nukleinsäure eines neuen menschlichen kinesin

*DE60133023T220090319*
(19)
Bundesrepublik Deutschland
Deutsches Patent- und Markenamt
(12)
(10)
DE 601 33 023 T2 2009.03.19
Übersetzung der europäischen Patentschrift
C12N 15/09 (2006.01)
(97) EP 1 329 504 B1
(21) Deutsches Aktenzeichen: 601 33 023.4
(86) PCT-Aktenzeichen: PCT/JP01/08635
(96) Europäisches Aktenzeichen: 01 972 634.8
(87) PCT-Veröffentlichungs-Nr.: WO 2002/026965
(86) PCT-Anmeldetag: 01.10.2001
(87) Veröffentlichungstag
der PCT-Anmeldung: 04.04.2002
(97) Erstveröffentlichung durch das EPA: 23.07.2003
(97) Veröffentlichungstag
der Patenterteilung beim EPA: 27.02.2008
(47) Veröffentlichungstag im Patentblatt: 19.03.2009
(51) Int Cl.8:
(30) Unionspriorität:
2000300247
(84) Benannte Vertragsstaaten:
DE, FR, GB, IT
29.09.2000
JP
(73) Patentinhaber:
Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc., Tosu-shi,
Saga, JP; Chiba Prefecture, Chiba, JP
C12N 15/12 (2006.01)
C07K 14/47 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01)
A61K 38/17 (2006.01)
A61K 48/00 (2006.01)
A61K 31/711 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
(72) Erfinder:
NAKAGAWARA, Akira, Chiba-shi, Chiba 260-0801,
JP
(74) Vertreter:
Grünecker, Kinkeldey, Stockmair &
Schwanhäusser, 80802 München
(54) Bezeichnung: NUKLEINSÄURE EINES NEUEN MENSCHLICHEN KINESIN-ASSOZIIERTEN GENS, VON DER NUKLEINSÄURE KODIERTES PROTEIN, PEPTIDFRAGMENT DAVON SOWIE DIE NUKLEINSÄURE UND ÄHNLICHES ENTHALTENDE ANTIKREBSMITTEL
Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch
einlegen. Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr entrichtet worden ist (Art. 99 (1) Europäisches Patentübereinkommen).
Die Übersetzung ist gemäß Artikel II § 3 Abs. 1 IntPatÜG 1991 vom Patentinhaber eingereicht worden. Sie wurde
vom Deutschen Patent- und Markenamt inhaltlich nicht geprüft.
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Beschreibung
Technisches Gebiet
[0001] Diese Erfindung betrifft neuartige, mit Kinesin verwandte, menschliche Gene, Proteine, für welche die
Gene kodieren und ihre Verwendung zur Behandlung von Krebs oder zum Diagnostizieren der Prognose von
Krebs.
Stand der Technik
Substanztransport in Neuronen
[0002] Verschiedene Substanzen werden von spezifischen Systemen in neuronalen Axonen transportiert und
ein derartiger Transport wird abhängig von der Geschwindigkeit in zwei Arten eingeteilt, entweder in „schnellen
Transport" oder in „langsamen Transport". „Schneller Transport" beinhaltet sowohl den anterograden Transport
in Richtung vom Zellkörper zum Axonende als auch den retrograden Transport in der entgegengesetzten Richtung. „Schneller Transport" ist eine gerichtete Bewegung, im Allgemeinen innerhalb der Zelle, und wird durch
die Bewegung von intrazellulären, an Organellen anhaftenden, molekularen Motoren (Motorproteinen) auf Mikrotubuli bewirkt.
Rolle von Kinesin beim axonalen Transport
[0003] Kinesin befördert intrazelluläre Organellen in Richtung des Plus-Endes von Mikrotubuli, womit ein
schneller, anterograder Transport im neuronalen Axon bewerkstelligt wird. Das Kinesinmolekül ist ein Heterotetramer, das zwei schwere Ketten mit 120 kDa und zwei leichte Ketten mit 64 kDa umfasst. Das N-terminale
Ende der schweren Kette bildet einen kugelförmigen Kopf, der eine Motordomäne, die mit ATP und Mikrotubuli
bindet, darstellt, und dehnt sich aus, um einen stabförmigen Stiel und einen fächerförmigen Schwanz mit einer
Gesamtlänge von etwa 80 nm zu bilden (Hirnkawa N. et al., Cell 56: 867–878, (1989)). Die leichte Kette kann
aus jeder von 3 molekularen Spezies bestehen, durch Spleißen entstanden sein (Cyr JL. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 10114–10118, (1991)) und abhängig vom jeweiligen Organ unterschiedlich sein. Die leichte
Kette haftet am Schwanz der schweren Kette an und die Bindung an Membranorganellen erfolgt an den
Schwanzteilen der schweren Ketten und den Teilen der leichten Ketten.
Mit Kinesin verwandte Gene
[0004] In letzter Zeit wurden verschiedene mit Kinesin verwandte Gene entdeckt und ihre Proteinstrukturen
wurden aufgeklärt. Diese mit Kinesin verwandten Gene haben in hohem Maße konservierte Motordomänenstrukturen (Eyer J. et al., Nature 391: 584–587 (1998)). Mehr als 30 mit Kinesin verwandte Gene wurden bisher
in Mäusen entdeckt, wobei alle Motorstrukturen haben (Gibbons IR. et al., Cell Motil. Cytoskel. 32: 136–144
(1995)), und sie sind insgesamt als die Kinesin-Superfamilie bekannt. Vor kurzem wurde ein phylogenetischer
Stammbaum der Kinesin-Superfamilie veröffentlicht (Hirnkawa N. et al., Science 279: 519–526 (1998)) und es
wurde festgestellt, dass verschiedene der Mitglieder am axonalen Transport beteiligt sind.
[0005] Über die Kinesin-Superfamilie wird derzeit in Mäusen, wo sie als KIF bezeichnet wird, rege geforscht
(Aizawa H. et al., J. Cell Biol. 199: 1287–1296 (1992)) und die Mitglieder werden im Wesentlichen basierend
auf der Position der Motorregion (am N-terminalen Ende, im Zentralbereich oder am C-terminalen Ende) in drei
Gruppen eingeteilt.
Kinesin-Superfamilie mit N-terminalem Motor
[0006] Die Kinesin-Superfamilie mit N-terminalem Motor wird weiter in die Unterfamilien KNC, Unc104,
RP85/95, BimC, MKLP1 und die Chromokinesin–Unterfamilien unterteilt. Unter diesen wurde die Familie BimC
in Säugern nicht identifiziert.
[0007] Die KHC-Familie umfasst drei Mitglieder, die in Mäusen identifiziert wurden (KIF5B, KIF5A, KIF5C),
und zwei, die in Menschen identifiziert wurden (HsuKHC, HsnKHC), während nur eine in Wirbellosen identifiziert wurde. Diese Familie kann in die ubiquitären Mitglieder (KIF5B, HsuKHC) und die für das Nervensystem
spezifischen Mitglieder (KIF5A, KIF5C, HsnKHC) unterteilt werden. HsnKHC ist über den ganzen Nervenzellkörper verteilt und HsuKHC wird auch im Axon nachgewiesen (Niclas J. et al., Neuron 12: 1059–1072 (1994)).
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[0008] Die Familie UNC104 wurde in Menschen nicht identifiziert, aber KIF1A und KIF1B sind in Mäusen bekannt. KIF1A ist ein großes Protein mit 1695 Aminosäuren und 200 kDa, das mit einem einzigen Kopf arbeitet
und Vorläufer von synaptischen Vesikeln mit einer Geschwindigkeit von 1,2–1,5 μm/s auf das Plus-Ende von
Mikrotubuli zu transportiert (Okada Y. et al., Cell 81: 769–780 (1995)). Gezielte Geninaktivierung (engl.: „gene
targeting") hat schwere kinästhetische Schädigung zur Folge und führt kurz nach der Geburt zum Tod.
[0009] KIF1B umfasst 1150 Aminosäuren und arbeitet auch mit einem einzigen Kopf, wobei es Mitochondrien
mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μm/s auf das Plus-Ende von Mikrotubuli zu transportiert (Nangaku M. et al.,
Cell 79: 1209–1220 (1994)).
[0010] Die von der Maus stammenden KIF3A und KIF3B aus der Familie RP85/95 liegen als Heterodimer mit
zwei Köpfen vor und bilden in Verbindung mit KAP3 ein Heterotrimer. Diese mit Kinesin verwandten Proteine
sind nicht neuronenspezifisch und befördern Membranvesikel, die größer als Synapsenvesikel sind, mit einer
Geschwindigkeit von 0,3 μm/s auf das Plus-Ende von Mikrotubuli zu (Yamazaki H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93: 8443–8448 (1996)).
[0011] Ein Mitglied der MKLP-Familie ist bei Menschen bekannt (humanes MKLP). Humanes MKLP1 übt
Funktionen für die Spindelelongation in der Anaphase B, die Bildung von kontraktilen Ringen und den Abschluss der zytoplasmatischen Teilung aus.
[0012] Von der Maus stammendes KIF4 der Chromokinesin-Familie umfasst 1231 Aminosäuren und hat eine
Länge von 116 nm mit zwei Köpfen. Es bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von 0,2 μm/s und transportiert
Membranvesikel zu Wachstumskegeln. Im Körper von Erwachsenen ist es reichlichst in den Organen des Immunsystems vorhanden (Shingyoji C. et al., Nature 393: 711–714 (1998)).
Kinesin-Superfamilie mit zentralem Motor
[0013] Die Kinesin-Superfamilie mit zentralem Motor wurde in Menschen nicht ermittelt. Von der Maus stammendes KIF2 ist ein Protein mit zwei Köpfen und 81 kDa, das sich mit einer Geschwindigkeit von 0,4 μm/s auf
das Plus-Ende von Mikrotubuli zu bewegt. Dieses mit Kinesin verwandte Protein ist nicht neuronenspezifisch,
wird aber im jugendlichen Nervensystem exprimiert, wo es den Transport von Membranvesikeln zu Wachstumskegeln durchführt (Noda Y. et al., J. Cell Biol. 129: 157–167 (1995)).
Kinesin-Superfamilie mit C-terminalem Motor
[0014] Auch die Kinesin-Superfamilie mit C-terminalem Motor wurde in Menschen nicht ermittelt. In dieser Superfamilie sind drei verschiedene, von der Maus stammende Kinesine (KIFC1, KIFC2 und KIFC3) bekannt.
KIFC2 fehlt in den peripheren Nerven, liegt in Dendriten reichlich vor und befördert hauptsächlich multivesikuläre Körper auf die Enden von Dendriten zu (Saito N. et al., Neuron 18: 425–438 (1997)).
Klonierung von neuen, mit Kinesin verwandten Genfragmenten vom Menschen
[0015] cDNA für KIAA0591 (GenBank-Zugangsnummer: AB011163) wurde aus einer nach dem Molekulargewicht fraktionierten cDNA-Bibliothek aus Gehirn vom Menschen kloniert (Nagase T. et al., DNA Res. 5: 31–39
(1998)).
[0016] Die cDNA bestand aus 5368 Basen und ist ein Teilfragment eines neuen Gens, das in hohem Maße
homolog zum Gen für den Synapsenvesikeltransporter in neuronalen Axonen vom Menschen ist. Da das 5'-Ende der cDNA für KIAA0591 über kein Initiationscodon für die Transkription verfügte und kürzer als das entsprechende, ungefähr 9,5 kb lange Transkriptionsprodukt war, deutete dies auf die Existenz einer längeren cDNA
mit voller Länge hin.
[0017] Die Erfinder der vorliegenden Erfindung suchten daher eine cDNA-Bibliothek aus Substantia nigra
vom Menschen ab, um die cDNA, welche die volle Länge hatte und KIAA0591 beinhaltete, zu erhalten, jedoch
ohne Erfolg beim Aufklären der cDNA mit der vollen Länge. Ihre Funktion bleibt somit unbekannt.
[0018] Im Lauf der Bestrebungen, die cDNA mit der vollen Länge für KIAA0591 aufzuklären, entdeckten die
Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch auch ein mit Kinesin verwandtes Gen ohne einen Teil, welcher der
Motordomäne, die in der Kinesin-Superfamilie ubiquitär angetroffen wird, entspricht. Die Rasensequenz für die
Translationsregion dieses Gens ist in SEQ ID NO: 3 im Sequenzprotokoll dargelegt, beziehungsweise das Pro-
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tein, das aus dieser Region translatiert wird, ist in SEQ ID NO: 1 dargelegt.
[0019] Es wurde auch entdeckt, dass das Gen bei 36,2–36,3 auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms
1, von dem festgestellt wurde, dass es in Neuroblastomen und Ähnlichem oft fehlerhaft ist, lokalisiert ist, dass
in 8 Typen eines Neuroblastoms und in 15 Typen von Zelllinien, die von einem Neuroblastom abstammen, keine Mutationen in der Region, die für dieses Gen kodiert, gefunden werden und dass es in einer Vielzahl von
adulten Geweben exprimiert wird und in Gehirn, Niere, Skelettmuskel und Pankreas, besonders im Gehirn von
einem menschlichen Fötus stark exprimiert wird ((Nakagawara A. et al., International Journal of Oncology 16:
907–916 (2000)).
[0020] Gleichwohl blieb die Funktion des mit Kinesin verwandten Gens, dem die Motordomäne fehlt, und seines Proteins unklar.
[0021] WO 00/63375 betrifft Polynukleotide, die für ein dem Kinesin ähnliches Polypeptid beim Menschen,
das sich von jeder der Sequenzen der vorliegenden Erfindung unterscheidet, kodieren.
Von Verankerung unabhängiges Wachstum und Krebs
[0022] Normale adhärente Zellen benötigen ein Anhaften an einem festen Anker, um zu proliferieren. Wenn
sie auf einer nicht haftfähigen Materialoberfläche kultiviert werden, werden die Zellen für eine ausgedehnte
Dauer überleben, werden aber nicht proliferieren. Zum Beispiel wird, wenn normale Zellen in einem nicht verankernden, halbfesten Medium wie zum Beispiel einem Agarosegel suspendiert werden, der lebenserhaltende
Stoffwechsel stattfinden, aber das Wachstum ist supprimiert. Andererseits fehlt maligne transformierten Zellen
wie zum Beispiel Krebszellen (oder Onkozyten) im Allgemeinen der Bedarf nach Adhäsion und somit bilden
sie, auch wenn sie in einem nicht verankernden, halbfesten Medium suspendiert werden, Kolonien und wachsen. Dieses Merkmal ist sehr stark mit der Fähigkeit von maligne transformierten Zellen, Tumore zu bilden, verbunden. Besonders Zellen, die in einer von Verankerung unabhängigen Weise proliferieren, sind beim Bilden
von Tumoren effizient, wenn sie in Tiere injiziert werden (siehe Darnell et al., Molecular Cell Biology, zweite
Auflage 24: 963–967 (1993)).
Zelladhäsion und Infiltration/Metastasierung durch Krebs
[0023] Krebs ist wegen seiner Fähigkeit zu infiltrieren und zu metastasieren bösartig. Obwohl auf das Aufklären des Mechanismus gerichtete Forschung bis jetzt aktiv betrieben wurde, sind Infiltration und Metastasierung
komplexe Erscheinungen, die als Ergebnis von Konflikten zwischen Krebszellen und Wirtszellen auftreten, und
das vollständige Bild wird noch nicht in vollem Umfang verstanden. Hämatogene Metastasierung ist durch Infiltration von Krebszellen aus Primärläsionen, Intravasation, Transport, Kolonisierung, Extravasation und
Wachstum im Initialstadium begründet. Man nimmt an, dass auch lymphogene Metastasierung, disseminierte
Metastasierung und intrakanalikuläre Metastasierung mit ähnlichen Prozessen einhergehen. Adhäsion und
Dissoziation zwischen Krebszellen und Krebszellen, Krebszellen und normalen Zellen und Krebszellen und extrazellulärer Matrix treten während all dieser Prozesse auf.
[0024] Da bei vielen Arten von Krebs eine verminderte Adhäsion zwischen Krebszellen beobachtet wird, gab
es eine Konzentration auf ihre Verbindung mit der Fähigkeit der Zellen zur Infiltration und Metastasierung.
Krebszellen treten mit vielen und verschiedenen Zellen während des Verlaufs ihrer Metastasierung in Kontakt.
Die Krebszellen, die an endothelialen Zellen anhaften, schließen diejenigen, die von endothelialen Zellen verkapselt sind, diejenigen, die an der apikalen Oberfläche der Endothelzellen anhaften, und diejenigen, die von
der basalen Oberfläche epithelialer Zellen bedeckt sind, ein und diese Zellen sind mit der Intravasation und der
Extravasation von Krebszellen eng verbunden. Die Adhäsion zwischen Krebszellen und der extrazellulären
Matrix wird auch ubiquitär beobachtet. Andere Beobachtungen ließen darauf schließen, dass es nach der Adhäsion von Krebszellen an normale Zellen zur Zellfusion und zum Tod normaler Zellen kommt (Turuo, T. et al.:
„Ganten'i no Bunshikiko" [Molecular Mechanisms of Cancer Metastasis], Medical View Publishing (1993)).
[0025] Wie oben erwähnt ist die Funktion des neuen, mit Kinesin verwandten Gens, dem die Motordomäne
fehlt, und des Proteins, für das es kodiert, die früher von den Erfindern der vorliegenden Erfindung entdeckt
wurden, unbekannt geblieben. Zusätzlich wurde, obwohl die Existenz der cDNA mit der vollen Länge einschließlich KIAA0591 prognostiziert war, diese noch nicht bestätigt oder identifiziert.
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Offenbarung der Erfindung
[0026] Diese Erfindung wurde angesichts der oben beschriebenen Umstände zustande gebracht. Es ist eine
Aufgabe der Erfindung, die Daten der Basensequenz für ein neues, mit Kinesin verwandtes Gen vom Menschen, das eine Motordomäne hat, bereitzustellen. Die Erfindung stellt ferner Information bereit, welche die
Funktion des Proteins, für welches das neue, mit Kinesin verwandte Gen vom Menschen mit einer Motordomäne kodiert, betrifft und erläutert das neue, mit Kinesin verwandte Gen ohne Motordomäne.
[0027] Als Ergebnis von umfangreicher, sorgfältiger Forschung gelang es den Erfindern der vorliegenden Erfindung, durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, (RACE, engl. „Rapid Amplification of cDNA Ends") ein
neues Gen zu klonieren, das ein längeres 5'-Ende als das mit Kinesin verwandte Gen ohne Motordomäne
(SEQ ID NO: 3) hat, und die cDNA dieses mit Kinesin verwanden Gens mit der vollen Länge zu sequenzieren.
Zur Einfachheit wurde das neue, mit Kinesin verwandte Gen mit einer Motordomäne als KIF1b-β bezeichnet
und seine cDNA-Sequenz (Basensequenz) ist in SEQ ID NO: 4 im Sequenzprotokoll dargestellt.
[0028] Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten auch, dass die Expression des KIF1b-β-Gens nur
in Neuroblastomgewebe mit einer günstigen klinischen Prognose gesteigert ist.
[0029] Es wurde weiterhin entdeckt, dass ein Supprimieren der Expression des KIF1b-β-Gens und des mit
Kinesin verwandten Gens ohne Motordomäne unter Einsatz von Antisense-RNA ein von Verankerung unabhängiges Wachstum normaler Zellen, die inhärent nur in einer von Verankerung abhängigen Weise wachsen,
erlaubt, oder in anderen Worten, dass diese Gene als Kontrolle der Entartung normaler Zellen in Krebszellen
fungieren.
[0030] Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten noch weiter, dass normale Zellen eine Tumorentstehung durchmachen, wenn die Expression des KIF1b-β-Gens und des neuen, mit Kinesin verwandten Gens
ohne Motordomäne unter Einsatz von Antisense-RNA supprimiert werden. Somit fördert der Verlust dieser
Gene die Tumorentstehung bei normalen Zellen.
[0031] Ausführungsformen der Erfindung sind:
1. Eine Nukleinsäure, die
a) eine Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz ist oder
b) eine Nukleinsäure ist, die für ein Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst, kodiert.
2. Eine Nukleinsäure nach Ausführungsform 1 zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung.
3. Eine Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 7 dargelegten Basensequenz.
4. Ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
5. Verwendung eines Proteins mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Neuroblastom.
6. Verwendung einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Neuroblastom.
7. Verfahren zum Bestimmen der Prognose von humanem Neuroblastom, wobei es das Verfahren umfasst,
das Expressionsniveau des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 4 kodiert, in einer vorher
von einem Patienten gewonnenen, klinischen Gewebeprobe aus Neuroblastom zu ermitteln, wobei eine
günstige Prognose mit einer im Vergleich zu einer klinischen Gewebeprobe mit einer ungünstigen Prognose
erweiterten Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 4 kodiert, korreliert.
8. Verfahren nach Ausführungsform 7, wobei die Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von
SEQ ID NO: 4 kodiert, unter Verwendung von Nukleinsäuresonden oder von PCR Primern ermittelt wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
[0032] Fig. 1A und Fig. 1B sind beide Darstellungen, die Elektrophorese-Fotografien entsprechen, welche
die Ergebnisse des Untersuchens der Genexpression von KIF1b-β in Neuroblastomen vom Menschen mit
günstiger Prognose beziehungsweise mit ungünstiger Prognose durch semiquantitative RT-PCT zeigen. In
den Figuren stellen die Bahnen 1–16 klinische Gewebeproben von Neuroblastomen vom Menschen mit günstiger Prognose dar und die Bahnen 17–32 stellen klinische Gewebeproben von Neuroblastomen vom Menschen mit günstiger Prognose dar.
[0033] Fig. 2 ist eine schematische Zeichnung der in den Beispielen verwendeten GSE-Methode.
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[0034] Fig. 3A ist eine Darstellung, die der Fotografie eines Soft-Agarose-Gels entspricht, das Wachstum als
Ergebnis von verankerungsunabhängigem Wachstum von Brustdrüsenzellen der Maus, in die das
KIF1b-β-Gen und ein mit Kinesin verwandtes Gen, dem die Motordomäne fehlt, als Antisense (KIFAS) unter
Einsatz eines Retrovirus-Vektors eingebracht wurde, zeigt.
[0035] Fig. 3B ist eine Darstellung, die der Fotografie eines Soft-Agarose-Gels entspricht, das die Ergebnisse
von verankerungsunabhängigem Wachstum von Brustdrüsenzellen der Maus, in die als negative Kontrolle ein
Gen für Neomycinresistenz unter Einsatz eines Retrovirus-Vektors eingebracht wurde, zeigt.
[0036] Fig. 4 ist ein Diagramm, das Wachstumskurven für NMuMG-Krebszellen, in die unter Einsatz eines
Adenovirus-Vektors das KIF1b-β-Gen eingebracht wurde, zeigt.
[0037] Fig. 5 ist ein Diagramm, das Wachstumskurven für NB-C201-Zellen, in die unter Einsatz eines Adenovirus-Vektors das KIF1b-β-Gen eingebracht wurde, zeigt.
[0038] Fig. 6 ist eine Darstellung, die einer Fotografie entspricht, die Tumorentstehung als Ergebnis der
Transplantation von Brustdrüsenzellen der Maus, in die unter Einsatz eines Retrovirus-Vektors KIFAS eingebracht wurde, unter die Oberschenkelhaut von nackten Mäusen zeigt.
[0039] Fig. 6B ist eine Darstellung, die einer Fotografie entspricht, welche die Ergebnisse der Transplantation
von Brustdrüsenzellen der Maus, in die als negative Kontrolle ein Gen für Neomycinresistenz eingebracht wurde, unter die Oberschenkelhaut von nackten Mäusen zeigt.
[0040] Fig. 7 ist ein Diagramm der Tumorentstehung bei der Maus, die in Fig. 6A gezeigt ist, in dem die Tumorgröße (das Tumorvolumen) gegen die Zeit aufgetragen ist.
Bester Modus zum Ausführen der Erfindung
[0041] Der Aufbau und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun ausführlich beschrieben
werden.
[0042] Der Ausdruck „Protein mit der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz", wie er überall in der
vorliegenden Beschreibung verwendet wird, kann sich nicht nur auf ein Protein, für das die in SEQ ID NO: 3
dargelegte Nukleinsäure kodiert, beziehen, sondern auch auf jedes Protein mit einer im Wesentlichen gleichwertigen Aktivität. Ein Protein mit einer im Wesentlichen gleichwertigen Aktivität ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen mit der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz identisch ist.
Die letztere Aminosäuresequenz kann zum Beispiel eine Aminosäuresequenz, die durch die Substitution oder
die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz
oder durch das Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäuren zu der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz ableitbar ist, sein. Auch hat der Ausdruck „Protein mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz" eine genau entsprechende Bedeutung und kann sich nicht nur auf ein Protein, für das die in
SEQ ID NO: 4 dargelegte Nukleinsäure kodiert, beziehen, sondern auch auf jedes Protein mit einer im Wesentlichen gleichwertigen Aktivität.
[0043] Der Ausdruck „Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 dargelegten Basensequenz", wie er überall in
der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, kann sich auch auf eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz
beziehen, die für ein Protein kodiert, das eine dem Protein, für das die in SEQ ID NO: 3 dargelegte Nukleinsäure kodiert, im Wesentlichen gleichwertige Aktivität hat. Der Ausdruck „Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:
4 dargelegten Basensequenz", hat eine genau entsprechende Bedeutung und kann sich auch auf eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz beziehen, die für ein Protein kodiert, das eine dem Protein, für das die in SEQ
ID NO: 4 dargelegte Nukleinsäure kodiert, im Wesentlichen gleichwertige Aktivität hat. Solche Nukleinsäuren
und Proteinvarianten können gemäß Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, wie zum Beispiel ortsspezifischer Mutation, auf der Basis der Information über die Basensequenz der oben erwähnten Nukleinsäuren hergestellt werden.
[0044] Der Begriff „Nukleinsäure", wie er überall in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht
sich auf DNA oder RNA, die für ein Protein wie oben definiert oder ein Teilpeptid als funktionell wirksames Fragment des Proteins kodiert, die zu einer Nukleinsäure, die für ein solches Protein oder Teilpeptid kodiert, komplementär ist oder die unter „stringenten" Bedingungen mit einer solchen Nukleinsäure hybridisiert.
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[0045] Wenn die Menge der Expression einer Nukleinsäure dieser Erfindung in Neuroblastomen mit günstiger
Prognose und mit ungünstiger Prognose verglichen wird, stellt man fest, dass sie in Neuroblastomen mit günstiger Prognose in größeren Mengen exprimiert wird. Das Einbringen von Antisense (Nukleinsäure) (unten beschrieben) gegen die Nukleinsäure in normale Zellen fördert verankerungsunabhängiges Wachstum der normalen Zellen und steigert die Tumorentstehung. Aus diesen Gründen wird angenommen, dass die Nukleinsäuren der Erfindung zumindest die Funktion des Aufrechterhaltens biologischer Normalität (zum Beispiel des
Supprimierens der Krebsentwicklung von Zellen) haben.
(1) Brauchbarkeit zur Diagnostik (siehe Ausführungsform 7 oben)
[0046] Die Nukleinsäuren, Proteine und Teilpeptide dieser Erfindung und auch Antikörper für die Proteine und
Teilpeptide sind für die Diagnostik nützlich.
[0047] Besonders können diese Moleküle dazu verwendet werden, Krankheiten (wie zum Beispiel Neuroblastom) oder Funktionsstörungen, bei denen eine Zunahme oder Abnahme der Expression der Proteine der Erfindung oder ihrer Teilpeptide eine Rolle spielt, mit einer jeden von verschiedenen Testmethoden zum Zweck
der Prognosenvorhersage, der Diagnose und der Überwachung zu erkennen.
[0048] Es gibt keine speziellen Einschränkungen von Immunassayverfahren unter Verwendung von Antikörpern für die Proteine der Erfindung oder ihre Teilpeptide und es können verschiedene kompetitive und nicht
kompetitive Testverfahren angeführt werden, die solche Methoden wie Western Blotting, Radioimmunassay,
ELISA, „Sandwich"-Immunassay, Immunpräzipitation, Präzipitinreaktion, Geldifferenzierungspräzipitinreaktion, Immundiffusionstest, Agglutinationstest, Komplementbindungstest, immunradiometrische Untersuchung,
Fluoreszenzimmunassay und Protein-A-Immunassay einsetzen.
[0049] Wenn man eine Nukleinsäure der Erfindung zur Diagnostik einsetzt, kann sie als Hybridisierungssonde
oder als PCR Primer zum Nachweis von gesteigerter Genexpression in Zellproben verwendet werden, um die
Prognose festzulegen. Die gesteigerte Genexpression kann durch jedes Verfahren untersucht werden, das
eine Basensequenz, die mit irgendeiner gewünschten Sequenz unter den durch die Erfindung offenbarten Basensequenzen hybridisiert, als Sonde verwendet. Vorzugsweise wird eine mit einem radioaktiven Isotop markierte Sonde verwendet, um mit Southern oder Northern Blotting zu untersuchen. Wenn die Menge von Nukleinsäure, die mit der Sonde in der Zellprobe hybridisiert, erhöht ist, kann die Diagnose einer günstigen Prognose gestellt werden. Wenn die Nukleinsäure als Primer zur PCR verwendet wird, kann RNA aus der Probe
(den Zellen) extrahiert werden, um untersucht zu werden, und die Genexpression kann mittels RT-PCR semiquantitativ gemessen werden.
(2) Brauchbarkeit zur Therapie (siehe Ausführungsform 5 oben)
[0050] Die Nukleinsäuren, Proteine und Teilpeptide der Erfindung sind nützliche Wirkstoffe für die Behandlung
von Krankheiten und Funktionsstörungen, mit denen eine(s) davon verbunden ist.
[0051] Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein
Protein oder Teilpeptid der Erfindung umfasst, gegen eine Krankheit (besonders einen malignen Tumor) oder
eine Funktionsstörung, die mit einer verminderten Expression des Proteins oder des Teilpeptids einhergeht,
verabreicht werden. Es kann auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Nukleinsäure der
Erfindung in ihrer Gesamtheit oder als Teil umfasst, verabreicht werden.
[0052] Gemäß einer anderen Ausführungsform kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Antisense, neutralisierende Antikörper oder einen kompetitiven Hemmstoff für ein Protein oder Teilpeptid der Erfindung
umfasst, gegen eine Krankheit oder Funktionsstörung, die mit einer gesteigerten Expression des Proteins oder
Peptids einhergeht, verabreicht werden, um entweder die Expression zu supprimieren oder die Funktion des
Proteins oder Peptids zu hemmen.
[0053] Besonders dann, wenn eine Nukleinsäure der Erfindung zur Gentherapie für den oben beschriebenen
Zweck eingesetzt wird, kann die Nukleinsäure in einen Vektor, der zum Gentransfer verwendet wird, eingebracht werden, und das eingebrachte Gen kann im Körper des Patienten unter jedem gewünschten Expressionspromotor zum Beispiel zur Behandlung von Krebs exprimiert werden.
[0054] Der Vektor zur Insertion der Nukleinsäure wird vorzugsweise auf Basis eines DNA- oder RNA-Virus
konstruiert. Es gibt keine speziellen Einschränkungen für die Art des Virusvektors und es können MoMLV-Vek-
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tor, Herpesvirus-Vektor, Adenovirus-Vektor, AAV-Vektor, HIV-Vektor, SIV-Vektor, Sendaivirus-Vektor und Ähnliche verwendet werden.
[0055] Alternativ kann ein pseudotypisierter Virusvektor, in dem ein oder mehrere der grundlegenden Proteine
des Virusvektors mit einem grundlegenden Protein einer anderen Virusart ersetzt ist oder in dem ein Teil der
Nukleinsäuresequenz der genetischen Information mit einer Nukleinsäuresequenz einer anderen Virusart ersetzt ist, verwendet werden. Als Beispiel kann ein pseudotypisierter Virusvektor, in dem das Protein Env, das
Hüllenprotein von HIV, mit dem Protein VSV-G, dem Hüllenprotein des Vesicular Stomatitis Virus (VSV) ersetzt
ist (Naldini L. et al., Science 272: 263–267 (1996)), angeführt werden.
[0056] Solange das Virus eine therapeutische Wirkung hat, kann es als Virusvektor eingesetzt werden, auch
wenn sein Wirtsbereich ein anderer als der Mensch ist. Es können auch Vektoren, die nicht von Viren stammen,
verwendet werden, wie zum Beispiel Calciumphosphat-Nukleinsäure-Komplexe, Liposomen, kationische Lipidkomplexe, Sendaivirus-Liposomen, Polymerträger mit polykationischem Rückgrat und Ähnliches. Bei dem
verwendeten System zum Gentransfer kann es sich um Elektroporation, eine Genkanone und Ähnliches handeln.
[0057] Für die Genexpression der Nukleinsäure der Erfindung, die in das vorher erwähnte Virus eingebracht
wurde, wird eine Expressionskassette, die einen Expressionspromotor umfasst, bevorzugt.
[0058] Die eingesetzte Expressionskassette kann von jeder Art sein, welche die Expression des Gens in Zielzellen ohne spezielle Einschränkungen zulässt. Ein Fachmann kann leicht eine solche Expressionskassette
auswählen, bei der es sich vorzugsweise um eine Expressionskassette handelt, die Genexpression in Zellen,
die von Tieren stammen, zulässt, bevorzugter um eine Expressionskassette, die Genexpression in Zellen, die
von Säugern stammen, zulässt und noch bevorzugter um eine Expressionskassette, die Genexpression in
menschlichen Zellen zulässt.
[0059] Zusätzlich zur Nukleinsäure der Erfindung kann die Expressionskassette verschiedene Sequenzen
wie zum Beispiel einen Promotor oder einen Enhancer für die Gentranskription, ein Poly-A-Signal, ein Markergen zum Markieren und/oder Selektieren der Zellen, in die ein Gen eingebracht wurde, eine Virusgensequenz
zur wirksamen Insertion des Gens in die genomische DNA-Sequenz der Zelle und eine Signalsequenz für die
extrazelluläre Sekretion und/oder die lokale, intrazelluläre Anreicherung der als Arzneimittel wirkenden Substanz, die von dem Gen hergestellt wurde, umfassen.
[0060] Als Promotorsequenzen, die in der Expressionskassette zu verwenden sind, können Promotoren, die
von solchen Viren wie Adenovirus, Zytomegalie-Virus, Humanem Immundefizienz-Virus, Affenvirus 40,
Rous-Sarkom-Virus, Herpes Simplex-Virus, Maus-Leukämie-Virus, Sindbis-Virus, Hepatitis A-Virus, Hepatitis
B-Virus, Hepatitis C-Virus, Papilloma-Virus, Humanem T-Zell-Leukämie-Virus, Grippevirus, Japanische Encephalitis-Virus, JC-Virus, Parvovirus B19 und Poliovirus abgeleitet sind, Säuger-Promotoren wie zum Beispiel
Albumin, SRα, Hitzeschockprotein und Promotoren für Elongationsfaktoren, chimäre Promotoren wie zum Beispiel der CAG-Promotor und Promotoren, deren Aktivität durch Tetrazykline, Steroide und Ähnliches induziert
wird, angeführt werden.
(3) Pharmazeutische Zusammensetzung
[0061] Die Nukleinsäuren, Proteine und Teilpeptide dieser Erfindung werden in Form von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung eingesetzt. Die Nukleinsäuren oder Ähnliches werden
daher gemäß dem unten beschriebenen Formulierungsverfahren hergestellt, ein bevorzugter Verabreichungsweg wird festgelegt und die Dosierung wird so festgesetzt, dass die erwünschte therapeutische Wirkung erreicht wird.
(Formulierungsverfahren)
[0062] Die eine Nukleinsäure, ein Protein oder Peptid umfassende pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist nicht spezifisch eingeschränkt und ein Arzneimittel kann durch Verkapselung in Liposomen, feinen Partikeln oder Mikrokapseln, Expression in rekombinanten Zellen, Rezeptor-vermittelte Aufnahme
oder als Retrovirus oder Teil einer anderen Vektorart konstruiert werden.
[0063] Spezieller kann ein rekombinanter Virusvektor, der eine Nukleinsäure der Erfindung umfasst, in einem
geeigneten Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser, physiologischer Salzlösung oder einer isotonisierten Puf-
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ferlösung gelöst werden, um eine Zusammensetzung, welche die Nukleinsäure der Erfindung enthält, herzustellen. Alternativ kann ein Protein oder Teilpeptid der Erfindung in einem geeigneten Lösungsmittel wie zum
Beispiel in Wasser, physiologischer Salzlösung oder in einer isotonisierten Pufferlösung gelöst werden, um
eine Zusammensetzung, welche das Protein oder Teilpeptid der Erfindung enthält, herzustellen. Polyethylenglykol, Glucose, verschiedene Aminosäuren, Kollagen, Albumin und Ähnliches können als Schutzmaterialien
für die Herstellung zugegeben werden.
[0064] Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann in neutralisierter Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen
diejenigen, die mit der freien Aminogruppe von einem Protein oder Peptid gebildet werden, wie zum Beispiel
diejenigen, die von Hydrochlorsäure, Phosphorsäure, Ethansäure, Oxalsäure, Weinsäure oder Ähnlichem abgeleitet sind, oder diejenigen, die mit der freien Carboxylgruppe von einem Protein oder Peptid gebildet werden, wie zum Beispiel diejenigen, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisen(II)-hydroxid, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain oder Ähnlichem abgeleitet sind, ein
(Verfahren der Verabreichung und Dosierung)
[0065] Wenn eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung dem Körper verabreicht wird, gibt
es keine spezifischen Beschränkungen des Verfahrens der Verabreichung. Es kann zum Beispiel vorzugsweise durch intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane oder intranasale Injektion ausgeführt werden. Die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird vom Verabreichungsweg und dem Zustand, dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht etc. des Patienten, an den verabreicht wird, abhängen und die optimale Dosis für einen bestimmten Patienten kann vom praktizierenden Arzt
festgelegt werden. Im Falle der Injektion beträgt zum Beispiel die Dosierung vorzugsweise etwa 0,1 μg/kg bis
1000 mg/kg pro Tag, bevorzugter etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg pro Tag.
(4) Zielerkrankungen und Zielfunktionsstörungen
[0066] Es gibt keine spezifischen Beschränkungen der Zielerkrankungen und Zielfunktionsstörungen, die mit
einer Nukleinsäure, einem Protein oder Teilpeptid der Erfindung als Arzneimittel zu behandeln sind, solange
die Funktion der Nukleinsäure etc. direkt oder indirekt in einem Zusammenhang mit dem Zustand steht. Wie
oben erwähnt, fördert das Einbringen von Antisense zur Nukleinsäure der Erfindung in normale Zellen das von
einer Verankerung unabhängige Wachstum der normalen Zellen und steigert die Tumorentstehung. Folglich
supprimieren die Nukleinsäuren, Proteine und Teilpeptide der Erfindung klar die Entwicklung normaler Zellen
zu Krebszellen und sind besonders gegen maligne Tumoren nützlich.
[0067] Es gibt keine spezifischen Beschränkungen von malignen Tumoren als Ziele der Behandlung mit den
Nukleinsäuren etc. der Erfindung und es können akute Leukämie, chronische Leukämie, Lymphom, Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Leberzellkarzinom, Choriokarzinom, Seminom, embryonales Karzinom,
Wilms Tumor, Gallengangskarzinom, Hodenkarzinom, Zervixkarzinom, Bronchialkarzinom, kleinzelliges Bronchialkarzinom, Blasenkarzinom, epitheliales Karzinom, Gliazellkarzinom, Medulloblastom, Epithelzellkarzinom, Angioblastom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom, Chondrosarkom, Angiosarkom, endotheliales
Sarkom, Lymphangiosarkom, Colonkarzinom, Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Prostatakarzinom, Plattenepithelkarzinom, papilläres Adenom, Zystadenokarzinom und Nierenzellkarzinom angeführt werden. Wenn
die Nukleinsäuren etc. der Erfindung für die Behandlung von malignen Tumoren eingesetzt werden, erlaubt es
ihre Funktion, dass sie auch als Arzneimittel zum Supprimieren von Metastasen von malignen Tumoren eingesetzt werden.
(5) Antisense (Nukleinsäure)
[0068] Es wird eine Antisense-Nukleinsäure verwendet, welche die Expression eines Gens, das von der Erfindung offenbart wird (einschließlich der Nukleinsäuren der Erfindung) supprimiert, um eine therapeutische
oder prophylaktische Wirkung zu erzielen. Hier bezieht sich „Antisense-Nukleinsäure" auf eine Nukleinsäure,
die aufgrund eines bestimmten Maßes an Sequenzkomplementarität an einen Teil von RNA (vorzugsweise
mRNA) eines Gens der Erfindung hybridisieren kann.
[0069] Die Antisense-Nukleinsäure kann in Form einer doppelsträngigen oder einer einzelsträngigen Nukleinsäure und entweder als RNA oder als DNA (welche für die RNA kodiert) Oligonukleotid oder als chimäres
Gemisch davon verwendet werden. Die Antisense-Nukleinsäure ist nicht spezifisch eingeschränkt und kann
aus einem Oligonukleotid von vorzugsweise 5–500 und bevorzugter von 200–500 Basen bestehen. Das Oligo-
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nukleotid kann auch in seinem Basenteil, Riboseteil oder Phosphat-Rückgrat modifiziert sein.
[0070] Die Antisense-Nukleinsäure kann in Form von katalytischer RNA, Ribozym oder chimärem
RNA-DNA-Analogon verwendet werden.
[0071] Die Antisense-Nukleinsäure kann mit einem Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, synthetisiert
werden, zum Beispiel unter Einsatz eines automatisierten DNA-Synthesizers.
[0072] Wenn die Antisense-Nukleinsäure für den Zweck der Behandlung oder Vorbeugung eingesetzt wird,
kann sie einem Patienten in derselben Art und Weise, wie oben für andere Nukleinsäuren beschrieben, als
pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, wird aber höchst bevorzugt speziellen Zellen (zum
Beispiel Krebszellen) direkt verabreicht. Zellen können auch mit einem Vektor, der DNA, die für RNA-Antisense-Nukleinsäure kodiert, umfasst, transformiert oder transfiziert werden, um die Antisense-Nukleinsäure durch
Transkription in den Zellen herzustellen.
(6) Antikörper
[0073] Antikörper gegen ein Protein oder ein Teilpeptid der Erfindung oder Fragmente davon einschließlich
der Bindungsdomänen können als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe verwendet werden. Speziell
zur Verwendung als therapeutischer Wirkstoff kann ein Antikörper an eine spezifische Region eines Proteins
der Erfindung gebunden werden, um als Antagonist oder als Agonist zu wirken. Zur Verwendung als diagnostischer Wirkstoff können Antikörper in verschiedenen Arten von Immunassays zum Nachweis und zur Messung
eines Proteins der Erfindung wie oben erwähnt verwendet werden.
[0074] Die Antikörper können unter Verwendung des Proteins oder Teilpeptids der Erfindung oder eines Fragments, Analogons oder Derivats davon als Immunogen in Übereinstimmung mit Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Als solche Antikörper können polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, einzelsträngige Antikörper, Fab-Fragmente oder Antikörper, die aus einer
FAB-Expressionsbibliothek stammen, angeführt werden.
(7) Knockout-Tiere
[0075] Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung können eine Nukleinsäuresequenz, welche die Expression eines Gens der Erfindung ausschaltet, und Knockout-Tiere, welche diese Sequenz als
Transgen in sich eingebracht haben, bereitgestellt werden. Basierend auf dieser Information können Tiere für
Krebsmodelle konstruiert werden.
[0076] Die Erfindung wird nun ausführlicher durch Beispiele beschrieben werden. Diese Beispiele sind jedoch
ein keiner Weise für die Erfindung einschränkend.
Beispiele
(Beispiel 1) Klonierung der cDNA mit der vollen Länge
[0077] Ausgehend von der Aminosäuresequenz für das mit Kinesin verwandte Protein, dem die Motordomäne fehlt (SEQ ID NO: 1), wurde das 5'-Ende aus einer humanen, embryonischen Gehirnbibliothek (Clontech)
unter Verwendung eines SMART RACE cDNA Amplifikationskits (Clontech) kloniert. Die Basensequenz des
klonierten DNA-Fragments wurde in Übereinstimmung mit einem etablierten Protokoll (Sanger F. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) bestimmt. Die gesamten Basensequenzen von beiden Strängen
wurden untersucht.
[0078] Die Ergebnisse der Untersuchung identifizierten ein DNA-Fragment für das bekannte, mit Kinesin verwandte Protein, dem die Motordomäne fehlt, und weitere 1390 Basenpaare am 5'-Ende. Eine Suche nach der
translatierten Region des Fragments erbrachte eine Region von 85 Basenpaaren am 5'-Ende, die nicht translatiert wird, eine Region von 5472 Basenpaaren, die translatiert wird und eine Region von 1353 Basenpaaren
am 3'-Ende, die nicht translatiert wird. Das translatierte Protein bestand aus 1824 Aminosäuren und hatte ein
Molekulargewicht von 205.065 Dalton. Die Aminosäuresequenz des translatierten Proteins wird in SEQ ID NO:
2 dargelegt und die Rasensequenz der translatierten Region wird in SEQ ID NO: 4 dargelegt. Dieses neue, mit
Kinesin verwandte Protein wurde als KIF1b-β bezeichnet. Die in SEQ ID NO: 4 dargelegte Basensequenz wurde bei DDBJ, GenBank und EMBL (Zugangsnummer: AB017133) registriert.
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(Beispiel 2) Messung der Genexpression in Neuroblastomen vom Menschen mit günstiger und ungünstiger
Prognose durch semiquantitative PCR
[0079] Aus Teilen des KIF1b-β-Gens wurden PCR-Primer synthetisiert und für eine vergleichende Messung
von Expression in klinischen Gewebeproben aus Neuroblastom mit günstiger Prognose und mit ungünstiger
Prognose verwendet. Die Sequenzen der synthetisierten PCR-Primer sind in SEQ ID NO: 5 (Vorwärts-Primer)
und in SEQ ID NO: 6 (reverser Primer) dargelegt. Aus klinischen Gewebeproben von Neuroblastom vom Menschen wurde mRNA extrahiert und einer PCR-Reaktion unter Einsatz von rTaq (Takara Shuzo) unterzogen.
Genau bezeichnet wurden 5 μl steriles, destilliertes Wasser, 2 μl der mRNA, 1 μl von 10 × rTaq-Puffer, 1 μl der
2 mM dNTPs, 0,5 μl von jedem synthetisierten Primerset und 0,5 μl rTaq kombiniert. Das Gemisch wurde 2
Minuten lang bei 95°C denaturiert und dann wurde ein Zyklus von 15 Sekunden lang 95°C, 15 Sekunden lang
63°C und 20 Sekunden lang 72°C über 35 Zyklen wiederholt. Dem folgten 6 Minuten Stehen bei 72°C, um die
PCR-Reaktion zu vervollständigen. Die Reaktionslösung wurde einer Elektrophorese auf einem 2,5%-Agarosegel unterzogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1A und Fig. 1B dargestellt.
[0080] Die Ergebnisse in Fig. 1 bestätigten eine gesteigerte Expression des KIF1b-β-Gens nur in Neuroblastom vom Menschen mit günstiger Prognose.
(Beispiel 3) Untersuchungen der Wirkungen von KIF1b-β-Gen und mit Kinesin verwandtem Gen, dem die Motordomäne fehlt, auf das Tumorwachstum mit der „Genetic Suppressor Element" (GSE) Methode (1) „GSE" bezieht sich auf ein kurzes, biologisch aktives Genfragment, das für ein dominant
[0081] agierendes Peptid oder eine hemmende Antisense-RNA kodiert. Die Methode, die GSE als Instrument
in der molekularen Onkologie einsetzt, ist als GSE-Methode bekannt und ihr Konzept und ihre Strategie sind
in Roninson IB et al., Cancer Res. 55: 4023–4028 (1995) zusammengefasst. Speziell kann die GSE-Methode
zur funktionellen Untersuchung von jedem Gen in Verbindung mit Tumorwachstum angewandt werden. Die
Technik umfasst Gentransfer in eine Empfängerzelle unter Verwendung eines Retrovirurs-Vektors und einer
Verpackungszelle und das Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von Tumorentstehung. Fig. 2 zeigt eine
Übersicht dieser Technik in der Abfolge. Spezieller wird Antisense gegen das Gen von Interesse in die Empfängerzellen eingebracht, was zur Suppression der Genfunktion in den Zellen führt. Konsequenterweise kann,
wenn die Zellen, in die Antisense eingebracht wurde, tumorbildende Qualität wie zum Beispiel von Verankerung unabhängiges Wachstum erlangen, der Schluss gezogen werden, dass die ursprüngliche Funktion des
Gens eine negative Kontrolle auf die Tumorentstehung ausübt.
[0082] Dem Protokoll von Garkavtsev et al. (Garkavtsev I. et al., Nature Genet. 4, 415–420 (1996)) folgend
wurde ein Retrovirus-Vektor konstruiert, um Antisense gegen das KIF1b-β-Gen (KIF1b-β) und das mit Kinesin
verwandte Gen, dem die Motordomäne fehlt (auch als „KIFAS" bezeichnet) zu exprimieren, und wurde zur
Transfektion von Brustdrüsenzellen der Maus verwendet. Die verwendete Antisense-Sequenz ist in SEQ ID
NO: 7 dargelegt. Antisense wurde an einen synthetischen Adapter ligiert und der Sense-Strang des Adapters
wurde als PCR-Primer für die PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR-amplifizierte DNA wurde in einen Retrovirus-Vektor pLXSN kloniert und die erhaltene Plasmidbibliothek wurde in BOSC23 Virusverpackungszellen
transfiziert. Brustdrüsenzellen von der Maus (nicht zu Tumorzellen umgewandelte, immortalisierte Brustdrüsenzellen der Maus: NMuMG) wurden mit der Flüssigkeit des Kulturüberstands, die Retrovirus enthielt, infiziert. Die infizierten Brustdrüsenzellen von der Maus wurden auf Soft-Agar-Medium (Soft-Agarose-Gel) kultiviert und das Vorliegen von Wachstum, das von Verankerung unabhängig war, wurde beobachtet. Als (negative) Kontrolle wurden Brustdrüsenzellen von der Maus, in die ein Gen für Neomycinresistenz auf die gleiche
Weise eingebracht worden war, verwendet. Das Soft-Agar-Medium bestand aus einer unteren Schicht (DMEM,
10% FCS, 0,6% Agar) und einer oberen Schicht (DMEM, 10% FCS, 0,3% Agar) und 5 × 104 Zellen wurden auf
das Soft-Agar-Medium (10-cm-Platte) übertragen und man beließ sie 6–7 Wochen lang bei 37°C. Die Ergebnisse der Beobachtung sind in Fig. 3A (Zellen, in die KIFAS eingebracht wurde) und Fig. 3B (negative Kontrolle) dargestellt.
[0083] Wie von den Ergebnissen in Fig. 3A und Fig. 3B gezeigt wird, wurde ein im Vergleich mit der negativen Kontrolle merkliches, von Verankerung unabhängiges Wachstum in den mit KIFAS transformierten Brustdrüsenzellen der Maus beobachtet.
[0084] In gleicher Weise wie oben wurde die cDNA mit voller Länge für das KIF1b-β-Gen (SEQ ID NO: 4) in
einen Adenovirus-Vektor eingebracht und dazu verwendet, NMuMG Mammakarzinomzellen zu infizieren. Die
Zellen wurden in Medium gezüchtet und die Wachstumskurve wurde ermittelt, wie in Fig. 4 gezeigt. Als Kontrolle wurden NMuMG Mammakarzinomzellen, die mit einem Vektor, der nur den LacZ-Promotor enthielt, infi-
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ziert waren, verwendet. In der Abbildung stellt „MOI" die Zahl von Viren für die Infektion pro Zelle dar.
[0085] Die cDNA mit voller Länge für das KIF1b-β-Gen wurde auch in einen Adenovirus-Vektor eingebracht
und dazu verwendet, NB-C201 Zellen (eine homozygot-defiziente oder eine Neuroblastom-Zelllinie, der das
KIF1b-β-Gen fehlt) zu infizieren. Die Zellen wurden in Medium gezüchtet und die Wachstumskurve wurde ermittelt, wie in Fig. 5 gezeigt.
[0086] Fig. 4 und Fig. 5 zeigen beide, dass das Einbringen des KIF1b-β-Gens das Wachstum von Krebszellen supprimiert.
(Beispiel 4) Untersuchungen der Wirkungen von KIF1b-β-Gen und mit Kinesin verwandtem Gen, dem die Motordomäne fehlt, auf das Tumorwachstum mit der GSE-Methode (2)
[0087] Unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 3 beschrieben wurden Brustdrüsenzellen von
der Maus, die mit einem Retrovirusvektor, der KIFAS exprimierte, infiziert waren, unter die Haut des Oberschenkels einer nackten Maus transplantiert und das Vorliegen oder Fehlen von Tumorentstehung wurde bestätigt. Als (negative) Kontrolle wurden Brustdrüsenzellen von der Maus, in die auf gleiche Weise wie Beispiel
3 ein Gen für Neomycinresistenz eingebracht worden war, verwendet und sie wurden auch unter die Haut einer
nackten Maus transplantiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6A (KIFAS eingebracht) und in Fig. 6B (negative Kontrolle) gezeigt.
[0088] Wie durch die Ergebnisse in Fig. 6A und Fig. 6B gezeigt wird, wurde eine im Vergleich mit der negativen Kontrolle merkliche Tumorentstehung beobachtet, wenn die mit KIFAS transformierten Brustdrüsenzellen
der Maus unter die Haut des Oberschenkels der nackten Maus transplantiert wurden.
[0089] Mit KIFAS transformierte Brustdrüenzellen der Maus und Brustdrüsenzellen der Maus, in die ein Gen
für Neomycinresistenz eingebracht worden war, wurden auch in jeweils 5 nackte Mäuse einer behandelten
Gruppe und einer Kontrollgruppe transplantiert und die Veränderungen der Größen der Tumore, die sich bildeten, wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt, die klar eine Zunahme der Tumorgröße während der 5 Wochen nach der Transplantation in der behandelten Gruppe zeigt.
Industrielle Verwendbarkeit
[0090] Die Nukleinsäuren dieser Erfindung sind DNA oder RNA für neue, mit Kinesin verwandte Gene mit einer Motordomäne, welche die Basensequenzdaten der mit Kinesin verwandten Gene aufklären.
[0091] Die Nukleinsäuren dieser Erfindung oder ihre Fragmente können als Sonden oder Primer für verschiedene Arten von Hybridisierung oder PCR, gerichtet auf den Nachweis von Expression der mit Kinesin verwandten Gene in Gewebe oder Zellen und auf die Untersuchung ihrer Strukturen und Funktionen, verwendet werden. Die Kinesin-Proteine, für welche die Gene kodieren, können mithilfe der Gentechnologie hergestellt werden.
[0092] Weiterhin kann, da die Expression der Nukleinsäuren der Erfindung nur in klinischem Gewebe aus
Neuroblastom mit günstiger Prognose gesteigert ist, die Prognose eines Neuroblastoms auf der Basis ihres
Expressionsniveaus diagnostiziert werden.
[0093] Es wurde bestätigt, dass ein Supprimieren der Expression des KIF1b-β-Gens und des mit Kinesin verwandten Gens, dem die Motordomäne fehlt, mit Antisense-Nukleinsäuren gemäß der Erfindung ein von Verankerung unabhängiges Wachstum normaler Zellen, die inhärent nur in einer von Verankerung abhängigen
Weise wachsen, fördert. Das heißt, es wurde gezeigt, dass die Gene so wirken, dass sie eine Entartung normaler Zellen zu Krebszellen supprimieren. Es wurde weiter auch entdeckt, dass ein Einbringen des
KIF1b-β-Gens in Krebszellen das Wachstum der Zellen supprimiert. Auf der Grundlage dieser Befunde können
die Nukleinsäuren, Proteine etc. dieser Erfindung als Wirkstoffe gegen Krebs zur Behandlung von malignen
Tumoren zum Zweck des Supprimierens der bösartigen Entartung von Zellen verwendet werden.
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Patentansprüche
1. Nukleinsäure, die
a) eine Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz oder
b) eine Nukleinsäure, die für ein Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst,
kodiert,
ist.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung.
3. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 7 dargelegten Rasensequenz.
4. Protein mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz oder ein pharmazeutisch annehmba-
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res Salz davon.
5. Verwendung eines Proteins mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Neuroblastom.
6. Verwendung einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Neuroblastom.
7. Verfahren zum Bestimmen der Prognose von humanem Neuroblastom, wobei es das Verfahren umfasst, das Expressionsniveau des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 4 kodiert, in einer vorher
von einem Patienten gewonnenen, klinischen Gewebeprobe aus Neuroblastom zu ermitteln, wobei eine günstige Prognose mit einer im Vergleich zu einer klinischen Gewebeprobe mit einer ungünstigen Prognose erweiterten Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 4 kodiert, korreliert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ ID
NO: 4 kodiert, unter Verwendung von Nukleinsäuresonden oder von PCR Primern ermittelt wird.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen
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Anhängende Zeichnungen
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