Modulares konfokales Laserscanning- System

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Imaging System
Modulares konfokales LaserscanningSystem eröffnet neue Möglichkeiten
HAUKE KAHL
GESCHÄFTSBEREICH MIKROSKOPIE, OLYMPUS DEUTSCHL AND GMBH, HAMBURG
Die modernen Life Science-Wissenschaften entwickeln sich mit rasantem
Tempo. Daher ist es ein Muss für heutige wissenschaftliche Instrumente,
dass sie gegenwärtigen und zukünftigen Anforderungen gewachsen sind.
Dieser Anspruch gilt umso mehr für die Mikroskopie, wo regelmäßig neuartige Bildgebungsverfahren entwickelt werden, die sich rasch als Routinemethoden etablieren und so den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn
enorm beschleunigen.
ó Um den vielfältigen Anforderungen und
Möglichkeiten gerecht zu werden, hat Olympus seine Forschungsmikroskope nach dem
Vorbild einer optischen Bank konzipiert, welche die Integration einer Vielzahl unterschiedlicher Module ermöglicht. Ein solcher
Ansatz erlaubt die kompromisslose Realisierung des richtigen Mikroskops für die jeweilige kundenspezifische Anwendung. Bestes
Beispiel für dieses richtungweisende modulare Konzept ist das Olympus FluoView
FV1000. Dieses innovative konfokale Laserscanning-Mikroskop kann mit einer Reihe
fortschrittlicher Module ausgestattet werden
kann. So ermöglicht der SIM-Scanner – ein
voll integrierter zweiter Laser-Scanner – die
unabhängige Photomanipulation bei gleichzeitiger Bildaufnahme. Das TIRF-Modul dage-
˚ Abb. 1: Konfokale Fluoreszenzaufnahmen von Kaede-exprimierenden HeLa-Zellen. Die Bildserie wurde in 3 Sek.-Intervallen erstellt und zeigt die Umwandlung des grünen Kaede mit einem 405 nm Laser
in die photokonvertierte rote Form, die sich zunehmend in der Zelle ausbreitet. Laser des Hauptscanners: 488 nm/543 nm Objektiv: UPlanApo60Xoil. Mit freundlicher Genehmigung: Ryoko Ando und Dr.
Atsushi Miyawaki, RIKEN, Brain Science Institute Laboratory for Cell Function Dynamics.
gen erlaubt die evaneszente Beleuchtung der
Probe durch die mit dem konfokalen System
installierten Laser. Weitere optionale Komponenten, wie das laserbasierte Z-Drift-Kompensationssystem und ein CO2-Inkubator mit
Temperaturkontrolle, gestatten Langzeitaufnahmen lebender Zellen, was die experimentellen Einsatzmöglichkeiten des FV1000
abermals erweitert.
Fluoreszente Revolution
Die vergangenen zehn Jahre erlebten einen
Paradigmenwechsel in der Fluoreszenzmikroskopie. Zunächst exotisch anmutende
Techniken wie FRET (Förster-/Fluorescence
Resonance Energy Transfer), FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) und FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
entwickelten sich zum alltäglichen Standard.
Die beiden letztgenannten Methoden erfordern das selektive Bleichen fluoreszenter
Marker in definierten Zielregionen einer Zelle, um die Bewegungen membrangebundener
oder intrazellulär lokalisierter Moleküle zu
verfolgen.
Bei der FLIP-Methode wird die Zielregion
während des Experiments kontinuierlich
gebleicht und aus der langsamen Abnahme
der Fluoreszenzintensität in den umgebenden Arealen wird auf die Bewegung der fluoreszenten Moleküle rückgeschlossen. FRAP
hingegen bedeutet, dass die Zielregion während eines festen Zeitintervalls gebleicht wird,
um anschließend den Anstieg der Fluoreszenzintensität zu messen, der die Bewegung
ungebleichter Moleküle aus der Umgebung
in die Zielregion anzeigt. Bei herkömmlichen
konfokalen Laserscanning-Mikroskopen werden das Bleichen der Zielregion und das Scannen des Bildes von demselben Laser-Scanner
übernommen, wodurch eine signifikante Verzögerung zwischen Probenmanipulation und
Messung der Fluoreszenzintensität entsteht.
Aus diesem Grund werden sehr schnelle aber
möglicherweise bedeutsame Prozesse leicht
verpasst. Dank der Ausstattung des FV1000
mit dem SIM-Scanner-Modul kann die Fotomanipulation bei gleichzeitiger BilddatenBIOspektrum | 01.07 | 13. Jahrgang
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Fluoreszenzintensität bei FLIP und FRAP
nicht entgehen.
Die Nützlichkeit der SIM-Scanner-Technologie erweist sich aber auch bei der Verwendung neuartiger fluoreszenter Moleküle, den
„optischen Leuchtmarkern“ (optical highlighters). Diese teils natürlich vorkommenden, teils rekombinant veränderten Proteine
zeichnen sich durch die Besonderheit aus,
dass sich Ihre Absorptions- und Emissionseigenschaften durch gezielte Bestrahlung mit
Licht bestimmter Wellenlängen manipulieren lassen. Das fotoaktivierbare Grün-fluoreszierende-Protein (PA-GFP) beispielsweise
muss erst durch 405 nm Lichtpulse aktiviert
werden, bevor die Fluoreszenz dauerhaft bei
488 nm angeregt werden kann. Das Emissionsmaximum liegt dann bei 517 nm. PA-GFP
lässt sich zur gezielten Markierung einzelner Zellen, Organellen oder Proteine innerhalb größerer Ansammlungen verwenden,
um sie bei Langzeitaufnahmen verfolgen zu
können. Ein weiteres fluoreszentes Markerprotein namens Dronpa zeichnet sich durch
die vorteilhafte Eigenschaft aus, dass seine
Fluoreszenz durch einen starken 488 nm
Laserpuls abgeschaltet werden kann. Anders
als beim Bleichen ist dieser Vorgang aber
reversibel, denn durch einen schwachen
405 nm Laserpuls lässt sich die Fluoreszenz
reaktivieren. Die Möglichkeit ein Fluoreszenzsignal an- und abzuschalten und damit
wiederholte Fotoaktivierungsexperimente an
derselben Zelle durchzuführen, zeigt Proteindiffusionsvorgänge in einem neuen Licht
und der Informationsgewinn ist enorm.
Das gilt auch für andere Fotomanipulationsanwendungen. Kaede beispielsweise ist
ein rekombinant hergestelltes fluoreszentes
Protein aus Trachyphylla geoffroyi, welches
grünes Licht emittiert. Wird dieses Protein
jedoch violetter oder ultravioletter Strahlung
ausgesetzt, verändert sich das Emissionsspektrum und das Molekül emittiert langwelligeres Rot. Dieser Farbwechsel von Grün
zu Rot gleicht dem eines herbstlichen Ahornbaums, weshalb das Protein nach dem japanischen Wort „Kaede“ für Ahorn benannt
wurde. Illuminiert man eine Kaede-exprimierende Zelle punktuell mit violettem/ultraviolettem Licht, so lässt sich beobachten wie
sich das rötliche Kaede-Protein durch Diffusion in der gesamten Zelle ausbreitet; eine
elegante und einfache Methode, um ausgesuchte Zellen zu markieren. In ähnlicher
Weise können die Pulse eines 405 nm Lasers
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A
B
˚ Abb. 2: A, PA-GFP-markierte HeLa-Zelle, 488 nm Anregung, Aufnahme: 1 Bild pro Sekunde, Fotostimulation: periodische 405 nm Laserstimulation. B, Einführung des fluoreszenten Kalziumindikators
‚Calcium Green’ in HeLa-Zellen. Mit inaktiviertem (caged) ATP versetzte Zellen, wurden punktuell mit
Pulsen eines 405 nm Lasers bestrahlt, um das ATP freizusetzen (un-cage). Der ATP-Stimulus bewirkt
einen lokalen Anstieg der Ca2+-Konzentration in der Zelle. Mit freundlicher Genehmigung: Dr. Takeharu
Nagai, Dr. Takayuki Miyauchi, Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN Brain Science Institute Laboratory for Cell
Function Dynamics.
¯ Abb. 3: Fluoreszente Mehrfachmarkierung
der Fokalen Adhäsionskinase (FAK, grüne Fluoreszenz) und des f-Actin im Zytoskelett (rote
Fluoreszenz). Im Gegensatz zur konventionellen Epifluoreszenzbeleuchtung (oben) des
f-Aktin-Skeletts emöglicht die TIRF-Mikroskopie (Mitte) eine wesentlich kontrastreichere
Abbildung, da hier Aktinfasern, die tiefer im
Zellinneren liegen, nicht zur Fluoreszenz angeregt werden. TIRF-mikroskopische Aufzeichnung der Verteilung der FAK-Proteinmoleküle
und Überlagerung mit dem TIRF-mikroskopischen Bild des f-Aktin-Zellskeletts zeigt, dass
die Aktinfasern zwischen den FAK enthaltenden Haftstrukturen aufgespannt sind (unten).
Mit freundlicher Genehmigung: Götz Pilarczyk,
Uta Joos, Till Biskup, Oliver Ernst, Ines Westphal, Fraunhofer Institut für Biomedizinische
Technik, Invalidenstraße 42, D-10115 Berlin.
dazu benutzt werden, um beispielsweise ATP
zu aktivieren (un-cage), das zuvor in modifizierter, inaktiver Form vorlag (caged). Die
genannten Anwendungen können unter
Zuhilfenahme des SIM-Scanners durchgeführt
werden, während der Hauptscanner die zu
beobachtenden Veränderungen bildlich festhält.
Objektiv-basiertes TIRFM
Die Stärke der TIRFM-Technik (Totale-interne-Reflektions-Fluoreszenzmikroskopie)
besteht in einer herausragenden Z-Auflösung,
weshalb sie sich zur Erforschung des gesamten Spektrums von Ereignissen an der Zelloberfläche besonders eignet. Dazu zählen
unter anderem Zellinteraktionen, Zelladhäsion sowie Endo- und Exocytose. TIRFM
beruht auf einer gänzlich anderen Art der
Beleuchtung, als die zuvor besprochene konfokale Laserscanning-Mikroskopie. Mit dem
TIRFM-Modul des FV1000 wird das Laserlicht
auf den äußersten Randbereich der hinteren
Fokusebene eines brechungsstarken Objektivs gerichtet (Numerische Apertur, NA =
1,45). Dieser spezielle Strahlenverlauf führt
dazu, dass das aus dem Objektiv austretende
Licht in einem derart flachen Winkel auf die
Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe
trifft, dass es total reflektiert wird. Während
das einfallende Licht also nicht in die Probe
übertritt, reicht dennoch das von ihm ausstrahlende elektrische Feld bis in die Probe
hinein. Die Intensität dieses evaneszenten
Feldes nimmt mit zunehmendem Abstand von
der Grenzfläche exponentiell ab. Aus diesem
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Grund werden nur diejenigen fluoreszenten Moleküle angeregt, die sich in
einem Abstand von wenigen Hundert
Nanometern zur Deckglasoberfläche
befinden, was eine enorme Verbesserung der Auflösung in Z-Richtung zur
Folge hat. Die tatsächliche Schichtdicke, innerhalb der eine effektive fluoreszente Anregung erfolgt, hängt von
der Wellenlänge des verwendeten
Laserlichts und von dessen Einfallswinkel beim Auftreffen auf die
Grenzfläche ab. Dieser Einfallswinkel lässt sich beim FV1000-TIRFMModul einstellen. Die optimale Eindringtiefe des evaneszenten Feldes
kann somit den Gegebenheiten der Probe angepasst werden. Die minimal
erreichbare Schichtdicke mit evaneszenter Anregung beträgt etwa 50 nm.
Diese physikalischen Grenzbereiche
werden mit dem Ölimmersionsobjektiv APO100xOHR von Olympus erreicht, dass eine NA von 1,65 vorweisen kann.
Durch Integration des TIRFMModuls in das FV1000-Gesamtsystem
können alle installierten Laserwellenlängen sowohl für das konfokale Laserscanning als auch für TIRFM genutzt
werden. Präzise optische (= konfokale)
Schnitte in mehreren spektralen Kanälen sind damit ebenso möglich, wie die
TIRFM-Darstellung von Zelloberflächen
mit hoher Z-Auflösung. Zur reibungslosen Bilddatenaufnahme ist das
FV1000 mit einem voll synchronisierten CCD-basierten Cell^M/^R Imaging
System bestückt. Damit lassen sich Protokolle, wie sequenzielle multi-spektrale Aufnahmen oder TIRFM-Bildfolgen mit variabler Eindringtiefe des evaneszenten Feldes auf einfachste Weise
vom Nutzer programmieren.
dul entwickelt. Dieses Modul nutzt eine
785 nm Laserdiode, um Abweichungen
von der Fokusebene in Z-Richtung zu
detektieren. Der Laser misst in regelmäßigen Abständen die Entfernung zu
einer Referenzebene mit fester Relation zur Probe, üblicherweise zur Deckglasoberfläche. Zu Beginn der Aufnahmesequenz wird die Probe fokussiert
und die mit dem Kompensationsmodul
gemessene Entfernung zur Referenzebene als Sollwert definiert. In einem
Regelkreis mit negativer Rückkopplung
wird nun vor jeder Bildaufnahme die
aktuelle Entfernung überprüft und
gegebenenfalls an den Sollwert angeglichen. Damit ist sichergestellt, dass
alle Bilder in derselben Fokusebene
aufgenommen werden. Ein Vorteil, der
sich schon bei Zeitrafferaufnahmen mit
kurzen Intervallen (10 min) aber
besonders bei solchen mit langen Intervallen (Stunden bis Tage) bezahlt
macht.
ó
Korrespondenzadresse:
OLYMPUS DEUTSCHLAND GMBH
Geschäftsbereich Mikroskopie
Dr. Hauke Kahl
Vertriebsleiter Laser-Scanning-Mikroskopie
Tel.: 040-237730
Fax: 040-230817
[email protected]
www.olympus.de
Im Fokus bleiben
Für die Aufnahme von Zeitraffersequenzen ist es unabdingbar, die Proben konstant in der gewünschten
Fokusebene zu halten. Unglücklicherweise führen vielerlei Faktoren zu
Abweichungen von der exakten Fokusposition. Temperaturschwankungen
können beispielsweise eine thermische
Drift der Mechanik eines Mikroskops
auslösen. Um einer solchen Z-Drift entgegenzuwirken, hat Olympus für das
FV1000 ein neues KompensationsmoBIOspektrum | 01.07 | 13. Jahrgang