elf kDa schweren Intermediärproduktes, nicht aber
zur Bildung von maturem SP-C führte (Akinbi et al.1997).
Lin et al. (1999) zeigten, daß es sowohl unter physiologischen als auch unter
pathologischen Bedingungen zum alternativen Splicen der SP-B mRNA
kommen kann. Sie konnten feststellen, daß bei pulmonalen Erkrankungen
die
Menge
an
aufgetretenen
Spliceprodukten
höher
ist
als
unter
physiologischen Bedingungen. Möglicherweise stehen diese modifizierten
4. Diskussion
- 65 -
SP-B mRNAs in einem Zusammenhang mit dem Auftreten von pulmonalen
Erkrankungen (Lin et al. 1999).
4.11 Die
Bedeutung
von
Kathepsin
H
und
Napsin
A
in
der
Prozessierung des Surfactant Proteins B
Im Rahmen dieser Studie wurde immunhistochemisch zunächst die
Verteilung der Kathepsine der Familie Papainproteasen B, H, K, L und S
sowie der Familie der
Pepsinproteasen D, E und Napsin A in der
menschlichen Lunge charakterisiert. Als einzige Proteasen ließen sich
Kathepsin H und Napsin A in den Typ-II-Pneumozyten nachweisen. Napsin A
fand sich im Gegensatz zu Kathepsin H auch in den Clara-Zellen. In den
Clara-Zellen
ist
es
mit
pro
SP-B
kolokalisiert.
Doppellabeling-
Untersuchungen zeigten eine Kolokalisation von SP-B mit Kathepsin H und
Napsin
A
in
den
cuboidalen
Alveolardeckepithelien.
Zur
weiteren
Charakterisierung der Zellorganellen, in denen sich Kathepsin H und Napsin
A darstellen ließen, wurden immunelektronenmikroskopische Untersuchungen
Kathepsin
angeschlossen.
H
multivesikulären
und
Im
Napsin
Körperchen
Rahmen
A
in
den
dieser
Untersuchung
Typ-II-Pneumozyten
nachgewiesen
werden.
konnten
in
Aufgrund
den
ihrer
Lokalisation kommen nur Kathepsin H und Napsin A als mögliche
Kandidaten für die Prozessierung des Surfactant Proteins B in Frage.
Eine in vitro Studie von Weaver et al. (1992) an der Rattenlunge zeigte,
daß möglicherweise Kathepsin D oder eine Kathepsin D ähnliche AspartylProtease in die Prozessierung des PräproSP-B zum 25 kDa schweren
Intermediärprodukt involviert ist. Seine Ergebnisse stützen sich unter
anderem darauf, daß die Prozessierungsschritte nur bei sauren pH-Werten
ablaufen und über Inhibitoren (zum Beispiel Pepstatin A), die auf die
katalytische Einheit der Asparaginproteasen einwirken, gehemmt werden
können. Substanzen, die die katalytische Aktivität der Zysteinproteasen
hemmen, zeigten keine Wirkung (Weaver et al. 1992).
Yarus et al. (1997) führten Untersuchungen an transgenen Mäusen durch,
welche SP-B über die Brustdrüse abgaben. In der sekretierten Milch konnte
nur das ca. 40 kDa schwere Präproprotein nachgewiesen werden. Ein 25
kDa schweres Intermediärprodukt fand sich nicht, obwohl in den Zellen der
Brustdrüse Kathepsin D in hohen Konzentrationen vorlag. Sie kamen zu dem
4. Diskussion
- 66 -
Ergebnis, daß Kathepsin D in vivo nicht in die Prozessierung des Surfactant
Proteins B involviert sein kann (Yarus et al. 1997).
Im Rahmen dieser Studie an gesunden nicht transplantierten menschlichen
Lungen zeigte sich ebenfalls, daß Kathepsin D in der menschlichen Lunge
nicht in die Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert sein kann, da
sich Kathepsin D immunhistochemisch und immunelektronenmikroskopisch
weder in Typ-II-Pneumozyten noch in Clara-Zellen nachweisen ließ.
Schauer-Vukasinovic
et
al.
charakterisierten
1999
einen
weiteren
„Angehörigen“ der Familie der Pepsinproteasen. Es handelte sich hierbei um
das Napsin A, das sich im Lungengewebe in Typ-II-Pneumozyten, den
Alveolarmakrophagen, dem respiratorischen Epithel, den Plasmazellen und
den Lymphozyten lokalisieren ließ (Schauer-Vukasinovic et al. 1999).
Ergänzend zu diesen Ergebnissen konnte in dieser Studie Napsin A in
multivesikulären Körperchen und Lamellenkörperchen in Typ-II-Pneumozyten
sowie in Clara-Zell-Granula lokalisiert werden. Matures Napsin A zeigt eine
ausgeprägte Homologie zu Kathepsin D , die sich auf die cDNA (47,1%) und
die Aminosäuresequenz (48,3%) bezieht. Weiterhin finden sich Ähnlichkeiten
im Bereich der Glykolysierungseinheiten. Die Glykolysierungseinheit in
Position Asn67-Gly68-Thr69 ist in ihrem Lokalisationsort identisch zu den
Lokalisationsorten im Kathepsin D und im Renin (Tatnell et al. 1998).
Setzt man die heutigen Erkenntnisse von Tatnell et al. (1998) und SchauerVukasinovic et al. (1999) in Beziehung zu den Egebnissen von Weaver et al.
(1992), liegt die Vermutung nahe, daß es sich bei der von Weaver et al.
(1992) postulierten Asparaginprotease möglicherweise um Napsin A handelt
(Tatnell et al. 1998, Schauer-Vukasinovic et al. 1999, Weaver et al. 1992).
Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, daß Napsin A
auch an der Prozessierung des proSP-B in Typ-II-Pneumozyten und ClaraZellen beteiligt ist. Die Prozessierung des Präproproteins findet in ClaraZellen
wahrscheinlich
nur
bis
zur
Stufe
des
25
kDa
schweren
Intermediärproduktes statt, das sich sowohl immunhistochemisch im Lumen
der
Bronchioli,
als
auch
der
Broncho-Alveolären-Lavage-Flüssigkeit
nachweisen läßt. Matures Surfactant Protein B konnte immunhistochemisch
in den Clara-Zellen nicht eindeutig lokalisiert werden. Der Mangel an
maturem SP-B in Clara-Zellen kann möglicherweise auf das Fehlen von
4. Diskussion
- 67 -
Kathepsin H in diesen Zellen zurückzuführen sein, so daß die weitere
Prozessierung zum maturen SP-B nicht erfolgen kann.
Im
Gegensatz
Präproproteins
zu
den
Clara-Zellen
findet
die
Prozessierung
des
in den Typ-II-Pneumozyten bis zum maturen Surfactant
Protein B statt, wobei dieser Vorgang bereits im Bereich der multivesikulären
Körperchen abgeschlossen ist. Zusammenfassend legen die Ergebnisse
dieser Studie die Vermutung nahe, daß die Prozessierung bis zum 25 kDa
Intermediärprodukt mit Hilfe von Napsin A erfolgt, während die weiteren
Prozessierungsschritte, die Typ-II-Zell-spezifisch sind, durch Kathepsin H
katalysiert werden.
Noch nicht veröffentlichte weiterführende
biochemische Untersuchungen
von Herrn Dr. F. Brasch (Institut für Pathologie, Berufsgenossenschaftliche
Universitätskliniken Bergmannsheil) und Herrn Dr. F. Bühling (Institut für
Immunologie, Universität Magdeburg) zeigen bereits, daß Kathepsin H und
Napsin A in die Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert sind.
4.12 Clara-Zellen
4.12.1 Allgemeine Charakteristika
Die Clara-Zellen sind eine Gruppe von nicht-zilientragenden sekretorischen
Zellen im pulmonalen Gewebe, die 1937 erstmals von Max Clara beschrieben wurden. 1967 postulierte Niden, daß die Clara-Zellen in der Lage seien,
den pulmonalen Surfactant zu bilden, der dann von den Typ-II-Pneumozyten
über Endozytose aufgenommen und in den Lysosomen gespeichert wird
(Niden 1967). Weiterführende Studien von Clements (1970) und Askin et al.
(1971) und sollten dieses Ergebnis widerlegen und zeigen, daß der
Surfactant intraalveolar von den Typ-II-Pneumozyten gebildet wird (Clements
1970, Askin et al. 1971). Heute weiß man, daß die Synthese des Surfactant
in den Typ-II-Pneumozyten stattfindet (Ballard et al. 1989).
In den Clara-Zellen konnten weiterhin die Surfactant Proteine A, B und D
nachgewiesen werden sowie ein Teil der Surfactantlipide gebunden an das
„Clara-Cell specific“ Protein CC10 (Singh et al. 1997). Ob diese Bestandteile
nur in den Clara-Zellen gespeichert oder auch von ihnen synthetisiert
werden, ist noch nicht geklärt.
4. Diskussion
- 68 -
Phelps und Floros charkterisierten 1991 die Unterschiede in der Lokalisation
der mRNA der Surfactant assoziierten Proteine A und B in Bezug auf die
humane und die Rattenlunge. In der Rattenlunge konnten sie die mRNA von
SP-A und SP-B in Typ-II-Pneumozyten und in nicht zilientragenden
Bronchiolarzellen nachweisen. Im humanen Lungengewebe lokalisierten sie
die mRNA von SP-A und SP-B in Typ-II-Zellen sowie die SP-B mRNA in
nicht zilientragenden Bronchiolarzellen (Phelps und Floros 1991).
Die Clara-Zelle läßt sich in CC10-positive und CC10-negative Zellen einteilen
(Singh et al. 1997).
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, daß proSP-B in
CC10-positiven Clara-Zellen synthetisiert, vermutlich in diesen Zellen aber
nur inkomplett bis zum 25 kDa schweren Intermediärprodukt prozessiert wird.
4.12.2 Aufbau des „Clara-Cell specific“ Proteins CC10
Das 10 kDa schwere „Clara-Cell specific“ (CC10) Protein, dessen kodierende
Gene auf dem Chromosom 11p12-q13 lokalisiert sind, setzt sich aus einem
91 Aminosäuren langem Proprotein zusammen, das folgende Sequenzen
enthält:
1. eine Signalsequenz am N-terminalen Ende (Position 1-21) und
2. das mature CC10 (Position 22-91).
Matures CC10 liegt als Dimer vor, der sich aus zwei Monomeren von jeweils
70 Aminosäuren Länge und einem Molekulargewicht von jeweils fünf kDa
über Verbindung mit zwei antiparallelen Disulfidbrücken in den Positionen
Cys3-Cys69` und Cys3`-Cys69 zusammensetzt (Singh et al. 1988, Umland et
al. 1994). Die Monomere enthalten vier α-Helices in den Positionen Pro4Leu, Pro18-Leu27, Gln32-Asp46 und Gln50-Ser66, die über kurze Schleifen
in β-Formation verbunden sind (Umland et al. 1994).
Weiterhin verfügt das CC10-Protein in seiner Struktur über eine „hydrophobe
Tasche“, die durch die Polymerisation der beiden Monomere zum Dimer
entsteht. Nach Sekretion des CC10-Proteins aus der Clara-Zelle in den
Bronchiolarraum können an die „hydrophobe Tasche“ Lipide, wie zum
Beispiel Phospholipase A2, Phosphatidylcholin und Phosphatidylinositol,
binden (Singh et al. 1990, Umland et al. 1994).
4. Diskussion
- 69 -
In Tierversuchen an Kaninchenlungen konnte gezeigt werden, daß die
Expression von CC10-Protein über Kortison erhöht werden konnte. Ob die
Expressionsrate auch in der humanen Lunge über Kortison erhöht werden
kann, kann durch diese Tierversuche nicht eindeutig geklärt werden, da sich
humanes- und Kaninchen-CC10-Protein in ihrem Aufbau unterscheiden (Wolf
et al. 1992).
Singh et al. (1988) konnten die CC10-positiven Clara-Zellen in Bronchiolen
mit einem Durchmesser von fünf mm oder weniger lokalisieren. In
cuboidalen, nicht zilientragenden Zellen der respiratorischen Bronchiolen und
den proximalen Bronchiolen waren sie nicht nachweisbar (Singh et al. 1988).
4.12.3 Funktion der Clara-Zellen
Über ihre Fähigkeit, Phospholipase A2 in der „hydrophoben Tasche“ zu
binden, sind die CC10-Proteine der Clara-Zellen möglicherweise in die
Regulation von Entzündungsprozessen in den Bronchiolen involviert, wobei
man
sich
diesen
Mechanismus
folgendermaßen
vorstellen
könnte:
Phospholipase A2 ist in die Produktion der Arachidonsäure involviert, die
wiederum an der Bildung der Entzündungsmediatoren Prostaglandine und
Leukotriene beteiligt ist (Hay et al. 1995, Singh et al. 1990). Eine Inhibition
der Phosphololipase A2 würde somit möglicherweise zu einer Verminderung
von Entzündungsmediatoren führen. Diese These wird zusätzlich durch die
Tatsache gestützt, daß die Gene für das CC10-Protein der Clara-Zellen in
einer Region auf Chromosom elf lokalisiert sind, in der sich noch weitere für
die Regulation an Entzündungsprozessen beteiligte Gene befinden (Singh et
al. 1997). Ferner zeigten Lesur et al. (1995) in einer in vitro Studie, daß das
CC10-Protein eine Phospholipase-A2-vermittelte Hemmung der Fibroblastenmigration bewirkt. Ein Mangel an CC10-Protein führte zum Auftreten einer
Lungenfibrose (Lesur et al. 1995).
Als eine weitere Aufgabe der Clara-Zellen zeigten Brody et al. (1987) in
Tierversuchen eine Involvierung in die Regeneration des Bronchialepithels.
Sie installierten Clara-Zellen des Kaninchens in die „nackte“ (nach
Entfernung des eigentlichen Trachealepithels) Trachea
von Ratten und
konnten eine de novo Bildung von Zellen beobachten. Es hat sich allerdings
gezeigt, daß es nur zur Neubildung von Clara-Zellen und zilientragenden
4. Diskussion
- 70 -
Zellen kam. Eine Neubildung von Basalzellen und mukösen Drüsen konnte
nicht beobachtet werden (Brody et al. 1987).
4.13 Die Prozessierung des Surfactant Proteins B in den Clara-ZellGranula
Im Rahmen dieser Studie konnte immunhistochemisch in den CC10positiven Clara-Zellen in den Bronchiolen eindeutig proSP-B nachgewiesen
werden, wobei jedoch nur wenige Clara-Zellen mit dem Antikörper gegen
matures SP-B schwach angefärbt wurden. Diese schwach positive Reaktion
in den Clara-Zellen stellt möglicherweise eine Kreuzreaktion mit proSP-B dar.
Die Prozessierung des proSP-B findet in den Clara-Zellen wahrscheinlich
nur bis zur Stufe des 25 kDa schweren Intermediärproduktes statt, welches
sich biochemisch in der BAL-Flüssigkeit und immunhistochemisch im Lumen
der Bronchioli nachweisen ließ. Hieraus ergibt sich, daß die Clara-Zellen in
der Lage sind, dieses Intermediärprodukt zu sezernieren.
Weiterhin zeigte diese Studie, daß in den Clara-Zell-Granula nur Napsin A,
nicht aber Kathepsin H nachweisbar ist.
5. Zusammenfassung
- 71 -
5 Zusammenfassung
Bei den Zysteinproteasen und Asparaginproteasen handelt es sich um zwei
Familien von lysosomalen Proteasen, über deren Verteilung und Funktion in
der menschlichen Lunge bisher nur wenig bekannt ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Verteilung der Zysteinproteasen
Kathepsin B, H, K, L und S sowie der Asparaginproteasen Kathepsin D, E
und Napsin A in der humanen Lunge zu charakterisieren, insbesondere unter
der Fragestellung, welche der Proteasen aufgrund ihrer Lokalisation in die
Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert sein könnten.
Untersucht wurden humane Lungengewebsproben von Explantaten acht
gesunder erwachsener Individuen. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden Antikörper gegen die Zysteinproteasen Kathepsin B, H,
K, L und S, die Asparaginproteasen Kathepsin D, E und Napsin A, gegen das
Surfactant Protein B sowie die Proform des SP-B (proSP-B) und das ClaraZell-spezifische
Protein
CC10
eingesetzt.
Zusätzlich
wurde
immun-
elektronenmikroskopisch die Verteilung der Kathepsine D, H und Napsin A
untersucht.
Immunhistochemisch fanden sich in den zilientragenden Bronchialepithelien
und den Alveolarmakrophagen die Kathepsine B, D, H, K und L. Kathepsin D
ließ sich ultrastrukturell nur in den Lysosomen der Kinozilien tragenden
Bronchialepithelien lokalisieren. Kathepsin S fand sich immunhistochemisch
ausschließlich in Alveolarmakrophagen, in denen sich auch Napsin A
nachweisen ließ. Kathepsin E ließ sich in CC10-negativen Clara-Zellen im
Übergangsbereich der Bronchioli terminales in Bronchioli respiratorii
lokalisieren.
Kathepsin H und Napsin A ließen sich als einzige Proteasen in den
cuboidalen
Alveolardeckepithelien
nachweisen.
chungen zeigten eine Kolokalisation
Doppellabeling-Untersu-
mit SP-B in diesen Zellen.
Immunelektronenmikroskopisch ließen sich Kathepsin H und Napsin A in den
Lamellenkörperchen und den multivesikulären Körperchen der Typ-IIPneumozyten nachweisen. Napsin A fand sich ferner in den Granula der
Clara-Zellen
kolokalisiert
mit
proSP-B.
In
der
BAL
ließ
sich
ein
5. Zusammenfassung
- 72 -
Intermediärprodukt des proSP-B nachweisen, welches von den Clara-Zellen
in den Bronchioli sezerniert wird.
Zusammenfassend
zeigen
die
erzielten
Ergebnisse,
daß
sich
die
untersuchten lysosomalen Proteasen in ihrer zellulären Verteilung in der
humanen Lunge unterscheiden und aufgrund ihrer Lokalisation nur Kathepsin
H und Napsin A als Kandidaten für die Prozessierung des Surfactant
Proteins B in Typ-II-Pneumozyten in Frage kommen. In den Clara-Zellen ist
nur Napsin A ein Kandidat, der in die Prozessierung des Surfactant Proteins
B involviert ist, wobei sich aus den Untersuchungen indirekt Hinweise
ergaben, daß das proSP-B nur bis zu einem 25 kDa schweren Intermediärprodukt prozessiert wird, das von den Clara-Zellen sezerniert wird und
in der BAL nachweisbar ist. Diese unvollständige Prozessierung des proSP-B
in Clara-Zellen ist möglicherweise durch das Fehlen von Kathepsin H in
diesen Zellen bedingt. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, daß auch
lysosomale Zystein- und Asparaginproteasen partiell in den sehr komplexen
Vorgang
der
Prozessierung
eingebunden sind.
von
pulmonalen
Surfactant
Proteinen
6. Literaturverzeichnis
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Danksagung
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. K. M.
MÜLLER für die Überlassung des Themas dieser Dissertation sowie für die
zahlreichen Anregungen und Hilfestellungen.
Meinem Betreuer Herrn Dr. F. BRASCH danke ich besonders herzlich für die
hervorragende Betreuung, die ausgezeichnete Einführung in die Materie, die
vielen Diskussionen und Hinweise und die Zeit, die er für mich erübrigt hat.
Den medizinisch-technischen Assistentinnen A. KRUSAT und S. SCHAUB
gilt mein besonderer Dank für die Erstellung hervorragender Schnittpräparate
und immunhistochemischer Färbungen.
Mein besonderer Dank
gilt Herrn Dr. rer. nat. G. JOHNEN und Frau S.
GEIGER für die biochemische Aufarbeitung der BAL-Proben.
Mein herzlicher Dank gilt T. Blumenschein, C. Riemann-Spernau sowie K.
und E. Waldschmidt, die diese Dissertation Korrektur gelesen haben.
Für die Überlassung der benötigten Antikörper danke ich Dr. S. Hagwood,
Prof. of Pediatrics, UCLA, Dr. F. Bühling, Magdeburg sowie Dr. Suzuki,
Tokio, Japan.
- 91 -
Lebenslauf
Lebenslauf
Ich wurde am 4. August 1971 als Tochter von Christa Riemann-Spernau und
Dr. Friedrich Riemann in Herford geboren. Von 1977 bis 1982 besuchte ich
die Loh-Grundschule in Dortmund und anschließend bis 1985 das
Mallinckrodt-Gymnasium in Dortmund. Das Schuljahr 1985/1986 verbrachte
ich am Colegio Visconde de Porto Seguro in Sao Paulo, Brasilien. Ab 1986
besuchte ich erneut das Mallinckrodt-Gymnasium in Dortmund, das ich 1991
mit dem Abitur abschloß.
Von 1991 bis 1992 leistete ich ein Freiwilliges Soziales Jahr im St. JohannesHospital in Dortmund ab.
Von November 1992 bis Ende September 1994 erfolgte die Ausbildung zur
Medizinisch-Technischen-Assistentin
am
Knappschafts-Krankenhaus
in
Bochum-Langendreer, die ich vor Beginn meines Studiums abschloß.
Seit dem Wintersemester 1994/1995 bin ich an der Ruhr-Universität-Bochum
im Fach Humanmedizin eingeschrieben. Während des Sommersemesters
2000 und des Wintersemesters 2000/2001 arbeitete ich am Institut für
Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil an
der Charakterisierung der Zysteinproteasen B, H, K, L und S sowie der
Asparaginproteasen D, E und Napsin A und ihrer Bedeutung bei der
Prozessierung des Surfactant Proteins B. Zum Ende des Sommersemesters
2001 werde ich mein zweites Staatsexamen ablegen und dann mit dem
Praktischen Jahr beginnen.
Abstract
Riemann
Nadja
Charakterisierung der Verteilung lysosomaler Zystein- und Asparaginproteasen in der menschlichen
Lunge und ihre Bedeutung bei der Prozessierung des Surfactant Proteins B
Einleitung: Bei den Zysteinproteasen und Asparaginproteasen handelt es sich um zwei Familien von
lysosomalen Proteasen, über deren Verteilung und Funktion in der menschlichen Lunge bisher nur wenig
bekannt ist.
Fragestellung: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Verteilung der Zysteinproteasen Kathepsin B, H, K, L
und S sowie der Asparaginproteasen Kathepsin D, E und Napsin A in der humanen Lunge zu
charakterisieren, insbesondere unter der Fragestellung, welche der Proteasen aufgrund ihrer Lokalisation in
die Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert sein könnten.
Material und Methoden: Untersucht wurden humane Lungengewebsproben von Explantaten acht gesunder
erwachsener Individuen. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden Antikörper gegen die
Zysteinproteasen Kathepsin B, H, K, L und S, die Asparaginproteasen Kathepsin D, E und Napsin A, gegen
das Surfactant Protein B sowie die Proform des SP-B (proSP-B) und das Clara-Zell-spezifische Protein CC10
eingesetzt. Zusätzlich wurde immunelektronenmikroskopisch die Verteilung der Kathepsine D, H und Napsin
A untersucht.
Ergebnisse: Immunhistochemisch fanden sich in den zilientragenden Bronchialepithelien und den
Alveolarmakrophagen die Kathepsine B, D, H, K und L. Kathepsin D ließ sich ultrastrukturell nur in den
Lysosomen
der
Kinozilien
tragenden
Bronchialepithelien
lokalisieren.
Kathepsin
S
fand
sich
immunhistochemisch ausschließlich in Alveolarmakrophagen, in denen sich auch Napsin A nachweisen ließ.
Kathepsin E ließ sich in CC10-negativen Clara-Zellen im Übergangsbereich der Bronchioli terminales in
Bronchioli respiratorii lokalisieren.
Kathepsin H und Napsin A ließen sich als einzige Proteasen in den cuboidalen Alveolardeckepithelien
nachweisen. Doppellabeling-Untersuchungen zeigten eine Kolokalisation
mit SP-B in diesen Zellen.
Immunelektronenmikroskopisch ließen sich Kathepsin H und Napsin A in den Lamellenkörperchen und den
multivesikulären Körperchen der Typ-II-Pneumozyten nachweisen. Napsin A fand sich ferner in den Granula
der Clara-Zellen kolokalisiert mit proSP-B. In der BAL ließ sich ein Intermediärprodukt des proSP-B
nachweisen, welches von den Clara-Zellen in den Bronchioli sezerniert wird.
Schlußfolgerungen: Zusammenfassend zeigen die erzielten Ergebnisse, daß sich die untersuchten
lysosomalen Proteasen in ihrer zellulären Verteilung in der humanen Lunge unterscheiden und aufgrund ihrer
Lokalisation nur Kathepsin H und Napsin A als Kandidaten für die Prozessierung des Surfactant Proteins B in
Typ-II-Pneumozyten in Frage kommen. In den Clara-Zellen ist nur Napsin A ein Kandidat, der in die
Prozessierung des Surfactant Proteins B involviert ist, wobei sich aus den Untersuchungen indirekt Hinweise
ergaben, daß das proSP-B nur bis zu einem 25 kDa schweren Intermediärprodukt prozessiert wird, das von
den Clara-Zellen sezerniert wird und in der BAL nachweisbar ist. Diese unvollständige Prozessierung des
proSP-B in Clara-Zellen ist möglicherweise durch das Fehlen von Kathepsin H in diesen Zellen bedingt. Die
Untersuchungsergebnisse zeigen, daß auch lysosomale Zystein- und Asparaginproteasen partiell in den
komplexen Vorgang der Prozessierung von Surfactant Proteinen eingebunden sind.