Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum Skriptum

Kleines hämatologisches
und immunologisches
Praktikum
für die Mittelstufe
Skriptum
© Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum
für Gesundheit und Umwelt
Skriptversion: 17.06.2008
Kleines hämatologisches und immunologisches Praktikum
Als „Saft des Lebens“ wurde das Blut früher auch bezeichnet und mit der Seele
gleichgesetzt. Auf welchen biologischen Tatsachen beruht aber der mystisch verklärte Ruf
des Blutes?
Ziel der Versuche in diesem großen, hämatologischen Praktikum ist es, den Schülerinnen
und Schülern die Zusammensetzung, die Funktionen und die Leistungsfähigkeit des
Blutes zu vermitteln und auf gesundheitsrelevante Bezüge wie Doping und Rauchen
aufmerksam zu machen. Über die Bestimmung der Immunzellen führt die Diskussion
direkt zur Geißel des 20. und 21. Jahrhunderts, der Krankheit AIDS.
Experimente
1.
2.
3.
4.
5.
Blutausstrich
Osmotische Erythrozytenresistenz
Hämatokritwertbestimmung
Sauerstoffminderung durch CO
Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern (oder
Antigenen)
Kleines Hämatologisches Praktikum
1 – Blutausstrich
1 - Der Blutausstrich
A) Blutausstrich anfertigen
Der Blutausstrich dient ungefärbt zur mikroskopischen Untersuchung auf Parasiten. Gefärbt
ermöglicht der Blutausstrich Gestalt und Aussehen der Leukozyten (der Begriff Leukozyt kommt
aus dem griechischen: leukos = weiss; kytos = Zelle; Synonym: Weißes Blutkörperchen) gut
sichtbar zu machen und sie den verschiedenen Gruppen zuzuordnen. Parallel dazu betrachtet
man auch die Erythrozyten (der Begriff Erythrozyt kommt aus dem griechischen: erythros = rot;
kytos = Zelle; Synonym: Rotes Blutkörperchen) und beurteilt sie nach Größe, Form und Farbe.
Diese Basisuntersuchung des Blutes wird als kleines Blutbild bezeichnet.
Eine weitere sehr wichtige Untersuchung des Blutes ist das Differentialblutbild. Mit dem
Differentialblutbild wird das Mengenverhältnis der verschiedenen Leukozyten ermittelt. Auf diese
Weise lassen sich z.B. die Ursache und die Schwere von Infektionen annäherungsweise
bestimmen.
Material:
entfettete und staubfreie Objektträger, Glasstab, Folienstift zum Beschriften der Ausstriche, EDTA-Blut, Alkohol
Versuchsablauf
Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1.
Legen Sie zwei Objektträger in einer Linie ausgerichtet
nebeneinander
Unbedingt die Objektträger mit Alkohol
reinigen!
2.
Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des
Blutröhrchens und geben Sie dann mit dem Glasstab einen
kleinen Bluttropfen auf das äußere Drittel eines Objektträgers
Den Glasstab dazu schräg an den
Objektträger heranführen!
3.
Platzieren Sie die schmale Kante des zweiten Objektträgers vor
den Blutstropfen auf den liegenden Objektträger
4.
Ziehen Sie den Objektträger langsam auf den Blutstropfen und
warten Sie, bis sich das Blut entlang der Glaskante verteilt hat
5.
Stoßen Sie das Blut mit Hilfe des Objektträgers in einem Winkel
von etwa 30° langsam über den liegenden Objektträger
6.
Beschriften Sie sofort den Ausstrich am unteren Rand, um
Verwechslungen vorzubeugen
7.
Der Blutausstrich wird anschließend zum Trocknen ausgelegt
Kontrollieren Sie die Qualität des Ausstrichs
durch Betrachten im Gegenlicht (vergleiche
unten!)
Die Trocknung des Ausstrichs lässt sich
durch kurzes Wedeln beschleunigen
Qualität von Blutausstrichen
(1)
Zu dünn und zu lang
(2)
Richtig!!
(3)
Zu kurz (zu kleiner Blutstropfen?)
(4)
Zu dick
3
Kleines Hämatologisches Praktikum
1 – Blutausstrich
Anleitung zur Anfertigung des Blutausstrichs
Bluttropfen
Objektträger zur Aufnahme
des Bluttropfens
Mit dem Objektträger
vorsichtig an den
Bluttropfen andocken
Bluttropfen
Ausstrichrichtung
Bluttropfen
(im Winkel verlaufen)
4
Kleines Hämatologisches Praktikum
1 – Blutausstrich
Der Blutausstrich
B) Blutausstrich färben
Ein wichtiger Bestandteil der täglichen Laborarbeit ist das Färben biologischer Präparate. In der
Hämatologie hat sich die May-Grünwald-Giemsa-Färbung (Synonym: Pappenheim-Färbung oder
panoptische Färbung) als Standardfärbung etabliert. Das Wesen der Pappenheim-Färbung ist
durch eine Farbsalzbildung basischer Farbstoffbestandteile mit sauren Zelleiweißanteilen bzw.
sauren Farbstoffkomponenten mit basisch reagierenden Zellsubstanzen zu erklären.
Mit dieser Färbemethode ist es möglich, Blutzellen so anzufärben, dass alle geformten
Blutbestandteile eines getrockneten Blutausstrichs unterscheidbar werden. Der Vorteil der
Pappenheim-Färbung liegt in der sehr feinen morphologischen Differenzierung der Zellen, was
ein hohes Maß an diagnostischer Sicherheit gewährleistet.
Material:
gut getrockneter Blutausstrich, Schnellfärbeset bestehend aus Fixierlösung, zwei Färbelösungen und einem
Becherglas mit Pufferlösung, Fliesspapier zum Trocknen der gefärbten Ausstriche, Mikroskop
Versuchsablauf
Bemerkungen
1.
Tauchen Sie den getrockneten Blutausstriche 5mal je eine
Sekunde in die Fixierlösung (Reagenz 1). Lassen Sie die
überschüssige Fixierlösung auf dem Fließpapier ablaufen.
Durch den in dieser Lösung vorhandenen
Methylalkohol (giftig!) werden die Zellen
fixiert.
2.
Tauchen Sie den Objektträger 3mal je eine Sekunde in
Färbelösung 1 (Reagenz 2). Lassen Sie die überschüssige
Färbelösung 1 auf dem Fließpapier ablaufen.
3.
Tauchen Sie den Objektträger nun 6mal je eine Sekunde in
Färbelösung 2 (Reagenz 3). Lassen Sie die überschüssige
Färbelösung 2 auf dem Fließpapier ablaufen.
Standardisierte
und
pH-eingestellte
Färbelösungen mit Methylenblau (färbt saure
Zellbestandteile blau), Methyl-Azur (färbt
basische Zellbestandteile rot-violett) und
Eosin (färbt basische Zellbestandteile
orange-rot), wobei der pH-Wert der Lösung
für das färberische Verhalten ausschlaggebend ist. Da alle Zellbestandteile gefärbt
werden,
wird
diese
Färbung
auch
panoptisch genannt.
4.
Geben Sie zum Abschluss den Objektträger für 45 Sekunden
in das Becherglas mit der Pufferlösung.
5.
Legen Sie den Objektträger zum Trocknen mit der Schichtseite
nach oben auf das Fliesspapier. Die Auswertung erfolgt
anschließend mit dem Mikroskop.
Auswaschen der überschüssigen
Färbelösungen
Auswertung von Blutausstrichen:
•
•
•
Die Auszählung der weißen Blutkörperchen erfolgt mikroskopisch mit 400 facher Vergrößerung
In der Praxis werden 100 Zellen ausgezählt (mäanderförmig durchmustern, siehe Bild unten!) und als
Ergebnis erhält man den Prozent-Anteil der einzelnen Gruppen der weißen Blutzellen.
Führe diese Prozedur durch und notiere deine Ergebnisse!
5
Kleines Hämatologisches Praktikum
1 – Blutausstrich
Färbeanleitung
5 x 1 sec
Reagenz 1
3 x 1 sec
Reagenz 2
6 x 1 sec
Reagenz 3
45 sec
Pufferlösung
pH 7,2
6
Kleines Hämatologisches Praktikum
1 – Blutausstrich
Aufgabe zum Blutausstrich
Versuchen Sie mit Hilfe der ausgelegten Folie („Die Leukozyten“) mindestens drei verschiedene Formen der weißen Blutzellen zu unterscheiden und skizzieren Sie
diese.
A
B
C
7
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1 – Blutausstrich
8
Kleines Hämatologisches Praktikum
2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz
2 - Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz
Eine ausreichende Zeitspanne vorausgesetzt, wird so gut wie jedes Molekül durch eine
Plasmamembran
in
Richtung
seines
Konzentrationsgradienten
diffundieren.
Die
Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, variiert jedoch enorm, in Abhängigkeit von der Größe
des Moleküls, hauptsächlich aber von seiner relativen Löslichkeit in Öl (d.h. je hydrophober
oder unpolarer es ist). So sind Plasmamembranen für Wasser 109-mal durchlässiger als selbst
für solch kleine Ionen wie Na+ und K+.
Da die Plasmamembran für Wasser schwach durchlässig ist, fließt dies entsprechend seinem
Konzentrationsgradienten langsam in die Zelle ein oder aus der Zelle heraus. Dieser Prozess
wird als Osmose bezeichnet. Wird die Solutkonzentration im äußeren Milieu (hypotonische
Lösung) erniedrigt, bedingt dies eine Gesamtbewegung von Wasser in die Zelle (die Zelle
schwillt!). Umgekehrt führt eine hypertonische Lösung zum Austritt von Wasser aus der Zelle (die
Zelle schrumpft!). Viele Säugetierzellen enthalten außerdem besondere Wasserkanäle in ihrer
Plasmamembran, die Aquaporine, die den osmotischen Wasserfluss erleichtern.
In Abhängigkeit von einer sich ändernden Osmolarität der extrazellulären Flüssigkeit können
solche Änderungen des Wasserflusses mikroskopisch sehr gut an Erythrozyten beobachtet
werden. Wie lange ein Erythrozyt einem Wassereinstrom standhält, bevor er schließlich platzt
(osmotische Hämolyse), ist Ausdruck seiner physiologischen Funktionsfähigkeit und damit von
großem diagnostischen Interesse, denn es gibt Krankheiten, bei denen die osmotische
Widerstandskraft der Erythrozyten erhöht ist und solche, bei denen sie vermindert ist. Besonders
um die letzteren zu erkennen, misst man die osmotische Erythrozytenresistenz.
Material:
Reagenzgläser, Reagenzglasständer, weißer Papierstreifen, Tropfpipette,
NaCl-Konzentrationsreihe von 0,2 - 0,9%, EDTA-Blut
Versuchsablauf
Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1.
Beschriften Sie zunächst 8 Reagenzgläser entsprechend der NaClKonzentrationsreihe von 0,2 – 0,9% und befüllen diese dann mit
jeweils 3 ml der vorbereiteten NaCl-Lösungen.
2.
Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens
und
geben
Sie
dann
mit
der
Tropfpipette
je
2 Tropfen Blut in die Reagenzgläser.
3.
Röhrchen gut schütteln und bei Zimmertemperatur 10 min stehen
lassen.
4.
Danach Zentrifugation der Reagenzgläser für 5 min bei 1370 U/min
(entspricht 280 g).
Wird von der Kursassistenz
durchgeführt!
5.
Direkt nach der Zentrifugation
Reagenzgläsern Hämolyse auftritt.
Um eine evtl. auftretende Trübung
besser beurteilen zu können, empfiehlt
es sich hinter die aufgereihten
Reagenzgläser einen weißen
Papierstreifen zu halten
feststellen,
in
welchen
Auswertung:
•
Man sucht das Röhrchen, in dem die Salzlösung nicht mehr ganz farblos sondern schon leicht rötlich ist. Das ist
die Konzentration, bei der die ersten Erythrozyten zerplatzt sind. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre
das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.46% der Fall).
•
Dann sucht man das Röhrchen, in dem überhaupt keine Erythrozyten mehr am Boden des Röhrchens sind. In
diesem Röhrchen sind offenbar alle Zellen zerplatzt. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei
einer NaCl-Konzentration von 0.3% der Fall).
•
Für normale menschliche Erythrozyten wird der Referenzbereich für diese Methode daher mit 0.30 und 0.46
angegeben.
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2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz
Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz
Beispiel für die Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz:
Die Erythrozyten des Patienten wurden in ca. 20 Röhrchen mit ansteigender NaCl-konzentration gegeben,
von fast reinem Wasser bis zu der Kochsalzkonzentration, die für rote Blutkörperchen ideal ist (0,9%ige
NaCl-Lösung*). Die Reagenzgläser wurden für 24h stehen gelassen und dann visuell ausgewertet. Der
Übersichtlichkeit halber sind nur 4 Röhrchen dargestellt.
Erhöhung der Erythrozytenresistenz
Bei einigen Krankheiten setzt die komplette Auflösung der Erythrozyten erst später als bei
0.30%, eventuell erst bei NaCl-Konzentrationen um 0.06% ein. Dazu zählen z.B. die:
•
•
•
•
•
Thalassämie (Erbkrankheit)
Sichelzellen-Anämie (Erbkrankheit)
Eisenmangel-Anämie
Leberschäden
Gelbsucht durch Gallenabflussbehinderung
Eine Erhöhung der Erythrozytenresistenz ist keine große Hilfe für die Diagnose, denn für
die damit assoziierten Krankheiten gibt es heute weit bessere Diagnosemöglichkeiten.
Verminderung der Erythrozytenresistenz
Bei einigen Krankheiten beginnt die Auflösung der Erythrozyten bereits bei Konzentrationen von
0.7%, die vollständige Auflösung der Erythrozyten bereits bei 0.4%. Dazu zählen z.B.:
•
•
Kugelzellen-Anämie (Erbkrankheit)
andere hämolytische Anämien
Da es für die Kugelzellen-Anämie nicht viele diagnostische Möglichkeiten gibt, hat die
Messung der osmotischen Erythrozytenresistenz hier noch ihre Berechtigung.
* Eine Lösung von 0,9% Kochsalz in Wasser entspricht 154 mMol pro Liter. Die Lösung wird
auch als „physiologische Kochsalzlösung“ oder „plasma-isotonische“ Lösung bezeichnet.
Physiologisch oder plasma-isotonisch bedeutet, dass der osmotische Druck der Kochsalzlösung
dem des Blutplasmas entspricht. Physiologische Kochsalzlösungen werden in der Medizin
eingesetzt, um kurzfristig den Verlust eines größeren Blutvolumens auszugleichen und zudem
recht häufig als Trägerlösung für die Infusion von Medikamenten verwendet.
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Kleines Hämatologisches Praktikum
2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz
Aufgabe zur Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz
Überlegen Sie sich, wie die Form der Erythrozyten in hypotonischer und hypertonischer NaCl-Lösung aussieht und stellen Sie dies zusammen mit der
Bewegung der H2O-Moleküle durch die Zellmembran zeichnerisch dar.
hypotonisch
isotonisch
hypertonisch
H2O
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2 – Osmotische Erythrozytenresiszenz
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3 – Hämatokritwertbestimmung
3 - Hämatokritwertbestimmung
Was ist der Hämatokrit-Wert?
Der Hämatokrit-Wert (der Begriff Hämatokrit kommt aus dem griechischen: haima = Blut und
krinein= trennen, absondern) bezeichnet den Anteil der zellulären Bestandteile am
Gesamtvolumen des Blutes und gibt Auskunft über die Fließeigenschaften des Blutes.
Wie wird der Hämatokrit-Wert gemessen?
Bestimmt wird der Hämatokrit-Wert, indem man eine ungerinnbar gemachte Blutprobe in einem
Mikro-Hämatokritröhrchen zentrifugiert. Die schwereren Erythrozyten setzen sich dabei ab. Die
so gebildete rote Blutsäule wird gemessen und als prozentuales Verhältnis der Gesamtblutsäule
angegeben. Den Anteil der Leukozyten (ca. 1%) an den zellulären Bestandteilen des Blutes kann
man dabei vernachlässigen. Der Hämatokrit ist sowohl von der Anzahl als auch vom Volumen
der Erythrozyten abhängig.
Material:
entfettete und staubfreie Objektträger, Tropfpipette, Mikro-Hämatokritröhrchen, Zentrifuge, EDTABlut
Versuchsablauf
Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1.
2.
3.
4.
Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des
Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette 2 große
Bluttropfen auf einen Objektträger
Das Hämatokrit-Röhrchen waagrecht, mit der nicht markierten
Seite an den Blutstropfen heranführen und durch
Kapillarwirkung zu ca. ¾ füllen
Zentrifugation der so vorbereiteten Kapillaren für 15 min bei 9
000 U/min (entspricht 7 700 g)
Direkt nach der Zentrifugation mit Hilfe der Schablone die
verschiedenen Fraktionen ausmessen
Keine Luftblasen einsaugen!
Wird von der Kursassistenz durchgeführt!
Auswertung:
•
Die ausgemessenen Fraktionen in
%-Anteile umrechnen
•
Den %-Anteil der festen Bestandteile berechnen
Plasmasäule
Leukozyten
Erythrozyten
Plastikmasse
REFERENZWERTE
BEREICH
Männer
40-54 %
Frauen
37-47 %
Auf dem Notebook finden Sie ein Lernmodul mit Fragen und Hintergrundwissen zum Hämatokrit!
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3 – Hämatokritwertbestimmung
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Kleines Hämatologisches Praktikum
4 – Sauerstoffminderung durch CO
4 - Sauerstoffaufnahmeminderung durch Kohlenstoffmonooxid
Erythrozyten bestehen zu etwa 34% aus dem roten Blutfarbstoff Hämoglobin (der Begriff
Hämoglobin kommt aus dem griechischen: haima = Blut und globus =Kugel, wobei mit Globinen
kugelartige Eiweißstoffe gemeint sind), der große Bedeutung für den O2 und CO2-Transport und
die Pufferfunktion des Blutes hat. Das Molekül setzt sich aus 4 Polypedtidketten mit je einer
Farbstoffkomponente (Häm) zusammen, die zentral ein zweiwertiges Eisenatom trägt.
Die rote Farbe des Hämoglobins und damit auch des Blutes ist dadurch bedingt, dass
kurzwelliges Licht (blau) relativ stark, langwelliges Licht (rot) von Hämoglobin kaum absorbiert
wir. Durch Anlagerung von O2 und CO2 verändert sich das Hb-Molekül, und damit sein
charakteristisches Absorptionsspektrum, was sich photometrisch quantifizieren lässt, aber auch
mit dem bloßen Auge als Farbänderung zu beobachten ist. Der reversibel an das Hämoglobin
gebundene O2 führt zu einer hellroten Färbung, wohingegen desoxygeniertes Hämoglobin
dunkelrot erscheint. Etwa 10% der aus dem Gewebe aufgenommenen CO2-Menge bindet sich
an die Aminogruppe der Proteinkomponente des Hämoglobins, wodurch das Blut eine bläulichdunkelrote Farbe annimmt.
Aufgrund der größeren Affinität des giftigen Kohlenmonoxids (CO) zu Hämoglobin wird O2 aus
der Bindung mit Hämoglobin verdrängt. Es entsteht das kirschrot aussehende CO-Hämoglobin.
Der weitere O2-Transport wird dabei blockiert wird. Hierin liegt die Giftigkeit des farb- und
geruchlosen CO-Gases begründet.
Material:
2 Stative mit Muffen und Klammern, 2 Messzylinder (50 mL), 3 Gaswaschflaschen, Schläuche, Pipette, 2
Bechergläser, Tiegelzange, Oxalatblut, Alkohol, Zigarette
Versuchsablauf
Bemerkungen
Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!
1.
Die Gaswaschflasche mit ca. 50 ml Oxalatblut füllen.
2.
Geben Sie eine Pipette voll Alkohol in die Waschflasche und
stopfen Sie anschließend Watte in den Verschluss.
3.
Die Gaswaschflasche mit Hilfe eines Stativ fixieren, über die
Schlauchverbindung an die Wasserstrahlpumpe anschließen
und dann Luft langsam perlend durch das Blut in der
Waschflasche leiten. BEOBACHTUNG?!
4.
Anschließend wird im zweiten Versuch die CO2-Zuleitung am
linken, oberen Hahn geöffnet und das Gas langsam perlend
durch das Blut geleitet.
5.
Folgend werden gesamten Schwelgase einer Zigarette durch
das Blut in der Waschflasche hindurch gesaugt. Der Rauch
soll durch den Filter der Zigarette und durch eine weitere,
wasserbefüllte Waschflasche geleitet werden, um den Teer
vom Blut weitgehend fern zu halten.
6.
Nach Veränderungen des Blutes können die Waschflaschen
gegeneinander ausgetauscht werden, um die Reversibilität
des Vorgangs zu verdeutlichen.
Durch Zugabe von Alkohol wird die
Oberflächenspannung des Blutes und damit die
Schaumbildung unterdrückt
Vor Inbetriebnahme den jeweiligen Aufbau
unbedingt von einem Betreuer kontrollieren
lassen!
Jeweils die ungeöffneten Waschflaschen bis
zum Ende des Versuchs als Referenz stehen
lassen!
Unter dem Abzug arbeiten! Es darf kein Rauch
in den Laborraum gelangen!
Auswertung
1. Zeigen Sie die Unterschiede der Bindungsfähigkeit der verwendeten Gase im Blut
auf, indem Sie durch andere Reihenfolgen der oben beschriebenen
Versuchsschritte dies nachweisen!
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Kleines Hämatologisches Praktikum
4 – Sauerstoffminderung durch CO
2. Notieren Sie die Beobachtungen und erklären sie die Ursachen für die Veränderungen
des Blutes!
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Kleines Hämatologisches Praktikum
4 – Sauerstoffminderung durch CO
Was macht Rauchen so gefährlich?
Zigarettenrauch ist ein chemischer Cocktail aus ca. 3.500 bis 4.000 verschiedenen Substanzen.
Mehr als 40 Inhaltsstoffe, wie z.B. Teer, Arsen, Benzol und Cadmium, können
Krebserkrankungen verursachen; andere Stoffe, wie z.B. Kohlenmonoxid, sind für ihre Giftigkeit
bekannt.
In der Schwangerschaft wird das heranwachsende Baby über die Nabelschnur mit den
lebensnotwendigen Nährstoffen versorgt. Die schädigenden Bestandteile des Rauchens
erreichen auf diesem Weg das ungeborene Kind. Durch das Rauchen fällt ein beträchtlicher Teil
der mütterlichen Erythrozyten für seine eigentliche Aufgabe als Sauerstoffträger aus. Als Folge
kommt es zur Unterversorgung des Kindes mit Sauerstoff. Konsequenzen für das Ungeborene
wurden bereits ab einem regelmäßigen Konsum von sieben Zigaretten/Tag beobachtet. Eine
starke Reduzierung der Zigarettenmenge ist daher - zumindest während Schwangerschaft und
Stillzeit - unbedingt anzuraten. Am besten für Mutter und Kind wäre jedoch ein vollständiger
Verzicht. Dies betrifft natürlich auch den Partner, weil Passivrauchen dem Ungeborenen ebenso
schadet (denn der Tabakrauch in der Raumluft enthält die gleichen giftigen und Krebs
erregenden Inhaltsstoffe wie der direkt inhalierte Rauch).
Vorteile für das ungeborene Baby
Wenn Schwangere aufhören zu rauchen, tragen sie entscheidend dazu bei, dass:
• das Risiko einer Fehlgeburt vermindert wird
• sich die Gefahr einer Frühgeburt um die Hälfte reduziert
• ihr Baby eine größere Chance hat, normal gewichtig auf die Welt zu kommen
• das Risiko einer Totgeburt um ein Drittel sinkt
Vorteile für den Säugling
Auch wenn das Kind geboren ist, sollte es nicht dem Zigarettenrauch ausgesetzt werden.
Ohne Passivrauchbelastung kann das Risiko für eine Reihe von Krankheiten bei Ihrem
Kind vermieden werden:
• akute Atemwegserkrankungen
• Bronchitis und Lungenentzündungen
• Chronische Mittelohrentzündungen
• Asthmatische Erkrankungen und allergische Reaktionen
• „Plötzlicher Kindstod“
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Versuch 5 – ELISA-Verfahren
Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern
(oder Antigenen)
Der Beitrag der B-Zellen zur Immunabwehr besteht in der Bereitstellung von Antikörpern, die sich in der
flüssigen Phase des Blutes (Plasma) und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gewebe ansammeln und
dort Krankheitserreger oder ihre toxischen Produkte zunächst binden um sie anschließend zu beseitigen
(siehe dazu die Abbildungen und Erklärungen ab Seite 3). In vielen Bereichen nutzen heute
Standardverfahren die Spezifität (Spezifität nennt man die Fähigkeit, das jeweilige Immunogen von
körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden) und die Stabilität der AntigenAntikörper-Bindung. So werden z.B. in der Medizin Antikörper als molekulare Sonden zur Bestimmung
von Hormonspiegeln in Blut und Gewebeflüssigkeiten oder zum Nachweis von zirkulierenden Antikörpern
zur diagnostischen Abklärung von Infektionen (z.B. HIV) eingesetzt. Bei diesen diagnostischen
Testverfahren handelt es in der Regel um ein sog. ELISA-Testsysteme (Enzyme Linked ImmunoSorbent
Assay; enzymgekoppelter Immunadsorptionstest), die leicht zu automatisieren und an internationalen
Standards abgeglichen sind (siehe dazu die schematische Darstellung auf Seite 2).
Im Rahmen des Praktikums soll nur auf die die Grundzüge des ELISA-Verfahrens eingegangen werden.
Eine Abwandlung des hier vorgestellten Testprinzips wird im medizinischen Alltag für die Bestimmung der
erzeugten Antikörper nach Impfungen verwendet. Durch diesen Antikörpernachweis kann direkt auf den
Immunschutz geschlossen bzw. Rückschlüsse für eine eventuelle Impfauffrischung gezogen werden.
Material:
Mikrotiterplatte beschichtet mit den Testproben, Pipette, Lösung mit
enzymgekoppeltem Antikörper, Waschlösung, Substratlösung
Versuchsablauf
Bemerkungen
1.
Pro Testansatz werden 100 µl einer antigenhaltigen Lösung
werden in die Vertiefung der Mikrotiterplatte eingefüllt
Grundsätzlich werden Doppelbestimmungen durchgeführt!
2.
Die so behandelten Mikrotiterplatte werden über Nacht
stehen gelassen
Während dieser Zeit vollzieht sich der
Prozess der Adsorption des Antigens
an die Plastikoberfläche der
Vertiefung. Dieser Vorgang ist rein
physikalischer Natur!
3.
Nicht adsorbiertes Antigen wird durch mehrfaches Waschen
mit antigenfreiem Waschlösung aus der Vertiefung entfernt
Der Prozess der Beschichtung
(Adsorptionsphase) ist damit
abgeschlossen
In diesem Zustand werden Ihnen die Vertiefungen zur „Durchführung des ELISAVerfahrens“ zur Verfügung gestellt!
4.
100 µl einer enzymgekoppelten Antikörperlösung wird in
die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert und der
Ansatz für mindestens 30 min bei Raumtemperatur stehen
gelassen
Während der Inkubationsphase
bindet der Enzym-markierte
Antikörper an sein Antigen
(spezifische Interaktion von
Antigen und Antikörper)
5.
Nach der Inkubation werden die Vertiefungen 5-mal mit
200 µl Waschlösung behandelt
Ungebunden Antikörper werden
durch den Waschvorgang entfernt. In
der Vertiefung verbleibt nur der
gebundene Antikörper.
Wird von der Kursassistenz
durchgeführt!
6.
An den Waschvorgang schließt sich die enzymatische
Nachweisreaktion an. Dazu werden jeweils 100 µl
Substratlösung in die Vertiefungen gefüllt und etwa 5 min
unter Lichtabschluss inkubiert
Enzymatische Nachweisreaktion!
Wird von der Kursassistenz
durchgeführt!
Auswertung:
•
Die Auswertung der Tests und die Besprechung der Ergebnisse erfolgt am Ende des Praktikums.
18
Versuch 5 – ELISA-Verfahren
Grundzüge des enzymgekoppelten Immunadorptionstests (ELISA)
Beschichtung mit
Antigen
Probe 1
(Antigen A)
Zugabe von enzymgekoppelten
Anti-A-Antikörpern
Probe 2
(Antigen B)
Enzym erzeugt farbiges Produkt
aus farblosem Substrat
Auswaschen nicht gebundener
Antikörper
Grundsätzliches:
Die Basis jedes Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) stellen 3 chemischphysikalische Prozesse dar:
A:
Adsorption von Antigen oder Antikörper an eine Festphase (Plastikoberfläche)
B:
spezifische Interaktion (Bindung) von Antigen und Antikörper
C:
enzymatische Nachweisreaktion
Die Kombination dieser drei Prozesse bildet den immunchemischen Nachweis „ELISA“, der
heute eines der häufigsten Verfahren der medizinischen Diagnostik ist. Er findet zudem eine
breite Anwendung in der biologischen Forschung. Dazu trägt insbesondere die extrem
geringe Nachweisgrenze für Antigene bei, die häufig bei wenigen Picogramm (1 pg = 10-12 g)
Antigen liegt. Die gute Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit ist ein weiteres
wesentliches Argument für die Verbreitung des ELISA-Verfahrens.
19
Versuch 5 – ELISA-Verfahren
Die Antikörper-vermittelte Immunität
–
die Anheftung von Bakterien an Körperzellen verhindern
–
bakterielle Toxine neutralisieren
–
Infektionen durch Viren blockieren
20
Versuch 5 – ELISA-Verfahren
Die wichtigsten Eigenschaften einer Antikörperantwort sind die Spezifität, die Menge, die Klasse und die Bindungsstärke der erzeugten
Antikörper. Spezifität nennt man die Fähigkeit, das jeweilige Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu
unterscheiden. So sind Antikörper in der Lage so eng verwandte Proteine wie z.B. menschliches und Schweineinsulin klar voneinander
abzugrenzen. Die Menge ist ein Maß für die Zahl der reagierenden B-Zellen, die Geschwindigkeit der Antikörpersynthese und die Lebensdauer
der Antikörper. Die Zusammensetzung der Klassen einer Antikörperantwort bestimmt deren biologische Funktionen, sowie die Körperregionen,
in denen sie auftritt. Die Bindungsstärke ist von großer Bedeutung, denn je höher sie ist, umso weniger Antikörpermoleküle sind für die
Beseitigung des Krankheitserregers oder seines toxischen Produktes erforderlich.
Schematische Darstellung der Antikörper-Klassen
IgG
IgD
IgE
IgM
IgA
21
Versuch 5 – ELISA-Verfahren
IgG
Die weitaus größte Menge der Antikörper ist mit ungefähr 75 Prozent das Immunglobulin G (IgG). IgG wird bei einer Erstinfektion erst
nach ungefähr drei Wochen gebildet. Tritt dieselbe Infektion aber noch einmal auf, so werden IgG Antikörper sehr schnell und in sehr
großer Menge produziert. Das verhindert in der Regel den erneuten Ausbruch einer Erkrankung. Eine weitere Besonderheit von IgG ist,
dass es bei einer Schwangerschaft die schützende Plazenta durchdringen kann. So wird auch das Kind vor und auch nach der Geburt vor
einer Infektion geschützt. Dieser Schutz hält aber nur etwa ein halbes Jahr an.
IgD
Das Immunglobulin D (IgD) ist im Serum nur in sehr geringen Mengen nachweisbar. Über seine genaue Funktion und Bedeutung ist bisher
nicht sehr viel bekannt. Da es auf der Oberfläche der B-Lymphozyten „sitzt“, spielt es zumindest bei der Aktivierung der B-Zellen eine
wesentliche Rolle.
IgE
Das Immunglobulin E (IgE) ist ebenfalls stark spezialisiert und spielt bei der Abwehr von Wurminfektionen und bei Allergien eine Rolle. IgE
ist üblicherweise nur in winzigen Mengen nachweisbar. Nur rund 0,001 Prozent aller Immunglobuline sind IgE. Trotzdem spielt es bei über
90 Prozent aller allergischen Prozesse eine wichtige Rolle. IgE kann sich leicht an bestimmte Immunzellen (z.B. Mastzellen) ankoppeln.
Diese sind vor allem in der Haut und in den Schleimhäuten zu finden. Kommen Allergene mit dem Zell-gebundenen IgE in Berührung,
bewirkt das eine Veränderung in der Funktion dieser Zellen. Diese Veränderungen führen zur Ausschüttung von Stoffen aus den Zellen, die
in der Folge eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Diese Stoffe werden Mediatoren oder Mittlersubstanzen genannt. Der bekannteste
Mediator ist das Histamin.
IgA
Das Immunglobulin A (IgA) ist spezialisiert auf Abwehr von Antigenen an den Oberflächen der menschlichen Schleimhäute z. B. in Nase,
Rachen und Darm. Ihr Anteil an der gesamten Antikörpermenge beträgt ungefähr 17 Prozent. Häufig werden Krankheitserreger und
Allergene schon durch IgA abgefangen und neutralisiert. Dringen die Erreger aber tiefer ein, kommt es zu einer Immunreaktion. IgA
gelangt in die Milch einer stillenden Mutter, die so ihre Abwehrstoffe auf den Säugling übertragen kann.
IgM
Wenn ein fremder Erreger in den Organismus gelangt, reagiert der Körper als erstes mit der Produktion von Immunglobulin M (IgM). Weil
IgM so schnell zur Verfügung steht, wird es gelegentlich auch als Frühantikörper bezeichnet. Ist die akute Phase einer Infektion
überwunden, sinkt die Konzentration des IgM wieder. Handelt es sich um eine Zweitinfektion, dann bleibt die IgM Konzentration gering.
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Notizen
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