Praktikum Stoffwechselphysiologie

Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
Universität Ulm
Praktikum Stoffwechselphysiologie
WS 2011/2012
Versuch Blut/ Hämolymphe
Gruppe XY
Betreuer:
Praktikanten:
Versuchstag:
1
Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................................................ 4
1.1 Theoretischer Hintergrund ............................................................................................................ 4
1.1 Blut ............................................................................................................................................ 4
1.2 Hämoglobine ............................................................................................................................. 4
1.3 O2- und CO2-Transport im Blut ................................................................................................. 5
1.4 Blutgruppen ............................................................................................................................... 6
1.5 Immunsystem ............................................................................................................................ 6
1.6 Lambert-Beer-Gesetz ................................................................................................................ 8
1.7 Hämolymphe ............................................................................................................................. 8
1.8 Insektenentwicklung .................................................................................................................. 8
1.9 Hormone .................................................................................................................................... 8
1.10 Chromatographie ................................................................................................................... 10
2. Material und Methoden ..................................................................................................................... 10
2.1 Material ....................................................................................................................................... 10
2.1.1 Geräte ................................................................................................................................... 10
2.1.2 Reagenzien ........................................................................................................................... 10
2.2 Methoden ..................................................................................................................................... 11
2.2.1 Blutgruppenbestimmung ...................................................................................................... 11
2.2.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut ..................................................................... 11
2.2.3 Humaner Blutausstrich......................................................................................................... 12
2.3 Theoretische Versuche zum Thema Hämolymphe ...................................................................... 12
2.3.1 Fraßhemmung / Alles- oder Nichts-Prinzip.......................................................................... 12
2.3.2 HPLC-Trennung und Fraktionierung ................................................................................... 12
3. Ergebnisse ......................................................................................................................................... 13
3.1 Blut .............................................................................................................................................. 13
3.1.1 Blutgruppenbestimmung ...................................................................................................... 13
3.1.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut ...................................................................... 14
3.1.3 Humaner Blutausstrich ......................................................................................................... 15
3.2 Hämolymphe ............................................................................................................................... 15
3.2.1 Fraßhemmung/Alles-oder-Nichts-Prinzip ............................................................................ 15
3.2.2 HPLC-Trennung (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und Fraktionierung ..................... 15
4. Diskussion ......................................................................................................................................... 16
4.1 Blut .............................................................................................................................................. 16
4.1.1 Blutgruppenbestimmung ...................................................................................................... 16
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
4.1.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut ...................................................................... 17
4.1.3 Humaner Blutausstrich ......................................................................................................... 17
3.2 Hämolymphe ............................................................................................................................... 18
3.2.1 Fraßhemmung/Alles-oder-Nichts-Prinzip ............................................................................ 18
3.2.2 HPLC-Trennung (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und Fraktionierung ..................... 18
5. Quellen .............................................................................................................................................. 19
3
Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
1. Einleitung
1.1 Theoretischer Hintergrund
1.1 Blut
Das Blutvolumen des Menschen beträgt etwa 4-6
4 l und macht 7-88 % der Körpermasse aus.
Das Volumen variiert jedoch mit den Körpermaßen. Generell wird das Blut in den flüssigen
Anteil, das Blutplasma, und den zellulären Anteil unterschieden. Das Blutplasma besteht
b
vorwiegend aus Wasser, Ionen und Proteinen. Das Blutserum ist das Blutplasma abzüglich
der Gerinnungsfaktoren. Der zelluläre Anteil besteht vorwiegend aus Erythrozyten,
Erythroz
Leukozyten und Thrombozyten.
yten.
Erythrozyten, oder auch rote Blutkörperchen, sind zahlenmäßig mit 5-66 Mio Zellen/ µl die
häufigsten Zellen im Blut. Sie besitzen einen Durchmesser von ca. 7,5 µm, eine Lebensdauer
von 120 Tagen und dienen hauptsächlich dem O2- und CO2-Transport.
Transport. Erythrozyten besitzen
keinen Zellkern, keine Ribosomem und auch
auch keine Mitochondrien. Die Energie wird über
Glykolyse und nachfolgende Milchsäuregärung gewonnen. Ihre Bildung kann durch
Erythropoetin (EPO) angeregt werden.
Leukozyten, oder weiße Blutkörperchen, haben einen Durchmesser von ca. 10-17
10
µm,
kommen zahlenmäßig 5000-10000
10000 Zellen/ µl vor und dienen der Abwehr. Sie werden im
roten Knochenmark gebildet.
Thrombozyten, auch Blutplättchen genannt, haben einen Durchmesser von 1-3
1 µm und dienen
der Blutstillung. Sie besitzen ebenfalls keinen Zellkern und auch keine
keine DNA. Gebildet
werden diese aus Megakaryozyten im Knochenmark.
Funktionen des Blutes sind der O2- und CO2-Transport,
Transport, Nährstofftransport, Exkrettransport,
Hormontransport, Ionenhaushalt und pH-Wert,
pH Wert, Wärmeregulation und Abwehrfunktion.
1.2 Hämoglobine
Hämoglobin ist ein Protein aus 4 Untereinheiten, jeweils 2 homologe α- und 2 ββ
Untereinheiten. Jede Untereinheit enthält als prosthetische Gruppe das Häm.
Abb. 1 Struktur des Häm
http://de.wikipedia.org/wiki/H%C3%A4moglobin 30.01.2012
4
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Blut / Hämolymphe
In Abb. 1 ist die Strukturformel des Häms gezeigt. Dieses besteht aus Protoporphyrin IX und
einem komplexierten Eisen-(II)-Ion. Im Hämoglobin wird das Eisenion von von einem
Histidinrest stabilisiert. An der freien Koordinationsstelle kann nun Sauerstoff oder auch ein
anderes Molekül (z.B. CO) binden. Dieses wird dann ebenfalls durch einen Histidinrest
stabilisiert.
Hämoglobin mit koordiniertem Sauerstoff bezeichnet man als Oxyhämoglobin, ohne
Sauerstoff als Desoxyhämoglobin. Methämoglobin besitzt anstatt eines Fe-(II)-Ions ein Fe(III)-Ion welches keine Sauerstoffaffinität besitzt. Bei Methämoglobincyanid ist zusätzlich ein
Cyanidion irreversibel am Eisenion koordiniert. Unter Carboxyhämoglobin versteht man ein
Hämoglobin mit koordiniertem CO, der 300 mal stärker an das Eisenion bindet als Sauerstoff.
Myoglobin, welches vor allem als Sauerstoffspeicher in den Muskeln zu finden ist, besteht im
Unterschied zu Hämoglobin aus nur einer Untereinheit.
Andere respiratorische Proteine wären Hämerythrin, Chlorocruorin und Hämocyanin.
Hämerythrin kommt vor allem bei den Wirbellosen vor und ist im oxygenierten Zustand
violett. Zentralatom ist das Fe(II)-Ion. Chlorocruorin ist grün, besitzt eine Häm-Gruppe wie
Hämoglobin und ist bei Ringelwürmern zu finden. Hämocyanin besitzt Cu2+ als Zentralatom,
ist farblos und bei Gliederfüßern zu finden.
1.3 O2- und CO2-Transport im Blut
Abb. 2 Sauerstoffbindungskurve
http://de.wikipedia.org/wiki/Sauerstoffs%C3%A4ttigung 30.01.2012
In Abb. 2 ist die Sauerstoffbindungskurve des Hämoglobins gezeigt. Der sigmoide
Kurvenverlauf ist deutlich zu erkennen. Dieser entsteht durch die kooperative Bindung von
Sauerstoff, d.h. dass eine Bindung von O2 an eine Untereinheit die Bindung eines weiteren O2
an eine andere Untereinheit des Hämoglobins vereinfacht. Das gleiche gilt für das loslösen
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
von Sauerstoff. Unter der R-Form versteht man die Konformation mit höherer
Sauerstoffaffinität, unter der T-Form die mit geringerer.
Unter dem Bohr-Effekt versteht man das Phänomen, dass CO2 und H+ die Affinität des
Hämoglobins für Sauerstoff erniedrigen und somit bei gebundenem Sauerstoff dessen
Loslösung hervorrufen. Dies kommt dadurch zustande, da CO2 und H+ durch bei Bindung an
Hämoglobin ionische Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten erlauben, die die TForm begünstigen. 2,3-diphospho-Glycerat hat begünstigt ebenfalls die T-Form durch
ionische Wechselwirkungen und erniedrigt somit die Sauerstoffaffinität.
Der Root-Effekt ist vor allem bei Fischen auszumachen, ähnelt dem Bohr-Effekt, nur das
beim Root-Effekt Hämoglobin bei niedrigen pH-Werten so gut wie kein Sauerstoff mehr
aufnehmen kann. Dies ist Voraussetzung um die Schwimmblase auch bei sehr hohen O2Partialdrücken noch befüllen zu können.
Der CO2-Transport erfolgt im Blut hauptsächlich über drei Wege. 70% werden als
Bicarbonat, 23 % als an eine freie Aminogruppe gebundenes CO2 und 7 % als gelöstes CO2
transportiert. Die Umwandlung von CO2 in Bicarbonat erfolgt in den Erythrozyten über die
Carboanhydrase. Beim CO2-Transport ist vor allem der Haldane-Effekt von Bedeutung.
Dieser Beschreibt das Auftreten einer zunehmenden H+-Affinität bei Sauerstoffabgabe. Es
wird somit H+ dem Gleichgewicht zwischen CO2 und der Kohlensäure verschoben, was eine
Gleichgewichtsverschiebung zu Gunsten von Kohlensäure und somit zu einer zunehmenden
CO2-Transportkapazität führt.
1.4 Blutgruppen
Unter den verschiedenen Blutgruppen sind vor allem die Zwei von Karl Landsteiner
entdeckten wichtig. Diese wären das AB0- und das Rhesus-System.
Beim AB0-System werden 2 Klassen von Antigenen auf der Oberfläche der Erythrozyten
unterschieden, die durch verschiedene Glykosidierungen entstehen. Blutgruppe 0 besitzt kein
Antigen. Die Antikörper für die jeweiligen sind jeweils schon zu Beginn vorhanden, werden
also nicht als Antwort auf Antigene gebildet. Universeller Spender ist die Blutgruppe 0,
universeller Akzeptor die Blutgruppe AB.
Das Rhesussystem bezieht sich hier nur auf ein Protein auf der Oberfläche der Erythrozyten,
welches als Antigen wirkt. Der Großsteil der Menschen ist Rhesus+, besitzt als das Antigen.
Die Antikörper werden als Antwort auf ein körperfremdes Protein auf den Erythrozyten
gebildet. Dies ist vor allem bei Schwangerschaft von Rh--Frauen von Gefahr, da diese bei
vormaliger Schwangerschaft mit einem Rh+ Kind Antikörper wegen möglicher
Blutvermischungen gegen das Protein gebildet haben könnten. Diese könnten bei abermaliger
Schwangerschaft mit einem Rh+ Kind dessen Erythrozyten anhand des vorhandenen Antigens
erkennen und für eine Agglutination sorgen.
1.5 Immunsystem
Beim Immunsystem wird zwischen einem unspezifischem und einem spezifischen
unterschieden. Außerdem zwischen einem Humoralen und Zellulären.
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
Das unspezifische Immunsystem ist sehr schnell, unterscheidet jedoch nicht spezifisch
zwischen den Angreifern. Man unterscheidet
unterscheidet einer erste und zweite Verteidigungslinie. Bei
der ersten wird versucht, die Mikroorganismen und Fremdstoffen am Eindringen in den
Körper zu hindern. Dies geschieht vor allem durch mechanischen Schutz durch Haut und
Schleimhäute oder auch Säureschranken.
reschranken. Bei der zweiten Verteidigungslinie werden vor
allem Phagozyten, natürliche Killerzellen und das Komlpementsytem aktiv, die die
Eindringlinge entfernen müssen, sollten diese bereits eingedrungen sein.
Die spezifische Abwehr ist Antigen-Antikörper
Antigen
abhängig und langsamer als die
Unspezifische, besitzt jedoch ein Gedächtnis. Die Unterscheidung zwischen Humoralen und
Zellulärem ist hier besonders wichtig. Die Humorale beruht vor allem auf den Antikörpern,
die von den B-Lymphozyten
Lymphozyten gebildet werden. Antikörper bestehen aus 2 schweren und 2
leichten Ketten. Der variable Teil ist für die Antigenerkennung erforderlich und befindet sich
an dem oberen Teil von leichten und schweren Ketten.
Abb. 3 Antikörper
http://de.wikipedia.org/wiki/Antik%C3%B6rper 30.01.2012
In Abb. 1 ist ein Beispiel gezeigt. Es gibt verschiedene Antikörper, auch Immunglobuline
genannt. Am verbreitetsten ist IgG mit einem Anteil von 75 % an den Antikörpern. Es handelt
sich um ein Monomer und kommt bei der Bakterienabwehr zu Anwendung.
Anwendung. IgE, ebenfalls
Monomer, dient der Parasitenabwehr. Beispiel für ein Dimer wäre IgA, ein Pentamer wäre
IgM, dieses ist das erste im Blut auftretende Immunglobulin. Antikörper sorgen für eine
Pathogenabwehr in dem sie Antigene erkennen und diese dann durch
durch Bindung für den Abbau
markieren oder auch für eine Agglutination sorgen und die Pathogene damit unschädlich
machen.
An der zellulären spezifischen Immunantwort sind vor allem die cytotoxischen T-Zellen
T
beteiligt. Diese T-Lymphozyten
Lymphozyten beseitigen die jeweiligen
jeweiligen Pathogene, indem sie bei diesen
Apoptose hervorrufen.
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
1.6 Lambert-Beer-Gesetz
Das Lambert-Beer-Gesetz erlaubt die Konzentrationsbestimmung einer Substanz mit
monochromatischem Licht durch Bestimmung der Extinktion in Vergleich zu einem
Leerwert. Es ist in Formel (1) dargestellt.
= × × (1)
E: Extinktion; ε: substanzspezifischer Extinktionskoeffizient; c: Konzentration; d=
Küvettendicke
1.7 Hämolymphe
Die Hämolymphe ist bei einigen Tieren als Ersatz von Blut und Lymphe zu finden. Sie tritt
bei Tieren mit offenem Kreislaufsystem auf und umfließt die Organe. Die Funktion ist ähnlich
zu dem Blut (Abwehr, versch. Transportmechanismen), besitzt jedoch eine andere
Zusammensetzung, es finden sich z.B. keine Erythrozyten. Der Sauerstofftransport wird von
Hämocyanin übernommen.
1.8 Insektenentwicklung
Es wird zwischen einer hemimetabolen und holometabolen Insektenentwicklung
unterschieden. Bei der holometabolen erfolgt die Entwicklung im Gegensatz zu
hemimetabolen über ein Puppenstadium. Sie durchlaufen eine vollständige Metamorphose
über das Puppenstadium, ein Beispielorganismus wäre der Schmetterling. Die verschiedenen
Phasen der Metamorphose werden über Hormone gesteuert. Wichtige Hormone sind hier
Bursicon, Ecdyson, Eclosionshormon, Juvenilhormon und PTTH. Bursicon spielt bei der
Flügelentwicklung eine wichtige Rolle, Ecdyson bei der Häutung. Die physiologisch aktive
Form von Ecdyson ist das β-Ecdyson. Die Vorstufe, α-Ecdyson, enthält eine Hydroxylgruppe
weniger. Das Eclosionshormon hat ebenso eine wichtige Funktion bei der Häutung. Es
induziert das Ausschlüpfen nach der Häutung. Das Juvenilhormon reguliert die Ausprägung
der Larvenmerkmale. PTTH, auch prothorakotropes Hormon genannt, steuert die Sekretion
von Ecdyson und damit Wachstum und Häutung.
1.9 Hormone
Hormone sich chemische Botenstoffe eines Organismus, welche Informationen zwischen
verschiedenen Zellen übermitteln. Der Bildungsort entspricht nicht dem Wirkort, transportiert
werden sie über das Blut. Im Gegensatz zu Neurotransmittern lösen sie länger andauernde
Veränderungen aus, wirken über große Abstände und werden nicht so schnell wieder
abgebaut.
Hormone werden in verschiedene Substanzklassen eingeteilt. Dazu gehören Peptidhormone,
Aminosäurederivate, Steroide, Isoprenoide und die Eicosanoide.
Peptidhormone sind Proteine, deren Zweck hauptsächlich die Informationsübertagung ist. Ein
bekanntes Peptidhormon ist das Insulin. Aminosäurederivate leiten sich von diversen
Aminosäuren ab, z.B. ist Adrenalin ein Derivat des Tyrosins. Weiter Beispiele hierfür wären
Noradrenalin und Dopamin. Hormone, die sich von Steroiden ableiten, besitzen das
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Blut / Hämolymphe
Grundgerüst des Sterans. Es ist in Abb. 4 gezeigt. Ein Beispiel für ein Steroidhormon ist das
Östrogen, ein weibliches Sexualhormon.
Abb. 4 Sterangrundgerüst
http://de.wikipedia.org/wiki/Steran 31.01.2012
Die Klasse der Isoprenoide sind Derivate des Isoprens (2-Methylbuta-1,3-dien).
(2
dien). Die
Strukturformel des Isoprens ist in Abb. 5 gezeigt. Wichtige Vertreter der Isoprenoide sind die
Terpene und die Steroide.
Abb. 5 Strukturformel Isopren
http://de.wikipedia.org/wiki/Isopren 31.01.2012
Die Eicosanoide sind hydrophobe Hormone, welche Produkte des Stoffwechsels ungesättigter
Fettsäuren sind, die aus 20 Kohlenstoffatomen bestehen. Es werden drei Serien der
Eicosanoide unterschieden, je nach dem Stoff aus dem sie gebildet werden. Am bekanntesten
ist hier die Serie 3 aus Arachnidonsäure.
Hormone die auf intrazelluläre Rezeptoren wirken sind vor allem fettlösliche Stoffe. Diese
können frei durch die Zellmembran in die Zelle gelangen und dort auf Rezeptoren wirken.
Wichtigste Vertreter der fettlöslichen Proteine sind die Steroide. Wasserlösliche Stoffe
können hingegen nicht frei durch die Zellmembran diffundieren und müssen deshalb an
membrangebundene Rezeptoren binden. Im Zellinnern löst dieser dann eine Signalkaskade
aus. Am verbreitetsten ist G-Protein
Protein-vermittelte Signaltransduktion. Dabei ist der Rezeptor
mit einem heterotrimeren G-Protein
Protein gekoppelt. Durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem
Rezeptor und G-Protein
Protein tauscht dieses GDP gegen GTP aus, welches eine Dissoziation der αα
Untereinheit von den βγ-Untereinheiten
Untereinheiten bewirkt. Die Untereinheiten können nun diverse
Signalkaskaden starten. Zum Beispiel die Aktivierung einer Adenylcyclase, welche aus ATP
AT
cAMP synthetisiert. cAMP fungiert dann als second messenger, ebenso bekannte „second
messenger“ sind Ca2+-Ionen
Ionen oder IP3.
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Blut / Hämolymphe
1.10 Chromatographie
Unter Chromatographie versteht man physikalische Methoden, mit Hilfe derer man die
Auftrennung verschiedener Stoffgemische bewerkstelligt. Das Prinzip bei der
Chromatographie ist das Nutzen einer mobilen und einer stationären Phase. Je nach Verfahren
macht man sich unterschiedliche Wechselwirkungen der Moleküle untereinander, bzw. mit
dem Lösungsmittel oder einer festen Phase zu Nutze, um die Moleküle aufzutrennen.
Getrennt wird nach vor allem nach folgenden Eigenschaften: Löslichkeit, Ladung, Größe,
Affinität, Gestalt, Polarität bzw. Hydrophobizität und Adsorptionsverhalten.
Die wohl am weitesten verbreitete Methode ist die Dünnschichtchromatographie. Hierbei
wird das Stoffgemisch mit einem normalerweise unpolaren Laufmittel (mobile Phase)
gemischt und dann an einer festen Phase (z.B. SiO2) (stationäre Phase) aufgetrennt. Hier
spielen vor allem die Polarität der Substanz und ihr Adsorptionsverhalten gegenüber der
stationären Phase eine große Rolle.
Weitere Arten der Chromatografie sind die Ionenaustauschchromatografie, bei der man
anhand der Ladung trennt, die Gelfiltrationschromatographie, hier wird nach der
Molekülgröße aufgetrennt, und die Affinitätschromatographie, bei der die Affinität
bestimmter Moleküle ausgenutzt wird.
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte
−
−
−
−
−
−
−
−
Tüpfelplatte
Sechs Reagenzgläser
Sechs Einmalküvetten
Photometer
Mikroskop
Objektträger mit Blutausstrich
Pipetten (2-20 µl; 100-1000µl)
Reagenzglasständer
2.1.2 Reagenzien
−
−
−
−
−
Sechs Blutproben vom Menschen
Antikörperlösung gegen Antigen der Blutgruppe A (Anti A)
Antikörperlösung gegen Antigen der Blutgruppe B (Anti B)
Antikörperlösung gegen Antigen D des Rhesus positives Blut (Anti D)
Reaktionslösung zum Messen des Hämoglobingehalts
enthält: Kaliumcyanid, Kaliumhexacyanoferrat (III) und Puffer für pH 7,2
10
Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
2.2 Methoden
Während dem Arbeiten mit menschlichem Blut sind wegen der Gefahr einer
Ansteckung die ganze Zeit über Handschuhe zu tragen!
2.2.1 Blutgruppenbestimmung
Hierbei wurden zunächst in die Vertiefungen der Tüpfelplatte, die, wie in Tabelle 1
dargestellt, aufgeteilt war, mit Hilfe einer Pipette 20 µl der jeweiligen Blutprobe in die dafür
vorgesehene Vertiefung gegeben (eine Spalte für jede Blutprobe). Danach gab man in jede
Aussparung einer Zeile die entsprechende Antikörperlösung, also in die Zeile, die mit A
beschriftet war, die Anti A-Lösung, in die Zeile mit B die Anti B-Lösung und in die Zeile mit
D gab man in jede Vertiefung einen Tropfen der Anti D Lösung. Danach verrührte man die
Antikörperlösungen mit den Blutproben (hierzu wurde eine Pipettenspitze verwendet). War
dies erledigt, ließ man die Tüpfelplatte wenige Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nun
musste man noch einmal umrühren, um besser erkennen zu können, welche Proben mit
welchen Antiseren agglutiniert haben, also wo sich ein Niederschlag gebildet hat, oder nicht.
Es musste danach notiert werden, welche Probe mit welchem Antikörper zu einer
Verklumpung des Blutes geführt hat.
Tabelle 1: Aufteilung der Tüpfelplatte
1
2
3
4
A
B
C
2.2.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut
Bei diesem Versuchsteil musste das Hämoglobin der jeweiligen Blutproben erst in eine
farbstabile Form überführt werden, damit man mit Hilfe eines Photometers die Extinktion der
Probe messen konnte, damit ein Rückschluss auf die Konzentration des Hämoglobins im Blut
möglich war. Die stabile Form, die sich nicht während des Versuches ändern kann, ist die des
Methämoglobincyanids. Man überführt das Oxy- bzw. Desoxy-Hämoglobin in das
Methämoglobincyanid, in dem man es mit Kaliumhexacanoferrat (III) und dann schließlich
mit Kaliumcyanid reagieren lässt. Bei dieser Reaktion reagiert das zweiwertige Eisenion des
Hämoglobins zum dreiwertigen Eisenion, indem es einen Komplex mit dem
Kaliumhexacanyoferrat bildet (K3[Fe(CN)6]). Dieser Komplex zerfällt dann wieder, sodass
das Hämoglobin mit dem Fe3+-Ion mit dem Kaliumcyanid das Methämoglobincyanid bilden
kann. Hierbei besetzt das Stickstoffatom des Cyanids die Bindungsstelle am Eisen-Ion.
Die eben beschriebene Reaktion wurde in Gang gesetzt, indem man in jedes der sechs
Reagenzgläser 5 ml der Reaktionslösung pipettierte (Achtung: Kaliumcyanid ist giftig!!,
weshalb auch die Reaktionslösung giftig ist!!) und dazu die jeweilige Blutprobe gab. Die
Probe und die Reagenzlösung waren mit Hilfe einer Pipette gut zu durchmischen. Danach
mussten die Reaktionsansätze mehrere Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach
dieser Inkubationszeit wurde jeweils 1 ml der Flüssigkeit aus dem jeweiligen Reagenzglas in
eine Einmalküvette gefüllt. Als Referenz wurde 1 ml der Reaktionslösung ebenfalls in eine
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
Küvette gegeben und mit dieser der Nullabgleich am Photometer bei einer Wellenlänge von
546 nm gemacht. Danach maß man die Extinktionen der Lösungen der Blutproben. Damit
genauere Ergebnisse erzielt werden konnten, wurde eine Zweifachbestimmung für jede
Blutprobe durchgeführt und die jeweiligen Extinktionswert notiert.
Da Kaliumcyanid giftig ist und Kaliumhexacyanoferrat (III) umweltschädlich ist, mussten die
Lösungen in einem extra Behälter entsorgt werden.
2.2.3 Humaner Blutausstrich
Bei diesem Versuchsteil wurden bereit vorgefertigte Dauerpräparate eines menschlichen
Blutausstriches unter einem Lichtmikroskop betrachtet. Die verwendet maximale
Vergrößerung war eine vierzig-fache Vergrößerung. Zuerst mussten die Blutzellen gefunden
werden, in dem man den Objektträger unter dem Objektiv solange verschob, bis ein rosa
Schimmer auftrat. Danach konnte man die Blutzellen mit Hilfe des Feintriebs am Mikroskop
scharfstellen.
Die verschiedenen Blutzelltypen, Leukozyten und Erythrozyten, die unter dem Mikroskop
sichtbar wurden, waren zu unterscheiden und zu zeichnen.
2.3 Theoretische Versuche zum Thema Hämolymphe
2.3.1 Fraßhemmung / Alles- oder Nichts-Prinzip
Der Strandkrabbe Carcinus meanas wurden 60 µl-Pellets mit unterschiedlichen
Konzentrationen an α- oder β-Ecdyson gefüttert und beobachtet, welches Futterpellet
gefressen wurde und welches nicht. Denn die Strandkrabbe besitzt spezifische Rezeptoren in
ihrem Mund, die die Konzentration an Ecdyson wahrnehmen kann. Denn Ecdyson kann bei
der Strandkrabbe nach überschreiten einer Grenzkonzentration eine Häutung hervorrufen,
deshalb frisst die Krabbe nur das Futter, welches eine Konzentration an Ecdyson enthält, die
geringer als die Grenzkonzentration ist. Das Fressen des Futters bei der Strandkrabbe verläuft
also nach dem Alles- oder Nicht-Prinzip, entweder frisst sie das Pellet oder eben nicht. Um
sicher zu gehen, dass die Krabbe, das Futter nicht einfach nur nicht frisst, weil sie zum
Beispiel krank ist, wurde in diesem Fall immer eine Negativprobe, also Futter ohne Ecdyson,
verabreicht.
Das Futter der Strandkrabbe hatte die in Tabelle 2 dargestellten Konzentrationen. Es ist zu
beachten, dass ein Futterpellet entweder α- oder β-Ecdyson enthielt.
Tabelle 2: Konzentrationen cn an α- bzw. β-Ecdyson in den Futterpellets der Strandkrabbe
α-Ecdyson
β-Ecdyson
c1 [nmol]
21,6
21,6
c2 [nmol]
10,8
10,8
c3 [nmol]
5,4
5,4
c4 [nmol]
2,7
2,7
c5 [nmol]
1,35
-
c6 [nmol]
0,675
-
2.3.2 HPLC-Trennung und Fraktionierung
Bei diesem Versuchsteil verwendete man eine RPC18-Adsorptionssäule für die
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Adsorptionssäule stellt die unpolare
Phase dar. Auf diese wird ein Gemisch aus zweimal so viel β-Ecdyson wie α-Ecdyson
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
gemeinsam mit 60 µl 40 %-igem Methanol gegeben, wobei das Methanol die polare Phase
und die zwei verschiedenen Ecdyson-Derivate (das β-Ecdyson besitzt ein Hydroxy-Gruppe
mehr als das α-Ecdyson und ist deshalb polarer) das aufzutrennende Stoffgemisch darstellen.
Nach der Auftragung des Gemisches wird die Adsorptionssäule an eine Saugpumpe
angeschlossen, die das Stoffgemisch durch die Säule zieht. Nach den ersten 20 Minuten, die
die Chromatographie gelaufen ist, sind die beiden Ecdyson-Derivate aufgetrennt worden.
Daraufhin folgte ein elf-minütiger Reinigungsschritt mit 100 %-igem Methanol. Zum Schluss
musste die Adsorptionssäule wieder kalibriert werden, was mit 40 %-igem Methanol geschah.
Am anderen Ende der Adsorptionssäule befindet sich ein Detektor, der die aufgetrennten
Fraktionen misst und als Peak darstellt.
An die Chromatographie wurde eine Extinktionsbestimmung des α- und des β-Ecdyson mit
Hilfe eines Photometers durchgeführt, damit die Konzentration des jeweiligen Stoffes
bestimmt werden
3. Ergebnisse
3.1 Blut
3.1.1 Blutgruppenbestimmung
Tabelle 1 zeigt schematisch die Anordnung der Blutproben auf der verwendeten Tüpfelplatte.
In den Spalten sind jeweils die verschiedenen Blutproben, in den Zeilen befinden sich je die
benutzten Antiseren Anti-A, Anti-B und Anti-D.
Tabelle 1: Schema der Tüpfelplatte
1
2
3
4
5
A
X
X
X
X
X
B
X
C
X
X
X
X
X
6
X
Ein X in der Tabelle zeigt an, dass die Probe agglutinierte.
Somit ergeben sich anhand der Reaktionen folgende, in Tabelle 2 aufgelisteten, Blutgruppen
für die sechs verschiedenen Proben.
Tabelle 2: Blutgruppen der Blutproben
Blutgruppe
1
2
3
4
5
6
AB, rh+
A, rh+
A, rh+
A, rh+
A, rh+
0, rh+
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
3.1.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut
Die in einer photometrischen Doppelbestimmung erhaltenen Extinktionswerte der Blutproben
bei einer Wellenlänge von 546 nm sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Extinktionen der Blutproben bei 546 nm
Probe
Extinktion E 1
Extinktion E 2
Mittelwert
1
0,600
0,714
0,657
2
0,507
0,518
0,513
3
0,688
0,731
0,710
4
0,629
0,691
0,660
5
0,624
0,632
0,628
6
0,520
0,594
0,557
Die Hämoglobinkonzentrationen werden nun mit folgender, aus dem Lambert-Beer’schen
Gesetz umgewandelten, Formel bestimmt:
=
∙
Hierbei bezeichnet ε = 44 * 106 cm2/mol den Extinktionskoeffizienten und d = 1 cm die
Schichtdicke der Küvette.
Da die Blutproben um den Faktor 251 verdünnt wurden, muss man noch mit dem
Verdünnungsfaktor multiplizieren.
Multipliziert man das Ergebnis zusätzlich mit der molaren Masse des Hämoglobins von MW
= 64500 g/mol, so erhält man die in Tabelle 4 gezeigten Konzentrationen.
Tabelle 4: Hämoglobinkonzentrationen der Blutproben
Probe
Hämoglobinkonzentration [g/ml]
1
0,242
2
0,189
3
0,261
4
0,243
5
0,231
6
0,205
14
Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
3.1.3 Humaner Blutausstrich
Die aus den histologischen Dauerpräparaten menschlicher Blutausstriche identifizierten und
gezeichneten Blutzellen sind an das Protokoll angehängt.
Die große Mehrzahl der beobachteten Zellen war farblos mit einer leicht grauen Schattierung,
die zur Mitte hin in weiß überging. Einige wenige Zellen besaßen violett angefärbte
Kompartimente, die untereinander verbunden waren.
3.2 Hämolymphe
3.2.1 Fraßhemmung/Alles-oder-Nichts-Prinzip
In den Tabellen 5 und 6 sind die Reaktionen der Krabben auf mit α- bzw. β-Ecdyson
versetztes Futter aufgelistet.
Tabelle 5: Fressverhalten bei α-Ecdyson
c1
c2
c3
c4
c5
c6
verweigert
verweigert
verweigert
verweigert
gefressen
gefressen
Tabelle 6: Fressverhalten bei β-Ecdyson
c1
c2
c3
c4
verweigert
verweigert
gefressen
gefressen
Nach dem Verweigern wurde jeweils die Negativkontrolle gefressen.
3.2.2 HPLC-Trennung (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und Fraktionierung
Das Ergebnis der HPLC ist in Abbildung 1 zu sehen.
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
Abbildung 1: Chromatogramm der HPLC
Tabelle 7 zeigt die Werte für die Konzentrationsbestimmung von α- und β-Ecdyson, inklusive
der photometrisch gemessenen Extinktionen.
Tabelle 7: Werte zur Konzentrationsbestimmung
α-Ecdyson
β-Ecdyson
Absmax
242 nm
Absmax
240 nm
Emax
0,736
Emax
1,562
log ε
4,093
log ε
4,103
4. Diskussion
4.1 Blut
4.1.1 Blutgruppenbestimmung
Die Blutgruppenbestimmung aus sechs Blutproben ergab viermal die Blutgruppe A, einmal
die Blutgruppe AB und einmal die Blutgruppe 0. Alle Blutproben waren rhesuspositiv.
Etwas verwunderlich ist hierbei, dass die Blutgruppe 0 nur einmal auftaucht, also deren
Häufigkeit nur 16,7 % beträgt. Laut Wikipedia beträgt die Häufigkeit für Blutgruppe 0 in
Deutschland 41 %. Blutgruppe A kommt viermal vor, also zu 66,7 %. Dies liegt angesichts
nur sechs überprüfter Blutgruppen im Rahmen des deutschlandweiten Wertes von 43 %. Der
Rang der häufigsten Blutgruppe konnte für die Gruppe A in unserem Versuch bestätigt
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Erstabgabe
Blut / Hämolymphe
werden. Auch dass Blutgruppe AB nur einmal auftaucht, sowie Blutgruppe B gar nicht, passt
zu den deutschlandweiten Häufigkeiten.
Keine der untersuchten Blutproben war rhesusnegativ, auch dies entspricht der
deutschlandweiten Häufigkeit von rhesuspositivem Blut von 85 %.
Zum Erhalt von aussagekräftigeren Daten hätten weit mehr Blutproben untersucht werden
müssen.
4.1.2 Bestimmung des Hämoglobingehalts im Blut
Laut Wikipedia beträgt die Hämoglobinkonzentration einer erwachsenen Frau 7,5 - 9,9
mmol/l und die eines erwachsenen Mannes 8,7 – 11,2 mmol/l. Die höchste von uns
gemessene Hämoglobinkonzentration befand sich in Blutprobe 3 und entsprach etwa 4,05
mmol/l. Diese Konzentration ist nur ungefähr halb so hoch, wie sie laut Literatur sein sollte.
Ein Grund hierfür könnte sein, dass die Blutproben nicht mehr ganz frisch waren und damit
schon Teile des Hämoglobins abgebaut waren.
Hauptgrund dürfte jedoch die Methode der Hämoglobindetektierung mit dem Photometer
sein. Hierfür musste das native Hämoglobin zuerst mithilfe von Kaliumcyanid und
Kaliumhexacyanoferrat
in
stabiles
Cyan-Methämoglobin
umgewandelt
werden.
Möglicherweise wurde diese Reaktion zu kurz oder bei zu niedriger Temperatur inkubiert, so
dass nicht das ganze Hämoglobin umgesetzt wurde. Dadurch könnte zu detektierendes
Hämoglobin
verloren
gegangen
sein,
was
zu
einer
zu
niedrigen
erhaltenen
Hämoglobinkonzentration führte.
Vorteilhaft an der spektralphotometrischen Methode ist jedoch die Vermeidung der direkten
Messung von nativem Hämoglobin, da dieses in verdünnten Lösungen, wie wir sie
verwendeten, relativ unbeständig ist. Außerdem würde sich durch spontane O2-Beladung
dessen Extinktion verändern. Dies ist bei Cyan-Methämoglobin nicht möglich.
4.1.3 Humaner Blutausstrich
Die wenigen angefärbten Zellen waren Leukozyten. Da Leukozyten einen Zellkern besitzen
war es möglich ihr Erbgut anzufärben, welches dann unter dem Mikroskop violett erschien.
Die vielen farblosen Zellen wurden als Erythrozyten identifiziert. Sie waren ungefärbt, da sie
keinen Zellkern mehr besitzen und deshalb auch keine DNA, die gefärbt werden könnte.
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Blut / Hämolymphe
3.2 Hämolymphe
3.2.1 Fraßhemmung/Alles-oder-Nichts-Prinzip
Die Stoffmengenkonzentrationen von α-Ecdyson sind in Tabelle 8 aufgeführt, jene von βEcdyson in Tabelle 9.
Tabelle 8: Stoffmengenkonzentrationen von α-Ecdyson in den Futterpellets
c1 [mmol/l]
c2 [mmol/l]
0,36
0,18
c3 [mmol/l]
c4 [mmol/l]
0,09
0,045
c5 [mmol/l]
c6 [mmol/l]
0,0225
0,01125
Tabelle 9: Stoffmengenkonzentrationen von β-Ecdyson in den Futterpellets
c1 [mmol/l]
0,36
c2 [mmol/l]
c3 [mmol/l]
0,18
0,09
c4 [mmol/l]
0,045
Die Grenzkonzentrationen liegen für α-Ecdyson zwischen 0,045 und 0,0225 mmol/l und für
β-Ecdyson zwischen 0,18 und 0,09 mmol/l.
3.2.2 HPLC-Trennung (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und Fraktionierung
Peak 1 aus Abbildung 1 stellt das β-Ecdyson dar, Peak 2 das α-Ecdyson. Das α-Ecdyson ist
aufgrund einer fehlenden OH-Gruppe unpolarer als das β-Ecdyson, es bleibt also an der
unpolaren stationären Phase stärker haften und taucht deshalb im Chromatogramm später auf.
Der dritte Peak stammt von dem anschließenden Reinigungsdurchgang mit 100 %igem
Methanol.
Mithilfe des Lambert-Beer’schen Gesetzes
=
∙
und den Werten aus Tabelle 7 lassen sich die Ecdysonkonzentrationen bestimmen:
cα-Ecdyson = 0,180 mol/ml
cβ-Ecdyson = 0,381 mol/ml
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Blut / Hämolymphe
5. Quellen
http://de.wikipedia.org/wiki/Blutgruppen
http://de.wikipedia.org/wiki/H%C3%A4moglobin
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