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Entwicklung und Anwendung eines Analyseverfahrens für den qualitativen und quantitativen Nachweis von DNA-Addukten von N,N-Dimethylformamid in Humanurin Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Kristina Hennebrüder aus Mönchengladbach i Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 28. Juni 2007 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatterin : Prof. Dr. M. Pischetsrieder Zweitberichterstatter : Prof. Dr. J. Angerer ii Lebenslauf Kristina Hennebrüder Geboren am 12. Februar 1978 in Mönchengladbach Verheiratet, 1 Kind, Deutsche Staatsangehörigkeit Berufserfahrung Seit 08/2006 Anstellung als Diplom-Chemikerin Institut Dr. Appelt GmbH & Co.KG, Leipzig Hochschulausbildung 08/2005-07/2006 Promotionsstipendium im Rahmen des Hochschul- und WissenschaftsProgramms 05/2003-04/2005 Einstellung als wissenschaftliche Mitarbeiterin Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin, Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg, Promotion unter Leitung von Frau Prof. M. Pischetsrieder (Lebensmittelchemie) in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Angerer (Arbeitsmedizinische Toxikologie) 12/2002-03/2003 Wissenschaftliche Hilfskraft Analytische Untersuchungen im Rahmen des Hochwasserprojektes Adhoc, Umweltforschungszentrum Leipzig 11/2002 Abschluss: Chemie-Diplom (Gesamtnote: sehr gut) Diplomarbeit : Untersuchungen zur Anreicherung von Gd-Komplexen aus Oberflächenwässern, Umweltforschungszentrum Leipzig Betreuer: Prof. Dr. W. Engewald, Dr. R. Wennrich 09/2000-06/2001 Auslandsstudium in Frankreich Ecole Nationale Supérieure de Chimie Montpellier Ingenieurpraktikum: Nanofiltration von Modelllösungen zur Erstellung eines Simulationsprogrammes, Centre de Resources Technologiques, TechnoMembranes, Montpellier 10/1997-11/2002 Studium der Chemie Fakultät für Chemie und Mineralogie der Universität Leipzig Schulausbildung 06/1997 02/1995-06/1997 08/1994-01/1995 08/1988-07/1994 08/1984-07/1988 Abitur (Durchschnittsnote: 1,4) Gymnasium Leopoldinum, Detmold Marianne-Weber-Gymnasium, Lemgo Bischöfliches St. Ursula Gymnasium, Geilenkirchen Katholische Grundschule Gangelt I, Gangelt-Breberen iii Veröffentlichungen und Vorträge während der Bearbeitung dieser Dissertation Veröffentlichungen: K. Hennebrüder, J. Angerer, Determination of DMF modified DNA base N4methylcarbamoylcytosine in human urine using off-line sample clean-up, two-dimensional LC and ESI-MS/MS detection, Journal of Chromatography B 822(1-2), 124-132 (2005) H. U. Käfferlein, C. Ferstl, A. Burkhart-Reichl, K. Hennebrüder, H. Drexler, T. Brüning, J. Angerer The use of biomarkers of exposure of N,N-dimethylformamide in health risk assessment and occupational hygiene in the polyacrylic fibre industry, Occupational and Environmental Medicine, 62(5), 330-6 (2005) Vorträge (Vortragender unterstrichen): K. Hennebrüder, H.U. Käfferlein, H. Drexler, J. Angerer, Nachweis von DNA-Addukten im Urin von DMF-belasteten Beschäftigten - Ist DMF mutagen?, 45. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin e.V. (DGAUM), 06. - 09.April 2005, Bochum, Deutschland H. U. Käfferlein, K. Hennebrüder, T. Brüning, H. Drexler, J. Angerer, Exposition gegenüber N,NDimethylformamid an unterschiedlichen Arbeitsplätzen bei der Herstellung von Polyacrylfasern 44. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin e.V. (DGAUM) gemeinsam mit der Österreichischen Gesellschaft für Arbeitsmedizin, 21. - 24. April 2004, Innsbruck, Österreich Teile der Dissertation haben Anteil an dem bei der DFG beantragten und bewilligten Projekt „Entwicklung eines Biochemischen Effektmonitorings als Beanspruchungsindikator beruflicher DMFBelastungen“ (AN 107/15-3/4). iv Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Mai 2003 bis Januar 2007 am Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. J. Angerer angefertigt. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. J. Angerer für die Überlassung des interessanten Themas und die kontinuierliche Unterstützung in allen Bereichen meiner Tätigkeit am Institut. Frau Prof. Dr. M. Pischetsrieder vom Institut für Lebensmittelchemie danke ich herzlich für die Betreuung und die Begutachtung meiner Dissertation von Seiten der Naturwissenschaftlichen Fakultäten, sowie für ihr großes Interesse an interdisziplinärer Kooperation. Den Mitarbeitern von Acordis Kelheim GmbH und Frau Dr. A. Burkhart-Reichl danke ich für die Bereitstellung der Proben. Bei Dr. W. Versées von der Freien Universität Brüssel bedanke ich mich für das Testen der Nukleosidhydrolasen. Ich möchte mich generell bei den Mitarbeitern des Instituts für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin für die freundliche Zusammenarbeit bedanken. Kathleen Franke und Jan Irmler danke ich für ihre Unterstützung bei der Probenaufarbeitung. v Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................................viii 1. Einleitung und Aufgabenstellung............................................................ 1 2. Theoretische Grundlagen ........................................................................ 3 2.1 N,N-Dimethylformamid....................................................................................................... 3 2.2 Expositionskontrolle und Gesundheitsschutz.................................................................. 21 2.3 DNA-Addukte..................................................................................................................... 23 2.1.1 Allgemeines, Produktion und Verwendung von N,N-Dimethylformamid...................................... 3 2.1.2 Aufnahme und Metabolismus ......................................................................................................... 4 2.1.3 Akute Toxizität................................................................................................................................ 7 2.1.3.1 Tierstudien ............................................................................................................................. 7 2.1.3.2 Erfahrungen beim Menschen ................................................................................................. 7 2.1.4 Subchronische und chronische Toxizität......................................................................................... 8 2.1.4.1 Tierstudien ............................................................................................................................. 8 2.1.4.2 Erfahrungen beim Menschen ............................................................................................... 11 2.1.5 Reproduktions- und Entwicklungstoxikologie .............................................................................. 14 2.1.5.1 Tierstudien ........................................................................................................................... 14 2.1.5.2 Erfahrungen beim Menschen ............................................................................................... 15 2.1.6 Mutagenität und Kanzerogenität ................................................................................................... 15 2.1.6.1 In vitro Experimente ............................................................................................................ 16 2.1.6.2 In vivo Experimente............................................................................................................. 17 2.1.6.3 Erfahrungen beim Menschen ............................................................................................... 18 2.2.1 2.2.2 2.3.1 2.3.2 2.3.3 3. 4. Ambient Monitoring...................................................................................................................... 21 Biomonitoring ............................................................................................................................... 22 Entstehung, Reparatur und Ausscheidung..................................................................................... 23 DNA-Addukte als Biomarker........................................................................................................ 24 Nachweisverfahren für DNA-Addukte im Humanurin ................................................................. 26 Synthese und Charakterisierung der Standards ................................. 30 3.1 Synthese von N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin............................................................. 30 3.2 Synthese von N4-Methylcarbamoylcytosin ...................................................................... 31 3.3 Charakterisierung mit NMR............................................................................................. 32 3.4 Charakterisierung mit Massenspektrometrie ................................................................. 32 Analyseverfahren zur Bestimmung von N4-Methylcarbamoylcytosin und N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin in Humanurin.......................... 35 4.1 Grundlagen des Verfahrens .............................................................................................. 35 4.2 Geräte, Chemikalien, Lösungen ....................................................................................... 36 4.3 Probenvorbereitung ........................................................................................................... 37 4.4 Analytische Bestimmung ................................................................................................... 38 4.5 Optimierung des Analyseverfahrens ................................................................................ 42 4.4.1 4.4.2 Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie .......................................................................... 38 Tandem-Massenspektrometrie ...................................................................................................... 40 4.5.1 Hydrolyse von N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin zu N4-Methylcarbamoylcytosin..................... 42 4.5.2 Anreicherung des Analyten und Abtrennung von Matrixkomponenten........................................ 45 4.5.3 Analytische Bestimmung .............................................................................................................. 51 4.5.3.1 Gaschromatographie-Massenspektrometrie......................................................................... 51 4.5.3.2 Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie ............... 52 vi Inhaltsverzeichnis 4.6 Kalibrierung und Berechnung des Analysenergebnisses ............................................... 58 4.7 Qualitätssicherung ............................................................................................................. 59 4.8 Gütekriterien des Analyseverfahrens............................................................................... 60 4.9 Diskussion des Analyseverfahrens.................................................................................... 65 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 4.8.5 Nachweisgrenze ............................................................................................................................ 60 Präzision in Serie........................................................................................................................... 61 Präzision von Tag zu Tag.............................................................................................................. 61 Richtigkeit ..................................................................................................................................... 61 Studie zu Wiederfindung und Empfindlichkeit ............................................................................. 63 5. Qualitative Bestätigung des Nachweises von N4Methylcarbamoylcytosin in Humanurin................................................ 70 6. Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid .......................................... 73 6.1 Kollektive und Methoden .................................................................................................. 73 6.2 Ergebnisse........................................................................................................................... 76 6.1.1 6.1.2 Kollektive...................................................................................................................................... 73 Methoden ...................................................................................................................................... 74 6.2.1 Ergebnisse zur inneren Belastung ................................................................................................. 76 6.2.1.1 Ergebnisse zu N-Methylformamid....................................................................................... 76 6.2.1.2 Ergebnisse zu N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein ................................................... 77 6.2.1.3 Diskussion ........................................................................................................................... 77 6.2.2 Ergebnisse des biochemischen Effektmonitorings ........................................................................ 82 6.2.2.1 Ergebnisse zum Hämoglobin-Addukt N-methylcarbamoyliertes Valin .............................. 82 6.2.2.2 Ergebnisse zu den DNA-Addukten N4-Methylcarbamoylcytosin und N4Methylcarbamoyldeoxycytidin ............................................................................................ 82 6.2.2.3 Halbquantitative Abschätzung von N4-Methylcarbamoylcytosin und N4Methylcarbamoyldeoxycytidin ............................................................................................ 84 6.2.2.4 Diskussion ........................................................................................................................... 85 7. Zusammenfassung ................................................................................. 89 8. Summary.................................................................................................. 92 9. Literatur.................................................................................................... 95 10. Anhang................................................................................................... 107 10.1 Tabelle-Übersichtsartikel zu DNA-Addukten ............................................................... 107 10.2 Tabelle-Getestete Säulen ................................................................................................. 108 10.3 Abbildung-Produktscans von N4-Methylcarbamoylcytosin und isotopenmarkiertem N4-Methylcarbamoylcytosin (2-13C, 1,3-15N).................................................................. 109 10.4 Ergebnisse des Biomonitorings Kollektiv 1 ................................................................... 110 10.5 Ergebnisse des Biomonitorings Kollektiv 2 ................................................................... 112 10.6 Ergebnisse des Biomonitorings Kontrollkollektiv......................................................... 113 vii Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AGS AGW ALT AMCC AP AST Ausschuss für Gefahrstoffe Arbeitsplatzgrenzwert Alanin-Aminotransferase N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein Alkalische Phosphatase englisch: atmospheric pressure chemical ionisation, chemische Ionisation bei Atmosphärendruck Aspartat-Aminotransferase BAT BGW BSTFA cps CYP2E1 Biologischer Arbeitsstoff-Toleranzwert Biologischer Grenzwert N,O-Bis(trimethylsilyl)-trifluoracetamid englisch: counts per seconds, Zahl pro Sekunde Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase 2E1 DFG DMF DNA E. coli ESI Deutsche Forschungsgemeinschaft N,N-Dimethylformamid englisch: deoxyribonucleic acid, Deoxyribonukleinsäure Escherichia coli Elektrospray-Ionisation Fl/fl-Extraktion GC GC-MS gGT Flüssig/flüssig-Extraktion Gaschromatographie Gaschromatographie-Massenspektrometrie h Hb HCl HFC HMF HMMF englisch: hour, Stunde Hämoglobin Salzsäure Hochfrequenter SCE Hydroxymethylformamid N-(Hydroxymethyl)-N-methylformamid englisch: high performance liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie APCI HPLC IA γ-Glutamyl-Transpeptidase ILO IS Immunoaffinitätsaufreinigung englisch: International Agency for Research on Cancer, Internationale Agentur für Krebsforschung englisch: International Labour Organisation, Internationale Arbeitsorganisation Interner Standard LC LC/LC LC50 LC-MS LC-UV LD50 LOEL Flüssigkeitschromatographie, hier kurz für HPLC Zweidimensionale LC Letale Konzentration, bei der 50% der Versuchstiere sterben Flüssigkeitschromatographie mit Detektion mittels Massenspektrometrie Flüssigkeitschromatographie mit Detektion der Absorption von ultraviolettem Licht Letale Dosis, bei der 50% der Versuchstiere sterben englisch: lowest observed effect level, niedrigstes Level, bei dem ein Effekt beobachtet wird IARC viii Abkürzungsverzeichnis M m/z Max MIC min Min MAK MRM MS MS/MS MTBSTFA MW mol/L Masse/Ladung Maximalwert Methylisocyanat Minuten Minimalwert Maximale Arbeitsplatzkonzentration englisch: multiple reaction monitoring, Überwachung multipler Reaktionen Massenspektrometrie Tandem-Massenspektrometrie Methyl-N-tert(butyldimethylsilyl)trifluoroacetamid Mittelwert NMC NMC-Cyt NMC-Cyt* NMC-dC NMF NMR NOEL NWG N-MethylcarbamoylN4-Methylcarbamoylcytosin (2-13C, 1,3-15N) N4-Methylcarbamoylcytosin (isotopenmarkierter IS) N4-Methylcarbamoyl-2´-deoxycytidin N-Methylformamid Nukleare magnetische Resonanz englisch: no observed effect level, höchstes Level, bei dem kein Effekt beobachtet wird Nachweisgrenze OH-MeUra OxodG PFBzBr ppm englisch: Organisation for Economic Cooperation and Developement, Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung 5-Hydroxymethyluracil 8-Oxo-2`-deoxyguanosin Pentafluorbenzylbromid englisch: parts per million, hier mL/m3 RAM RNA RP RSD RT englisch: restricted access media, Medien mit eingeschränktem Zugang englisch: ribonucleic acid, Ribonukleinsäure englisch: reversed phase, Umkehrphase englisch: relative standard deviation, relative Standardabweichung englisch: retention time, Retentionszeit SCE SDH SIM SPE englisch: sister chromatid exchange, Schwesterchromatidaustausch Sorbitoldehydrogenase englisch: selected ion monitoring, Überwachung ausgewählter Ionen englisch: solid phase extraction, Festphasenextraktion TRGS UDS Technischen Regeln für Gefahrstoffe ungeplante DNA-Synthese englisch: United Nations Environment Programme, Umweltprogramm der Vereinten Nationen englisch: volume to volume, Volumenverhältnis englisch: World Health Organisation, Weltgesundheitsorganisation OECD UNEP v/v WHO ix Einleitung und Aufgabenstellung 1. Einleitung und Aufgabenstellung N,N-Dimethylformamid (DMF) ist ein wichtiges organisches Lösungsmittel, dessen weltweite Jahresproduktion oberhalb von 250.000 Tonnen liegt. DMF wird vor allem als Lösungsmittel in der chemischen Industrie und bei der Herstellung von Kunstfasern verwendet. DMF ist hepatotoxisch. Beim Umgang mit DMF kann es beim Menschen zur Erkrankung der Leber kommen. Handelt es sich dabei um eine durch Ausübung einer versicherten Tätigkeit bedingte Erkrankung, ist diese als anerkannte Berufskrankheit BK1316 entschädigungspflichtig. Im Tierversuch erwies DMF sich als embryotoxisch und teratogen. In den 1980er Jahren wurde DMF mit Krebsfällen an bestimmten Arbeitsplätzen in Verbindung gebracht. Kontrollstudien konnten eine Kanzerogenität von DMF nicht belegen. Von der International Agency for Research on Cancer (IARC) wurde DMF in Gruppe 3 eingeordnet: DMF is not classifiable as to its carcinogenity to humans. Bei der Produktion und Verwendung von DMF werden Beschäftigte exponiert. Um die individuelle Belastung zu erfassen, sind Raumluftmessungen nicht ausreichend, da DMF sowohl inhalativ als auch über die Haut aufgenommen wird. Die Hautgängigkeit eines Stoffes unterliegt individuellen Faktoren, so dass bei gleicher Luftbelastung unterschiedliche innere Belastungen der exponierten Personen vorliegen können. Zur Erfassung der individuellen inneren DMF-Belastung von Beschäftigten sind in der Arbeitsmedizin bisher vier Biomarker identifiziert und eingesetzt worden: der Metabolit N-Methylformamid (NMF) in Urin, die Merkaptursäure N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein (AMCC) in Urin und die Hämoglobin-Addukte (N-methylcarbamoyliertes Valin und N-methylcarbamoyliertes Lysin des Hämoglobins) im Blut. Als reaktives Intermediat im DMF-Metabolismus wird Methylisocyanat (MIC) angenommen, da es ebenfalls AMCC und die Hämoglobin-Addukte N-methylcarbamoyliertes Valin und N- methylcarbamoyliertes Lysin des Hämoglobins bildet. Die Bildung von Addukten mit Proteinen wie Hämoglobin im Körper ist anerkanntermaßen ein Hinweis auf die potenzielle Mutagenität eines Stoffes, das heißt auf die Eigenschaft an das Erbgut (DNA, Deoxyribonukleinsäure) zu binden und dann Veränderungen (Mutationen) hervorzurufen. Diese Mutationen können zur Kanzerogenese (Krebsentstehung) führen. Hämoglobin-Addukte gelten zudem als Surrogate (Ersatz) für DNAAddukte. DNA-Addukte können durch Reparaturmechanismen des Körpers entfernt und im Urin ausgeschieden werden. Der Nachweis eines DNA-Adduktes von DMF in Humanurin wäre die Bestätigung, dass DMF bzw. MIC im Menschen an die DNA binden und potentiell mutagene Substanzen sind. 1 Einleitung und Aufgabenstellung In vitro Experimente hatten gezeigt, dass von den DNA-Basen Cytosin das beste Substrat für die Reaktion mit MIC war und bei inkubierter DNA das Addukt N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin (NMC-dC) gebildet wurde. Das Ziel dieser Arbeit war es, basierend auf diesen Erkenntnissen das DNA-Addukt NMC-dC und/oder die entsprechende Base N4-Methylcarbamoylcytosin (NMC-Cyt) von DMF bzw. MIC im Urin DMF-belasteter Beschäftigter nachzuweisen. Dazu musste ein Analyseverfahren entwickelt werden, das die qualitative und quantitative Bestimmung der DNA-Addukte in Urin ermöglicht. Für das Verfahren mussten die DNA-Addukte von DMF bzw. MIC als Standardsubstanzen synthetisiert werden. Die Entwicklung des Verfahrens brachte zwei große Herausforderungen mit sich: Es galt eine sehr niedrige Nachweisgrenze zu erreichen, da zu erwarten war, dass die DNA-Addukte in Konzentrationen im pmol/L-Bereich im Urin vorliegen. Zudem musste eine sehr hohe Selektivität erreicht werden, damit das DNA-Addukt neben den vielen Störkomponenten im Urin spezifisch nachgewiesen werden konnte. Das entwickelte Verfahren sollte auf Beschäftigte, die am Arbeitspatz DMF exponiert waren, und ein Kollektiv nicht exponierter Kontrollpersonen angewendet werden. Anhand der Untersuchung des Kontrollkollektivs sollte überprüft werden, ob bei der Allgemeinbevölkerung eine Hintergrundbelastung vorliegt. Der gelungene Nachweis der DNA-Addukte des DMF ergänzte den DMF-Metabolismus und wäre ein zusätzlicher Hinweis auf die potentielle Mutagenität von DMF und des postulierten Intermediats MIC. Der Nachweis von DNA-Addukten könnte zu einer Neubewertung der eventuellen genotoxischen und mutagenen Eigenschaften von DMF für den Menschen führen. Zudem sollten sie die Einschätzung ermöglichen, welcher der Parameter (NMF, AMCC, Hämoglobin-Addukt, DNA-Addukt) sich besser für das Biomonitoring DMF-exponierter Personen eignet. 2 Theoretische Grundlagen 2. Theoretische Grundlagen 2.1 N,N-Dimethylformamid Umfassende Informationen zu N,N-Dimethylformamid (DMF, CAS-Nr. 68-12-2) finden sich im Concise International Chemical Assessment Document 31 - N,N-Dimethylformamide [1] des Internationalen Programms für Chemische Sicherheit (ein Joint venture von Weltgesundheitsorganisation (WHO), Internationaler Arbeitsorganisation (ILO) und vom Umweltprogramm der Vereinten Nationen (UNEP)) aus dem Jahr 2001. Dieses Dokument bietet prägnante Überblicke zu verschiedenen Aspekten von DMF darunter analytische Verfahren, Vorkommen in der Umwelt, Exposition von Menschen, Kinetik und Metabolismus, Effekte auf in vitro Testsysteme, Tier und Mensch und eine Bewertung der Auswirkungen für Gesundheit und Umwelt. Eine ähnliche Zusammenfassung bietet die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) in Form eines Screening Information Data Set - Initial assessment profile [2], das teilweise auf nicht veröffentliche Studien aus der Industrie zurückgreift. 2.1.1 Allgemeines, Produktion und Verwendung von N,N-Dimethylformamid DMF ist eine farblose, unbegrenzt mit Wasser mischbare Flüssigkeit und eines der wichtigsten organischen Lösungsmittel in der Industrie. Seine weltweite Jahresproduktion wurde im Jahr 1989 auf 250.000 Tonnen geschätzt [3]. Es kann davon ausgegangen werden, dass weltweit heute eine wesentlich größere Menge an DMF produziert wird. DMF wird überwiegend als Lösungsmittel bei der Synthese von Feinchemikalien, bei der Herstellung von Polyacrylnitrilfasern, bei der Beschichtung mit Polyurethanen und in der Elektroindustrie verwendet [1, 2, 4]. Daneben findet es in der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie, sowie als Lösungsmittel in Pflanzenschutzmitteln Verwendung [2]. Natürliche Quellen für DMF sind nicht bekannt [5]. Zur Emission von DMF in die Umwelt kann es bei dessen Produktion oder während seiner Nutzung als Lösungsmittel kommen. In Deutschland wurden in den alten Bundesländern im Jahr 1991 ca. 352 Tonnen in die Hydrosphäre und 9000 Tonnen in die Atmosphäre freigesetzt [5]. Produktinformationsregister in Europa zeigen zudem, dass einige Produkte DMF in bedeutenden Mengen enthalten, darunter solche, die für den Privatgebrauch bestimmt sind [2]. Die Exposition von Verbrauchern kann also nicht ausgeschlossen werden. Darüber 3 Theoretische Grundlagen hinaus können berufsbedingte Expositionen gegenüber DMF bei dessen Produktion und bei dessen Verwendung in unterschiedlichen Prozessen auftreten. 2.1.2 Aufnahme und Metabolismus DMF wird nach oraler, dermaler und inhalativer Aufnahme von Tier und Mensch gut resorbiert und im Organismus schnell und gleichmäßig verteilt. In der Leber wird es durch mikrosomale Enzymsysteme metabolisiert. Der Metabolismus eines Fremdstoffes wie DMF vollzieht sich in zwei Phasen. In Phase I erfolgt die Funktionalisierung, die der Einführung oder Freisetzung funktioneller Gruppen dient, die als Angriffspunkte für die Konjugation der Phase II dienen können [6]. In Phase I wird DMF durch die Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase 2E1 (CYP2E1), zu N-(Hydroxymethyl)-N-methylformamid (HMMF) metabolisiert (Metabolismus-Schema in Abbildung 1) [7, 8]. Aus HMMF entsteht N-Methylformamid (NMF), das weiter zu Hydroxymethylformamid (HMF) und dann zu Formamid metabolisiert wird. Die Metabolite HMMF und NMF werden renal ausgeschieden und können im Urin nachgewiesen werden. Sie stellen 22% bzw. 13% der inhalativ vom Menschen aufgenommen Dosis an DMF, während der Anteil von unverändertem DMF 0,3% beträgt [9]. In Phase II erfolgt die Konjugation der Fremdstoffe bzw. ihrer Phase I- Metaboliten mit körpereigenen Komponenten wie z.B. Glucuronsäure und Glutathion, mit dem Ziel die Ausgangssubstrate in besser wasserlösliche Produkte zu überführen [6]. Die Konjugation verschiedener Substratmoleküle an das endogene Glutathion erfolgt durch Glutathion-S-Transferasen. Beim DMF-Metabolismus kommt es ausgehend von NMF und/oder HMMF zur Konjugation mit Glutathion, die in S-(NMethylcarbamoyl)-glutathion (NMC-Glutathion) resultiert. Der Weg über HMMF ist möglich jedoch unwahrscheinlich. Bei Inkubation mit Lebermikrosomen ist die Bildungsrate von NMC-Glutathion in Gegenwart von NMF wesentlich größer als die in Gegenwart von HMMF [10]. Bei der Konjugation von NMF an Glutathion spielt die Katalyse von CYP2E1 eine Rolle [8, 10]. Dies wird dadurch belegt, dass die mikrosomale Bildung von NMC-Glutathion durch die Induktion des Enzyms gesteigert und durch einen Antikörper gegen CYP2E1 effektiv inhibiert wird [10]. Außerdem wird NMC-Glutathion bei Inkubation von Glutathion und NMF mit gereinigtem CYP2E1 gebildet [10]. NMC-Glutathion wird im Organismus weiter zu N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)cystein (AMCC) metabolisiert, das renal ausgeschieden wird. Bei inhalativer Aufnahme beträgt der Anteil von AMCC 13% [9]. Die Halbwertzeiten der Eliminierung betragen 2, 4, 5, 7 und 23 Stunden für DMF, HMMF, HMF, NMF und AMCC [9, 11]. Wegen der langen Halbwertszeit von AMCC kommt es zur Akkumulation von AMCC beim Menschen, so dass sich die Anteile der Metaboliten verschieben (16 h nach letzter Exposition, bei Exposition an fünf Tagen): 14% HMMF, 32% NMF, 54% AMCC [1]. Mraz et al. entdeckten, dass der Anteil von AMCC am DMF-Metabolismus beim Menschen größer ist als bei Nagetieren [12]. Sie argumentierten, dass das hepatotoxische Potential von DMF in Verbindung zum 4 Theoretische Grundlagen Ausmaß der metabolischen Umsetzung zu AMCC stehen könnte. Da AMCC auch nach Exposition gegenüber Methylisocyanat (MIC) identifiziert wurde [13, 14], wurde MIC als reaktives Intermediat im Metabolismus von DMF postuliert. Die Bindung von MIC an Glutathion ist reversibel [13, 15]. Die N-Methylcarbamoylgruppe kann auf andere nukleophile Stellen in Peptiden oder Proteinen übertragen werden [13, 15]. Deshalb wird angenommen, dass NMC-Glutathion nicht nur zur Entgiftung, sondern zur Verteilung von MIC im Organismus beiträgt [14, 16]. Das Hämoglobin-Addukt (Hb-Addukt) Nmethylcarbamoyliertes Valin (NMC-Valin) war bei in vitro und in vivo Versuchen mit MIC [17], sowie bei Unglücksopfern (Bhopal, Indien 1984) [18] nachgewiesen worden. Der Nachweis des HbAdduktes NMC-Valin bei Exposition von Personen gegenüber DMF bestätigte MIC als Intermediat des DMF-Metabolismus [19-22]. Zusätzlich wurde später das Hb-Addukt, N-methylcarbamoyliertes Lysin bei in vitro Versuchen mit MIC und in DMF-exponierten Beschäftigten nachgewiesen [23, 24]. Hb-Addukte gelten als Surrogate für DNA-Addukte [25, 26]. Die Bestätigung der Bildung von DMFDNA-Addukten bei DMF-exponierten Beschäftigten war Gegenstand dieser Arbeit. Daher sind im Metabolismus-Schema die DNA-Addukte mit einem Fragezeichen versehen. Segal et al. zeigten, dass MIC mit Deoxynukleosiden der DNA reagiert und N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin (NMC-dC), N6Methylcarbamoyldeoxyadenosin und N2-Methylcarbamoyldeoxyguanosin mit relativen Reaktivitäten von 100: 0,7: 0,003 bildet [27]. Bei in vitro Reaktionen mit MIC und Kalbsthymus DNA wurden NMC-dC und N6-Methylcarbamoyl-deoxyadenosin isoliert [28]. Es war also denkbar, dass mit MIC als Intermediat im DMF-Metabolismus die entsprechenden DNA-Addukte (Exemplarisch ist NMC-dC im Schema dargestellt.) gebildet wurden. 5 Theoretische Grundlagen H3C O HO H O N N H3C H DMF H N H H3C O H3C H3C C N H Formamid O MIC Postuliertes Intermediat H3C O CH3 NH H H HMF NMF O N HO H HMMF H O N HN DNAAddukte? Hb NH CH3 N NH H 3C O O S HO Glu O N O NH Hb-Addukt NMC-Val H3C O NMC-Glutathion OH NMC-Deoxycytidin OH O NH S NH H3C CH3 O O AMCC Abbildung 1: Metabolismus von DMF (in Anlehnung an [1]), Eingekreist ist die durch DMF/MIC hervorgerufene Modifizierung: N-Methylcarbamoylgruppe (NMC), DMF:Dimethylformamid, HMMF:N-(Hydroxymethyl)-N-methylformamid, NMF:N-Methylformamid, HMF:Hydroxymethylformamid, MIC:Methylisocyanat, Hb-Addukt NMC-Val:Hämoglobin-Addukt NMC-Valin, AMCC:N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein 6 Theoretische Grundlagen 2.1.3 Akute Toxizität Zur Toxizität von DMF gibt es Übersichtsarbeiten, darunter Stoffberichte [1, 5, 29] und Berichte speziell zur Hepatotoxizität [30] und zur chronischen Toxizität [31]. Akute Toxizität von DMF in Form von Leberschäden wird schon bei geringeren Konzentrationen beobachtet, letal ist DMF jedoch nur in relativ hohen Dosen. 2.1.3.1 Tierstudien Die akute Toxizität von DMF wurde an verschiedenen Spezies über unterschiedliche Aministrationswege untersucht. Bei einmaliger Gabe wirkte DMF erst in hohen Dosen tödlich. Die letalen Dosen liegen im Bereich von einigen g/kg Körpergewicht für orale, dermale und parenterale Aufnahme und im Bereich von einigen g/m3 bei inhalativer Aufnahme. Für Ratten werden z.B. letale Dosen, bei der 50% der Versuchstiere sterben (LD50), mit 3 bis 7,2 g/kg Körpergewicht (oral), 5 bis 11,5 g/kg Körpergewicht (dermal) angegeben [1]. Bei inhalativer Aufnahme liegt die letale Konzentration, bei der 50% der Versuchstiere sterben (LC50), bei 9 bis 15 g/m3 [1]. Die LD50-Werte für orale Aufnahme liegen bei der Maus zwischen 3,7 und 6,8 g/kg, beim Kaninchen zwischen 9,4 und 2,36 g/kg und beim Meerschweinchen zwischen 0,9 und 3,4 g/kg [5]. Bei trächtigen Kaninchen betrug die LD50 bei dermaler Aufnahme unter Occlusiv-Bedingungen 1,5 g/m3 [5]. Dies belegt, dass die Hautresorption toxischer Mengen möglich ist. Klinische Zeichen nach akuter Exposition waren u.a. Anästhesie, Appetitsverlust, Zittern, erschwertes Atmen und Leberschäden. Bei histopathologischen Untersuchungen zeigten sich Verfettung und Nekrosen in der Leber. Als Leitenzym der DMF-Schädigung der Leber wurde Sorbitoldehydrogenase (SDH) beschrieben [5]. 2.1.3.2 Erfahrungen beim Menschen Zur akuten Toxizität von DMF im Menschen liegen Kasuistiken vor, bei denen es akzidentiell zu hohen Expositionen kam. Sie wurden beim Umgang mit DMF durch Fehlfunktionen der Ausrüstung, Verschütten des Lösungsmittels über den Körper oder unzureichende Schutzmaßnahmen verursacht. Die Leber erwies sich dabei als kritisches Zielorgan der DMF-Schädigung [32]. Die Symptome umfassten u.a. Übelkeit, Erbrechen, Koordinationsstörungen, Gelbsucht, Durchfall, Alkoholintoleranz und Hautreizung [1, 29]. Klinische Untersuchungen zeigten Funktionsstörungen der Leber an [1, 29]. 7 Theoretische Grundlagen Bei Suizidversuchen mit T-61, einem veterinären Einschläferungsmedikament mit DMF als Lösungsmittel, wurden bis zu 0,6 mg DMF/kg Körpergewicht aufgenommen [33-36]. Es kam zu Gelbsucht, schweren Leberschäden bis hin zu Leberversagen [33-36]. Es wurden Erhöhungen der Serumspiegel verschiedener Leberenzyme, darunter Bilirubin, Aspartat-Aminotransferase (AST), Alkalische Phosphatase (AP) und Alanin-Aminotransferase (ALT) beobachtet [33, 35]. 2.1.4 Subchronische und chronische Toxizität Bei subchronischer und chronischer Exposition gegenüber DMF werden in Mensch und Tier übereinstimmend hepatotoxische Auswirkungen beobachtet. 2.1.4.1 Tierstudien Zur Untersuchung der Toxizität von DMF bei wiederholter Exposition wurde eine Vielzahl von Studien an Versuchstieren durchgeführt. Es wurden orale, dermale und parenterale Administrationswege untersucht. Die Applikationszeiträume lagen bei bis zu zwei Jahren. Als Versuchstiere wurden vor allem Ratten und Mäuse, aber auch Kaninchen, Meerschweinchen, Affen, Katzen, Hunde und Wüstenrennmäuse eingesetzt. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die wichtigsten Studien. DMF führte bei allen Spezies und Administrationsarten zu Veränderungen der Leber. Eine Ausnahme bildet die Studie von Hurtt et al. an Affen, die nach 13 Wochen Exposition eine ebenso lange Regenerierungszeit hatten [37]. Obgleich die besondere Aufmerksamkeit der Leber galt, wurden keine schädlichen Gesundheitsauswirkungen beobachtet. Die zwei Langzeitstudien werden nachfolgend eingehender beschrieben. In der Studie von Malley et al. wurden Ratten 24 Monate und Mäuse 18 Monate bis zu 400 ppm DMF inhalativ exponiert (6 h/Tag, 5 Tage/Woche) [38]. Die Ratten reagierten mit reduziertem Körpergewicht und erhöhtem relativen Lebergewicht bei 100 und 400 ppm. Die Serumaktivität von SDH war bei Ratten erhöht (100, 400 ppm). Substanzabhängige morphologische Veränderungen der Leber wurden beobachtet. Mikroskopische Untersuchungen offenbarten hepatische Schäden, darunter zentrilobulare hepatozelluläre Hypertrophie, Lipofuscin- oder Hämosiderin-Akkumulation in Kupfferzellen und Einzelzellnekrosen (100 und 400 ppm). Bei Mäusen wurden erhöhte Lebergewichte (100 und 400 ppm) und bei allen Expositionskonzentrationen mikroskopische Veränderungen der Leber beobachtet. Untersuchungen zeigten leicht erhöhte Zellproliferation bei männlichen Ratten in der höchsten Expositionsgruppe nach zwei Wochen und drei Monaten, nicht aber nach zwölf Monaten. Bei weiblichen Tieren wurden stromale, endometriale Polypen der Gebärmutter festgestellt. Im Vergleich zu Kontrollen waren die Ergebnisse aber nicht signifikant erhöht, so dass DMF unter den gewählten 8 Theoretische Grundlagen Versuchsbedingungen als nicht onkogen erachtet wurde. Der no observed effect level (NOEL) wurde für Ratten mit 25 ppm und der lowest observed effect level (LOEL) für Mäuse mit 25 ppm angegeben [38]. In der aktuelleren Langzeitstudie des Japanese Bioassay Research Center an Ratten und Mäusen aus dem Jahr 2004 (Inhalation von bis zu 800 ppm, 6 h/Tag, 5 Tage/Woche, 24 Monate) wurden ebenfalls hepatische Schäden und Erhöhung von Lebergewichten und Serumwerten (γ-Glutamyl-Transpeptidase gGT, ALT, AST, Bilirubin) beobachtet [39]. Im Gegensatz zur Studie von Malley et al. trat eine signifikante Erhöhung von Adenomen und Karzinomen in der Leber der Tiere auf. Der LOEL lag für beide Spezies bei 200 ppm, der niedrigsten Expositionskonzentration. Die Ergebnisse zu Leberschäden wie Lebervergrößerungen, Leberverfettung und Nekrosen sind im Allgemeinen konsistent in allen Studien. Begleitet werden diese Schäden von einer Erhöhung der Serumenzymaktivitäten (z.B. AST, ALT, SDH). Als weitere Zielorgane der Toxizität von DMF sind u.a. Herz, Lunge, Magendarmtrakt, Niere, Nervensystem und Reproduktionssystem beschrieben [5]. Hauptzielorgan der toxischen Wirkung von DMF ist jedoch die Leber. 9 Inhalation 0, 150, 300, 600, 1200 ppm Inhalation 0, 100, 200, 400, 800, 1600 ppm 0, 50, 100, 200, 400, 800 ppm Inhalation 0, 30, 100, 500 ppm Inhalation 0, 25, 100, 400 ppm Ratte, Maus Ratte, Maus Affen Ratte, Maus 6 h/Tag 5 Tage/Woche 24 Monate 1 Dosis/Tag 90 Tage 6 h/Tag 5 Tage/Woche 18-24 Monate Dauer 6 h/Tag 5 Tage/Woche 13 Wochen 6 h/Tag 5 Tage/Woche 12 Wochen 6 h/Tag 5 Tage/Woche 2 Wochen bzw. 13 Wochen 6 h/Tag 5 Tage/Woche 13 Wochen Senoh et al. [42] Hurtt et al. [37] Erhöhtes Lebergewicht, hepatozelluläre Nekrose, zentrilobulare Fibrose, zentrilobulare, hepatozelluläre Hypertrophie, erhöhte Serumwerte (AST, ALT, Cholesterin, Phospholipid) Keine Veränderungen bezüglich Organgewebe, Gewicht, Hämatologie und klinischer Chemie nach 13 Wochen Erholungsphase Senoh et al. [39] Malley et al. [38] Craig et al. [41] Dosisabhängige Verringerung von AP bei männlichen und Erhöhung bei weiblichen Tieren, hispathologische Veränderung der Leber, Maus:10% und 40% Todesrate bei 600 bzw. 1200 ppm Verringerte Gewichtszunahme, dosisabhängige Erhöhung von Serum-SDH, erhöhtes Lebergewicht, zentrilobulare, hepatozelluläre Hypertrophie, hepatische Akkumulierung von Lipofuscin und Hämosiderin, hepatische Nekrose, Kupfferzell-Hypertrophie, Pigmentakkumulation Erhöhtes Lebergewicht, erhöhte Serumwerte (gGT, ALT, AST, Bilirubin), Erhöhung hepatozellulärer Adenome, Karzinome, Hepatoblastome, veränderte Zellherde in der Leber Vergrößerung hepatischer Zellen, hämatologische Effekte (Anämie, Leukozytose), verringerte Gewichtszunahme, erhöhtes Serumcholesterin Lynch et al. [40] Referenz Erhöhtes Lebergewicht, hepatozelluläre Nekrose, erhöhte Serumwerte (ALT, SDH, Isocytratdehydrogenase) Effekte Ratte Oral Kennedy et 0, 10, 50, 250 mg/kg KG Shermann [41] Oral Ratte, 1 Dosis/Tag Becci et al. Verringertes Wachstum, erhöhtes Lebergewicht Ratte ~ 0, 20, 69, 235 mg/kg KG Maus 15-17 Wochen [43] Maus ~ 0, 28, 96, 326 mg/kg KG WüstenOral 1 Dosis/Tag Llewellyn et Hohe Todesrate der Tiere ab 7-11 mg/kg KG, Leberschäden, Nierenschäden rennmaus ca. 5-40 mg/kg KG 200 Tage al. [44] 3 ppm:parts per million (hier mL/m ), KG:Körpergewicht, ALT:Alanin-Aminotransferase, SDH:Sorbitoldehydrogenase, AP:Alkalische Phosphatase, AST:AspartatAminotransferase, gGT:γ-Glutamyl-Transpeptidase, Inhalation 0, 200, 400, 800 ppm Inhalation 0, 50, 100, 200, 400, 800 ppm Ratte, Maus Ratte, Maus Dosis Spezies Tabelle 1: Subchronische und chronische Toxizität von DMF bei Versuchstieren 10 Theoretische Grundlagen Theoretische Grundlagen 2.1.4.2 Erfahrungen beim Menschen In Übereinstimmung zu Tierversuchen war auch bei beruflicher Exposition von Beschäftigten gegenüber DMF die Leber das Zielorgan der Toxizität. Die hervorgerufenen Effekte sind ähnlich wie bei Tieren und umfassen Zunahme der Serumleberenzyme, histopathologische Effekte, Kopfschmerzen, Übelkeit, Schwindel, Alkoholintoleranz und gastro-intestinale Störungen. In älteren Studien wurden neben Schäden der Leber (mit erhöhten Enzymwerten u.a. ALT, AST) Herz-Kreislauf-Störungen, Störungen des Nervensystems und gastro-intestinale Störungen beschrieben [5, 45]. Jedoch fehlen oftmals die Angaben zur Arbeitsplatzkonzentration und CoExposition mit anderen Substanzen [5]. Eine Übersicht zu Studien mit Überwachung der Arbeitsplatzkonzentration und Bestimmung von Leberenzymwerten bietet Tabelle 2. Die Studien unterscheiden sich bezüglich der Zahl der erfassten Beschäftigten, des Ausmaßes und der Dauer der DMF-Exposition und des Ausmaßes der Co-Exposition gegenüber anderen Substanzen. Sie beschreiben aber konsistent den Anstieg der Serumenzymwerte von Beschäftigten mit relativ hoher Exposition (>8 ppm). Nachfolgend werden die fünf umfangreichsten Studien (Anzahl der erfassten Beschäftigten 75) und eine Studie, bei der Leberbiopsien durchgeführt wurden, kurz beschrieben. Fiorito et al. untersuchten 75 Beschäftigte einer Fabrik, in der synthetisches Leder hergestellt wurde [46]. Die Luftbelastung lag zwischen 0,7 und 15 ppm (durchschnittlich 7 ppm). Hautkontakt mit DMF wurde nicht ausgeschlossen. Das Kontrollkollektiv umfasste 75 Personen gleichen Alters, Geschlechts, sozialen Status und Wohnorts. Störeinflüsse von Alkohol und zuvor bestehender Lebererkrankung wurden durch gezielte Auswahl der Personen minimiert. Der Leberfunktionstest umfasste u.a. AST, ALT, gGT und AP. Die mittleren Serumwerte dieser Enzyme waren in zwölf der 75 DMF-Exponierten signifikant erhöht. Siebzehn Prozent der Beschäftigten hatten eine anormale Leberfunktion gegenüber nur 4% des Kontrollkollektivs. Multivariate Analysen bestätigten, dass die Werte von ALT, AST und gGT signifikant mit zunehmender DMF-Exposition korrelierten. 50% der exponierten Beschäftigten berichteten von gastro-intestinalen Beschwerden, 40% von Kopfschmerzen, Herzklopfen, Benommenheit und Zittern nach Alkoholkonsum. Viele vermieden daher Alkohol. Cirla et al. beobachteten bei exponierten Beschäftigten (DMF 3-19 ppm, Mittelwert 7 ppm) vermehrtes Auftreten hoher Serumwerte für AP, AST, ALT und gGT (25 von 100 Personen) im Vergleich zu einer Kontrollgruppe (10 von 100) [47]. Wang et al. erfassten 186 Beschäftigte und berichteten, dass hohe Expositionskonzentrationen (2560 ppm) signifikant mit erhöhten ALT-Werten assoziierten [48]. Dieses Ergebnis änderte sich auch bei Stratifizierung des Hepatitis B Träger Status nicht. Bei einem Kollektiv von 126 Beschäftigten fanden Wrbitzky und Angerer über personengebundene Probenahme DMF-Konzentrationen von 0,1 bis 37,9 ppm (Median 1,2 ppm) [49]. Parallel wurde ein 11 Theoretische Grundlagen Kontrollkollektiv von 54 Personen untersucht. Verschiedene Leberfunktionsparameter wurden analysiert, darunter AST, ALT, gGT, AP, Cholinesterase und Albumin [50]. Der Median des Kollektives zeigte keine Überschreitung der Normalwerte, auch wenn einzelne Fälle außerhalb der Normalbereiche lagen. Nur bei gGT und AST wurden statistisch erhöhte Werte bei den exponierten Personen gefunden. Alkoholkonsum wurde als Mitverursacher nicht ausgeschlossen. Beschwerden nach dem Genuss von Alkohol wurden von 72% der exponierten Beschäftigten beschrieben (4% des Kontrollkollektivs). Aufgrund dessen hatten 15% der Beschäftigten seit Beginn der Beschäftigung ihren Alkoholkonsum verringert. Cai et al. untersuchten 318 DMF-exponierte Beschäftigte (195 Männer, 123 Frauen) und 143 nicht DMF-exponierte Kontrollpersonen (67 Männer, 76 Frauen) [51]. Die DMF-Exposition lag bei bis zu 7 ppm und bei Co-Exposition mit Toluol bei bis zu 4,2 ppm. Die Ergebnisse bezüglich Hämatologie und Serumwerte (AST, ALT, gGT) waren bei DMF-exponierten und Kontrollpersonen vergleichbar. Die subjektiven Symptome der Beschäftigten (Übelkeit, Bauchschmerzen, Alkoholintoleranz) zeigten jedoch einen konzentrationsabhängigen Anstieg. In einer Studie mit sieben DMF-exponierten Beschäftigten wurden neben der Bestimmung von Leberfunktionswerten auch Biopsien durchgeführt [52]. Drei der Personen waren weniger als drei Monate exponiert und vier länger als ein Jahr. Die drei kurzzeitig Exponierten beschrieben Symptome wie Bauchschmerzen, Appetitlosigkeit und Alkoholunverträglichkeit. Die Serumwerte der Aminotransferasen waren erhöht, mit einem ALT/AST-Verhältnis von größer als eins. Leberbiopsien ergaben hepatozelluläre Nekrose und mikrovesikulare Verfettung. Bei den Beschäftigten mit längerer Expositionszeit waren die Enzymwerte nur leicht erhöht und die Biopsien zeigten makrovesikulare Verfettung, aber kein Zeichen persistenter akuter Erkrankung oder Fibrose. 12 0,3-15,5 ppm (im Allgemeinen <10 ppm) statistische Flächenüberwachung 0,2-8 ppm Flächenüberwachung 1-27 ppm 4-8 ppm 0,9-86,6 ppm 7 ppm Flächenüberwachung an verschiedenen Arbeitsplätzen 3-20 ppm personengebundene Probenahme 2,3 ppm personengebundene Probennahme 10-60 ppm Flächenstichproben 0,1-7 ppm personengebundene Probennahme ppm:parts per million (hier mL/m3) 5-20 ppm 1-5 ppm personengebundene Probennahme, Flächenüberwachung 10-42 ppm Flächenüberwachung Luftkonzentration 13 Erhöhung (ohne genaue Angabe) - 27 28 66 75 100 126 183 318 Signifikante Erhöhung Signifikante Erhöhung Erhöhung Erhöhung Keine Auswirkung Co-Exposition einiger Beschäftigter mit weiteren Lösungsmitteln Co-Exposition einiger Beschäftigter mit Toluol - - - Co-Exposition mit Acrylnitril 26 - Exposition gegenüber Lösungsmitteln Nur wenige Details angegeben. - Störeinflüsse Erhöhung (ohne genaue Angabe) Keine Auswirkung Keine Auswirkung Erhöhung 22 13 Erhöhung Keine Auswirkung 6 Zahl der Beschäftigten Keine Auswirkung Auswirkung auf Leberenzyme Tabelle 2: Auswirkung von beruflicher DMF-Exposition auf die Leberfunktion im Menschen (in Anlehnung an [1]) Cai et al. [51] Wang et al.[48] Wrbitzky et Angerer, Wrbitzky [49, 50] Cirla et al. [47] Fiorito et al. [46] Paoletti et al. [58] Catenacci et al. [59] Luo et al. [60] Major et al. [57] Lauwerys et al. [56] Tomasini et al. [55] Yang et al. [54] Yonemoto et Suzuki [53] Referenz 13 Theoretische Grundlagen Theoretische Grundlagen 2.1.5 Reproduktions- und Entwicklungstoxikologie Bei Versuchstieren wurden bei Exposition gegenüber DMF embryotoxische, fetotoxische und teratogene Auswirkungen beobachtet. 2.1.5.1 Tierstudien Ältere Studien (bis 1990) zeigten, dass DMF bei höherer Dosis über alle Administrationswege zu statistisch signifikanter Zunahme embryotoxischer und teratogener Effekte führte [5, 29]. Bei neueren Studien wurden nicht immer Reproduktions- und Entwicklungsschäden beobachtet. In einer Studie an Ratten und Mäusen (bis zu 800 ppm, 6 h/Tag, 5 Tage/Woche, 13 Wochen) wurden Spermiumdichte und -beweglichkeit, sowie Zahl und Länge der Zyklen beobachtet [40]. Nur bei der höchsten Expositionsgruppe zeigte sich eine Verlängerung des Zyklus. Hurtt et al. fanden bei exponierten Affen (bis zu 500 ppm, 6h/Tag, 5 Tage/Woche, 13 Wochen) keine Veränderungen des Samenvolumens und der Spermiumbeweglichkeit [37]. An Mäusen wurde eine Studie über drei Generationen (F0, F1, F2) durchgeführt [61]. Die chronische Exposition gegenüber DMF im Trinkwasser mit Konzentrationen von 0, 1000, 4000 und 7000 mg/L (ca. 200-1300 mg/kg Körpergewicht/Tag) führte zu verminderter Fruchtbarkeit beim ersten Wurf (4000 mg/L). Bei Kreuz-Paarung (7000 mg/L) wurden die F0 Weibchen als die betroffene Gruppe identifiziert. Die postnatale Überlebensquote der F1-Generation war reduziert bei 4000 mg/L. F1Paarung reduzierte die F2-Wurfgröße und das Gewicht der Jungtiere bei 1000 mg/L. DMF- exponierte Jungtiere, der F1 und F2-Generation hatten Schädel- und Skelettmissbildungen. Hellwig et al. untersuchten die pränatale Toxizität von DMF an Kaninchen, Ratten und Mäusen bei oraler, dermaler, inhalativer und intraperitonealer Administration [62]. Bei oraler Gabe (über Sonde) wurden vermehrte Missbildungen bei Ratten und Mäusen ohne offenkundige Anzeichen maternaler Toxizität beobachtet (166 und 182 mg/kg Körpergewicht/Tag Ratten bzw. Mäuse). Nach dermaler Administration zeigte sich ein dosisabhängiges Auftreten von Teratogenität in Ratten und Kaninchen ohne bzw. bei leichter maternaler Toxizität. Inhalation von 287 ppm führte bei Ratten zu Fetotoxizität und Embryoletalität. Teratogene Auswirkungen wurden bei Kaninchen bei 450 und 150 ppm beobachtet. Bei intraperitonealer Injektion zeigte sich in Mäusen Teratogenität (944 mg/kg Körpergewicht/Tag) und leichte Embryotoxizität (378 mg/kg Körpergewicht/Tag). Bei Administration von DMF an Ratten über Magensonde zeigten sich Entwicklungsschäden der Föten in Form von verringertem Gewicht bei 100, sowie fehlenden oder schlecht ausgebildeten Brustbein- und Schädelsegmenten bei 200 und 300 mg DMF/kg Körpergewicht/Tag an den Gestationstagen 6 bis 20 [63]. Maternale Toxizität wurde ab 100 mg/kg Körpergewicht vorgefunden. 14 Theoretische Grundlagen Mittels Administration von [14C]DMF wurde festgestellt, dass DMF und dessen Metaboliten ins Embryo- und Fötusgewebe transferiert wurden. DMF, HMMF und NMF wurden außerdem in der Muttermilch nachgewiesen. Bei einer Inhalationsstudie an Ratten führte DMF (300 ppm, Gestationstage 6 bis 15) zu verringerter Gewichtszunahme des Muttertiers und geringerem Fötengewicht [64]. Missbildungen wurden nicht beobachtet. Bei epikutaner Administration von DMF an Ratten (Gestationstage 6-15 oder 1-20, 2 mL DMF/kg Körpergewicht) verringerten sich Körpergewicht, Gewichtszunahme und Schwangerschaftsrate [65]. Außerdem wurde eine Verringerung der Anzahl lebender Föten, des Fötengewichts und eine Erhöhung des Absterbens eingenisteter Eizellen beobachtet. Diese Effekte waren bei längerer Exposition ausgeprägter. Der LOEL betrug 1 mL DMF/kg Körpergewicht. Klug et al. untersuchten die Entwicklungstoxizität von DMF, NMF und deren Hauptmetaboliten in einem Maus-Gliedmaßenknospen-Versuch [66]. Im Gegensatz zu DMF, NMF und HMMF zeigten die Metaboliten NMC-Glutathion, NMC-Cystein und AMCC Entwicklungsaktivitäten. Die Autoren schlussfolgerten daher, dass die Entwicklungstoxizität von DMF in Beziehung zum Ausmaß der Bindung an Glutathion steht. 2.1.5.2 Erfahrungen beim Menschen Zu Entwicklungs- und Reproduktionsschäden von DMF liegen nur wenige Informationen vor. Eine Studie aus dem Jahr 2004 zeigte, dass bei DMF-exponierten Beschäftigten die Spermienbeweglichkeit im Vergleich zu Kontrollpersonen signifikant reduziert war [67]. Die Mobilitätsparameter standen in Dosis-Wirkungs-Beziehung zur NMF-Konzentration im Urin. In unzureichend dokumentierten Studien wurden Hinweise auf höhere Abortraten und Zyklusstörungen bei DMF-exponierten weiblichen Beschäftigten gefunden [29]. 2.1.6 Mutagenität und Kanzerogenität Mutagenität und Kanzerogenität von DMF sind derzeit ungeklärt. Die meisten in vitro und in vivo Studien zeigten bisher keine genotoxische, mutagene oder kanzerogene Eigenschaft von DMF. In den 1980er Jahren wurden einige Krebsfälle in Zusammenhang mit DMF beobachtet, die in Kontrollstudien aber nicht belegt werden konnten. Der gelungene Nachweis von Hb-Addukten von DMF nach beruflicher Exposition ist ein Hinweis auf die genotoxische Wirkung von DMF [19, 20, 22, 24]. Aufschluss gäbe der gelungene Nachweis von DNA-Addukten von DMF. 15 Theoretische Grundlagen 2.1.6.1 In vitro Experimente Zur Ermittlung von Mutagenität und Genotoxizität von DMF wurden verschiedene in vitro Versuche mit mikrobiellen Testsystemen und Säugerzellkulturen durchgeführt. Eine Zusammenfassung der Studien bietet Tabelle 3. Die Testergebnisse waren fast ausschließlich negativ. Das Ergebnis eines Ames-Tests war zweideutig [68]. Tabelle 3: Genotoxizität in vitro, + bzw. - positives, negatives Ergebnis, * inkonklusiv (entnommen aus [5]) Methode/Endpunkt Ames-Test Rec Assay E. coli differential killing Tests E. coli Rec Assay SOS-Chromotest Vorwärts-Mutation an Hefen Reversion an Hefen Konzentration Zell-Typ 10.000 µg/Platte 2500 µg/Platte (als Fluktuations-Test) 500 µg/mL 20 mg/Platte 33,3 mg/mL Salmonella typhimurium TA 98, 100, 1535, 1537, 1538 (-,+ S9) + [68-71] [68] TA 98, 100 (Aktivierung mit Hepatozyten) * [68] Bacillus subtilis (-,+ S9) WP2, WP6, CM871, W3110, P3478 - [68] [68] 100 µL/mL 1 g/mL 7,3 ng-7,3 mg/mL E. coli W3110, P3478 (-,+ S9) - [68] JC1, 9328, 8471, 5519, 7623, 7689 E. coli (-,+ S9) Schizosaccharomyces pompe, P1 S. cerevisiae (XV 185-14c) S. cerevisiae JD1 S. cerevisiae D7, D4 S. cerevisiae T1, T2 + - [68] [71] [68] [68] Mitotische Rekombination [68] Mitotisches crossing over 10-10.000 µg/mL S. cerevisiae T1, T2 - [68] Mitotische Aneuploidie LOEL 100 µg/mL S. cerevisiae D6 (- S9) + [68] 5 µL/mL 1000 µg/mL S. cerevisiae D7 (+ S9) S. cerevisiae JD1 - [68] [68] LOEL 300 µg/mL S. cerevisiae wild, rad + [68] 0,01-100 µg/mL 8-200 µg/mL Humanfibroblasten HeLa-Zellen - [68] 1,1-90 µg/mL (-S9) 2-30 µg/mL (+S9) 0,032-100 µg/mL Humanfibroblasten (WI-38) (-,+ S9) Humanfibrolasten (Hautbiopsien) HeLa-Zellen Primäre Hepatozyten (Nagetiere) - Mitotische Genkonversion DNA-Reparatur-Test an Hefen Kernvergrößerung Unplanmäßige DNASynthese-Test 0,1-100 µg/mL [68] [72-75] Schwesterchromatidaustausch 0,00625-0,1% 1-100 µg/mL CHO-Zellen (-,+ S9) CHO-Zellen Periphere Humanlymphozyten - [68] Chromosomenaberrationen 75-300 µg/mL Zellinie aus Rattenleberepithel - [68] 46,9-3000 µg/mL L5178Y - [68] 5000 µg/mL L5178Y + [76] 0,2-0,5 µg/mL Human-Lungenfibrolasten (HSC 172) - [68] mouse lymphoma Genmutationstest Genmutation (Diphterietoxin-Resistenz) [69] 0,011-1,1 mol/L [69] Periphere Humanlymphozyten 10-20% + [77] +/- S9 : mit/ohne S9 mix zur metabolischen Aktivierung, LOEL: lowest observed effect level-niedrigstes Level, bei dem ein Effekt beobachtet wird In vitro Cytogenetik 16 Theoretische Grundlagen 2.1.6.2 In vivo Experimente Einen Überblick der in vivo Studien zur Mutagenität und Genotoxizität von DMF bietet Tabelle 4. Wiederum waren die Testergebnisse mehrheitlich negativ. Zur Kanzerogenität von DMF in Tieren liegen einige ältere Berichte und zwei neuere adäquate Langzeitstudien vor. In älteren Studien wurde bei Ratten bei oraler Gabe (Trinkwasser), subkutaner und intraperitonealer Injektion keine erhöhte Tumorinzidenz festgestellt [78, 79]. Intraperitoneale Injektion von DMF (ca. 250 mg/kg Körpergewicht/Woche, 6-8,5 Monate) führte bei syrischen Hamstern nicht zum Auftreten von Tumoren [80]. Die zwei neueren Langzeitstudien aus den Jahren 1992 [38] und 2004 [39] sind widersprüchlich. Malley et al. exponierten Ratten 24 Monate und Mäuse 18 Monate bis zu 400 ppm DMF (Inhalation, 0, 25, 100, 400 ppm, 6 h/Tag, 5 Tage/Woche) [38]. Nur in männlichen Ratten wurde bei 400 ppm DMF eine leicht erhöhte Zellproliferation nach zwei Wochen und nach drei Monaten festgestellt. Diese war nach zwölf Monaten aber nicht mehr zu beobachten. Weibliche Ratten zeigten stromale, endometriale Polypen der Gebärmutter (1,7%, 5,1%, 3,4% und 14,8% bei 0, 25, 100 bzw. 400 ppm DMF). Ältere Kontrolldaten des Institutes belegten einen variablen Inzidenzbereich für derartige Polypen in nicht exponierten Tieren (2-15%). Die Autoren schlussfolgerten, dass DMF unter den gewählten Versuchsbedingungen nicht onkogen war. Das Japanese Bioassay Research Center führte an Ratten und Mäusen eine ähnliche Studie durch, wobei die Expositionskonzentrationen höher waren (Inhalation 0, 200, 400, 800 ppm, 6 h/Tag, 5 Tage/Woche, 24 Monate) [39]. Bei Ratten war die Zahl der hepatozellulären Adenome (400, 800 ppm) und Karzinome (800 ppm) signifikant erhöht. Bei Mäusen kam es bei allen Expositionskonzentrationen zu signifikant erhöhtem Auftreten von hepatozellulären Adenomen und Karzinomen. Desweiteren war die Inzidenz von Hepatoblastomen in männlichen Mäusen (200, 400 ppm) erhöht. In beiden Spezies traten veränderte Zellherde auf, die konzentrationsabhängig waren und im kausalen Zusammenhang zu den hepatozellulären Tumoren standen. Die Autoren schlossen, dass die DMFExposition zu vermehrter Inzidenz von hepatozellulären Adenomen, Karzinomen und Hepatoblastomen führte und dass die Hepatokarzinogenität von DMF in Mäusen ausgeprägter war als in Ratten. 17 Theoretische Grundlagen Tabelle 4: Genotoxizität in vivo, + bzw. – positives, negatives Ergebnis (entnommen aus [5]) Methode Ames-Test mit Blut DMFexponierter Mäuse Spezies/Stamm Ratte Ratte Maus Ratte Dosis/Zufuhrweg 0,17-5,1 g/kg KG i.p. als 1, 20, 25 oder 30%ige DMF-Lösung, Blutentnahme nach 30, 60, 90, 120 und 140 min 30, 300 mL/m3 Inhalation 6h/Tag, 5 Tage 10, 400 mL/m3 Inhalation 7h/Tag, 5 Tage 400, 680 mL/kg KG i.p. 2,3-600 mg/m3 Inhalation Maus 60% der LD50 i.p. + [81] - [82] [83] [84] [85] - [68] 0,425-1,7 mL/kg KG i.p. 0,4-1,6 mL/kg KG i.p. >1mg/kg KG 1× / 3 × + 0,1-1,5 mL/kg KG i.p. 0,2-2000 mg/kg KG i.p. Spermienzellmorphologie 5×0,1-1,5 mL/kg KG i.p. Ratte 10, 400 ppm Inhalation 5 h/Tag, 7 Tage KG:Körpergewicht, i.p.:intraperitoneal, LD50:letale Dosis bei der 50% der Versuchstiere sterben [68] [68] [86] [68, 69] [87] Dominant Letal-Test Chromosomaberration Schwesterchromatidaustausch Mikronukleus-Test 2.1.6.3 Maus ICR Maus CD-1 Maus Kunming-Maus Maus BALB/C Maus [88] Erfahrungen beim Menschen Für die Genotoxizität von DMF bei beruflicher Exposition liegen einige ältere Studien zu DNA- und Chromosomen-Schäden in peripheren Lymphozyten vor [89-91]. Diese berücksichtigten Rauchen nicht als Mitverursacher [89]. Zudem kam es zu Co-Exposition mit anderen Chemikalien [90]. Seiji et al. untersuchten die Auswirkungen von beruflicher Exposition auf Raten des Schwesterchromatidaustauschs (SCE) in peripheren Lymphozyten von 22 DMF exponierten Frauen (0,3-5,8 ppm) im Vergleich zu einer Kontrollgruppe [92]. Alle Personen waren Nichtraucher und Nichttrinker. Die SCE-Raten waren in stark (5,8 ppm) und mittel (0,7 ppm) exponierten Gruppen signifikant höher als in den entsprechenden Kontrollgruppen. Zur Bewertung genotoxischer Effekte bei beruflicher Exposition gegenüber DMF und Acrylnitril führten Major et al. innerhalb von 20 Monaten dreimal Studien zu Chromosomaberrationen, SCE- und hochfrequenten SCE-Raten (HFC), Zellzykluskinetik und Ultraviolett-Licht induzierte ungeplante DNA-Synthese (UDS) in peripheren Humanlymphozyten durch [57, 93]. Die Studie umfasste 26 exponierte Beschäftigte, sechs Kontrollpersonen aus der Industrie und 26 weitere Kontrollpersonen. Der Raucherstatus wurde über den Thiocyanat-Spiegel im Serum abgeschätzt. Bei jeder Studie wurden signifikante Erhöhung von Chromosomenaberrations- und SCE-Raten und sowie eine Erhöhung der UDS-Rate festgestellt. Die Anzahl von Chromatidbrüchen und azentrischen Fragmenten stieg in sieben Monaten an und blieb innerhalb von 20 Monaten konstant erhöht. Erhöhte Werte von Chromatid- und Chromosomentypaustausch-Aberrationen traten zum ersten Mal nach 20 Monaten auf. Die Rolle von biologischen Störeinflüssen (Alter, Lymphozytenzahl, Hämatokrit) und Störeinflüssen aufgrund der Lebensweise (Rauchen, Trinken) wurden bei der zweiten Studie durch 18 Theoretische Grundlagen multivariate Analyse mitberücksichtigt. Die Chromosomenaberrationen in exponierten Beschäftigten waren gegenüber Kontrollpersonen gleichen Raucherstatus signifikant erhöht. Die Autoren vermuteten, dass die berufliche Exposition genotoxische Auswirkungen hätte und ein erhöhtes Krebsrisiko zur Folge haben könne. Cheng et al. untersuchten SCE-Raten bei Beschäftigten, die DMF und/oder Epichlorhydrin exponiert waren [94]. Im Zusammenhang mit DMF zeigten sich keine erhöhten SCE-Raten, so dass die Autoren schlossen, dass DMF nicht genotoxisch sei. Zur Kanzerogenität von DMF im Menschen liegen einige Kasuistiken vor, die aber mittels Kontrollstudien nicht statistisch belegt werden konnten. In einem Flugzeugbetrieb wurden unter 153 Beschäftigten drei Hodentumore festgestellt [95]. Bei Durchsicht eines weiteren Betriebs mit vergleichbaren Arbeitsbedingungen wurden daraufhin vier weitere Fälle gefunden. Die Beschäftigen waren verschiedenen Substanzen exponiert, darunter in großen Mengen DMF. Konzentrationsmessungen am Arbeitsplatz lagen nicht vor. Drei Fälle von Hodenkrebs gab es in Ledergebereien, in denen neben DMF andere Lösungsmittel und Farbstoffe verwendet wurden [96]. Bei der Untersuchung weiterer Arbeiter wurden keine zusätzlichen Fälle entdeckt [97]. In retrospektiven Kontrollstudien untersuchten Chen et al. die Mortalität und das Auftreten von Krebs bei Beschäftigten, die DMF und Acrylnitril exponiert waren [98-100]. In den Jahren 1950 bis 1982 zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Mortalitätsrate der exponierten Beschäftigten, die laut den Autoren aber auch auf statistischem Zufall oder Faktoren des Lebensstils basieren könnte [100]. Zwischen 1956 und 1984 kam es bei Beschäftigten die DMF („häufig mehr 10 ppm“), aber nicht Acrylnitril exponiert waren, vermehrt zu Mundhöhlen- und Rachentumoren und malignen Melanomen [99]. Bei Beschäftigten, die beiden Substanzen exponiert waren, wurde ein signifikanter Anstieg von Prostatatumoren beobachtet. Ein Zusammenhang zwischen Expositionshöhe und -dauer konnte aber nicht festgestellt werden. Als Mitverursacher der Tumorfälle kamen Tabak- und Alkoholkonsum und andere Faktoren des Lebensstils in Frage. Eine Fall-Kontrollstudie umfasste 8274 Beschäftigte in vier Betrieben und ergab 39 Mundhöhlen- und Rachen, sechs Leber-, 43 Prostata- und elf Hodentumore, sowie 39 maligne Melanome (darunter die Fälle aus [99]). Bei Untersuchung der einzelnen Betriebe wurde in einem Fall eine signifikante Erhöhung von Prostatakrebs (drei von vier exponierten Personen) festgestellt. Die zusammenfassende Analyse der vier untersuchten Betriebe zeigte aber keine statistisch signifikante Verbindung zwischen DMF-Exposition und nachfolgender Entstehung eines Tumors. 19 Theoretische Grundlagen Die International Agency for Research on Cancer (IARC) beurteilte die Datenlage zu DMF im Jahr 1999. Sie wurde als negativ in Hinblick auf Kanzerogenität und Genotoxizität von DMF befunden und DMF wurde in Gruppe 3 eingeordnet: DMF is not classifiable as to its carcinogenity to humans [101]. 20 Theoretische Grundlagen 2.2 Expositionskontrolle und Gesundheitsschutz Aufgrund der gesundheitsschädlichen Eigenschaften von DMF ist das Ziel der Arbeitsmedizin, die berufliche Exposition von Beschäftigten zu kontrollieren und zum Zwecke des Gesundheitsschutzes gegebenenfalls zu reduzieren. Arbeits- und Umweltmedizin erfassen dazu generell die äußere (Ambient Monitoring) und innere Belastung (Biologisches Monitoring/ Biomonitoring). 2.2.1 Ambient Monitoring Für das Ambient Monitoring wird die Konzentration an Gefahrstoff in der Luft am Arbeitsplatz z.B. durch personengebundene Probennahme bestimmt. Zur Beurteilung der Messergebnisse werden Luftgrenzwerte herangezogen. Die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) erarbeitet maximale Arbeitsplatzkonzentrationen (MAK-Werte). MAK-Werte sind definiert als die höchstzulässige Konzentration eines Arbeitsstoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, die nach dem gegenwärtigen Stand der Kenntnis auch bei wiederholter Exposition (täglich acht Stunden bei Einhaltung der Wochenarbeitszeit von 40 Stunden) über lange Zeiträume im Allgemeinen die Gesundheit der Beschäftigen nicht beeinträchtigt und diese nicht unangemessen belästigt [102]. Der MAK-Wert wird als mittlere Konzentration für einen Arbeitstag oder eine Arbeitsschicht angegeben. Die MAK-Werte bilden die Grundlage für die Technischen Regeln für Gefahrstoffe (TRGS). Im Rahmen der TRGS900 werden vom Ausschuss für Gefahrstoffe (AGS) rechtskräftige Arbeitsplatzgrenzwerte (AGW) aufgestellt und vom Bundesministerium für Arbeit und Soziales bekannt gegeben werden. Der MAK-Wert für DMF beträgt 5 ppm [102]. Der AGW der TRGS900 beträgt derzeit 10 ppm [103]. In den Jahren 1996 bis 2001 wurden bei der BASF AG in Deutschland vier Messungen bei der Produktion und 219 Messungen bei der Verwendung von DMF durchgeführt [2]. Das 90. Perzentil der Messwerte betrug 1,05 ppm. In der internationalen Literatur sind höhere Arbeitsplatzkonzentrationen mit bis zu 160 ppm beschrieben [11, 60, 104, 105]. Im Fall einer nachgewiesenen berufsbedingten Lebererkrankung durch DMF-Exposition muss diese Erkrankung als entschädigungspflichtige Berufskrankheit (BK1316) anerkannt werden [106]. 21 Theoretische Grundlagen 2.2.2 Biomonitoring Beim Biomonitoring wird die innere Belastung von Personen erfasst, die sich bei gleicher äußerer Belastung aufgrund individueller Faktoren (z.B. Atemvolumen, Hautbeschaffenheit bei hautresorptiven Stoffen) unterscheiden kann. Generell können dazu die Konzentration von Schadstoffen und ihrer Metaboliten im Organismus (Dosismonitoring), deren Addukte an Proteinen und DNA (biochemisches Effektmonitoring) oder die Wirkungen des Schadstoffes im menschlichen Organismus, z.B. Veränderungen von Enzymaktivitäten (biologisches Effektmonitoring) ermittelt werden [26]. Die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der DFG erarbeitet auch Biologische Arbeitsstoff-Toleranzwerte (BAT-Werte). Diese sind die beim Menschen höchstzulässige Quantität eines Arbeitsstoffes bzw. eines Arbeitsstoffmetaboliten oder die dadurch ausgelöste Abweichung eines biologischen Indikators von seiner Norm, die nach dem gegenwärtigen Stand der Kenntnis im Allgemeinen die Gesundheit auch dann nicht beeinträchtigt, wenn sie durch Einflüsse des Arbeitsplatzes regelhaft erzielt wird [102]. Der AGS stellte in der TRGS903 ebenfalls als BAT-Werte bezeichnete Grenzwerte auf [107]. Die TRGS903 wird derzeit überarbeitet, soll aber in diesem Jahr mit den neuen Biologischen Grenzwerten (BGW) erscheinen. Bis diese fertiggestellt ist, werden die BAT-Werte der DFG zur Beurteilung innerer Belastung herangezogen. Für DMF beträgt der BAT-Wert der DFG 35 mg NMF pro Liter Urin. Zudem erhielt DMF in der MAK- und BAT-Liste die Zusätze H und wurde in die Schwangerschaftsgruppe B eingeordnet. H steht für einen hautresorptiven Stoff. Die Einordnung in Schwangerschaftsgruppe B bedeutet, dass ein Risiko der Fruchtschädigung auch bei Einhaltung von MAK- und BAT-Wert nicht ausgeschlossen werden kann. In der TRGS900 sind die entsprechenden Kennzeichnungen H und Z [103], wobei MAK- und BAT-Wert durch AGW und BGW ersetzt werden. Die Gefahrstoffverordnung schreibt u.a. für DMF regelmäßige arbeitsmedizinische Vorsorgeuntersuchung vor, die die Erfassung etablierter Biomonitoring-Parameter (für DMF die Bestimmung von NMF in Urin) einschließen müsste [108]. Zur Erfassung der individuellen inneren DMF-Belastung von Beschäftigten wurde neben NMF [11, 21, 49, 50, 67, 104, 105, 109-122], die Merkaptursäure AMCC [11, 21, 104, 112-115, 119, 120, 122, 123] in Urin bestimmt. Die Konzentrationen von NMF lagen teilweise über 100 mg/L [11, 49, 104, 112, 115] und somit klar oberhalb des BAT-Wertes. Als biochemische Effektmarker wurden die HbAddukte N-methylcarbamoyliertes Valin [19-22, 24] und N-methylcarbamoyliertes Lysin [24] nachgewiesen. 22 Theoretische Grundlagen 2.3 DNA-Addukte Elektrophile Substanzen oder solche, die im Organismus zu reaktiven elektrophilen Intermediaten metabolisiert werden, können mit den nukleophilen Stellen der DNA-Basen reagieren und kovalente Verbindungen bilden. Diese Verbindungen werden als DNA-Addukte bezeichnet. Werden DNA-Addukte nicht repariert, können sie Fehlpaarungen bei der Transkription verursachen und dadurch zu Mutationen und eventuell zur Initiation von Krebs führen. Deshalb gilt ihre Bildung als Initialschritt der Kanzerogenese. DNA-Adduktlevel spiegeln die aufgenommene Dosis und deren individuell unterschiedliche Verstoffwechselung, somit die Suszeptibilität des Einzelnen gegenüber der Substanz wider. Ziel ist es letztendlich, DNA-Addukte zur Abschätzung des individuellen Gesundheits- und Krebsrisikos einzusetzen. Insbesondere deshalb werden DNA-Addukte intensiv erforscht. Es gibt eine Vielzahl von Übersichtsartikeln, die die Kenntnislage zu verschiedenen Aspekten der DNA-Addukte zusammenfassen: Nachweisverfahren für DNA-Addukte [124-128], Erkenntnisse zu bestimmten DNA-Addukt-Gruppen [129-133], DNA-Addukte als Biomarker für Genotoxizität und Kanzerogenese [134-141] und DNA-Reparatur [142-144]. Eine Tabelle mit diesen seit 2000 publizierten Übersichtsartikeln befindet sich im Anhang. 2.3.1 Entstehung, Reparatur und Ausscheidung Die elektrophilen Substanzen, die DNA-Addukte bilden, können endogenen oder exogenen Ursprungs sein. Durch Prozesse wie Lipidperoxidation und oxidativen Stress entstehen endogen DNA-Addukte, z.B. 8-Oxo-2’-deoxyguanosin und Etheno-DNA-Addukte. Exogene Addukte können durch Substanzen wie aromatische Amine [132], polyaromatische Kohlenwasserstoffe [129], durch alkylierende Agenzien im Zigarettenrauch [145] oder Nahrungsinhaltsstoffe wie Mykotoxine [146, 147] gebildet werden. DNA-Läsionen können über mindestens vier Hauptreparaturwege in Säugetierorganismen behoben werden. Bei der Basenexzisionsreparatur werden falsch gepaarte oder fehlerhafte Basen durch DNAGlykosylasen als freie Basen herausgeschnitten [148]. Die durch Exzision oder spontane Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung entstandenen apurinischen und apyrimidinischen Lücken werden von DNA-Polymerasen wieder aufgefüllt [148]. Bei der Nukleotidexzisionsreparatur werden die fehlerhaften Basen als Teil eines Oligonukleotidstrangs (ca. 30 Basen) entfernt und von DNAPolymerasen wieder neu synthetisiert [148]. Bei der Basenfehlpaarungsreparatur überprüft die DNA- 23 Theoretische Grundlagen Polymerase während der Synthese den neuen Strang und vergleicht ihn mit dem ursprünglichen Strang [148]. Bei Entdeckung fehlerhafter Nukleotide werden diese herausgeschnitten und neu synthetisiert. Die Rekombinationsreparatur behebt Einzel-, Doppelstrangbrüche und Querverbindungen zwischen den beiden Strängen [148]. Fehlerhafte DNA-Basen und Nukleotide sind schlechte Substrate für in der Nukleotidsynthese involvierte Enzyme und werden meist ohne weiteren Metabolismus renal ausgeschieden [149, 150]. DNA-Läsionen durch Carbamoylierungen mit MIC (u.a. NMC-dC) und Naphtylisocyanat wurden in vitro von uvr-Endonukleasen des Escherichia coli Bakteriums repariert [28, 151]. Weitere Erkenntnisse liegen für NMC-dC nicht vor. 2.3.2 DNA-Addukte als Biomarker Die Verwendung von DNA-Addukten als Biomarker für Genotoxizität und individuelle Krebsrisikoabschätzung [134-141] wird viel diskutiert. In experimentellen Systemen fanden Poirier et al. eine Dosis-Wirkungs-Beziehung beim Vergleich von DNA-Adduktbildung und Tumorgenese [152, 153]. Otteneder und Lutz werteten in einem Übersichtsartikel Studien an Mäusen und Ratten aus, in denen Tumorbildung und DNA-Adduktlevel im Zielgewebe untersucht worden waren. Sie konnten Korrelationen zwischen Tumorbildung und DNA-Adduktleveln nachweisen [154]. Studien bei Menschen, bei denen Adduktbildung und das Auftreten von Krebs korreliert, sind selten. Sasco et al. identifizierten zwei DNA-Addukte (1-Methylinosin und 1-Methyladenosin) in Urin als Tumormarker bei Brustkrebspatienten, die das fortgeschrittene Stadium der Erkrankung anzeigten [155]. Als leitendes Beispiel für die Verwendung von DNA-Addukten zur Prognose von nachfolgender Krebsentstehung wird stets die Studie von Qian et al. angeführt, bei der eine Beziehung zwischen dem Aflatoxin B1-Guanin-Addukt in Urin und hepatozellulären Karzinomen beobachtet wurde [156]. Alternativ zu DNA-Addukten könnten auch Hb-Addukte bestimmt werden, weil sie als Surrogate für DNA-Addukte gelten [25, 26]. Die biologischen Auswirkungen der Hb-Addukte sind weniger bedeutend als die der DNA [136]. DNA-Addukte geben weitergehende Informationen zur mutagenen Bedeutung der Substanz und sind näher am Wirkprinzip des potentiellen Kanzerogens [26, 136]. 24 Theoretische Grundlagen Die Bestimmung von DNA-Addukten in Humanurin ist gegenüber der Bestimmung von Hb-Addukten oder DNA-Addukten in Blut und Gewebe vorzuziehen, da nicht das Problem des begrenzten oder schwer zugänglichen Probematerials besteht. Die Probennahme ist einfach und nicht invasiv. Zudem reflektiert die Konzentration der Reparaturprodukte im Urin die DNA-Schäden und deren proportionale Reparatur im gesamten Organismus [149, 150]. Die Bestimmung des Adduktlevels im Gewebe gibt dagegen die Konzentration des Adduktes für dieses bestimmte Gewebe zum Probenahmezeitpunkt an [136]. Zudem erfolgt die Reparatur in den Geweben schnell, so dass die Konzentrationen an DNA-Addukten niedrig sind. Der Nachteil der Herangehensweise Exkretionsprodukte zu messen besteht darin, dass die Quelle der Addukte unbekannt ist. Vorstellbar ist, dass sie aus der Ribonukleinsäure (RNA) oder aus dem Nukleotidpool genauso gut wie aus der DNA entstehen. Shuker und Farmer führten in ihrem Übersichtsartikel zu DNA-Addukten in Urin aber Argumente an, die widerlegen, dass die Addukte in Urin aus RNA oder Nukleotidpool stammen [149]. Chen und Chiu schlossen RNA und Nukleotidpool als Quelle für Ethenoadenin, das in Urin nachgewiesen wurde, aus [157]. Sie begründeten dies damit, dass einerseits RNA-Addukte nicht in dem Maße wie DNA-Addukte erkannt und repariert würden. Andererseits wäre die spontane Depurinierung des Nukleosids schwieriger als beim Deoxynukleosid, da die N-glykosidische Bindung in Ribosen stärker wäre als in 2’-Deoxyribosen. Sowohl für modifizierte Deoxynukleoside als auch für Nukleoside und Basen wird in allgemeiner Konvention der Begriff DNA-Addukt benutzt. DNA-Adduktlevel reflektieren die individuell unterschiedliche Suszeptibilität der Person gegenüber der Substanz und dadurch das individuelle Gesundheitsrisiko. Bei molekular-epidemiologischen Studien ermöglichen sie eine präzise Expositionserfassung auf individueller Basis. Derzeit ist eine direkte Schlussfolgerung von DNA-Adduktlevel auf genotoxische Wirkung oder Kanzerogenese nicht möglich. Die Schwierigkeit DNA-Addukte zur Prognose des Krebsrisikos zu verwenden, beruht u.a. darauf, dass Menschen immer einer Vielzahl von Substanzklassen ausgesetzt sind, und es zur Bildung verschiedener DNA-Addukte kommt. Für die einzelnen DNA-Addukte muss das mutagene Potential und die involvierten DNA-Reparaturmechanismen berücksichtigt werden. Die Bedeutung von exogenen DNA-Schäden im Vergleich zu endogenen Schäden ist bislang unklar [158]. Anhand epidemiologischer Studien könnte geprüft werden, ob DNA-Adduktlevel und Entstehung von Tumoren miteinander korrelieren. Bei einer Korrelation könnten DNA-Addukte als biochemische Effektmarker zur Diagnose und zur Prävention von Krebsentstehung eingesetzt werden. 25 Theoretische Grundlagen 2.3.3 Nachweisverfahren für DNA-Addukte im Humanurin In der Vergangenheit wurden vor allem 32 P-Postlabelling und Immunoaffinitätsverfahren für den Nachweis von DNA-Addukten im Urin eingesetzt [127]. Diese Verfahren verfügen über eine herausragende Empfindlichkeit. radioaktiven Chemikalien 32 P-Postlabelling ist jedoch unspezifisch. Außerdem muss mit umgegangen werden [159]. Die Herstellung der für die Immunoaffinitätsverfahren benötigten Antikörper ist zeitaufwendig und kostenintensiv [159]. Durch Kreuzreaktionen mit strukturähnlichen Addukten kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen [159]. Beide Verfahren verfügen nicht über die gewünschte Selektivität, die für genaue und zuverlässige Quantifizierung notwendig ist. In den letzten Jahren haben vor allem Verfahren basierend auf Massenspektrometrie (MS) und der Verwendung interner Standards bewiesen, dass sie die erforderliche Leistung mit hoher Selektivität und Genauigkeit bieten [127]. Durch kontinuierliche Verbesserung der Gerätetechnik nähern sich diese Verfahren bezüglich der Empfindlichkeit an 32P-Postlabelling und Immunoaffinitätsverfahren an. In Tabelle 5 sind die bisher publizierten analytischen Verfahren mit MS-Detektion für den Nachweis von DNA-Addukten in Humanurin zusammengestellt. In der Regel steht am Anfang des Analyseverfahrens eine Probenaufarbeitung, die der Aufreinigung der Probe und zugleich der Anreicherung des Analyten dient. Dies wird mit off-line Festphasenextraktion (englisch: solid phase extraction SPE), Immunoaffinitätsaufreinigung (IA), flüssig/flüssig-Extraktion (fl/fl-Extraktion), präparativer Flüssigkeitschromatographie (engl.: preparative liquid chromatography LC) oder einer Kombination dieser Techniken bewerkstelligt. Nur Weimann et al. verzichteten auf eine aufwendige Probenaufarbeitung [160, 161]. Für die chromatographische Trennung wurden Flüssigkeitschromatographie (LC), zweidimensionale LC (LC/LC) oder Gaschromatographie (GC) eingesetzt. Bei den LC-MS-Methoden wurde meist TandemMassenspektrometrie (MS/MS) verwendet und Massenübergänge mittels multiple reaction monitoring (MRM) erfasst. Bei den GC-MS-Methoden wurden ausgewählte Massenionen detektiert (selected ion monitoring SIM). Zum Ausgleich von Faktoren, die die Quantifizierung beeinflussen wie Verluste bei der Probenaufarbeitung oder unterschiedlich gute Ionisation werden interne Standards verwendet. Hierbei haben sich isotopenmarkierte interne Standards aufgrund ihres weitgehend gleichen chemischen Verhaltens als besonders effektiv erwiesen. Die Mehrheit der beschriebenen Verfahren ist für DNA-Addukte, die endogen gebildet werden können und durch oxidativen Stress oder Lipidperoxidation hervorgerufen werden, wie 8-Oxo-2’deoxyguanosin (OxodG), 5-Hydroxymethyluracil (OH-MeUra), Etheno-DNA-Addukte und das Guaninaddukt von Malondialdehyd. Die Konzentrationen von OxodG und OH-MeUra lagen im nmol/L-Bereich. Die Maximalkonzentration eines Ethenoadduktes betrug 8 nmol/L. 26 Theoretische Grundlagen Zum Nachweis von alkylierten DNA-Basen, die im Zusammenhang mit alkylierenden Agenzien im Zigarettenrauch stehen, wurden zwei Analyseverfahren entwickelt. Der Grundlevel von 3Methyladenin im Urin lag im nmol/L-Bereich, was auf Einflüsse durch die Nahrung und eine endogene Bildung zurückzuführen ist. Die Level der anderen alkylierten DNA-Basen waren kleiner 10 nmol/L. Desweiteren sind Verfahren für die DNA-Addukte von Aflatoxin B1 und Benzo[a]pyren beschrieben. Aflatoxine sind natürlich vorkommende Mykotoxine (Pilzgifte), die von Schimmelpilzen in Lebensmitteln gebildet werden. Benzo[a]pyren gehört zu den polyaromatischen Kohlenwasserstoffen. Diese entstehen durch unvollständige Verbrennung von organischem Material bei über 700°C (hier beim Rauchen von Zigaretten, sowie beim Heizen und Kochen mit Kohle). Die Konzentration der DNA-Addukte von Aflatoxin B1 und Benzo[a]pyren lagen bei 1 nmol/L und kleiner. Peter B. Farmer hatte festgestellt, dass oxidative DNA-Schäden in viel größerem Ausmaße vorliegen als Schäden, die durch Exposition gegenüber Substanzen aus der Umwelt hervorgerufen werden [136]. In der Studie eines Kollektives waren die Werte von OxodG (LC-MS) 5000 mal höher, die Werte des DNA-Addukt von Malondialdehyd (immunoslot blot assay) 40 mal höher als die der Addukte von polyaromatischen Kohlenwasserstoffen (32P-Postlabelling) [136]. Die Konzentration der DNA-Addukte von DMF müsste folglich vergleichbar mit den Addukten von Aflatoxin B1 und Benzo[a]pyren im unteren nmol/L-Bereich liegen. 27 2×SPE, GC-MS edC 2×SPE, LC-MS/MS <NWG-1,1 (n=30) <NWG-8,0 (n=13) <NWG-0,8 (n=23) 0,02-4,2 (n=25) 24-142 (n=134) 32-178 (n=21) 50-65 (n=28) 34-65 OH-MeUra, 6-14 OxodG (n=60) 30±15 OxodG, 583±376 Oxo-Gua, 7±4 OxoAde, 121±56 OH-MeUra (n 10) 8-43 (n=140) <NWG-21 (n=53) 20 (n=1) 1-100 OxodG, <NWG OxodA (n=20) 13-60 OxodG, 21-54 Oxo-G, 62-296 Oxo-Gua (k.A.) <NWG-1,3 (n=18) <NWG-0,8 (n=23) 2,3×10-3-0,1 (n=33) Ergebnisse nmol/L Chen et Chiu [177] Gonzalez-Reche et al. [176] Chen et al. [175] Chen et al. [173, 174] Chen et Chang [171] Chen et Chiu [157] Hillestrom et al. [172] Weimann et al. [161] Hu et al. [168] Renner et al. [169] Ravanat et al. [170] Weimann et al. [160] Ravanat et al. [167] Bianchini et al. [162] Chen et al. [163] Faure et al. [164, 165] Pourcelot et al. [166] Referenz M1G SPE, 2×präparative LC, LC-MS <NWG (n=6) Jajoo et al. [178] OH-MeUra:5-Hydroxymethyluracil, OxodG:8-Oxo-2’-deoxyguanosin, Oxo-G:8-Oxoguanosin, OxodA:8-Oxo-2’-deoxyadenosin, Oxo-Gua:8-Oxoguanin, eAde:1,N6Ethenoadenin, edA: 1,N6-Etheno-2’-deoxyadenosin, eCyt:3,N4-Ethenocytosin, edC:3,N4-Etheno-2’-deoxycytidin, eGua1:N2,3-Ethenoguanin, eGua2:1N2-Ethenoguanin, M1G: Malondialdehyd-Addukt von Guanin :Pyrimido[1,2-a]purin-10(3H)-on LC:Flüssigkeitschromatographie, GC:Gaschromatographie, MS:Massenspektrometrie, SPE:Festphasenextraktion, MS/MS:Tandem-Massenspektrometrie, LC/LC:zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie, n:Anzahl, NWG:Nachweisgrenze eGua2 2×SPE, LC/LC-MS/MS 2×SPE, GC-MS eCyt eGua1, eGua2 SPE, LC-MS/MS 2×SPE, GC-MS SPE, LC/LC-MS/MS LC-MS/MS SPE, LC-MS/MS SPE, LC-MS/MS SPE, LC-MS/MS LC-MS/MS präparative LC, GC-MS präparative LC, GC-MS 2×SPE, GC-MS präparative LC, GC-MS präparative LC, GC-MS Analyseverfahren eAde eAde edA Oxo-dG, Oxo-G, Oxo-Gua Oxidativer Stress und Lipidperoxidation OH-MeUra OH-MeUra OH-MeUra OH-MeUra, OxodG OxodG, Oxo-Gua, Oxo-Ade, OH-MeUra OxodG OxodG OxodG OxodG, OxodA Tabelle 5: Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukten in Humanurin mit MS-Detektion 28 Theoretische Grundlagen IA, GC-MS IA, GC-MS IA, 2 × [fl/fl-Extraktion +präparative LC], LC-MS/MS <NWG- 50 BP-Gua, <NWG BP-Ade (n=8) <NWG-0,008 (n=169) 268 nmol/L (n=1) 115±123 nmol/Tag MeAde,10 nmol/Tag OHEtAde, <1 nmol/Tag EtAde, <NWG BzAde (n 60) Ergebnisse nmol/L Bhattacharya et al. [182] Egner et al. [181] Prevost et al. [145, 180] Friesen et al. [179] Referenz BP-Gua, BP-Ade SPE, fl/fl-Extraktion, präparative LC, fl/fl-Extraktion, <NWG-0,3 BP-Gua, <NWG-0,01 BP-Ade Casale et al. [183] LC-MS/MS (n=27) MeAde:3Methyladenin, EtAde:3-Ethyladenin, OHEtAde:3Hydroxyethyladenin, BzAde:3-Benzyladenin, AFB1:Aflatoxin1-N7-Guanin, BP-Gua:7-(Benzo[a]-pyren-6yl)guanin, BP-Ade:7-(Benzo[a]pyren-6-yl)adenine, IA:Immunoaffinitätsaufreinigung, GC:Gaschromatographie, MS:Massenspektrometrie, SPE:Festphasenextraktion, LC:Flüssigkeitschromatographie, MS/MS:TandemMassenspektrometrie, fl/fl-Extraktion:Flüssig/flüssig-Extraktion, NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl BP-Gua, BP-Ade Aflatoxin AFB1-Gua SPE, IA, LC-MS/MS Benzo[a]pyren (Zigarettenrauch, Haushaltskohlerauch) MeAde, EtAde, OHEtAde, BzAde Alkylierende Agenzien (Zigarettenrauch) MeAde Analyseverfahren Tabelle 5-Fortsetzung: Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukten in Humanurin mit MS-Detektion 29 Theoretische Grundlagen Synthese und Charakterisierung der Standards 3. Synthese und Charakterisierung der Standards N4-Methylcarbamoyl-2´-deoxycytidin (NMC-dC) wurde vom Biochemischen Institut für Umweltcarcinogene (Grosshansdorf, Deutschland) hergestellt. N4-Methylcarbamoylcytosin (NMCCyt) und isotopenmarkiertes NMC-Cyt (2-13C, 1,3-15N) wurden im Institut synthetisiert. 3.1 Synthese von N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin Der Synthese von NMC-dC erfolgte über sechs Stufen (siehe Abbildung 2) in Anlehnung an Harwood et al. [184]. NH2 NH2 N N HO O N NH2 O TBDMS-Cl TBDMSO Imidazol DMF N O N O BnOH, Ph3P DEAD Dioxan TBDMSO OTBDMS OH HN Br SbBr3 O Butylnitrit CH2Br2 TBDMSO O N OBn NH TBDMSO O HN O N O OH N OBn NH O CH3 HN N HO CH3 OTBDMS OTBDMS TBAF, THF NH N CH3 H2N OBn OTBDMS O N N O NH CH3 N OBn Pd, EtOH, EtOAc 1,4-Cyclohexadien Formamid HO O N O OH Abbildung 2: Syntheseweg N4-Methylcarbamoyl-2´-deoxycytidin NMC-dC (TBDMS: Tetrabutyldimethylsilyl-, BnOH:Phenol, Ph3P:Triphenylphosphin, DEAD:Diethylazodi-carboxylat, TBAF:Tetrabutylammoniumfluorid, THF:Tetrahydrofuran, EtOH:Ethanol, EtOAc:Ethylacetat) Die 5’- und 3’-Hydroxygruppen des Deoxycytidins werden durch Umsetzung mit Tetrabutyldimethylsilylchlorid und Imidazol silyliert. Die O2-Hydroxygruppe wird als Benzylether geschützt. Mittels Antimon(III)bromid und Butylnitrit in Dibrommethan wird die N6-Amingruppe durch Bromid ersetzt. Nach Umsetzung mit N-Methylharnstoff wird das gewünschte Addukt mit den geschützten Gruppen 30 Synthese und Charakterisierung der Standards erhalten. Die Schutzgruppen werden in zwei weiteren Stufen durch Umsetzung mit Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran und durch Umsetzung mit Pd und 1,4-Cyclohexadien entfernt, um das Endprodukt NMC-dC zu erhalten. 3.2 Synthese von N4-Methylcarbamoylcytosin Zum Ausgleich geräteinterner und matrixbedingter Schwankungen bei der LC-MS empfiehlt sich die Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards. Diese sechsstufige Synthese wäre jedoch für einen isotopenmarkierten Standard aufgrund der geringen Ausbeute (<10%) und der hohen Kosten des markierten Cytosins zu kostenintensiv. Eine direkte Umsetzung von Deoxycytidin mit Methylisocyanat führte zwar zur gewünschten Carbamoylierung, aber darüber hinaus auch zur Carbamoylierung der Hydroxylgruppen des Zuckers. Daher wurde als interner Standard das Cytosinderivat NMC-Cyt eingesetzt, das aus der direkten Umsetzung von Cytosin und Methylisocyanat (MIC) erhalten werden konnte (siehe Abbildung 3). Die Synthese erfolgte in Anlehnung an Tamura et al. [28]. O NH2 HN N NH + O H3C N C O NH CH3 N DMF NH O Abbildung 3: Synthese von NMC-Cyt, DMF:Dimethylformamid Da MIC mit Wasser reagieren kann, werden die verwendeten Substanzen getrocknet und die Reaktion unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Es werden 50 mg Cytosin in 35 mL DMF und 4 mL Eisessig unter leichtem Erwärmen gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit 50 µL MIC versetzt und drei Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird das DMF unter Vakuum abgezogen, der Rückstand in 5 mL Methanol aufgenommen und unter Vakuum auf 2 mL eingeengt. Die Aufreinigung erfolgt mit einer Silicagel-Säule (Höhe 19 cm, Durchmesser 1,5 cm), die mit Methanol/Dichlormethan 20/80 (v/v) konditioniert wird. Die Elution erfolgt mit dergleichen Lösung. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 7 mL gesammelt, auf 1 mL unter Stickstoffstrom eingeengt und mittels Dünnschichtchromatographie auf den Analyten untersucht (ratio of front: Cytosin 0,14; NMC-Cyt 0,25). Die Fraktionen, die den Analyten enthalten, werden vereinigt und unter Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt. Die Ausbeute an NMC-Cyt bzw. NMC-Cyt* beträgt 30%. 31 Synthese und Charakterisierung der Standards 3.3 Charakterisierung mit NMR Das 1H-NMR von N4-Methylcarbamoyl-2´-deoxycytidin (NMC-dC) wurde in DMSO aufgenommen. Die Verschiebungen der Base waren: δ 2,8 [a], δ 6,3 [d], δ 8,2 [e], δ 8,7 [c], δ 9,9 [b]. Die Verschiebungen der Deoxyribose lauteten: δ 2,0 [g/h], δ 2,2 [g/h], δ 3,6 [l+m], δ 3,8 [k], δ 4,2 [i], δ 5,0 [n] δ 5,3 [j], δ 6,1 [o]. Die Verschiebungen von NMC-Cyt (Lösungsmittel deuteriertes Trichlormethan CDCl3) lauteten: δ 2,75 [a], δ 6,1 [d], δ 7,6 [e], δ 8,9 [b], δ 9,8 [c], δ 11,2 [f]. Isotopenmarkiertes (2-13C, 1,3-15N) N4Methylcarbamoylcytosin (NMC-Cyt*) wurde in deuteriertem Methanol vermessen (CD3OD): δ 2,85 [a], δ 6,1 [d] δ 7,65 [d]. Die Wasserstoffatome an den Stickstoffatomen (b, c und f) konnten nicht im 1 H-NMR gesehen werden, da sie austauschten. O c HN d n e HO l+m k O i OH NH CH3 c HN b N N O a d O o e a NH CH3 b N Nf H O g,h j Abbildung 4: Zuordnungen der Verschiebungen des 1H-NMR 3.4 Charakterisierung mit Massenspektrometrie Die Massenspektren der Substanzen wurden mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) erzeugt. NMC-dC, NMC-Cyt und NMC-Cyt* wurden in Methanol gelöst (15 mg/L) und durch direkte Infusion (5 µL/min) in die ESI-Quelle eingebracht. Bei positiver Ionspray-Spannung wurden Massenscans und zur Absicherung Produktscans der jeweiligen Molekülionen aufgenommen. Cytosin wurde ebenfalls vermessen. In Abbildung 5 ist der Massenscan von NMC-Cyt als Beispiel dargestellt. Neben Molekül- und Fragmentionen mit Protonierungen traten auch solche mit Addition von Natrium auf. Einige der Fragmente konnten nicht zugeordnet werden und stammten wahrscheinlich von Verunreinigungen. 32 Synthese und Charakterisierung der Standards 112,1 2,5e7 2,4e7 [M-NMC+H]+ 2,2e7 2,0e7 1,8e7 Intensität, cps 191,1 1,6e7 [M+Na]+ 1,4e7 1,2e7 1,0e7 8,0e6 6,0e6 4,0e6 2,0e6 [M-NMC+Na]+ 134,1 [M-NMC- NH3+H]+ 95,1 44,1 40 50 60 69,1 68,171,2 70 [M+H]+ 169,2178,1 124,0 80 113,1 94,1 96,1 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 192,1 190 200 m/z Abbildung 5: Massenscan von NMC-Cyt, LC-ESI-MS bei positiver Ionisation, Lösung in Methanol (15 mg/L), M:Molekül, NMC-Cyt, NMC:N-Methylcarbamoyl Die aus den Massenspektren der vier Substanzen erhaltenen protonierten Molekülionen und deren Produktionen sind in Tabelle 6 mit den dazugehörigen Strukturformeln zusammengestellt. NMC-dC [M+H]+ (m/z 285) zerfällt unter Verlust von Deoxyribose zu NMC-Cyt [M+H]+ (m/z 169). Von dort an stimmen die Fragmentierungen von NMC-dC und NMC-Cyt überein. Das nächste Fragmention ist protoniertes Cytosin (m/z 112) und entspricht dem Molekülion im Massenspektrum des Cytosins. Als weitere Fragmentionen aller drei Substanzen treten m/z 94 und 95 auf, die über einen Verlust von H2O (-18) bzw. NH3 (-17) des protonierten Cytosins erklärt werden können. Eine weitere Masse ist m/z 69, die auf die Abspaltung von CON aus protoniertem Cytosin (ähnlich wie eine Decarboxylierung) zurückzuführen ist, so dass das Fragment C3H5N2+ zurückbleibt. Für den internen Standard NMC-Cyt* ergeben sich die gleichen Fragmentierungen. Der Molekülion-Peak ist aufgrund der Isotopenmarkierung um 3 erhöht: m/z 172. Dies gilt in gleicher Weise für das Fragmention [Cyt+H]+ m/z 115 und dessen Zerfall unter Verlust von H2O (-18) bzw. NH3 (-17) m/z 97 und 98. Mit dem Fragment CON werden beim internen Standard zwei isotopenmarkierte Atome abgespalten, so dass die Masse des Fragmentions C3H5N2+ lediglich um eins erhöht ist und m/z 70 beträgt. 33 NMC-dC NMC-Cyt NMC-Cyt* Cytosin HO OH O N H2N+ 285 - N O O NH CH3 N H H2N+ N O O NH CH3 N NH2 N H N N NH+3 OH+2 O N H C+ N Molekül- und Fragmentionen (Masse/Ladungs-Verhältnis) 169 112 95 169 112 95 172 115 98 112 95 O N NH2 94 94 97 94 C+ N CH2 C+ Tabelle 6: LC-ESI-MS-Spektren von NMC-dC, NMC-Cyt und NMC-Cyt* und Cytosin, Molekül- und Fragmentionen, sowie deren Strukturformeln NH 69 69 70 69 NH2 34 Synthese und Charakterisierung der Standards Analyseverfahren 4. Analyseverfahren zur Bestimmung von N4-Methylcarbamoylcytosin und N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin in Humanurin 4.1 Grundlagen des Verfahrens Das Analyseverfahren für die Bestimmung der DMF-DNA-Addukte NMC-dC und NMC-Cyt besteht aus einer off-line Probenvorbereitung und einer on-line Messung der aufgearbeiteten Proben mit zweidimensionaler Flüssigkeitschromatographie (LC/LC) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Bei der Probenvorbereitung wird den Urinproben zunächst interner isotopenmarkierter Standard (IS) NMC-Cyt* zugesetzt, um eventuelle Verluste während des gesamten Analyseverfahrens auszugleichen. Dann werden die Proben angesäuert und hydrolysiert, wobei NMC-dC zu NMC-Cyt umgesetzt wird. Mittels Festphasenextraktion wird die Probe aufgereinigt und NMC-Cyt aufkonzentriert. Die aufgereinigte Probe, die immer noch Störkomponenten enthält, wird in das LC/LC-MS/MS-System injiziert. Innerhalb des Systems wird auf der ersten chromatographischen Säule NMC-Cyt weiter von Störkomponenten abgetrennt. Nur die Analytfraktion wird mittels Säulenschaltung auf die zweite Säule transferiert. Auf der zweiten Säule werden NMC-Cyt und restliche Störkomponenten aufgetrennt und anschließend mittels MS/MS detektiert. Dabei werden die Massenübergänge vom einfach positiv geladenen Molekülion (von NMC-Cyt und NMC-Cyt*) zu Produktionen verwendet. Ein Schema des Analyseverfahrens ist in Abbildung 6 dargestellt. Urin (20 mL) + IS NMC-Cyt* Hydrolyse (HCl) NMC-dC und NMC-Cyt in Urin NMC-dC NMC-Cyt Festphasenextraktion (Kationenaustauscher) Abtrennung von Matrixkomponenten, Anreicherung von NMC-Cyt LC/LC Abtrennung weiterer Matrixkomponenten ESI+-MS/MS Detektion NMC-Cyt m/z 169 112 NMC-Cyt* m/z 172 115 Abbildung 6: Schema des Analyseverfahrens, IS:interner Standard, LC/LC:zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie, ESI+:positive Ionisierung mit Elektrospray, MS/MS:TandemMassenspektrometrie, m/z:Masse/Ladungs-Verhältnis 35 Analyseverfahren 4.2 Geräte, Chemikalien, Lösungen Geräte LC-MS-System - Geräteaufbau (Autosampler, Quaternäre Pumpe, Vakuumentgaser) HP1100 (Hewlett Packard, Waldbronn) - Massenspektrometer API 2000 Sciex MS/MS, (Applied Biosystems, Langen) - ESI-Ionenquelle: Turbo-Ion-Spray-Interface - APCI-Ionenquelle - 10-Wegeventil - Isokratische Pumpe L6000A, (Merck-Hitachi, Darmstadt) Festphasenextraktion - VacElutTM (Varian, Darmstadt) - Oasis MCX, 6 mL, 150 mg, (Waters, Eschborn) Analytische Säulen - Synergi Hydro-RP 80A, 250 × 4,6 mm, 4 µm Partikelgröße (Phenomenex, Aschaffenburg) - LiChrospher RP-Select B, 250 × 4,6 mm, 5 µm Partikelgröße (Merck, Darmstadt) Chemikalien Bidestilliertes Wasser, MilliQ-Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) Wasser Lichrosolv (Merck, Darmstadt) Methanol suprapur, Lichrosolv, (Merck, Darmstadt) 25% Salzsäure pro analysis, (Merck, Darmstadt) Ameisensäure pro analysis, (Merck, Darmstadt) 32% Ammoniak extrapur, (Merck, Darmstadt) 20 mM Ammoniumformiat pH 4 (aus 32% Ammoniak und Ameisensäure) Nitrocellulose-Membranfilter, 45 µm (Millipore, Eschborn) 36 Analyseverfahren Lösungen Stammlösungen in Methanol (suprapur), Lagerung bei -18°C - NMC-Cyt 10 mg/L (59,5 µmol/L) - NMC-Cyt* 10 mg/L (58,5 µmol/L) - NMC-dC 103,8 mg/L (364 µmol/L) Arbeitslösungen in Wasser (LiChrosolv), Lagerung bei 4°C - NMC-Cyt* 300 ng/L (1754 pmol/L) - NMC-dC 20,76 µg/L (72,8 nmol/L) 4.3 Probenvorbereitung Für die Analyse werden die Urinproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Aliquote der Urine à 20 mL werden mit 20 µL interner Standardlösung (NMC-Cyt* 300 ng/L, 1754 pmol/L) versetzt. Für die saure Hydrolyse werden die Proben mittels 25%iger HCl auf pH 1 gebracht, bei 70 °C eine Stunde lang inkubiert und dann zum Abkühlen stehen gelassen. Die Probenaufarbeitung erfolgt mit Festphasenextraktion mittels Kationenaustauscher mit Sulfonylgruppen (Oasis MCX). Die Phase wird vor der Probenaufgabe mit je 8 mL Acetonitril, Methanol, Wasser gewaschen und mit 8 mL 0,1 M HCl konditioniert. Die hydrolysierten, abgekühlten Proben werden auf die Extraktionskartuschen gegeben. Die Kartuschen werden mit 3 mL 0,1 M HCl gewaschen, mittels Vakuum getrocknet und danach mit 3 mL Methanol gewaschen und wiederum mittels Vakuum getrocknet. Die Elution erfolgt mit 3 mL Methanol/32% Ammoniak v/v 98/2. Während aller Schritte beträgt die Fließgeschwindigkeit ca. 1 mL/min. Die Regulierung der Fließgeschwindigkeit erfolgt anhand der Durchflusshähne und gegebenenfalls durch Anwendung von Vakuum. Das Eluat wird unter Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt und anschließend in 200 µL Wasser (LiChrosolv) aufgenommen. 37 Analyseverfahren 4.4 Analytische Bestimmung 4.4.1 Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie Zur Bestimmung des Analyten in der aufgearbeiteten Probe wird ein zweidimensionales LC-System eingesetzt. Als erste Säule (1) wird Synergi Hydro-RP und als zweite Säule (2) LiChrospher RP-Select B eingesetzt. Probeninjektion, chromatographische Trennung und Aufreinigung, sowie Spülen und Regenerieren der Säule 1 werden mit der quaternären Gradientenpumpe durchgeführt. Die isokratische Pumpe wird für die chromatographische Trennung auf Säule 2 genutzt, und um einen konstanten Fluss von mobiler Phase in das Massenspektrometer zu gewährleisten. Das Injektionsvolumen beträgt 50 µL. Isokratische Pumpe MS/MS Säule 2 Autosampler Säule 1 Gradientenpumpe Abfall Abfall Abbildung 7: Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), System mit 10-Wegeventil, Ausgangsposition B: Vortrennung auf Säule 1/Trennung auf Säule 2 In Ventilposition B wird die Probe auf Säule 1 injiziert (Abbildung 7). Auf dieser wird eine Vortrennung von Matrix und NMC-Cyt mit 50 mM Ameisensäure/Methanol (90/10 v/v) als mobiler Phase mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min erzielt. Gleichzeitig liefert die isokratische Pumpe auf Säule 2 50 mM Ameisensäure/Methanol (70/30 v/v) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 mL/min. 38 Analyseverfahren Isokratische Pumpe MS/MS Säule 2 Autosampler Säule 1 Gradientenpumpe Abfall Abfall Abbildung 8: Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), System mit 10-Wegeventil, Position A: Transfer der Analytfraktion von Säule 1 2 Nach 15,8 min schaltet das Ventil in Position A (Abbildung 8). Die mobile Phase der Gradientenpumpe fließt von Säule 1 über Säule 2 in den Abfall und transferiert die Analytfraktion (15,8-19,2 min) auf Säule 2. Währenddessen liefert die isokratische Pumpe die mobile Phase direkt ins Massenspektrometer. Schaltet das Ventil wieder in Position B (nach 19,2 min), wird Säule 1 mit 100% Methanol gespült und anschließend mit dem Ausgangslaufmittel rekonditioniert. Auf Säule 2 wird die finale Auftrennung erzielt und NMC-Cyt wird vom Massenspektrometer detektiert. Abgesehen von der isokratischen Pumpe werden all diese Schritte von der Software Analyst 1.1 (bzw. 1.3) des Massenspektrometers kontrolliert. Eine übersichtliche Zusammenfassung der Schaltzeiten des Ventils und der Ereignisse auf den Säulen findet sich in Tabelle 7. Tabelle 7: LC/LC-System, Ventilposition, Zusammensetzung der mobilen Phase auf Säule 1, Ereignisse auf Säule 1 und 2, v/v:Volumenverhältnis Zeit min Ventil 50 mM HCOOH/ Methanol v/v Säule 1 Säule 2 Spülen 0,1 B 15,8 A 19,2 20 21 26 27 35 Probeninjektion, Trennung 90/10 50 mM HCOOH/Methanol v/v 70/30 Transfer der Analytfraktion von Säule 1 2; Isokratische Pumpe direkt ins Massenspektrometer Spülen B 0/100 90/10 Trennung + Detektion 50 mM HCOOH/Methanol v/v 70/30 Equilibrierung 39 Analyseverfahren 4.4.2 Tandem-Massenspektrometrie Das LC-MS-System wird mit einem Turbo-ion-spray Interface als ESI-Quelle verwendet und die Detektion erfolgt im Multiple Reaction Monitoring Modus. Für NMC-Cyt werden die Massenübergänge m/z 169 112 und 169 gemessen. Die Übergänge m/z 169 95, für NMC-Cyt* m/z 172 112 und 172 115 und 172 98 115 werden zur Quantifizierung herangezogen. Die Parameter des Massenspektrometers und der Ionenquelle sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Tabelle 8: Parameters des Massenspektrometers und der Ionenquelle Ionenquelle Temperatur 450°C ESI: Ionspray-Spannung 5500 V Gaseinstellungen (Stickstoff) Vernebelungsgas 65 psi Hilfsgas 40 psi Curtaingas 50 psi Massenspektrometer Kollisionsgas (Stickstoff) 5 IE Auflösung des Quadrupols Q1 unit Auflösung des Quadrupols Q3 low Einschwingzeit 5 msek Pause zwischen den Massenbereichen 5 msek Scanzeit pro Übergang 150 msek Potentiale für die Massenübergänge m/z 169 112, 172 115 (1.Spalte) m/z 169 95, 172 98 (2. Spalte) Declustering (DP) 21 V 31 V Fokussierung (FP) 330 V 360 V Eintritt (EP) –8 V –9 V Kollisionsenergie (CE) 27 V 37 V V:Volt, psi:pounds per square inch, IE:Instrumenteinheiten, msek:Millisekunden Exemplarisch zeigt Abbildung 9 das integrierte Chromatogramm einer dotierten Urinprobe (365 pmol/L NMC-Cyt), die mit dem Analyseverfahren vermessen wurde. 40 Analyseverfahren 800 (a) 600 400 Intensität, cps m/z 169 200 0 4 8 12 16 112 20 24 28 32 24 28 32 4500 (b) 3000 1500 m/z 172 0 4 8 12 16 115 20 Zeit, min Abbildung 9: Integriertes Chromatogramm einer dotierten Urinprobe, Massenübergänge (a) m/z 169 112 NMC-Cyt, (b) m/z 172 115 NMC-Cyt*, NMC-Cyt 365 pmol/L, Kreatiningehalt der Urinprobe 1,11 g/L 41 Analyseverfahren 4.5 Optimierung des Analyseverfahrens 4.5.1 Hydrolyse von N4-Methylcarbamoyldeoxycytidin zu N4-Methylcarbamoylcytosin Prinzip: NMC-dC sollte zu NMC-Cyt hydrolysiert werden, um durch den gemeinsamen Nachweis der beiden Substanzen die diagnostische Empfindlichkeit zu steigern. Die Hydrolyse sollte möglichst selektiv sein, so dass nur NMC-Cyt freigesetzt würde. Die Erzeugung eines Basenspektrums und von Molekülfragmenten großer Makromoleküle sollte vermieden werden, um Interferenzen beim Nachweis von NMC-Cyt zu minimieren. Daher wurden zunächst die Möglichkeiten einer selektiven enzymatischen Hydrolyse erprobt und dann auf chemisch-physikalische Verfahren zurückgegriffen. Versuche: - enzymatische Hydrolyse mit DNA-Reparaturenzymen Endonuklease III und VIII von Escherichia coli (BioLabs, Ipswich, USA) - enzymatische Hydrolyse mit Nukleosidhydrolasen (Kooperation mit Dr. ir. Wim Versées von der Freien Universität Brüssel, Institut für Biologie und Biotechnologie, Abteilung Ultrastruktur) - thermische Hydrolyse (pH 7, 100°C) - basische Hydrolyse (Ammoniumformiat, pH 9/11) - saure Hydrolyse (Ammoniumformiat 200 mM pH 3, Ameisensäure 1/30/60% , Essigsäure 1%, Salzsäure 0,1 M) Ergebnisse und Diskussion: Enzymatische Hydrolyse: Ein Ansatzpunkt für die enzymatische Hydrolyse von NMC-dC zu NMC-Cyt war die Verwendung von DNA-Reparaturenzymen. In der Literatur wurden drei Beispiele der Verwendung von DNAReparaturenzymen zur selektiven Freisetzung von modifizierten DNA-Basen für deren analytischen Nachweis beschrieben [185-187]. Für NMC-dC bzw. durch Methylisocyanat und Naphtylisocyanat hervorgerufene DNA-Schäden ist die Reparatur durch uvr-Endonukleasen von Escherichia coli bekannt [28, 151]. Diese Enzyme waren aber nicht kommerziell erhältlich. Alternativ kamen DNA-Glykosylasen in Frage, die durch Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung, geschädigte Cytosinbasen freisetzen, wie Fpg-Protein [144], Endonuklease III [188], Endonuklease VIII [144], Doppelstrang-Uracil-DNA-Glykosylase [189] und Human-DNA-Glykosylase [190]. Von diesen Basen waren Endonuklease III und VIII kommerziell 42 Analyseverfahren erhältlich und wurden für die Hydrolyse von NMC-dC zu NMC-Cyt getestet. Trotz hoher Enzymkonzentration wurde NMC-dC von keinem der beiden Enzyme hydrolysiert. Endonuklease III und VIII setzen vorwiegend oxidativ geschädigte DNA-Basen frei [143]. Offenkundig war ihre Substratspezifität nicht ausreichend breit, um auch NMC-dC zu NMC-Cyt zu hydrolysieren. Zudem ist es denkbar, dass die Enzyme auf Oligonukleotide angewiesen sind und ein vorliegendes einzelnes Nukleosid nicht als Substrat erkannt wird. Der zweite Ansatzpunkt für eine enzymatische Hydrolyse war die Verwendung von Nukleosidhydrolasen (Enzymklassifikationsnummer E.C.3.2.2. [191-194]). Diese Enzyme kommen in prokaryontischen Parasiten vor [195-199], die DNA-Basen nicht de novo synthetisieren können, sondern sich bei ihrem Wirt bedienen, indem sie N-glykosidische Bindungen spalten und dann die DNA-Basen verwerten [195, 197, 200]. Nukleosidhydrolasen sind nicht kommerziell erhältlich. Durch Kooperation mit Dr. ir. Wim Versées von der Freien Universität Brüssel (Institut für Biologie und Biotechnologie, Abteilung Ultrastruktur) konnten verschiedene Nukleosidasen gestestet werden, darunter Ribosylpyrimidinnukleosidase (E.C.3.2.2.8). Die getesteten Nukleosidasen konnten NMC-dC nicht ausreichend hydrolysieren. Dafür gibt es verschiedene Erklärungsmöglichkeiten. Zum einen verfügen Nukleosidhydrolasen über eine geringere Spezifität gegenüber Deoxynukleosiden wie NMCdC. Zum anderen ist denkbar, dass die Enzyme NMC-dC aufgrund der N-Methylcarbamoyl-Gruppe nicht als Substrat erkannten. Möglich ist auch, dass die Nukleosidhydrolasen NMC-dC zwar als Substrat erkannten, es aber aufgrund der Modifizierung nicht wie Cytidin aktivieren konnten. Chemisch-physikalische Hydrolyse: Da die Hydrolyse mittels Enzymen nicht funktioniert hatte, wurden chemisch-physikalische Hydrolysen getestet. Für die Freisetzung von DNA-Addukten für deren analytischen Nachweis sind vor allem saure Hydrolysen [127, 176, 201-206], daneben eine basische Hydrolyse [207] und eine neutrale thermische Hydrolyse [208] beschrieben. Verschiedene Vorschriften wurden aus der Literatur adaptiert und mittels wässriger Standardlösungen getestet. Bei basischer und neutraler thermischer Hydrolyse wurde keine Umsetzung von NMC-dC zu NMCCyt beobachtet. Mittels saurer Hydrolyse konnte NMC-dC zu NMC-Cyt umgesetzt werden. Gleichzeitig zeigte sich eine Zersetzung von NMC-Cyt. So musste neben der Ausbeute der Umsetzung von NMC-dC zu NMC-Cyt die Stabilität von NMC-Cyt beobachtet werden. In Abbildung 10 ist beispielhaft die Veränderung der Stoffmengen von NMC-dC und NMC-Cyt unter den Bedingungen einer Hydrolyse mit 1% Essigsäure dargestellt. Die optimale Hydrolysedauer für die Hydrolyse mit 1% Essigsäure bei 100 °C beträgt 45 min mit 75% Ausbeute für die Umsetzung von NMC-dC zu NMC-Cyt und 90% Wiederfindung von NMC-Cyt. In Summe ergibt dies rechnerisch 165%. 43 Analyseverfahren 100 Stoffmenge in % 80 60 NMC-Cyt NMC-Cyt aus NMC-dC NMC-dC 40 20 0 0 30min 45min 60min Hydrolysedauer Abbildung 10: Hydrolyse von NMC-dC mit 1% Essigsäure bei 100 °C (gestrichelte Linien), NMC-Cyt unter gleichen Bedingungen (durchgezogene Linie), Stoffmengen in % der Ausgangsmenge Hydrolysen mit Ameisensäure, Ammoniumformiat pH 3 und 0,1 M HCl wurden ebenso getestet und optimiert. Die Summen der Ausbeuten betrugen rechnerisch 160% (30% Ameisensäure, 70°C, 40 min), 145% (Ammoniumformiatpuffer pH 3, 70°C, 45 min) und 150% (0,1 M HCl, 70°C, 1 h). Die Hydrolyse mit Essigsäure ergab die besten Ergebnisse. In Kombination mit der Festphasenextraktion unter Verwendung von Realmatrix erwies sich diese Hydrolyse aber als ungeeignet. Matrixbestandteile des Urins pufferten vermutlich die 1% Essigsäure, so dass NMC-dC kaum zu NMC-Cyt umgesetzt wurde. Der gleiche Effekt wurde bei der Hydrolyse mit Ammoniumformiatpuffer beobachtet. Bei den Hydrolysen mit 30% Ameisensäure und 0,1 M HCl wurde NMC-dC gut zu NMC-Cyt umgesetzt und war nach der Festphasenextraktion nicht nachweisbar. Nach der Hydrolyse mit Ameisensäure konnte NMC-Cyt nicht so gut mittels Festphasenextraktion angereichert werden. Gegenüber der Hydrolyse mit HCl war die Wiederfindung um 30 Prozentpunkte schlechter. Dies kann auf eine Überlastung der Kartuschen, durch die Zugabe großer Säuremengen (3,6 g bei 10 mL Probe) im Vergleich zur Hydrolyse mit HCl (<0,5 g) zurückzuführen sein. Ein weiterer Vorteil der Hydrolyse mit HCl war, dass NMC-dC zu 75% zu NMC-Cyt umgesetzt wurde und NMC-Cyt zu 75% erhalten blieb. Der isotopenmarkierte interne Standard, der nur als Base vorlag (NMC-Cyt*), konnte somit auch die Auswirkungen der Hydrolyse auf das Deoxynukleosid NMC-dC widerspiegeln. Die Hydrolyse mit 0,1 M HCl eignete sich ergo in Kombination mit der Festphasenextraktion am besten für die Probenaufarbeitung von NMC-dC und NMC-Cyt. 44 Analyseverfahren 4.5.2 Anreicherung des Analyten und Abtrennung von Matrixkomponenten Prinzip: Nach der Hydrolyse bedarf es der Anreicherung des Analyten NMC-Cyt und der Abtrennung von Störkomponenten der Matrix. Durch die Aufkonzentrierung sollte die Nachweisgrenze verbessert werden, da allein durch sensitive MS-Detektion die im Humanurin zu erwartenden Konzentrationen im pmol/L-Bereich nicht zu erfassen waren. Prinzipiell kamen off-line oder on-line Verfahren in Frage. Für NMC-Cyt wurde ein on-line Verfahren angestrebt. On-line Verfahren bieten gegenüber off-line Verfahren eine weniger zeitaufwendige Handhabung und dadurch kürzere Analysenzeiten, geringere Probenverluste, sowie die Möglichkeit zur Automatisierung und zur Verwendung eines geringeren Probenvolumens. Da aber eine Anreicherung mittels eines on-line Verfahrens nicht gelang, wurde ein off-line Verfahren erarbeitet. Versuche: - On-line Verfahren mit restricted access media (RAM; C4, C8, C18) und mit einer Kationenaustauschersäule - Off-line Festphasenextraktion mit verschiedenen Sorbentien Ergebnisse und Diskussion: On-line Verfahren: Bei on-line Verfahren finden vor allem restricted access media (RAM) Verwendung [209]. RAMMaterialien arbeiten nach zwei chromatographischen Prinzipien. Durch eine sterische Ausschlusschromatographie werden makromolekulare Komponenten abgetrennt. Die niedermolekularen Komponenten werden, je nach Modifizierung der RAM-Phasen durch Adsorptions-, Affinitäts- oder Ionenaustauschchromatographie reteniert und angereichert [209, 210]. RAM-Phasen mit C4, C8 oder C18 (Butyl-, Octyl-, Octadecylsilica)-Phasen werden routinemäßig im medizinischen und forensischen Bereich [209, 211, 212] eingesetzt. In der DNA-Addukt-Analytik ist nur ein Beispiel für die Verwendung von RAM mit einer speziellen Kupferphtalocyanintrisulfonsäure-Phase beschrieben [213]. Zur Anreicherung von NMC-Cyt wurden C4, C8 und C18 RAM-Phasen (LiChrospher ADS RP-4/8/18, 25 x 4 mm, 25 µm Partikelgröße, Merck, Darmstadt) getestet. Keine dieser Phasen konnte NMC-Cyt ausreichend retenieren. Variation des pH-Wertes und Verwendung von Puffer brachten keine Verbesserung. NMC-Cyt war wahrscheinlich zu polar, um von diesen Phasen ausreichend retardiert zu werden. 45 Analyseverfahren Bei Parallelversuchen zur Festphasenextraktion hatte sich gezeigt, dass NMC-Cyt sich gut von Kationenaustauschern retenieren ließ. RAM-Phasen mit Ionenaustauscherfunktion sind vereinzelt in der Literatur beschrieben [214-218], aber noch nicht kommerziell erhältlich. Als weitere Option für eine on-line Anreicherung kamen trap-Säulen (engl.: Falle) in Frage. Deren Verwendung für die Anreicherung von DNA-Addukten wurde mehrfach in der Literatur [219-223] beschrieben. Trap-Säulen sind kurze Säulen (Länge: 1-2 cm), die sich besonders zur Aufkonzentrierung von Substanzen eignen. Packungsdichte und Partikelgröße unterscheiden sich im Vergleich zu analytischen Säulen, die stationären Phasen sind aber prinzipiell gleich. In Analogie zu diesen trap-Säulen wurde eine kurze Kationenaustauschersäule (Spherisorb S5 SCX 20×4,6 mm, 5 µm, Waters, Eschborn) als trap-Säule für NMC-Cyt getestet. Mit dieser ließ sich NMC-Cyt in wässriger Lösung gut retenieren und aufkonzentrieren. In Urinmatrix variierte die Retentionszeit stark (± 2 min). Eine Erklärung dafür ist der unterschiedliche Salzgehalt der Urine. Die im Urin enthaltenen Salze konkurrieren wahrscheinlich mit NMC-Cyt um die Sulfonylgruppen des Kationenaustauschers und haben so starken Einfluss auf die Retention des Analyten. Die Belastung mit Urinmatrix verschlechterte schnell die Retentionsleistung der Säule. Diese ließ sich trotz langer Regenerationszeit (30 min) nicht wiederherstellen. Die Kationenaustauschersäule kam damit nicht für eine on-line Anreicherung in Frage. Da die Möglichkeiten einer on-line Anreicherung erschöpft waren, musste ein off-line Verfahren erarbeitet werden. Off-line Verfahren: Für die Aufreinigung von DNA-Addukten, Purin- und Pyrimidinmetaboliten aus Urinmatrix wurden in erster Linie off-line Techniken verwendet: Festphasenextraktion [157, 163, 168-176, 224, 225], flüssig/flüssig-Extraktion [146, 147], selektive Präzipitation [226], präparative Flüssigkeitschromatographie [162, 164, 165, 170] und Immunoaffinitätsaufreinigung [145, 179, 180]. In einigen Fällen wurden diese Techniken miteinander kombiniert [178, 181-183, 226-228]. Immunoaffinitätsaufreinigung liefert von diesen Techniken die saubersten Analytextrakte, kam aber nicht in Frage, da die Herstellung der benötigten Antikörper eine spezielle Ausstattung erforderte, sowie zeitaufwendig und kostenintensiv war. Gegenüber flüssig/flüssig-Extraktion und präparativer Flüssigkeitschromatographie erschien Festphasenextraktion als weniger aufwendig und praktischer in der Handhabung, so dass diese getestet wurde. Bei der Festphasenextraktion können unterschiedliche Sorbentien eingesetzt werden. Für die Anreicherung von DNA-Addukten und Nukleosiden aus Humanurin ist die Verwendung von auf Silicagel basierenden Phasen, wie hydrophoben Octadecylphasen (C18) [168, 170, 178, 183, 227], polareren C18-OH Phasen [157, 163, 171, 173-175] und Silicagel mit Cyclohexylmodifizierung [224, 225] beschrieben. Silicagel ohne Modifizierung wurde meist zur Aufreinigung nach der Derivatisierung von DNA-Addukten eingesetzt [157, 163, 173-175]. 46 Analyseverfahren Neben Silicagel gibt es organische Polymere als Basis von Extraktionsmaterialien. Zur Anreicherung von DNA-Addukten aus Humanurin wurden unmodifizierte Copolymere [169, 172, 181] und Copolymere mit Sulfonylgruppen (Kationenaustauscher) erfolgreich eingesetzt [176, 228]. Für die Extraktion von Nukleosiden aus Urin eigneten sich Ionenaustauscher auf Basis eines Copolymers und auf Basis von Dextran, einem Polysaccherid [229]. Die Adaption einer in der Literatur beschriebenen Aufreinigung für NMC-Cyt ist schwierig, da es sich meist um Methoden für modifizierte Nukleoside und nicht für modifizierte Basen handelt. Zudem ist NMC-Cyt aufgrund der N-Methylcarbamoyl-Modifizierung im Vergleich zu anderen DNA-Addukten recht polar. Es galt also, die verschiedenen Möglichkeiten zu erproben, um eine geeignete Anreicherung und Aufreinigung zu ermitteln. Zunächst wurde die Eignung verschiedener Extraktionsmaterialien (Tabelle 9) für die Retention von NMC-Cyt auf der Festphase (Anreicherung) und für die Retardierung von Störkomponenten (Stripping) getestet (siehe Abbildung 11). Anreicherung/ Retention des Analyten Probenaufgabe Waschen Stripping/ Retardierung der Störkomponenten Elution Analyt Probenaufgabe +/ Waschen Störkomponente Abbildung 11: Prozesse bei der Festphasenextraktion [230] Für die Anreicherung von NMC-Cyt eigneten sich ein Copolymer mit Kationenaustauscherfunktion (Oasis MCX) und ein Copolymer mit Hydroxylgruppen (Isolute ENV+) bei pH 7 und pH 1, sowie eine C18-Phase bei pH 7. Unmodifizierte Copolymere waren fürs Stripping geeignet. Durch die Einführung der Hydroxylgruppen bzw. Sulfonylgruppen in die Copolymere, verfügten diese über Protonenakzeptoren und ausreichende Polarität um das polare, basische NMC-Cyt festzuhalten. Zudem ist anzunehmen, dass es im sauren Medium zur partiellen Protonierung der Aminogruppen von NMC-Cyt kommt und es als positiv geladenes Ion vorliegt. Dies erklärt auch, dass NMC-Cyt von einem C18-Material in neutraler Lösung quantitativ zurückgehalten werden konnte, während dies im salzsauren Medium nicht möglich war. 47 Analyseverfahren Tabelle 9: Getestete Materialien für die Festphasenextraktion Silica mit Octadecylmodifizierung C18, 3 mL 500 mg, Merck Si Si CH2 17 CH3 O O Divinylbenzol-vinylpyrrolidon-copolymer Oasis HLB, 3 mL 60 mg, Waters Divinylbenzol-vinylpyrrolidon-copolymer mit Sulfonylgruppen Oasis MCX, 3 mL 60 mg, Waters Styroldivinyl-copolymer mit Pyrrolidongruppen Strata X, 3 mL 60 mg, Phenomenex n N O Styroldivinyl-copolymer Isolute 101, 3 mL 50 mg, International Sorbent Technology Styroldivinyl-copolymer mit Hydroxylgruppen Isolute ENV+, 3 mL 50 mg, International Sorbent Technology 48 Analyseverfahren Die zwei Materialen, die sich für die Extraktion von NMC-Cyt aus saurem Medium eigneten, wurden weiter getestet, da nach der Hydrolyse die Analyten bereits in einem sauren Medium vorlagen. Bei Test mit Urinmatrizes zeigte sich schnell, dass Oasis MCX Störkomponenten besser als Isolute ENV+ abtrennte. Das Copolymer mit Hydroxylgruppen (Isolute ENV+) war wahrscheinlich weniger selektiv als der Kationenaustauscher (Oasis MCX). So wurde nur die Festphasenextraktion mit dem Kationenaustauscher weiterentwickelt. Hierzu wurden verschiedene Parameter variiert und optimiert: - Strippingmaterialien vor der Anreicherung, bzw. zweifache Anreicherung - Volumen und Art des ersten Waschschritts (0,1 M HCl /H2O, 3 mL, 6 mL) - Volumen und Art des zweiten Waschschritts (Methanol, Ethylacetat, Acetonitril, 3 mL, 6 mL) - Volumen und Art des Elutionsmittels (Methanol/NH3, verschiedene Verhältnisse, 3 mL, 6 mL) - Sorbensmenge (60 mg, 150 mg) - Probenvolumen (10 mL, 20 mL) Das Vorschalten von Strippingmaterialien vor der Anreicherung des Analyten verbesserte Matrixabtrennung und Wiederfindung. Dieser Effekt war bei der Einführung von Waschschritten aber so geringfügig, dass auf das Stripping aus Zeit- und Kostenersparnis verzichtet wurde. Eine weitere Idee war eine zweifache Anreicherung. Zunächst sollten mit Isolute ENV+ einfache Salze abgetrennt werden, so dass diese im zweiten Schritt nicht mehr die Extraktion mit dem Kationenaustauscher Oasis MCX beeinflussen konnten. Dieses Vorgehen war erheblich zeitaufwendiger. Da es gegenüber einer einfachen Extraktion mit dem Kationenaustauscher keine wesentliche Verbesserung brachte, wurde die Idee nicht weiter verfolgt. Die Waschschritte verbesserten die Matrixabtrennung. Dies zeigten saubere Chromatogramme und eine Verbesserung der Wiederfindung von NMC-Cyt. Im ersten Waschschritt erwies sich 0,1 M HCl als geeigneter als bidestilliertes Wasser. Vermutlich trug die 0,1 M HCl zur Fixierung des Analyten bei, während die Matrixbestandteile entfernt wurden. Im zweiten Waschschritt unterschied sich die Effektivität der verschiedenen organischen Lösungsmittel nicht. Methanol wurde gemäß der Empfehlung des Hersteller der Extraktionskartuschen für diesen Waschschritt ausgewählt. Für beide Waschschritte erwies sich ein Volumen von drei Millilitern als optimal. Dies wurde nach Veränderung von Probenvolumen (20 mL statt 10 mL) und Sorbensmenge (150 mg statt 60 mg) überprüft und bestätigt. 49 Analyseverfahren Dem Elutionsmittel Methanol wurde Ammoniak zugesetzt, um die Elution von NMC-Cyt als basischem Molekül zu verbessern. Nachdem zunächst hohe Volumenanteile getestet wurden (bis zu 30 Volumenprozent 32% Ammoniak), wurden diese immer weiter reduziert, um die Belastung durch Ammoniakdämpfe zu minimieren. Die Wiederfindung des Analyten verschlechterte sich nicht. Es zeigte sich, dass ein Volumenanteil von 2% und ein Volumen von drei Millilitern für die quantitative Elution des Analyten ausreichend waren. Die Wiederfindung von NMC-Cyt sollte durch Verwendung eines größeren Probenvolumens (20 mL statt 10 mL) verbessert werden. Da ein Durchbruch des Analyten NMC-Cyt aufgrund der höheren Matrixbelastung des Sorbens zu befürchten war, wurde parallel die Erhöhung der Sorbensmenge (150 mg statt 60 mg) getestet. Die Erhöhung beider Parameter führte zu einer wesentlichen Verbesserung der Wiederfindung. Aufgrund dieser Verbesserung wurden diese Parameter trotz des höheren Materials- und damit Kostenaufwandes beibehalten. Eine weitere Erhöhung des Probenvolumens war zwar generell denkbar, jedoch wäre die Aufarbeitung unpraktischer und oftmals läge nicht ausreichend Probenvolumen vor. Die großen Veränderungen dieser Parameter brachten größere Matrixbelastung und eine erhöhte Retention des Analyten mit sich. Daher wurde anschließend überprüft, ob eine Anpassung der Volumina von Waschlösungen und Elutionsmittel notwendig war. Diese konnten aber beibehalten werden. Wichtig für die Festphasenextraktion war zudem die Trocknung der Kartuschen durch Anlegen von Vakuum nach erstem und zweitem Waschschritt. So wurde die Lösung des vorherigen Schritts nahezu vollständig von der Extraktionskartusche entfernt und ihr Einfluss auf den nächsten Schritt wurde minimiert. 50 Analyseverfahren 4.5.3 Analytische Bestimmung Für die analytische Bestimmung von NMC-Cyt kamen prinzipiell GC-MS und LC-MS in Frage. 4.5.3.1 Gaschromatographie-Massenspektrometrie Prinzip: Ausgangspunkt zu den Untersuchungen mittels GC-MS war die Derivatisierung von NMC-Cyt mit dem Ziel NMC-Cyt in für GC geeignete flüchtige Verbindungen zu überführen. Versuche: - Derivatisierung mit Alkylierungsreagenzien - Derivatisierung mit Silylierungsreagenzien Ergebnisse und Diskussion: Die Derivatisierung von DNA-Basen und Nukleosiden kann generell mit Silylierungsreagenzien [231235] oder Alkylierungsreagenzien [236-240] erfolgen. Für Cytosin, Cytidin und deren Addukte sind Silylierungen mit Methyl-N-tert(butyldimethylsilyl)trifluoroacetamid (MTBSTFA) [162, 164, 165, 206, 241, 242] und N,O-Bis(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (BSTFA) [167, 232-234, 243], sowie Alkylierungen mit Pentafluorbenzylbromid (PFBzBr) [163, 173-175, 239, 240] beschrieben. In Anlehnung an die Literatur wurden Silylierungen mit MTBSTFA und BSTFA, sowie Alkylierung mit PFBzBr für die Derivatisierung von NMC-Cyt getestet. Für NMC-Cyt wurden die gleichen Derivatisierungsprodukte erhalten wie für Cytosin, das zum Vergleich mitgeführt wurde. Dies lässt sich mit der Abspaltung der charakteristischen NMethylcarbamoylgruppe während der Derivatisierung oder im Injektor erklären. NMC-Cyt konnte folglich mit GC-MS nach Derivatisierung nicht spezifisch nachgewiesen werden. Offensichtlich waren die nach Silylierung und Alkylierung mit GC-MS nachgewiesenen DNA-Addukte wie z.B. Ethenocytosin [173-175] 5-Methylcytosin [239] stabiler als NMC-Cyt. Ein direkter Nachweis von NMC-Cyt mit GC-MS ohne vorherige Derivatisierung wurde ebenfalls getestet, war aber nicht möglich. Das Addukt NMC-Cyt konnte folglich nicht mit einer GC-MS-Methode in Humanurin bestimmt werden. 51 Analyseverfahren 4.5.3.2 Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie Prinzip: Da eine GC-MS-Methode ausschied, musste NMC-Cyt mittels LC-MS nachgewiesen werden. Dies hatte den Vorteil, dass im Gegensatz zur Gaschromatographie auf eine Derivatisierung des Analyten verzichtet werden konnte. NMC-Cyt musste mittels LC von den restlichen Matrixkomponenten des Urins nach der Festphasenextraktion abgetrennt werden. Hierzu wurden Umkehrphasen und Kationenaustauscher getestet. Es wurde ebenfalls versucht, die Retention von NMC-Cyt durch Ionenpaarbildung zu verbessern. Da die Trennung von Matrix und Analyt nach einer chromatographischen Säule nicht ausreichend war, wurde letztendlich eine zweidimensionale LC-Methode erarbeitet. Für die Ionisation wurden APCI- und ESI-Quelle getestet. Versuche: - Retention mit Umkehrphasen - Retention mit Kationenaustauscher - Retention bei Ionenpaarbildung - Zweidimensionale LC (Umkehrphase/Kationenaustauscher, Umkehrphase/Umkehrphase) - Ionisation mit APCI- und ESI-Quelle Ergebnisse und Diskussion: Retention mit Umkehrphasen Für den Nachweis von DNA-Addukten in Humanurin wurde im Allgemeinen eindimensionale Chromatographie mit Umkehrphasen (reversed phase RP) eingesetzt. Dabei kamen C18-Phasen [160, 161, 169-171, 175, 226, 228, 244], eine Phase mit endständigen Polyamingruppen [168] und eine C16Säule mit Amidgruppen [245] zum Einsatz. Für die chromatographische Auftrennung von NMC-Cyt und Matrix musste eine geeignete Säule ermittelt werden. Hierzu wurden neben klassischen C18-Phasen Säulen getestet, die polare und/oder basische Verbindungen besser retenieren (Tabelle im Anhang). Die Säule sollte zum einen NMC-Cyt gut retenieren und andererseits eine Coelution von Matrixkomponenten vermeiden. 52 Analyseverfahren Bei einigen Säulen eluierte NMC-Cyt zur Totzeit oder 1-2 min danach. Dies ist wahrscheinlich auf die relativ hohe Polarität von NMC-Cyt zurückzuführen. Vier Säulen retenierten NMC-Cyt zufriedenstellend: - Synergi Max-RP 150×4,6 mm, 4 µm, C12-Phase mit endständigen Trimethylsilylgruppen (Phenomenex, Aschaffenburg) - Synergi Hydro-RP, 250 × 4,6 mm, 4 µm, C18-Phase mit endständigen polaren Gruppen (Phenomenex, Aschaffenburg) - Luna Phenylhexyl, 150×4,6 mm, 3 µm, Phenylhexyl-Phase (Phenomenex, Aschaffenburg) - LiChrospher 60 RP B 250 × 4,6 mm, 5 µm, C8-Phase (Merck, Darmstadt). Diese vier Säulen wurden mit Realmatrix (aufgearbeiteten Urinproben) getestet. Der Analytpeak verbreiterte sich, und es kam zu einer Schulter. Dies ist in der Regel ein Zeichen für die Überladung der Säule, was in diesem Fall auf die hohe Matrixbelastung zurückzuführen war. Die resultierende große Peakbreite und eine geringe Signalintensität ließen eine Bestimmung im Ultraspurenbereich nicht zu. Eine eindimensionale LC-Methode mit einer Umkehrphase war so nicht möglich. Um eine zweidimensionale LC-Methode zu vermeiden, wurde versucht die Retention von NMC-Cyt durch Ionenpaarbildung zu verbessern. Bei einer späteren Elution wäre vermutlich die Matrixlast geringer, so dass es nicht mehr zu einer Verbreiterung des Peaks käme. Ionenpaarbildung-Ionenpaarchromatographie Bei der Ionenpaarchromatographie bilden organische Gegenionen mit der zu analysierenden Verbindung hier NMC-Cyt ein Ionenpaar, das nach außen neutral ist und von Umkehrphasen besser retardiert wird [246]. Unter sauren Bedingungen (ca. ab pH 3) liegen die Aminogruppen von NMCCyt zumindest teilweise protoniert, ergo in kationischer Form vor. In Adaption einer Vorschrift von Gustavsson et al. für Aminverbindungen [247] wurde Trifluoressigsäure als Gegenion für NMC-Cyt getestet. Die Retention von NMC-Cyt wurde durch Trifluoressigsäure als Gegenion nur geringfügig verbessert (1 min), so dass der Ansatz der Ionenpaarchromatographie verworfen wurde. Retention mit Kationenaustauscher Als Alternative zu RP-Säulen wurde eine Kationenaustauschersäule (Spherisorb S5 SCX, 150×4,6 mm, 5 µm, Waters, Eschborn) getestet. Bei der Festphasenextraktion hatte sich gezeigt, dass NMCCyt gut von Kationenaustauscher zurückgehalten wird. Dieser Effekt sollte jetzt bei der Flüssigkeitschromatographie genutzt werden. Die Verwendung von Ionenaustauschern als analytische Säulen für die chromatographische Auftrennung von Verbindungen in biologischen Körperflüssigkeiten wird selten beschrieben [215, 218, 248]. So lagen wenige Erfahrungen auf diesem Gebiet vor und die Methode mit der Kationenaustauschersäule musste schrittweise erarbeitet werden. 53 Analyseverfahren Letztendlich gelang es durch Anwendung eines Puffergradienten (50 mM Ameisensäure 200 mM Ammoniumformiatpuffer pH 3) bei konstantem Methanolanteil (30 Volumenprozent) NMC-Cyt gut von Matrixkomponenten abzutrennen und ideal zu fokussieren. Es ließ sich grob eine Nachweisgrenze (Signal/Rausch-Verhältnis gleich 3) von 1 nmol/L Urin abschätzen. Diese war für NMC-Cyt nicht ausreichend, weil Konzentrationen im unteren nmol/L- bzw. im pmol/L-Bereich für Realproben erwartet wurden. Eine eindimensionale LC-Methode mit der Kationenaustauschersäule kam also nicht in Frage. Zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie Wenn eine einzelne chromatographische Auftrennung nicht ausreicht, kann eine zweidimensionale LC-Methode mit heart-cut Injektion genutzt werden. Drei Autorenkollektive beschreiben die Verwendung einer solchen Methode für den Nachweis von DNA-Addukten aus Humanurin [172, 176, 224, 225]. Bei der heart-cut Injektion werden die Verbindungen eines ausgewählten Retentionszeitfensters von der ersten analytischen Säule (1. Dimension) auf die zweite analytische Säule (2. Dimension) transferiert, während die Verbindungen, die außerhalb des gewählten Retentionsfensters eluieren, in den Abfall geleitet werden. So können z.B. mit einer unpolaren RPSäule die Salze abgetrennt werden, um dann mit einer Ionenaustauschersäule organische Ionen aufzutrennen. Dies war ein Ansatzpunkt für die Entwicklung der zweidimensionalen LC-Methode für NMC-Cyt. Umkehrphase/Kationenaustauscher: Es wurde erfolgreich eine zweidimensionale LC-Methode mit der Luna Phenylhexyl-Säule und der Kationenaustauschersäule erarbeitet. Die chromatographische Trennung war sehr gut und es ergaben sich keine Störungen im Poolurin (siehe Abbildung 12). Die Nachweisgrenze lag bei 200 pmol/L Urin, sollte aber weiter verbessert werden. Ein Problem war, dass der für die Ionenchromatographie notwendige Puffer, zu einer Signalunterdrückung des Analytsignals (Quenching) in der ESI-Quelle führte. Alternativ wurde die APCI-Quelle verwendet, bei der kein Quenching auftritt. Bei dieser Ionisation wurden erhöhtes Grundrauschen und mehr Störsignale beobachtet, so dass diese Möglichkeit ausschied. Die Optimierung dieser zweidimensionalen Methode war ausgereizt. Denkbar war die Verwendung einer dritten Säule/Dimension, auf der der Puffer vom Analyten abgetrennt würde. Die Steuerung eines solchen Systems war mit der vorhandenen Geräteausstattung nicht möglich. Folglich wurde die Kombination anderer Säulen im Rahmen eines zweidimensionalen Systems getestet. Die weitere Verwendung der Kationenaustauschersäule kam nicht in Frage, da es wieder zum Quenching durch den für die Chromatographie notwendigen Puffer käme. 54 Analyseverfahren 6000 Intensität, cps m/z 169 112 115 m/z 172 98 Mit hohem Grundrauschen 3000 0 16 95 m/z 169 m/z 172 18 20 22 24 26 Zeit, min Abbildung 12: Zweidimensionale LC: 1) Luna Phenylhexyl mit 50 mM Ameisensäure/Methanol 90/10 v/v, 0,5 mL/min; 2) Kationenaustauschersäule mit Methanol/20 mM Ammoniumformiat v/v Gradient 10-12 min 10 70% Methanol, 0,3 mL/min, ESI, Retentionszeit von NMC-Cyt 21,6 min, Poolurin mit 60 nmol/L NMC-Cyt und 44 nmol/L NMC-Cyt*, Massenübergänge: NMC-Cyt m/z 169 112,95, NMCCyt* m/z 172 115, 98 Umkehrphase/Umkehrphase: Die Entwicklung der zweidimensionalen LC-Methode unter Verwendung von zwei Umkehrphasen gestaltete sich schwierig. Im Vergleich zur Methode mit der Kationenaustauschersäule traten mehr Störpeaks von Matrixkomponenten auf. Es wurden verschiedene Kombinationen der vier für NMC-Cyt geeigneten Säulen getestet und optimiert. Dabei musste bezüglich der Wahl der mobilen Phase ein Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Analytabtrennung gefunden werden. Hohe Methanolanteile gewährleisteten eine gute Verdampfung in der Ionenquelle und damit eine gute Empfindlichkeit, verschlechterten aber die Abtrennung des Analyten. Zusätzlich traten technische Probleme auf. Während der heart-cut Injektion, wenn beide analytische Säulen hintereinandergeschaltet waren, stieg der Druck eines Säulensystems auf 300 bar. Dies lag nahe der Toleranzgrenze der Säulen und war nicht empfehlenswert. Als optimale Kombination erwies sich Synergi Hydro-RP als erste Säule und LiChrospher RP-Select B als zweite Säule. Die Synergi Hydro-RP war eine C18-Phase mit entständigen polaren Gruppen, die durch Wasserstoffbrückenbindung, polare und elektrostatische Wechselwirkungen polare Substanzen gut retenieren konnte. Besonders gut waren die Ergebnisse aufgrund der größeren Länge der Säule (250 mm versus 150 mm z.B. Max-RP) bei gleichem Innendurchmesser. Die Trennleistung (gemessen durch die Zahl der theoretischen Böden) nimmt proportional mit der Länge einer Säule zu. Das Zeitfenster für die quantitative Überführung des Analyten auf die zweite Säule war mit 3,5 min bei dieser Säule relativ groß. Dennoch gelang eine gute Matrixabtrennung und nur wenige Störsubstanzen wurden auf die zweite Säule transferiert. Die C8-Phase von LiChrospher RP-Select B schirmte das Silicagel der Säule weniger stark ab als eine C18-Phase und sorgte für eine bessere Retention polarer Substanzen durch Wechselwirkungen mit dem Silicagel. NMC-Cyt wurde auf dieser Säule gut fokussiert und ein scharfer Peak wurde erhalten. Die Störsubstanz, die nach NMC-Cyt eluierte konnte mit Grundlinientrennung separiert werden (Abbildung 13). 55 Analyseverfahren 7500 Intensität, cps m/z 172 5000 2500 0 25 27 115 m/z 169 112 m/z 172 98 29 31 33 Zeit, min Abbildung 13: Zweidimensionale LC, 1) Synergi Hydro-RP mit 90/10 v/v 50 mM Ameisensäure /Methanol, 0,5 mL/min, 2) LiChrospher 60 RP-Select B mit 70/30 v/v 50 mM Ameisensäure/Methanol, 0,3 mL/min, ESI, Retentionszeit von NMC-Cyt 30,5 min, Poolurin mit 1,7 nmol/L NMC-Cyt und 3,9 nmol/L NMC-Cyt*, Massenübergänge: NMC-Cyt m/z 169 112, NMC-Cyt* m/z 172 115, 98 Zuvor war die Luna Phenylhexyl-Säule als zweite Säule eingesetzt worden. Mit dieser ließ sich der Störpeak in der Nähe von NMC-Cyt aber nicht zufrieden stellend abtrennen. Bei der Verwendung der Max-RP als erster Säule waren mehr Matrixbestandteile auf die zweite Säule transferiert worden, obschon das Zeitfenster für den Analyttransfer mit 2 min kleiner war. Die Nachweisgrenze der Kombination Synergi Hydro-RP und LiChrospher RP-Select B wurde auf 60 pmol/L geschätzt. Bei zehn Individualurinen, die mit diesem System vermessen wurden, konnten alle Störsubstanzen abgetrennt werden. Der Druck lag bei diesem System während der heart-cut Injektion unterhalb von 250 bar. Die Kombination von Synergi Hydro-RP und LiChrospher RP-Select B erwies sich als beste Konfiguration, wurde validiert und für Realproben verwendet. Ionisation mit APCI- und ESI-Quelle Bei den LC-MS-Methoden für DNA-Addukte in Humanurin war im Allgemeinen die Ionisation mit ESI-Quelle im positiven Modus erfolgt [169-171]. Nur Hillestrom et al. verwendeten eine APCIQuelle [172]. Der Nachweis erfolgte in allen Fällen durch die Überwachung des Zerfalls eines Molekülions in Fragmentionen, sogenanntes multiple reaction monitoring. Für NMC-Cyt wurden positive und negative Ionisation getestet (Produktscans von NMC-Cyt, NMCCyt* im Anhang). Für die Anwendung bei LC-MS wurden jeweils die Massenübergänge mit größter Intensität gewählt. Die Signalintensität von NMC-Cyt und NMC-Cyt* war bei negativer Ionisation wesentlich geringer. Dies bestätigte sich auch in Urinproben. So wurde positive Ionisation verwendet. Um eine optimale Empfindlichkeit bei LC-MS-Messungen zu erreichen, wird die Atmosphärendruckionisation verbessert, indem der mobilen Phase ein flüchtiger Puffer oder eine flüchtige Säure als Modifier zugesetzt wird [249]. Für NMC-Cyt erwies sich bei der ESI-Quelle 50 mM Ameisensäure als idealer Modifier. Bei der APCI-Quelle wurde mit 50 mM Ammoniumformiat pH 4 die beste Ionisation erzielt. Messungen mit ESI haben den Nachteil, dass es durch coeluierende Substanzen zur Signalunterdrückung und dadurch zu einem Intensitätsverlust des Analytsignals kommt. Dies tritt bei 56 Analyseverfahren APCI nicht auf. Bei Messung von Urinproben mit APCI wurde für die Massenübergänge von NMCCyt aber ein hohes Grundrauschen und im Vergleich zu ESI mehr Störungen beobachtet. Dies resultierte in eine geringere und unzureichende Empfindlichkeit. Solche Effekte waren auch in der Literatur beschrieben worden [246]. Peaks von Matrixsubstanzen überlagerten sich zudem mit den Analytpeaks. Deshalb wurde die Messung mit ESI-Quelle vorgezogen. 57 Analyseverfahren 4.6 Kalibrierung und Berechnung des Analysenergebnisses Kalibrierreihen werden in Poolurin und in Wasser (LiChrosolv) hergestellt. Die Kalibrierstandards werden bis zur Verwendung bei -18°C gelagert. Sie werden wie alle anderen Proben aufgearbeitet. Um eine konstante, haltbare Urinmatrix zu gewinnen wird der Poolurin eingefroren, aufgetaut und nachfolgend durch einen Nitrocellulose-Membranfilter (45 µm) filtriert. Diese Arbeitsschritte werden zweimal wiederholt. Für die Herstellung der Kalibrierreihen werden 20 mL Aliquote von Poolurin mit der Arbeitslösung von NMC-dC (20,76 µg/L, M=284,269 g/mol) so versetzt, dass sieben Kalibrierungsniveaus zwischen 0 und 520 ng/L erhalten werden. Die exakten Konzentrationen an NMC-dC sind in Tabelle 10 in ng/L (Spalte 2) und pmol/L (Spalte 3) angegeben. Der Nachweis von NMC-dC erfolgt als NMC-Cyt (M=168,153 g/mol). Die in NMC-Cyt umgerechneten Konzentrationen in ng/L sind in Spalte 4 aufgeführt. In gleicher Weise wird eine wässrige Kalibrierreihe hergestellt. Tabelle 10: Kalibrierniveaus der Kalibrierreihe in Poolurin und in Wasser Leerwert K1 K2 K3 K4 K5 K6 NMC-dC ng/L NMC-Cyt / NMC-dC pmol/L NMC-Cyt ng/L 26,0 51,9 103,8 155,7 259,5 519,0 91 183 365 548 913 1826 15,4 30,7 61,4 92,1 154,0 307,0 Zur Ermittlung der Kalibriergeraden (lineare Regressionsgerade) wird der Quotient der Peakflächen von NMC-Cyt (m/z 169 112) über NMC-Cyt* (m/z 172 115) als Funktion der Konzentration aufgetragen. Die Berechnung der Kalibriergeraden und die Bestimmung von Analytkonzentrationen in unbekannten Proben erfolgt mittels der Gerätesoftware Analyst 1.1 (bzw. 1.3). Ohne zur Hilfenahme des internen Standards ist die Steigung der Kalibriergeraden in Urin nur halb so groß, wie die Steigung der Kalibriergeraden in Wasser. Dies ist auf den Verlust an Signalintensität durch Quenching von coeluierenden Verbindungen zurückzuführen. Durch Implementierung des internen Standards wird dieser Effekt ausgeglichen. Die Steigung der Kalibriergeraden liegt bei 0,0027 in Urin und 0,0029 in Wasser mit Korrelationskoeffizienten von R=0,9996 und 0,9999. In den Leerwerten konnte NMC-Cyt nicht nachgewiesen werden. Das Analyseverfahren war über den Kalibrierbereich von 0 bis 1800 pmol/L NMC-Cyt linear. 58 Analyseverfahren 4.7 Qualitätssicherung Die Qualitätssicherung erfolgt durch Überprüfung von Empfindlichkeit und Retentionszeit des LCMS-Systems vor jeder Messreihe, sowie anhand einer laborinternen Präzisionskontrolle. Die Empfindlichkeit des LC-MS-Systems wird überprüft, um einen ausreichend großen responseFaktor (Nachweisstärke) sicherzustellen. Zur Wiederherstellung der Nachweisstärke erfolgt gegebenenfalls die Reinigung der Ionenquelle des Massenspektrometers. Gleichzeitig erfolgt die Kontrolle der Retentionszeit. Aufgrund der Alterung einer Säule könnte es zu einer großen Verschiebung der Retentionszeit kommen, die in eine Verschlechterung der chromatographischen Trennung resultieren könnte. Bei einer großen Verschiebung der Retentionszeit auf der ersten Säule wäre zudem die Anpassung des Zeitfensters des Analyttransfers erforderlich. Zur Überprüfung von Empfindlichkeit und Retentionszeit wird eine neu hergestellte wässrige Standardlösung (595 nmol/L NMC-Cyt, 146 nmol/L NMC-Cyt*) in das LC-MS-System injiziert. Zur Überprüfung der Empfindlichkeit werden Signalhöhe und Grundrauschen des Massenübergangs m/z 169 112 abgeschätzt. Die Signalhöhe soll größer 35.000 cps und das Grundrauschen kleiner 100 cps sein. Die Retentionszeit soll sich nicht mehr als 0,5 min verschieben. Zur Präzisionskontrolle werden bei jeder Messreihe zwei Kontrollmaterialien mitgeführt. Die ermittelten Konzentrationen werden in Qualitätsregelkarten eingetragen. Die Kontrollmaterialien à 20 mL werden wie die Kalibrierniveaus in Poolurin angesetzt. Die Konzentrationen betragen 365 pmol/L (Q1niedrig) und 913 pmol/L (Q2hoch). Die Kontrollmaterialien werden bis zur Verwendung bei -18°C gelagert und wie alle Proben aufgearbeitet. In einer Vorperiode von zehn Messreihen wurden der Mittelwert (x) und die Standardabweichung (σ) für die Kontrollmaterialien ermittelt. Sie dienen als Grundlage der Shewhart-Regelkarte [250], bei der Mittelwert, die Warngrenze bei x±2σ und die Eingriffsgrenze bei x±3σ eingetragen werden. Die Werte der Kontrollmaterialien jeder Messreihe werden chronologisch eingetragen. Wird die Eingriffsgrenze überschritten, muss das Analyseverfahren überprüft werden. Gleichermaßen muss es überprüft werden, wenn mehr als sechs Werte auf einer Seite des Mittelwertes liegen und wenn sich ein Trend der Werte nach oben oder unten abzeichnet. Eine Überprüfung des Analyseverfahrens für NMC-Cyt war während der Anwendung nicht erforderlich. 59 Analyseverfahren 4.8 Gütekriterien des Analyseverfahrens 4.8.1 Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze (NWG) ist die Konzentration, bei der ein Analyt sicher vom Leerwert (Grundlinienrauschen) unterschieden werden kann [251]. In der Chromatographie wird allgemein als NWG die Größe eines Signals betrachtet, bei dem das Signal/Rausch-Verhältnis gleich drei ist. Die NWG der LC-MS-Methode wurde mittels der wässrigen Standardlösung (595 nmol/L NMC-Cyt, 146 nmol/L NMC-Cyt*) abgeschätzt, die zur Qualitätssicherung eingesetzt wurde. Sie betrug 1490 pmol/L (~250 ng/L) in wässriger Lösung. Das entspricht bei Berücksichtigung des Injektionsvolumens von 50 µL einer absoluten NWG von 75 fmol (~12,5 pg). Die NWG des gesamten Analyseverfahrens wurde anhand des niedrigsten Kalibrierniveaus in Humanurin auf 50 pmol/L NMC-Cyt (~8 ng/L) abgeschätzt (Abbildung 14). Bei Abschätzung mit dem niedrigsten Kalibrierniveau in Wasser beträgt die NWG 25 pmol/L (~4 ng/L). Sollten Empfindlichkeitsverluste in einzelnen Urinproben durch individuelle Quenching-Effekte von coeluierenden Verbindungen auftreten, kann die NWG in dem jeweiligen Urin bis zu fünffach höher liegen als die ermittelten 50 pmol/L. Die Quantifizierungsgrenze (Signal/Rausch-Verhältnis gleich sechs) beträgt rund 100 pmol/L. 360 91 pmol/L Signal = 360 cps Intensität, cps 280 200 Rauschen = 60 cps 120 40 0 2 6 10 14 18 22 26 30 34 Zeit, min Abbildung 14: Abschätzung der Nachweisgrenze von NMC-Cyt anhand des niedrigsten Kalibrierniveaus (91 pmol/L) in Humanurin, Signal des Massenübergangs m/z 169 112 von NMC-Cyt 60 Analyseverfahren 4.8.2 Präzision in Serie Die Präzision ist ein Maß für die Reproduzierbarkeit einer Messung [251]. Die Messung wird mehrmals durchgeführt und der Mittelwert (MW), sowie dessen Standardabweichung werden bestimmt. Zur Bestimmung der Präzision in Serie wurde Poolurin mit den Dotierungen 365 pmol/L und 913 pmol/L NMC-Cyt achtmal hintereinander aufgearbeitet und analysiert. Die Präzision wurde als relative Standardabweichung (RSD) angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 11: Präzision in Serie und von Tag zu Tag in dotiertem Poolurin Messwerte Min-Max (MW) pmol/L Präzision RSD % in Serie n=8 365 pmol/L NMC-Cyt 357-407 (376) 5 913 pmol/L NMC-Cyt 911-977 (944) 2 von Tag zu Tag n=8 365 pmol/L NMC-Cyt 339-392 (366) 5 913 pmol/L NMC-Cyt 891-990 (931) 4 Min:Minimalwert, Max:Maximalwert, MW:Mittelwert, RSD:relative Standardabweichung 4.8.3 Präzision von Tag zu Tag Für die Präzision von Tag zu Tag wurde Poolurin mit den Dotierungen 365 pmol/L und 913 pmol/L NMC-Cyt an acht unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgeführt. 4.8.4 Richtigkeit Die Richtigkeit beschreibt wie nah ein Messwert am wahren Wert liegt [251]. Zur Überprüfung der Richtigkeit wurden Wiederfindungsversuche gemacht. Hierzu wurde Poolurin dotiert und undotiert achtmal aufgearbeitet und analysiert. Die Dotierungen betrugen 365 pmol/L und 913 pmol/L NMC-Cyt. Die Wiederfindung (in %) wurde als MesswertLeerwert/dotierten Wert×100 ermittelt (Ergebnisse in Tabelle 12). In undotiertem Poolurin konnte kein NMC-Cyt nachgewiesen werden. 61 Analyseverfahren Tabelle 12: Wiederfindung in dotiertem Poolurin (n=8) Messwerte Wiederfindung RSD Min-Max (MW) pmol/L Min-Max (MW) % % 365 pmol/L NMC-Cyt 339-392 (366) 93-107 (100) 5 913 pmol/L NMC-Cyt 891-990 (931) 98-108 (102) 4 Min:Minimalwert, Max:Maximalwert, MW:Mittelwert, RSD:relative Standardabweichung Desweiteren wurden Experimente zur Wiederfindung mit zehn Individualurinen durchgeführt. Der Einfluss der komplexen und individuell variierenden Matrix des Urins auf das Analysenergebnis sollte untersucht werden. Die Auswahl der Individualurine geschah mit dem Ziel möglichst unterschiedliche Matrizes zu verwenden. Als Indikator der Unterschiedlichkeit der Urinmatrizes diente der Kreatiningehalt, der zwischen 0,28 und 2,22 g/L lag. Die Individualurine wurden ohne und mit Dotierung von NMC-dC (365 pmol/L) aufgearbeitet und analysiert. Die Wiederfindung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Der jeweilige Leerwert wurde in den nicht dotierten Proben bestimmt und war für die zehn Individualurine kleiner der Nachweisgrenze. Die ermittelten Konzentrationen in den dotierten Proben lagen zwischen 282 und 404 pmol/L mit einem Mittelwert von 355 pmol/L. Die Wiederfindung lag zwischen 77 und 111% mit einem Mittelwert von 97%. Die Einzelergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben. Tabelle 13: Wiederfindung in verschiedenen Urinmatrizes Kreatinin g/L 0,28 0,5 0,66 0,71 0,71 0,85 0,99 1,11 1,47 2,22 Messwerte pmol/L Wiederfindung % 404 378 357 364 372 357 357 339 335 282 111 103 98 100 102 98 98 93 92 77 Bei dieser Untersuchung wurde mit einer mittleren Wiederfindung von 97% ein sehr gutes Ergebnis erhalten. Lediglich bei der Probe mit einem Kreatiningehalt von 2,22 g/L ist die Wiederfindung mit 77% relativ schlecht. Der Vergleich mit der Mehrfachanalyse des dotierten Poolurins (365 pmol/L) mit einer Schwankungsbreite der Wiederfindung von 93 bis 107% zeigt, dass die unterschiedlichen Urinmatrizes kaum Einfluss auf die Wiederfindung und damit das Analysenergebnis haben. 62 Analyseverfahren Somit ist die Richtigkeit des Analyseverfahrens auch in unterschiedlichen Urinmatrizes gewährleistet. 4.8.5 Studie zu Wiederfindung und Empfindlichkeit Prinzip: Im Vergleich zu einem wässrigen Standard ist die Signalintensität des Analyten in einer aufgearbeiteten Urinprobe kleiner. Ziel dieser Untersuchung war die Ermittlung der Anteile von Probenaufarbeitung und Signalquenching in der ESI-Quelle an der Verringerung der Signalintensität. Hierzu wurden aufgearbeitete und nicht aufgearbeitete Standards mit APCI- und ESI-Quelle vermessen. Anhand der Messungen sollten die Verluste bei der Probenaufarbeitung und durch Gegenüberstellung von APCI- und ESI-Messungen das Ausmaß des Quenchings abgeschätzt werden. Durchführung: Es wurden eine wässrige Standardlösung und je ein aufgearbeiteter Kalibrierstandard in Urin bzw. Wasser verwendet. Die wässrige Standardlösung wurde so hergestellt, dass die gleiche Konzentration an NMC-Cyt* (30 µg/L) wie in den aufgearbeiteten Proben vorlag. Die Proben wurden gemäß Kapitel 4.4 mit ESI-Quelle, sowie zusätzlich mit APCI-Quelle vermessen. Die APCI-Messungen entsprachen den Messungen mit ESI-Quelle, abgesehen von der Ionenquelle und der mobilen Phase auf der zweiten Säule bestehend aus 20 mM Ammoniumformiat pH 4 und Methanol (70/30 v/v). Ergebnisse und Diskussion: Die Konzentration des internen Standards NMC-Cyt* betrug in allen Proben 30 µg/L, so dass die Signalflächen des Massenübergangs von NMC-Cyt* (m/z 172 115) direkt miteinander verglichen werden konnten. Die Signalflächen von wässrigem Kalibrierstandard betragen im Vergleich zur wässriger Standardlösung 75% (APCI-Messung) bzw. 70% ESI-Messung (Details siehe Tabelle 14). Diese Werte implizieren, dass der Analytverlust bei der Probenaufarbeitung bei 25% liegt. Unter Hydrolysebedingungen bleiben 75% NMC-Cyt erhalten (Kapitel 4.5.1). Die Ausbeute der Festphasenextraktion muss folglich nahezu 100% sein. Bei APCI werden die Moleküle in der Gasphase ionisiert und die Ionen von Lösungsmittel, Puffer und Matrix unterstützen durch Stöße die Ionisation des Analyten. Dagegen erfolgt bei ESI zunächst die Ionisation von Flüssigkeitströpfchen und dann die Überführung in die Gasphase. Moleküle von Lösungsmittel, Puffer und Matrix konkurrieren dabei mit dem Analyten um die Ionisation. Dieser Konkurrenzkampf resultiert in einen Empfindlichkeitsverlust des Analyten, sogenanntes Quenching. 63 Analyseverfahren Durch Gegenüberstellung von APCI- und ESI-Messungen kann das Ausmaß des Quenchings in der ESI-Quelle abgeschätzt werden. Im Vergleich zur wässrigen Standardlösung nimmt bei ESI die Peakfläche in der aufgearbeiteten wässrigen Probe auf 70% und im aufgearbeiteten Poolurin auf 36% ab. Während bei APCI die Peakflächen der aufgearbeiteten Proben gleich sind, demonstriert der signifikante Unterschied bei ESI die starke Auswirkung des Quenchings. Der Signalverlust bei ESI kann auf 40 Prozentpunkte (bzw. 50%) abgeschätzt werden. Tabelle 14: Einfluss von Probenaufarbeitung und Signalquenching auf die Signalintensität, Flächensignale von NMC-Cyt* in aufgearbeiteten und nicht aufgearbeiteten Standards bei ESI- und APCI-Messung Fläche m/z 172 115 cps H2O-Standard Aufgearbeitete Proben H2O-Standard Poolurin-Standard cps:counts per seconds APCI 159000 (100%) ESI 333000 (100%) 121000 (76%) 120000 (75%) 234000 (70%) 121000 (36%) Die Anteile an der Verringerung der Intensität des Analytsignals betragen somit 25% und 40% für Probenaufarbeitung bzw. Signalquenching. 64 Analyseverfahren 4.9 Diskussion des Analyseverfahrens Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Analyseverfahrens zur Bestimmung der DMF-DNAAddukte NMC-dC und NMC-Cyt in Humanurin. Die Anforderungen an das Analyseverfahren für NMC-dC und NMC-Cyt waren hoch und die Erarbeitung des Verfahrens eine besondere Herausforderung. Die Analyten waren in sehr geringen Konzentrationen (pmol/L-Bereich) zu erwarten. Ihr Nachweis musste aus einer sehr komplexen Matrix erfolgen, die weitere Komponenten in Konzentrationen enthält, die um Größenordnungen höher sind. Wichtige Merkmale für das Verfahren waren deshalb effektive Aufreinigung und Aufkonzentrierung der Analyten. Zur Steigerung der diagnostischen Empfindlichkeit wurde NMC-dC im salzsauren Medium zu NMCCyt hydrolysiert, so dass beide Parameter in Summe erfasst werden konnten. Die Hydrolyse ging leider mit einem Verlust von je 25% beider Substanzen einher. Da dennoch ein diagnostischer Zugewinn von 50% erzielt wurde, war dies vertretbar. Aufreinigung und Aufkonzentrierung von NMC-Cyt aus dem Hydrolysat gelangen mittels Festphasenextraktion mit Kationenaustauscher. Zunächst war ein on-line Verfahren angestrebt worden. NMC-Cyt wurde aber nicht ausreichend von kommerziellen RAM-Phasen (C4, C8, C18) zur on-line Anreicherung reteniert. Ursächlich hierfür könnten die geringe Größe und die relativ hohe Polarität von NMC-Cyt sein. Eine on-line Anreicherung mit Kationenaustauscher schlug ebenso fehl, da sich das Material bei wiederholter Matrixbelastung als ungeeignet erwies. Ein Verzicht auf eine zusätzliche Aufreinigung vor dem Nachweis mit LC-MS wie bei zwei Verfahren für Oxo-DNAAddukte [160, 161], war für NMC-Cyt aufgrund zu starker Interferenzen durch Störkomponenten und einer zu hohen Nachweisgrenze nicht möglich. Die letztendlich erarbeitete Aufreinigung von NMC-Cyt war, im Gegensatz zu anderen Verfahren für DNA-Addukte in Humanurin mit LC-MS (Tabelle 15) simpel. Bei jenen wurden zweifache Festphasenextraktionen oder Kombinationen verschiedener off-line Techniken wie Immunoaffinitätsaufreinigung oder flüssig/flüssig-Extraktion eingesetzt. Bei der einfachen Festphasenextraktion wurde NMC-Cyt, das aufgrund des niedrigen pH-Wertes im Hydrolysat in protonierter, ergo kationischer Form vorlag, vom Kationenaustauscher mit Sulfonylgruppen quantitativ reteniert. Durch Waschen mit organischem Lösungsmittel wurden unpolare Matrixkomponenten entfernt. Die effektive Elution von NMC-Cyt gelang mit Methanol, dem zur besseren Elution basischer Verbindungen wie NMC-Cyt Ammoniak zugesetzt wurde. Das Eluat wurde eingeengt und in 200 µL bidestilliertem Wasser wieder 65 Analyseverfahren aufgenommen. So konnte ausgehend von einem Probenvolumen von 20 mL ein Anreicherungsfaktor von 100 erzielt werden. Der analytische Nachweis von NMC-Cyt erfolgte mit LC-MS. Hierbei erwies sich eine zweidimensionale chromatographische Trennung als erforderlich, um restliche Matrixkomponenten abzutrennen. Bei DNA-Addukten von Aflatoxin und Benzo[a]pyren war eine einfache chromatographische Auftrennung mit einer einzigen Säule ausreichend [181-183]. Diese wurden aber zuvor durch aufwendigere off-line Verfahren aufgereinigt. Einige Verfahren waren dem Verfahren für NMC-Cyt bezüglich des Zeitaufwandes und der praktischen Handhabung aber überlegen. Der Nachweis von DNA-Addukten wie z.B. 8-Oxo-deoxyguanosin gelang aus Humanurin mit einer eindimensionalen LC-MS-Methode nach einmaliger Festphasenextraktion [168] oder sogar ohne vorherige Aufreinigung [160, 161]. Dass für NMC-Cyt ein so einfaches Verfahren nicht möglich war, lässt sich auf verschiedene Aspekte zurückführen. NMC-Cyt hat als DNA-Base ohne Deoxyribose im Vergleich zu 8-Oxo-deoxyguanosin eine geringere Masse. Bei kleineren Massenübergängen kommt es eher zu Interferenzen durch andere Substanzen, so dass die chromatographische Abtrennung von Störkomponenten schwieriger ist. 8-Oxo-deoxyguanosin liegt in größeren Konzentrationen vor (nmol/L) und lässt sich zudem besser mittels konventioneller Umkehrphasen retenieren als das relativ polare NMC-Cyt. Dieses eluiert frühzeitig zusammen mit vielen Störkomponenten. Nach langwierigen Experimenten gelang eine gute Abtrennung durch die Kombination verschiedener chromatographischer Trennprinzipien. Als erste Säule wurde eine hydrophile C18-Phase mit endständigen polaren Gruppen eingesetzt, so dass NMC-Cyt durch Wasserstoffbrückenbindung und polare Wechselwirkungen gut reteniert werden konnte. Die Analytfraktion wurde durch eine sogenannte heart-cut Injektion auf eine zweite Säule transferiert. Diese hatte eine C8-Phase und stellte so einen Wechsel des Trennprinzips im Vergleich zur vorherigen Säule dar. So konnten nun Matrixkomponenten von NMC-Cyt abgetrennt werden, die nicht durch den Kationenaustauscher der Festphasenextraktion und die hydrophile C18-Phase entfernt worden waren. Mit dieser ausgeklügelten zweidimensionalen LC war ein störungsfreier Nachweis von NMC-Cyt möglich. Die gute Matrixabtrennung zeigte sich nicht nur durch die Abwesenheit von Störpeaks, sondern auch durch eine große Signalstärke. 66 7500 300 500-2000 SPE, LC-MS/MS SPE, LC-MS/MS SPE, LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS OxodG OxodG OxodG OxodG OxodA OxodG Oxo-G Oxo-Gua 300 15 2 ×SPE, LC/LC-MS/MS 2 ×SPE, LC/LC-MS/MS SPE, 2×präparative LC, Reduzierung mit NaBH4, LC-MS SPE, IA, LC-MS/MS IA, 2 × [fl/fl-Extraktion + präparative LC], LC-MS/MS SPE, fl/fl-Extraktion, präparative LCFD, fl/fl-Extraktion, LC-MS/MS Abschätzung der Wiederfindung ohne IS 48% Wiederfindung 1 dotierter Urin 75-95% Wiederfindung 1 dotierter Urin 70-75% 5-10 0,1 Wiederfindung ohne IS 30% 0,04 500 Präzision in Serie (3 Urine, 2×), Tag zu Tag (3 Urine, 3×) RSD 2-9% Präzision in Serie (1 Urin, 10×) RSD 27-38% Casale et al. [183] Egner et al. [181] Bhattacharya et al. [182] Jajoo et al. [178] Chen et al. [175] Gonzalez-Reche et al. [176] Chen et Chiu [177] Hillestrom et al. [172] Chen et Chang [171] Präzision in Serie (3 Urine, 2×), Tag zu Tag (3 Urine, 3×) RSD 2-12% Präzision in Serie (5 Urine, 3×), Tag zu Tag (5 Urine, 2×) RSD 3-7%, Wiederfindung ohne IS in Urin, Wasser 86-104% - Weimann et al. [161] Weimann et al. [160] Ravanat et al. [170] Renner et al. [169] Hu et al. [168] Referenz Präzision in Serie, Tag zu Tag (1 Urin, 2×) RSD 4-7%. Präzision in Serie (1 Urin, 50×) OxodG RSD 3% Präzision in Serie, Tag zu Tag (3 Urine, 2×) RSD 3-8%, Wiederfindung in Wasser 90% Präzision in Serie (1 Urin, 5×) RSD 10%, Wiederfindung in 3 dotierten Urinproben 98% - Präzision und Wiederfindung NMC-Cyt SPE, LC/LC-MS/MS 50 67 Präzision in Serie, Tag zu Tag (Poolurin, 8×) 2-5%, Wiederfindung (Poolurin 8×) 93-108%, Wiederfindung (10 Urine) diese Arbeit 77-111%, Wiederfindung ohne IS in Urin 36% OxodG:8-Oxo-2’-deoxyguanosin, Oxo-G:8-Oxoguanosin, OxodA:8-Oxo-2’-deoxyadenosin, Oxo-Gua:8-Oxoguanin, eAde:1,N6-Ethenoadenin, edA: 1,N6-Etheno-2’deoxyadenosin, eCyt:3,N4-Ethenocytosin, edC:3,N4-Etheno-2’-deoxycytidin, eGua1:N2,3-Ethenoguanin, eGua2:1N2-Ethenoguanin, M1G: Malondialdehyd-Addukt von GuaninPyrimido[1,2-a]purin-10(3H)-on, AFB1:Aflatoxin1-N7-Guanin, BP-Gua:7-(Benzo[a]-pyren-6-yl)guanin, BP-Ade:7-(Benzo[a]pyren-6-yl)adenite, SPE:Festphasenextraktion, LC:Flüssigkeitschromatographie, MS:Massenspektrometrie, MS/MS:Tandem-Massenspektrometrie, LC/LC:zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie, fl/fl-Extraktion:Flüssig/flüssig-Extraktion, IA:Immunoaffinitätsaufreinigung, FD:Fluoreszenzdetektion, IS:interner Standard, RSD:relative Standardabweichung AFB1-Gua BP-Gua BP-Ade BP-Gua BP-Ade M1G - SPE, LC-MS/MS edC eGua1 eGua2 eGua2 0,7 SPE, LC/LC-MS/MS edA 130 SPE, LC-MS/MS eAde 700 - Analyseverfahren Addukt Nachweisgrenze pmol/L Urin Tabelle 15: Analyseverfahren mit LC-MS zum Nachweis von DNA-Addukten in Humanurin Analyseverfahren Analysenverfahren Bei der gewählten Ionisation mit ESI führen coeluierende Matrixkomponenten zu einer Signalunterdrückung (Quenching), die aber vom internen Standard NMC-Cyt* kompensiert wird. Zur Vermeidung des Signalverlustes durch Quenching könnte alternativ APCI eingesetzt werden. Dies ist für den Nachweis von Ethenodeoxyadenosin aus Humanurin beschrieben [172]. Für NMC-Cyt erwies sich APCI als ungeeignet, da für dessen Massenübergänge hohes Grundrauschen und mehr Störungen auftraten. Die Detektion von NMC-Cyt und internem Standard erfolgte anhand spezifischer Massenübergänge von Molekül- zu Fragmentionen. Für das Analyseverfahren wurde eine Nachweisgrenze von 50 pmol/L in Urinmatrix bzw. 25 pmol/L in Wasser ermittelt. Die unterschiedlichen Nachweisgrenzen lassen sich auf das zuvor erwähnte Quenching zurückführen. Je nach Urinmatrix kann die Nachweisgrenze bis zu fünffach höher liegen als 50 pmol/L. Ein solcher Quenching-Effekt in komplexen Matrizes wird auch von anderen Autoren beschrieben [176, 252]. Nur wenige Verfahren für DNA-Addukte im Humanurin mit LC-MS haben bessere Nachweisgrenzen (Tabelle 15). In einigen Fällen werden diese durch große Probenvolumina (bis zu 400 mL [182, 183]) und hohe Anreicherungsfaktoren (1000 [181]) erzielt. Dies ist für eine routinemäßige Anwendung des Verfahrens unpraktisch. Oft steht ein so hohes Probenvolumen nicht zur Verfügung. Unter Berücksichtigung der Aspekte der praktischen Handhabung und des Kostenaufwandes ist nur das Verfahren von Hillestrom et al. [172] dem Verfahren für NMC-Cyt bezüglich der Nachweisgrenze überlegen. Hillestrom et al. erzielten eine erstaunlich gute bis fragwürdige Nachweisgrenze für Ethenodeoxyadenosin (0,7 pmol/L) ausgehend von 3 mL Urin [172]. Sie verwendeten ein API 3000 Massenspektrometer (Sciex, Toronto, Kanada) und damit das Nachfolgemodell des bei dieser Arbeit eingesetzten Gerätes. Aus den on-column Nachweisgrenzen für Ethenodeoxyadenosin (0,6 fmol) und NMC-Cyt (75 fmol) lässt sich unter Vernachlässigung anderer Parameter für das neuere Massenspektrometer eine um den Faktor 100 größere Empfindlichkeit ableiten. Sind die Angaben von Hillestrom et al. korrekt, bedeutete dies, dass für NMC-Cyt mit einem neueren Massenspektrometer eventuell eine um den Faktor 100 niedrigere Nachweisgrenze erreicht werden könnte. Die für NMC-Cyt erzielte Nachweisgrenze war niedrig genug, um es erstmalig im Urin DMFexponierter Personen nachzuweisen (siehe Kapitel 6). Bei einer besseren Nachweisgrenze könnte es in mehr Proben nachgewiesen werden und eine eventuelle Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung könnte erfasst werden. Das entwickelte Verfahren erlaubt die genaue und zuverlässige quantitative Bestimmung von NMCCyt. Die Präzision in Serie und von Tag zu Tag war anhand zweier Konzentrationen in Poolurin untersucht worden und mit einer relativen Standardabweichung von 5% sehr gut. Die Richtigkeit wurde durch Wiederfindungsversuche in Poolurin (n=8, 93-108%) und in zehn verschiedenen Urinmatrizes (77-111%, Mittelwert 97%) ermittelt und war ebenfalls ausgezeichnet. So war 68 Analysenverfahren gewährleistet, dass NMC-Cyt in unbekannten Urinproben richtig quantifiziert wurde. Diese hervorragenden Ergebnisse waren der Verwendung des isotopenmarkierten internen Standards zu verdanken, der zu Beginn des Verfahrens zur Probe hinzu gegeben wurde und so Faktoren, die die Quantifizierung im Laufe des Verfahrens beeinflussen, effektiv ausglich. Ohne Verwendung dieses internen Standards betrüge die Wiederfindung 36%. Die Wichtigkeit eines internen Standards für die Präzision lässt sich bei Gonzalez-Reche et al. erkennen [176, 252]. Ohne Verwendung eines internen Standards lag die relative Standardabweichung für eine Aufarbeitung in Serie bei 27% und 38% [176]. Bei einer späteren Implementierung eines internen isotopenmarkierten Standards in das Verfahren wurden diese Werte auf 8-20% reduziert [252]. Bei den übrigen Verfahren, die interne Standards verwenden, wurden ebenfalls gute Präzision und Wiederfindung beschrieben [160, 161, 168, 171, 172, 177]. Wird wie bei einigen Verfahren für DNA-Addukte im Humanurin auf einen internen Standard verzichtet [169, 175, 176, 182, 183], kann aufgrund stark matrixabhängiger Effekte (z.B. Signalunterdrückung bei der Ionisation) eigentlich keine korrekte Quantifizierung in unterschiedlichen Urinen gewährleistet werden. Im Vergleich zu den anderen Verfahren aus Tabelle 15 kann gesagt werden, dass das Verfahren für NMC-Cyt bezüglich der Gütekriterien am gründlichsten geprüft, charakterisiert und validiert wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erfolgreich ein Analyseverfahren für NMC-dC und NMC-Cyt entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht erstmalig die Bestimmung eines DNA-Adduktes von DMF in Humanurin. Es verfügt über eine gute Nachweisgrenze bei gleichzeitiger außerordentlicher Zuverlässigkeit und Genauigkeit. Zudem ist das Verfahren durch die Detektion von Massenübergängen und isotopenmarkiertem internen Standard besonders spezifisch. Im Hinblick auf andere Verfahren in der DNA-Addukt-Analytik, die ähnlich gute Gütekriterien aufweisen, zeichnet es sich durch eine einfachere Handhabung und geringere Kosten aus. Verbesserungspotentiale des Verfahrens liegen in einer Vollautomatisierung und der Weiterentwicklung der Massenspektrometer. Durch Einsatz einer RAM-Phase mit Kationenaustauschern oder einer dreidimensionalen LC-Methode könnte auf eine off-line Anreicherung verzichtet werden. Durch neuere Massenspektrometer wäre eine weitere Absenkung der Nachweisgrenze möglich. 69 Qualitative Bestätigung des Nachweises 5. Qualitative Bestätigung des Nachweises von N4-Methylcarbamoylcytosin in Humanurin Prinzip: Ziel der in diesem Kapitel beschriebenen Untersuchung war es, den Nachweis von NMC-Cyt, der mit dem in Kapitel 4 beschriebenen Analyseverfahren gelungen war, qualitativ zu bestätigen. Dazu wurden Analytfraktionen positiver Proben exponierter Beschäftigter nach der ersten LC/LCAuftrennung (Kapitel 4) gesammelt und mittels eines zweiten LC/LC-MS/MS-System analysiert. Anhand der richtigen Retentionszeit über zwei LC/LC-Systeme und anhand zweier Massenübergänge (m/z 169 112 und 169 95) sollte die qualitative Bestätigung von NMC-Cyt erfolgen. Eine schematische Darstellung der Vorgehensweise zeigt Abbildung 15. Urin (20 mL) + IS NMC-Cyt* Festphasenextraktion (Kationenaustauscher) LC/LC Auffangen der Analytfraktionen LC/LC ESI+-MS/MS Analyseverfahren gemäß Kapitel 4 Hydrolyse (HCl) NMC-dC und NMC-Cyt in Urin NMC-dC NMC-Cyt Abtrennung von Matrixkomponenten, Anreicherung von NMC-Cyt und NMC-Cyt* 1. Säulensatz C18 mit polaren Gruppen/C8 3×Analytfraktion gesammelt, zur Trockne eingeengt in 200 µL aufgenommen 2. Säulensatz C12 mit Trimethylsilyl/Phenylhexyl Detektion NMC-Cyt m/z 169 112, 95 NMC-Cyt* m/z 172 115, 98 Abbildung 15: Schema des Verfahrens zur qualitativen Bestätigung des Nachweises von NMC-Cyt, IS:interner Standard, LC/LC:zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie, ESI+:positive Ionisierung mit Elektrospray, MS/MS:Tandem-Massenspektrometrie, m/z:Masse/Ladungs-Verhältnis 70 Qualitative Bestätigung des Nachweises Durchführung: Drei Urinproben von exponierten Beschäftigten, bei denen NMC-Cyt nachgewiesen worden war, wurden ausgesucht. Die Proben wurden gemäß des Analyseverfahrens aus Kapitel 4 aufgearbeitet. Jede Probe wurde dreimal in das erste LC/LC-System (Kapitel 4.4) injiziert. Die Analytfraktionen (2930,5 min) wurden jedoch nicht detektiert, sondern in einem LC-Vial aufgefangen. Die Fraktionen einer Probe wurden im Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt und in 200 µL Wasser (LiChrosolv) aufgenommen. Fünfzig Mikroliter dieser Lösung wurden in das zweite LC/LC-MS/MS-System injiziert. Es wurde derselbe Geräteaufbau wie in Kapitel 4.4 beschrieben verwendet, wobei die chromatographischen Bedingungen und die stationären Phasen variiert wurden. Die erste Säule war eine Silicagelsäule mit C12-Modifizierung und endständigen Trimethylsilylgruppen (Synergi Max-RP, 80A, 150×4,6 mm, 4 µm, Phenomenex, Aschaffenburg). Als zweite Säule wurde eine Silicagelsäule mit PhenylhexylPhase (Luna Phenylhexyl, 150×4,6 mm, 3 µm, Phenomenex, Aschaffenburg) verwendet. Auf der ersten Säule wurde 50 mM Ameisensäure/Methanol (90/10 v/v) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 mL/min als Laufmittel und auf der zweiten Säule 50 mM Ameisensäure/Methanol (70/30 v/v) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 mL/min verwendet. Die Analytfraktion (11-12,6 min) wurde von der ersten Säule auf die zweite Säule transferiert und mit MS/MS detektiert (Kapitel 4.4.2). Ergebnisse und Diskussion: Beim Analyseverfahren aus Kapitel 4 wurde NMC-Cyt über die Retentionszeit und einen Massenübergang (m/z 169 112) eines LC/LC-System mit MS/MS-Detektion identifiziert. Zur weiteren Bestätigung des qualitativen Nachweises waren die Analytfraktionen positiver Proben nach der ersten LC/LC-Trennung gesammelt worden und mit einem zweiten LC/LC-MS/MS-System analysiert worden. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, waren je Probe drei Fraktionen in einem Vial gesammelt, eingeengt und in 200 µL Wasser wieder aufgenommen worden. Die Säulen des zweiten Säulensatzes wurden mit dem Ziel ausgewählt, die Oberflächen zu variieren und vier unterschiedliche Trennmechanismen zu nutzen. Der erste Säulensatz bestand aus einer hydrophilen C18-Phase (Synergi Hydro-RP) und einer C8-Phase (LiChrospher RP-Select B). Synergi Hydro-RP ermöglichte mit seinen endständigen polaren Gruppen die Retention einer polaren Verbindung wie NMC-Cyt über Wasserstoffbrückenbindung, polare oder elektrostatische Wechselwirkungen. Die C8-Phase von LiChrospher RP-Select B schirmte das Silicagel der Säule weniger stark ab als eine C18-Phase und sorgte für eine bessere Retention von NMC-Cyt durch polare Wechselwirkungen mit dem Silicagel. Der zweite Säulensatz bestand aus einer C12-Säule mit endständigen Trimethylsilylgruppen (Synergi Max-RP) und einer Säule mit Phenylhexyl-Phase (Luna Phenylhexyl). Bei der C12-Säule wird ähnlich wie bei der C8-Säule das Silicagel schwächer abgeschirmt. Zudem eignete sich diese C12-Säule laut Spezifikation des Herstellers besonders für schwach polare Verbindungen und Basen. Die Phenylhexyl-Säule ist bekannt dafür, die Retention 71 Qualitative Bestätigung des Nachweises polarer, aromatischer Verbindungen aufgrund von π-Wechselwirkungen zu verbessern und die Reihenfolge von Analyten bei der Elution im Vergleich zu traditionellen RP-Säulen umzukehren. Wie erwartet verbesserte der zweite Säulensatz die Trennung von Analyt und Matrix. Dadurch wurde das Quenching reduziert und die Signalintensität gesteigert. Infolgedessen konnten die Massenübergänge m/z 169 95 (NMC-Cyt) und 172 98 (IS NMC-Cyt*) als Qualifier verwendet werden, was bei einem Säulensatz aufgrund geringer Signalintensität und Interferenzen nicht möglich gewesen war. In allen drei untersuchten positiven Proben konnte NMC-Cyt anhand der identischen Retentionszeit bei Verwendung zweier Säulensätze von je zwei analytischen Säulen und anhand zweier Massenübergänge m/z 169 112 und 169 95 (für IS NMC-Cyt*: m/z 172 115, 172 98) bestätigt werden. Eine repräsentative Probe ist in Abbildung 16 dargestellt. Durch diese qualitative Bestätigung des Nachweises ist NMC-Cyt in Realproben zweifelsfrei nachgewiesen. 2.0e4 1.6e4 (a) m/z 169 95 gestört 1.2e4 8000 Intensität, cps 4000 0.0 2.0e4 1.6e4 25 27 29 31 m/z 172 115 m/z 169 112 33 35 (c) (b) 1.2e4 8000 m/z 172 115 m/z 169 112 m/z 172 98 m/z 169 95 4000 0.0 17 19 21 23 25 Zeit, min Abbildung 16: Qualitative Bestätigung des Nachweises von NMC-Cyt, aufgearbeitete Probe (a) nach dem ersten Säulensatz, (b) nach dem zweiten Säulensatz, (c) Vergrößerung des Peaks aus b, Massenübergänge: NMC-Cyt m/z 169 112, 95; IS NMC-Cyt* m/z 172 115, 98 72 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 6. Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Die Belastung bei DMF-Exposition am Arbeitsplatz und die daraus resultierende Beanspruchung wurden anhand zweier Kollektive von Beschäftigten untersucht. Um eine eventuelle Hintergrundbelastung von DMF-DNA-Addukten abzuschätzen wurde ein Kontrollkollektiv aus der Allgemeinbevölkerung untersucht. 6.1 Kollektive und Methoden 6.1.1 Kollektive Kollektiv 1 - DMF-exponierte Beschäftige aus der Polyacrylfaserindustrie: Kollektiv 1 umfasste 32 männliche Beschäftigte aus der Polyacrylfaserindustrie, die am Arbeitsplatz DMF exponiert waren. Den Beschäftigten oblagen unterschiedliche Tätigkeiten im Rahmen der Fertigung der Polyacrylfasern (Spinnen, Kräuseln, Färben, Transport usw.). Die Beschäftigten waren zwischen 21 und 56 Jahren alt (Median 36). Sie waren seit bis zu 27 Jahren in dem Betrieb tätig. Siebzehn der Beschäftigten waren Raucher, einer nahm Schnupftabak und 14 waren Nichtraucher. Dieses Kollektiv war im Jahr 1997 akquiriert worden. Es lagen bereits die Ergebnisse zu den DMFStoffwechselprodukten NMF und AMCC, sowie zum biochemischen Effektmarker NMC-Valin (HbAddukt) vor [21, 114]. Zusätzlich wurde die Konzentration der DMF-DNA-Addukte in Urin bestimmt. Kollektiv 2 - DMF-exponierte Beschäftige aus der Polyacrylfaserindustrie: Das Kollektiv 2 bestand aus 25 männlichen DMF-exponierten Beschäftigten. Sie stammten aus dem gleichen Betrieb wie Kollektiv 1 und übten ebenfalls unterschiedliche Tätigkeiten bei der Fertigung von Polyacrylfasern aus. Von jedem Beschäftigten wurden innerhalb einer Woche zwei Urinproben jeweils nach Schichtende gesammelt. Die Anzahl der geleisteten Schichten lag zwischen eins und sieben (Details siehe Anhang). Die Beschäftigten waren zwischen 31 und 54 Jahren alt mit einem Median von 40. Die Beschäftigungszeit lag zwischen sechs und 28 Jahren. Acht der Beschäftigten waren Raucher, 17 Nichtraucher. Die Urinproben wurden im Jahr 2004 gesammelt und untersucht. Es wurden NMF und die DMF-DNA-Addukte bestimmt. Kontrollkollektiv aus der Allgemeinbevölkerung: Das Kontrollkollektiv bestand aus 24 Personen (11 männlich, 13 weiblich) ohne eine bekannte berufliche Exposition gegenüber DMF. Die Personen waren zwischen 13 und 64 Jahren alt mit einem 73 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Median von 33. Sieben der Personen waren Raucher und 17 Nichtraucher. Die Urinproben (aus dem Jahr 2002) wurden bezüglich der DMF-DNA-Addukte im Urin untersucht. Die genauen Daten zu den Kollektiven sind im Anhang in Tabellen zusammengefasst. Alle Urinproben wurden bei -18 °C gelagert. 6.1.2 Methoden Bestimmung von NMF und AMCC im Urin (Kollektiv 1) NMF und AMCC wurden beim Kollektiv 1 zusammen in einem Verfahren bestimmt [113]. Fünf Milliliter Urin werden mit Salzsäure angesäuert und mit Natriumchlorid gesättigt. N,NDimethylpropionsäureamid wird als interner Standard (100 mg/L Wasser) hinzugegeben. Die Probe wird dann zweimal mit Tetrahydrofuran extrahiert (5 mL). Nach Aufreinigung der organischen Fraktion mittels Kationenaustauscher wird diese auf ca. 0,5 mL eingeengt. Ethanol (2 mL) und Dikaliumcarbonat (1,5 g) werden hinzugegeben. Die Probe wird geschüttelt und zentrifugiert. Ein Milliliter der überstehenden Lösung werden mit zwei Millilitern Wasser versetzt und anschließend zweimal mit Dichlormethan (5 mL) extrahiert. Das Extrakt wird auf 100 µL eingeengt und mit GCMS analysiert. Während des Verfahrens wird AMCC in Ethyl-N-methylcarbamat und HMMF in NMF überführt. Folglich wird die Summe aus HMMF und NMF in Form von NMF bestimmt. Die Nachweisgrenzen für NMF und AMCC betragen 0,1 bzw. 0,03 mg/L Urin. Bestimmung von NMF im Urin (Kollektiv 2) NMF wurde beim Kollektiv 2 nach einem geprüften Verfahren bestimmt [253]. Die Urinproben (1 mL) werden mit einem Milliliter einer ethanolischen Lösung des internen Standards Dimethylacetamid (30 mg/L) versetzt. Nach kurzem Schütteln wird zur Abtrennung fester Bestandteile zentrifugiert. Die Proben werden mittels GC mit Stickstoff-Phosphor-Detektor analysiert. HMMF wird im Injektor thermisch zu NMF umgesetzt. Die Nachweisgrenze beträgt 0,1 mg/L. Bestimmung von NMC-Valin im Blut Die Bestimmung von NMC-Valin des Hämoglobins von Kollektiv 1 erfolgte nach Isolierung von Globin aus ca. 20 mL Blut [20]. Hierzu werden zunächst die Erythrocyten durch Zentrifugation von Plasmabestandteilen abgetrennt, mit Natriumchloridlösung (0,9%) gewaschen und durch Zugabe von bidestilliertem Wasser lysiert. Aus zwei Millilitern Lysat werden nach Zugabe von 50 mM Salzsäure (in 2-Propanol) mit Ethylacetat ca. 150 bis 250 mg Globin gefällt. Dies wird mit Ethylacetat und Hexan gewaschen und anschließend getrocknet. Das Globin wird bis zur Analyse bei -28°C gelagert. Das Globin wird einem modifizierten Edman-Abbau unterworfen. Hierzu werden 200 mg Globin zunächst mit internem Standard (100 µL, 3,4 mg/L 3-Ethyl-5-isopropylhydantoin/Ethylcarbamoyl- 74 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid valin) versetzt, in Essigsäure/Wasser (3 mL, v/v 1/1) gelöst und eine Stunde bei 110°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen entsteht 3-Methyl-5-isopropylhydantoin als Ringschlussprodukt aus terminalem NMC-Valin. Nach Abkühlen und Zufügen von einem Milliliter Natriumchloridlösung (0,9%) wird der pH-Wert auf 3 bis 5 eingestellt. Es wird zweimal mit Ethylacetat (5 mL) extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden dann zur Trockne eingeengt und über Nacht im Vakuumexsikkator über Natronlauge getrocknet. Die getrockneten Proben werden in 0,5 mL Ethylacetat aufgenommen und mit GC-MS analysiert. Bestimmung von NMC-dC und NMC-Cyt in Urin Die DMF-DNA-Addukte NMC-dC und NMC-Cyt wurden bei allen drei Kollektiven gemäß des Analyseverfahrens aus Kapitel 4 bestimmt. Bestimmung des Kreatiningehalts Der Kreatiningehalt aller Urinproben wurde photometrisch nach Larsen [254] bestimmt. Statistische Untersuchungen Häufigkeitsverteilungen (Box-Plot, Relative Summenhäufigkeit) und Korrelationen (Konfidenzbereich 95%) wurden mit Microcal Origin 6.0 durchgeführt. Bei der Prüfung auf Signifikanz eines Unterschiedes wurde auf Basis einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% entschieden. Parameter der deskriptiven Statistik wurden mit Microsoft Excel 2002 ermittelt. Messergebnisse unterhalb der analytischen Nachweisgrenzen sind entsprechend der halben Nachweisgrenze in die statistischen Berechungen eingegangen. 75 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 6.2 Ergebnisse 6.2.1 Ergebnisse zur inneren Belastung 6.2.1.1 Ergebnisse zu N-Methylformamid Die Ergebnisse zu NMF im Urin für die Kollektive 1 und 2 sind anhand der wesentlichen statistischen Parameter in Tabelle 16 bzw. Tabelle 17 zusammengestellt. Beim Kollektiv 1 konnte im Median eine Konzentration von 10 mg/L bestimmt werden. 95% der Werte lagen unterhalb von 48 mg/L. Zwischen den Ergebnissen in mg/L und denen in mg/g Kreatinin sind nur geringe Unterschiede festzustellen. 95. Perzentil und Mittelwerts sind bezogen auf den Kreatiningehalt der Proben etwas niedriger als auf das Volumen bezogenen. Fünf der Proben (16%) weisen NMF-Konzentrationen oberhalb des BAT-Wertes von 35 mg/L auf. Tabelle 16: Innere DMF-Belastung, NMF in Urin, Kollektiv 1 n (n>NWG) mg/L Urin 32 (32) mg/g Kreatinin 32 (32) NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl Minimum 2 3 NMF Konzentration Maximum Mittelwert Median 60 18 10 73 14 9 95. Perzentil 48 31 Median und 95. Perzentil des Kollektivs 2 betrugen 7 bzw. 66 mg/L. Wiederum bestehen nur marginale Unterschiede zwischen den auf Volumen und Kreatiningehalt bezogenen Werten. Die Konzentration des 95. Perzentils in mg/g ist etwas niedriger als die in mg/L. Fünf Proben (10%) überschreiten den BAT-Wert (35 mg/L), vier davon deutlich mit NMF-Konzentrationen von 61, 71, 92, 150 mg/L. Tabelle 17: Innere DMF-Belastung, NMF in Urin, Kollektiv 2 n (n>NWG) mg/L Urin 50 (50) mg/g Kreatinin 50 (50) NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl Minimum 1 0,3 NMF Konzentration Maximum Mittelwert Median 150 16 7 144 15 7 95. Perzentil 66 62 76 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 6.2.1.2 Ergebnisse zu N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein Eine Zusammenfassung der Ergebnisse zu AMCC in Urin für Kollektiv 1 gibt Tabelle 18. Maximum, Mittelwert und 95. Perzentil sind bezogen auf das Volumen höher als bezogen auf den Kreatiningehalt. AMCC liegt in vier Proben (12,5%) oberhalb des Grenzwertes von 40 mg/L, der von der American Conference of Governmental Industrial Hygienists vorgeschlagen wurde. Tabelle 18: Innere DMF-Belastung, AMCC in Urin, Kollektiv 2 n (n>NWG) mg/L Urin 32 (32) mg/g Kreatinin 32 (32) NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl 6.2.1.3 Minimum 1 1 AMCC Konzentration Maximum Mittelwert Median 116 21 11 56 14 9 95. Perzentil 67 39 Diskussion Die Bestimmung von NMF in Urin ist eine etablierte Methode zur Erfassung der inneren Belastung von DMF [11, 21, 49, 50, 67, 104, 105, 109-122, 255]. Dabei werden im Allgemeinen die beiden DMF-Metabolite NMF und HMMF zusammen als NMF bestimmt. Zwischen Kollektiv 1 und Kollektiv 2 konnte bezüglich NMF kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (zweiseitiger t-Test, p=0,74546). Mittelwert und Median sind nahezu gleich, wie die Box-Plot-Darstellung verdeutlicht. 160 120 NMF mg/L Urin 80 40 20 0 Kollektiv 1 K1NMFmgL Kollektiv 2 K2NMFmgL Abbildung 17: Vergleich der NMF-Konzentration in Urin von Kollektiv 1 (n=32) und Kollektiv 2 (n=50), p=0,74546 77 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Die Darstellung der relativen Summenhäufigkeiten zeigt, dass die Kurven der zwei Kollektive sich einander bis zum 60. Perzentil überlappen. Zwischen 60. und 90. Perzentil differieren sie geringfügig und erst danach sind größere Unterschiede festzustellen. Dies ist auf drei sehr hoch belastete Urinproben des Kollektivs 2 zurückzuführen (71, 92, 150 mg/L). Ohne diese stimmen die 99. Perzentile beider Kollektive überein. 99,9 Relative Summenhäufigkeit % 99 95 80 60 40 20 Kollektiv 1 Kollektiv 2 5 1 0 20 40 60 80 120 160 NMF mg/L Urin Abbildung 18: Relative Summenhäufigkeit, NMF-Konzentration in Urin, Kollektiv 1 (n=32) und Kollektiv 2 (n=50), p=0,74546 Die NMF-Konzentrationen der untersuchten Kollektive stehen im Einklang mit anderen Untersuchungen in der Polyacrylfaserindustrie [11, 49]. Wrbitzky und Angerer untersuchten 125 Beschäftigte und fanden NMF-Konzentrationen von maximal 100 mg/L mit einem Median von 15 mg/L (Probennahme Schichtende) [49]. Die Studie von Käfferlein et al. umfasste 23 Beschäftigte, bei denen die maximale innere Belastung an NMF 109 mg/L und der Median 6 mg/L betrug [11]. In einem Betrieb, der synthetisches Leder herstellte, wurden bei 25 Beschäftigten NMF-Konzentrationen zwischen 0,5 und 114 mg/L ermittelt [112]. Interessant ist, dass es in all diesen Studien bei einigen Beschäftigten zu deutlicher Überschreitung des BAT-Wertes von 35 mg/L kommt. Diese Überschreitungen treten auch auf, wenn der MAK-Wert von 10 ppm im Allgemeinen nicht überschritten wird [11, 49, 112]. Als Erklärung hierfür werden die individuell unterschiedliche dermale Aufnahme und die inkonsequente Nutzung von Schutzmaßnahmen wie z.B. Handschuhen angeführt. Verschiedentlich wurden signifikante Korrelationen zwischen NMF in Urin und der Konzentration von DMF am Arbeitsplatz (bei personengebundener Probenahme) beschrieben [104, 118, 255]. Solche konnten in anderen Studien nicht nachgewiesen werden [49]. Als Ursache für mangelnde Korrelation gelten wiederum dermale Resorption und unterschiedliche Handhabung von Protektionsmaßnahmen. 78 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Chang et al. erfassten die dermale Exposition am Arbeitsplatz durch eine tape-patch Methode und wiesen nach, dass sie einen substantiellen Anteil zur inneren Belastung beitrug [110, 256]. In einer weiteren Studie wurde die Effektivität verschiedener Protektionsmaßnahmen (darunter Handschuhe und Schutzcreme) bei DMF-Exposition geprüft und festgestellt, dass über die Haut ein größerer Anteil an Belastung aufgenommen wird als inhalativ [257]. Aufgrund der guten dermalen Resorption von DMF gilt es immer zu prüfen, wie sich die tatsächliche innere Belastung exponierter Personen darstellt. Neben NMF wird die Merkaptursäure AMCC in Urin als Biomarker zur Ermittlung der inneren DMFBelastung herangezogen [11, 21, 104, 112-115, 119, 120, 122, 123, 258-260]. AMCC ist ein Stoffwechselprodukt von DMF, das infolge der Konjugation von NMF an körpereigenes Glutathion entsteht. Die AMCC-Konzentrationen von Kollektiv 1 lagen zwischen ein und 116 mg/L mit einem Mittelwert von 21 mg/L. Diese Ergebnisse entsprechen denen einer Studie in der Industrie zur Herstellung synthetischen Leders [112]. Bei dieser wurden AMCC-Konzentrationen zwischen ein und 108 mg/L mit einem Mittelwert von 23 mg/L bestimmt [112]. Käfferlein et al. berichteten einen Mittelwert von 30 mg/L und einen Maximalwert von 205 mg/L AMCC bei DMF-Exponierten in der Polyacrylfaserindustrie [11]. Der Median war mit 12 mg/L nahezu gleich dem Median dieser Studie (11 mg/L) [11]. In anderen Studien wurden bei der Herstellung synthetischen Leders höhere AMCC Konzentrationen mit Mittelwerten zwischen 40 und 55 mg/L festgestellt [104, 115, 123]. Imbriani et al. fanden bei 22 DMF-exponierten Beschäftigten (Industriezweig nicht angegeben) Konzentrationen von bis zu 506 mg/L mit einem Mittelwert von 97 mg/L [261]. Für AMCC gibt es derzeit keinen BAT-Wert. Käfferlein leitete bei einer Studie einen möglichen Grenzwert ab [262]: Eine Exposition von 10 ppm DMF in der Luft (MAK-Wert) entsprach einer AMCC-Konzentration von 70 mg/L Urin am folgenden Tag vor Schichtbeginn [11]. Der biological exposure index der American Conference of Governmental Industrial Hygienists liegt mit 40 mg/L (Probenahme freitagmorgens) niedriger. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass dem biological exposure index und dem BAT-Wert unterschiedliche Definitionen zugrunde liegen. Der biological exposure index ist ein Mittelwert für eine Gruppe exponierter Beschäftigter, während der BAT-Wert ein tolerierbarer Höchstwert für Einzelpersonen ist. Für das hier untersuchte Kollektiv 1 kann festgehalten werden, dass vier Beschäftigte relativ hohe AMCC-Konzentrationen aufwiesen (>40 mg/L), davon zwei oberhalb von 70 mg/L. 79 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 120 y=9,31+0,65x R=0,4255 p=0,01519 AMCC mg/L Urin 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 NMF mg/L Urin Abbildung 19: Korrelation zwischen NMF und AMCC, Kollektiv 1 (n=32) Raucherstatus und Alter haben keinen Einfluss auf die Konzentrationen von NMF und AMCC. Bei Korrelation von AMCC und NMF ergibt sich ein signifikanter Zusammenhang (p<0,05). Es ist aber zu beachten, dass viele Punkte außerhalb des Konfidenzbereichs von 95% liegen und der Korrelationskoeffizient klein ist. Generell lässt sich nur sagen, dass mit steigender NMFKonzentration eher größere AMCC-Konzentrationen zu erwarten sind. Ein Zusammenhang zwischen AMCC und NMF im gleichen Urin wurde auch von Kim et al. beschrieben (Gleichung nicht gegeben, R=0,377, p<0,001). Eine bessere Korrelation mit einem größeren Koeffizienten ist vermutlich zu erwarten, wenn man die Summe der NMF-Konzentrationen zweier aufeinander folgender Tage mit der AMCC-Konzentration des zweiten Tages vergleicht. Aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit (ca. 5 h [9, 11]) spiegelt NMF nämlich die DMF-Aufnahme innerhalb eines kurzen Zeitraums z.B. einer Arbeitsschicht wider. AMCC hat eine Halbwertszeit von 16-23 h [9, 11] und zeigt daher die durchschnittliche Exposition zwei aufeinander folgender Tage an. Ob NMF oder AMCC als Parameter eingesetzt werden soll, hängt vom Blickpunkt und dem Ziel der Untersuchung ab. NMF eignet sich wegen seiner kurzen Halbwertszeit zur Überwachung der täglichen Arbeitshygiene beim Umgang mit DMF. Aufgrund der längeren Halbwertszeit ermöglicht AMCC eine genauere Abschätzung der Expositionssituation an einem Arbeitsplatz. Die Wahl des Probenahmezeitpunkts (vor oder nach der Schicht) hat bei AMCC weniger Einfluss auf das Ergebnis. Zudem wird vermutet, dass AMCC in direktem Zusammenhang mit den toxischen Eigenschaften steht. Klug et al. folgerten z.B. dass die Entwicklungstoxizität von DMF in Beziehung zum Ausmaß der Bindung an Glutathion steht [66]. Die Rolle von HMMF und NMF ist hingegen nicht geklärt. Für die Entstehung von AMCC wird wie für die Entstehung von Hb-Addukten das gleiche reaktive Intermediat (MIC) verantwortlich gemacht. Proteinaddukte gelten als Hinweis auf die mögliche 80 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Genotoxizität und Mutagenität eines Stoffes. Aufgrund dieser größeren toxischen Relevanz und der längeren Halbwertszeit eignet sich AMCC im Hinblick auf eine gesundheitliche Überwachung DMFexponierter Personen. Da analytische Methoden vorliegen, die die simultane Bestimmung von NMF und AMCC erlauben [113, 122], muss aber nicht mehr zwingend die Wahl zwischen den Parametern getroffen werden. Sohn et al. entwickelten eine LC-MS-Methode, bei der NMF, HMMF und AMCC ohne Konvertierung direkt und spezifisch aus Urin bestimmt werden können [122]. Aus analytischer Sicht besteht durch die Erfassung der drei Parameter kein Mehraufwand, so dass in Zukunft alle drei Parameter für eine Risikoevaluierung exponierter Beschäftigter genutzt werden können. 81 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 6.2.2 6.2.2.1 Ergebnisse des biochemischen Effektmonitorings Ergebnisse zum Hämoglobin-Addukt N-methylcarbamoyliertes Valin Die deskriptive Statistik der Ergebnisse zum Hb-Addukt NMC-Valin ist in Tabelle 19. Das HbAddukt konnte in allen Proben nachgewiesen werden. Median und 95. Perzentil betragen 110 nmol/g bzw. 216 nmol/g Globin. Tabelle 19: Biochemisches Effektmonitoring, Hb-Addukt NMC-Valin, Kollektiv 1 n (n>NWG) nmol/g Globin 32 (32) NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl 6.2.2.2 Ergebnisse zu den Minimum 26 NMC-Valin-Konzentration Maximum Mittelwert Median 412 124 110 DNA-Addukten 95. Perzentil 216 N4-Methylcarbamoylcytosin und N4- Methylcarbamoyldeoxycytidin Die Ergebnisse zu NMC-Cyt in den exponierten Kollektiven sind in Tabelle 20 und Tabelle 21 zusammengefasst. In keiner der 24 Proben des Kontrollkollektivs wurde NMC-Cyt nachgewiesen. Tabelle 20: Biochemisches Effektmonitoring, Ergebnisse NMC-Cyt in Urin, Kollektiv 1 Alle Proben, n=32 Konzentration NMC-Cyt pmol/L Urin Konzentrationsbereich <NWG - 1023 Mittelwert 151 Median <NWG 95. Perzentil 717 Positive Proben, n=10 A1 500 A2 294 A3 190 A4 232 A5 660 A6 184 A7 1023 A8 232 A9 607 A10 773 NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl pmol/g Kreatinin <NWG - 1333 153 <NWG 686 609 157 128 154 600 542 763 101 372 1333 82 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Abbildung 20 zeigt repräsentativ das Chromatogramm einer Probe eines DMF-exponierten Beschäftigten des Kollektivs 1 mit 660 pmol NMC-Cyt pro Liter in Urin. Beim Kollektiv 1 lagen die NMC-Cyt Konzentrationen zwischen <NWG und 1023 pmol/L Urin. Das 95. Perzentil beträgt 717 pmol/L. Die Ergebnisse in mg/L und in mg/g Kreatinin der deskriptiven Statistik unterscheiden sich marginal. Die Konzentration des 95. Perzentils ist auf das Volumen bezogen geringfügig größer als bei Bezug auf den Kreatiningehalt. Tabelle 21: Biochemisches Effektmonitoring, NMC-Cyt in Urin, Kollektiv 2 Alle Proben, n=50 Konzentration NMC-Cyt pmol/L Urin Konzentrationsbereich <NWG - 684 Mittelwert 47 Median <NWG 95. Perzentil 242 Positive Proben, n=12 B1 65 B2 131 B3 684 B4 65 B5 256 B6 119 B7 226 B8 77 B9 119 B10 155 B11 280 B12 155 NWG:Nachweisgrenze, n:Anzahl pmol/g Kreatinin <NWG - 621 55 <NWG 269 344 126 622 59 134 476 177 149 131 161 177 174 Die NMC-Cyt Konzentrationen reichten beim Kollektiv 2 von <NWG bis 684 pmol/L. 95% der Werte waren kleiner 242 pmol/L. Auch bei diesem Kollektiv sind in der deskriptiven Statistik keine großen Unterschiede zwischen Volumen- und Kreatininbezug zu erkennen. Die auf Kreatinin bezogenen Werte für Mittelwert und 95. Perzentil sind unwesentlich größer als die auf das Volumen bezogenen Werte. 83 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid 2600 2200 (a) 1800 1400 1000 m/z 169 600 112 Intensität, cps 200 0 4 8 12 16 20 24 28 32 20 24 28 32 3800 3400 (b) 3000 2600 2200 1800 1400 1000 m/z 172 115 600 200 0 4 8 12 16 Zeit, min Abbildung 20: Integriertes Chromatogramm einer aufgearbeiteten Urinprobe (A5 des Kollektivs 1), (a) Massenübergang m/z 169 112 für NMC-Cyt, (b) m/z 172 115 für NMC-Cyt*; Konzentration von NMC-Cyt 660 pmol/L 6.2.2.3 Halbquantitative Abschätzung von N4-Methylcarbamoylcytosin und N4- Methylcarbamoyldeoxycytidin Um zu untersuchen, ob vor allem NMC-Cyt oder NMC-dC in Realproben vorliegt, wurden fünf positive Proben von DMF-belasteten Beschäftigten ohne Hydrolyse (aber mit Einstellung auf pH 1) aufgearbeitet und vermessen. Die Konzentration an NMC-Cyt wurde mit einer regulären Kalibrierreihe (mit Hydrolyse) ermittelt. Beim entwickelten Analyseverfahren werden NMC-Cyt und NMC-dC als Summenparameter in Form von NMC-Cyt bestimmt. Ohne Hydrolyse wurde NMC-dC nicht in NMC-Cyt überführt und nur in der Probe vorhandenes NMC-Cyt erfasst. Die Konzentration von NMC-dC wird in Tabelle 22 als Summe von NMC-dC und NMC-Cyt (Bestimmung mit Hydrolyse) minus NMC-Cyt (Bestimmung ohne Hydrolyse) angegeben. In den Proben A5 und A7 lag überwiegend NMC-Cyt vor, während in den anderen wahrscheinlich überwiegend bzw. ausschließlich NMC-dC vorlag. Das Verhältnis von NMCCyt/NMC-dC lag zwischen 0:294 und 5,9:1. 84 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Tabelle 22: Abschätzung der Konzentration von NMC-Cyt und NMC-dC in Realproben Verfahren mit Hydrolyse Bestimmung von NMC-Cyt und NMC-dC Probe in Summe als NMC-Cyt pmol/L 294 A2 184 A3 660 A5 1023 A7 607 A9 NWG:Nachweisgrenze 6.2.2.4 Verfahren ohne Hydrolyse Bestimmung von Berechnung NMC-Cyt NMC-dC pmol/L pmol/L <NWG 294 <NWG 184 564 96 728 295 180 427 Diskussion Als erster biochemischer Effektmarker für DMF wurde das Hb-Addukt NMC-Valin bestimmt [19]. Dieses entsteht vermutlich durch Bindung des reaktiven DMF-Intermediates MIC an N-terminales Valin des Hämoglobins. Bisher wurden Hb-Addukte von DMF nur in wenigen Studien als biochemische Effektmarker bei DMF-Exposition eingesetzt [19, 20, 24]. Mraz et al. schlugen nach Expositionsexperimenten einen Grenzwert von 135 nmol NMC-Valin pro Globin als steady-state Level bei Inhalationsexposition gegenüber 10 ppm DMF (8 h/Tag, 5 Tage/Woche, 20 Wochen) vor [22]. Dieser wurde bei beruflicher DMF-Exposition in einigen Fällen überschritten. Angerer et al. berichteten für zehn exponierte Beschäftigte eine maximale Konzentrationen von 977 nmol/g Globin mit einem Median von 456 nmol/g Globin [19]. Mraz et al. beobachteten bei experimenteller und beruflicher Exposition Werte zwischen ein und 441 nmol/g Globin (n=21) [24]. Beim Kollektiv 1 wurde bei 38% (12 von 32) der Beschäftigten eine NMC-Valin-Konzentration oberhalb von 135 nmol/g Globin festgestellt. Die Maximalkonzentration betrug 412 nmol/g Globin und war somit deutlich geringer als bei Angerer et al. (977 nmol/g) [19]. Ähnlich wie auch bei NMF und AMCC sind diese Überschreitungen durch dermale Resorption und unzureichende Verwendung von Protektionsmaßnahmen bedingt. 85 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein DMF-DNA-Addukt im Urin von DMF-exponierten Personen bestimmt. Wie beim Hb-Addukt wird die Bildung auf das postulierte Intermediat MIC zurückgeführt. Dieses kann an die nukleophilen Stellen der DNA-Basen binden und so NMC-dC bzw. NMC-Cyt bilden. In zehn der 32 Proben von Kollektiv 1 und zwölf der 50 Proben von Kollektiv 2 konnte das DMFDNA-Addukt NMC-Cyt nachgewiesen und quantifiziert werden. Für eine aussagekräftige statistische Untersuchung liegt damit eine relativ geringe Datenbasis vor. So wurde zwischen Kollektiv 1 und 2 bei einem zweiseitigen t-Test zwar ein signifikanter Unterschied festgestellt (p=0,02039), aber generell bewegen sich die Konzentrationen beider Kollektive im gleichen Bereich. 1100 1000 NMC-Cyt pmol/L Urin 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Kollektiv 1 K1NMCCpmolL Kollektiv 2 K2NMCCpmolL Abbildung 21: Vergleich der NMC-Cyt-Konzentration in Urin von Kollektiv 1 (n=32) und Kollektiv 2 (n=50), p=0,02039 Durch die Untersuchung von fünf positiven Proben DMF-exponierter Personen ohne vorherige Hydrolyse konnte sowohl NMC-Cyt als auch indirekt NMC-dC nachgewiesen werden. Für DNABasen-Addukte wie NMC-Cyt kommt auch die RNA als Quelle in Frage. Bei Addukten von Deoxynukleosiden kann hingegen davon ausgegangen werden, dass sie mit der DNA gebildet wurden. So wurde mit dieser Untersuchung indirekt belegt, dass ein Teil der nachgewiesenen Addukte von der DNA stammte. Hb-Addukte gelten als Surrogate für DNA-Addukte, dennoch korrelierten die beiden biochemischen Effektmarker NMC-Cyt und NMC-Valin nicht (Abbildung 22). Bei Bezug der NMC-Cyt-Werte auf Kreatinin ergab sich auch kein signifikanter Zusammenhang. Für die Hb-Addukte NMC-Valin und 86 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid NMC-Lysin hatten Mraz et al. eine gute Korrelation festgestellt (y=0,56-0,263x; r=0,923) [24]. Dabei handelt es sich aber um zwei Hb-Addukte, die die gleiche Lebensdauer haben. Zur Kinetik der DNAAddukte NMC-dC und NMC-Cyt liegen derzeit keine Kenntnisse vor. NMC-Cyt korrelierte auch nicht mit AMCC oder NMF. Dies ist wiederum auf eine unterschiedliche Kinetik zurückzuführen. Es ergaben sich weder für das Hb-Addukt NMC-Valin noch für das DNA-Addukt NMC-Cyt Zusammenhänge mit Rauchverhalten oder der Beschäftigungszeit in Jahren. 450 400 y=119,15+0,03x R=0,1058 p=0,56442 NMC-Val nmol/g Globin 350 300 250 200 150 100 50 0 0 200 400 600 800 1000 1200 NMC-Cyt pmol/L Urin Abbildung 22: Korrelation zwischen NMC-Cyt und NMC-Valin, Kollektiv 1 Aufgrund der langen Lebensdauer der Hb-Addukte (ca. 120 Tage) eignen sie sich zur Erfassung der chronischen DMF-Belastung und als biochemischer Effektmarker von mutagener Relevanz insbesondere zur Abschätzung des Gesundheitsrisikos. Die Möglichkeit NMC-Cyt in Humanurin zu bestimmen, ist ein Fortschritt für das Biomonitoring von DMF gegenüber der Bestimmung der Hb-Addukte. Das DNA-Addukt ist ein genotoxischer Effekt und näher an der eigentlichen Wirkung einer potentiell kanzerogenen Substanz und somit der Abschätzung des Gesundheitsrisikos. Bevor NMC-Cyt als biochemischer Effektmarker in der Routine eingesetzt werden kann, wäre eine Verbesserung der Nachweisgrenze erforderlich, um NMC-Cyt in möglichst allen Proben exponierter Personen erfassen zu können. Derzeit ist noch die Bestimmung der HbAddukte vorzuziehen. Dies trifft insbesondere zu, da Mraz et al. ein Verfahren erarbeiteten, mit dem die direkte Bestimmung von NMC-Valin und NMC-Lysin aus Globin mit LC-MS möglich ist [24]. Die Hb-Addukte lieferten einen ersten klärenden Hinweis auf die im Zusammenhang mit DMF aufgetretenen Keimzelltumore. Die DMF-DNA-Addukte belegen nun die Genotoxizität von DMF und dessen mutagenes und kanzerogenes Potential. 87 Biomonitoring von N,N-Dimethylformamid Ihre Bildung zeigt, wie weit DMF bzw. das postulierte Intermediat MIC in den Organismus vordringt. Denkbar ist auch, dass MIC an Reparaturenzyme bindet, diese blockiert und dadurch indirekt zu Mutation und Kanzerogenese beiträgt. Der genaue Entstehungsweg der Protein- und DNA-Addukte von DMF ist dabei weiterhin ungeklärt. Da MIC die gleichen Addukte bildet, ist sein Auftreten als Intermediat im DMF-Metabolismus wahrscheinlich. Eine Überlegung ist, dass MIC direkt mit Proteinen und DNA reagiert. Die im Allgemeinen favorisierte Überlegung geht davon aus, dass MIC im Organismus an Glutathion bindet und anschließend auf die Aminogruppe eines Proteins oder einer DNA-Base übertragen wird. Transcarbamoylierungen ausgehend von Proteinaddukten von MIC können ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. 88 Zusammenfassung 7. Zusammenfassung N,N-Dimethylformamid (DMF) ist eines der industriell wichtigsten organischen Lösungsmittel. Seine Hepatotoxizität, Embryotoxizität und Teratogenität sind erwiesen. Somit stellt DMF ein großes gesundheitliches Gefährdungspotential dar. Eine mögliche Kanzerogenität wurde nach Auftreten einiger Krebsfälle in den 1980er Jahren diskutiert, ist aber bislang ungeklärt. Bei der Produktion und insbesondere bei der Verwendung von DMF kommt es zur Exposition von Beschäftigten. Für eine Prävention von Gesundheitsschäden ist als erste Maßnahme die Erfassung der inneren Belastung erforderlich. Dies ist im Falle von DMF umso wichtiger, da es gut über die Haut resorbiert wird und bei alleiniger Bestimmung der Luftkonzentration die aufgenommene Dosis oftmals unterschätzt wird. In der Arbeitsmedizin hat sich für das Dosismonitoring von DMF die Bestimmung dreier Urinmetabolite etabliert: N-Methylformamid (NMF) und Hydroxymethylformamid (HMMF) in Summe als NMF, sowie N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cystein (AMCC). Als biochemische Effektmarker sind die Hämoglobin-Addukte (N-methylcarbamoyliertes Valin und N- methylcarbamoyliertes Lysin des Hämoglobins) im Blut bekannt. Hämoglobin-Addukte weisen auf die potenzielle Mutagenität eines Stoffes hin und gelten als Surrogate für Addukte mit dem Erbgut (DNA, Deoxyribonukleinsäure). Im Rahmen dieser Arbeit sollte die toxikologisch und arbeitsmedizinisch wichtige Frage geklärt werden, ob es beim Menschen tatsächlich zur Bildung von DNA-Addukten durch DMF kommt. DNAAddukte können repariert und im Urin ausgeschieden werden. Erstes Ziel dieser Arbeit war deshalb ein Analyseverfahren zu entwickeln, dass die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Addukten von DMF im Urin beruflich exponierter Personen ermöglicht. Nach Auswertung der Literatur war die Bildung der DNA-Addukte NMC-dC (N4-Methylcarbamoyl2´-deoxycytidin) und NMC-Cyt (N4-Methylcarbamoylcytosin) durch DMF am wahrscheinlichsten. Diese wurden als Standards synthetisiert. Es wurde erfolgreich ein Analyseverfahren für NMC-dC und NMC-Cyt entwickelt und validiert. Nach Zugabe eines isotopenmarkierten internen Standards (NMC-Cyt*, 2-13C, 1,3-15N) erfolgt einleitend die Hydrolyse von NMC-dC zu NMC-Cyt, um die diagnostische Empfindlichkeit zu erhöhen und beide Substanzen in Summe zu erfassen. Durch Festphasenextraktion mit Kationenaustauscher wird die 89 Zusammenfassung Probe aufgereinigt und NMC-Cyt aufkonzentriert. Mittels einer anspruchsvollen zweidimensionalen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gelingt die effektive Abtrennung von Störkomponenten. Die Detektion erfolgt nach positiver Elektrospray-Ionisation massenspektrometrisch durch Überwachung der Übergänge von Molekül- zu Produktionen (NMC-Cyt m/z 169 m/z 172 112, NMC-Cyt* 115). Dies erlaubt einen eindeutigen Nachweis von NMC-Cyt. Das Verfahren zeichnet sich durch sehr gute Impräzision ( 5%) und Wiederfindung (Mittelwert 97%) aus. Die Nachweisgrenze des Analyseverfahrens für NMC-Cyt beträgt 50 pmol/L Humanurin. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand in der Anwendung des Verfahrens, um die DNA-Addukte bei DMF-Exposition nachzuweisen und um eine eventuelle Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung zu erfassen. Das neu entwickelte Verfahren wurde daher auf Kontrollpersonen und DMF-exponierte Beschäftigte angewendet. In 22 der 82 Urinproben exponierter Beschäftigter wurde NMC-Cyt nachgewiesen. Die Maximalkonzentration betrug 1023 pmol/L. In drei positiven Proben wurde der Nachweis mittels einer zweiten zweidimensionalen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie qualitativ bestätigt. NMC-Cyt konnte somit zweifelsfrei nachgewiesen werden. Durch Analyse fünf positiver Proben ohne Hydrolyse konnte indirekt die Bildung von NMC-dC bestätigt werden. In der Allgemeinbevölkerung wurde keine Hintergrundbelastung an NMC-Cyt festgestellt. Anhand der für die Biomarker von DMF erhaltenen Ergebnisse eines Kollektivs exponierter Personen sollte geklärt werden, welcher Parameter sich besser für das Biomonitoring von DMF eignet. Zur Überwachung der Arbeitshygiene beim Umgang mit DMF empfiehlt sich die Verwendung der Parameter NMF und AMCC, da diese mit Halbwertzeiten der Eliminierung von 5 bzw. 23 Stunden die DMF-Aufnahme innerhalb eines kurzen Zeitraums widerspiegeln. Die Hämoglobin-Addukte zeigen die chronische Aufnahme von DMF über 120 Tage an. Sie können als biochemische Effektmarker zur periodischen Überwachung und zur Abschätzung des Gesundheitsrisikos von Beschäftigten genutzt werden. Das erstmalig nachgewiesene DMF-DNA-Addukt NMC-Cyt in Humanurin ermöglicht die Erfassung eines biochemischen Effektmarkers der näher an der potentiell kanzerogenen Wirkung einer Substanz ist als ein Hämoglobin-Addukt. Seine allgemeine Anwendung als Effektmarker muss weiter erprobt werden. Diesbezüglich wäre eine Verbesserung der Nachweisgrenze wünschenswert, so dass NMC-Cyt in mehr Proben erfasst werden könnte. Eine solche Verbesserung ließe sich wahrscheinlich durch ein nachweisstärkeres Massenspektrometer erreichen. Die nachgewiesenen DNA-Addukte NMC-Cyt und NMC-dC, die mit den Addukten von Methylisocyanat (MIC) bei in vitro Versuchen identisch sind, belegen die Bildung von MIC als 90 Zusammenfassung Intermediat im DMF-Metabolismus. Ungeklärt bleibt, ob MIC direkt mit der DNA reagiert oder ob es nach der Bindung an körpereigenes Glutathion zur Übertragung der NMC-Gruppe kommt. Mit dem Nachweis von NMC-dC und NMC-Cyt gelang erstmalig die qualitative und quantitative Bestimmung von DNA-Addukten von DMF im menschlichen Körper. Die DNA-Addukte belegen, dass DMF genotoxisch ist und über ein mutagenes Potential verfügt. Dies lässt die Vermutung zu, dass DMF über einen genotoxischen Mechanismus Krebs verursachen könnte. Denkbar ist auch, dass das im DMF-Metabolismus gebildete MIC an DNA-Reparaturenzyme bindet, diese blockiert und so indirekt die Entstehung von Krebs fördert. Mit dem Analyseverfahren zur Bestimmung von NMC-Cyt liegt das notwendige Instrumentarium vor, um eine mögliche Kanzerogenität von DMF aufzuklären. Denkbar ist die Verwendung von NMC-Cyt in molekular epidemiologischen Studien mit dem Ziel einen Zusammenhang zwischen der Bildung des Adduktes und dem Auftreten von Krebsfällen festzustellen. 91 Summary 8. Summary N,N-Dimethylformamide (DMF) is one of the most important organic solvents used in industry. It has been proven to be hepatotoxic, embryotoxic and teratogenic. Therefore it represents a great health risk. DMF has been associated with cancer incidences in the 1980s. However it remains unclear if DMF is carcinogenic or not. Workers are occupationally exposed to DMF during its production and use. The assessment of the individual body burden is a first measure for prevention of health damage. This is particually important in the case of DMF as it is readily absorbed percutaneously and therefore ambient air monitoring might underestimated the uptake. Three metabolites of DMF have been used as biomarkers to assess the individual exposure of workers in occupational medicine: N-methylformamide (NMF) and hydroxymethylformamide (HMMF) in sum as NMF, as well as N-Acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)-cysteine (AMCC). Furthermore the haemoglobin-adducts of DMF (N-methylcarbamoyled valine and N-methylcarbamoyled lysine of haemoglobine) have been measured as biochemical effect markers in blood. Haemoglobine-adducts indicate a potential mutagenicity of a substance and are generally considered surrogates for adducts with the DNA (deoxyribonucleic acid). The purpose of this investigation was to reveal if DMF forms DNA-adducts in humans. Since DNAadducts can be repaired and excreted into urine the first task was to develop an analytical procedure allowing the identification and quantification of DNA-adducts of DMF in urine of occupational exposed persons. After examination of the literature NMC-dC (N4-methylcarbamoyl-2´-deoxycytidine) and NMC-Cyt (N4-methylcarbamoylcytosine) were considered the most probable DNA-adducts to be formed in presence of DMF. These substances were synthesised as standards. An analytical protocol for the identification and quantification of NMC-dC and NMC-Cyt has been successfully developed and validated. It can be summarised as following: Initially an internal isotopically labelled standard (NMC-Cyt*, 2-13C, 1,3-15N) is added to the sample. During acidic hydrolysis NMC-dC is converted to NMC-Cyt in order to determine both adducts in sum and thereby enhancing diagnostic sensitivity. Solid phase extraction with cation exchange resins is used for sample clean-up and concentration of NMC-Cyt. Effective separation of NMC-Cyt and matrix components is achieved by sophisticated two dimensional liquid chromatography. Detection is performed using positive electro spray ionisation and tandem mass spectrometry monitoring transitions of molecule 92 Summary ions to product ions (NMC-Cyt 169 112, NMC-Cyt* 172 115). This allows an unambiguous identification of NMC-Cyt. The obtained analytical procedure has excellent imprecision ( 5%) and recovery (mean 97%). The detection limit reaches down to 50 pmol/L in human urine. A further task was the application of the analytical procedure in order to determine the DNA-adducts in occupational exposed subjects and to assess background exposure in general population. The newly developed procedure was applied to controll subjects and occupationally to DMF exposed persons. NMC-Cyt could be detected in 22 out of 82 urine samples of occupationally exposed subjects. The concentrations ranged up to 1023 pmol/L. In three positive samples the identity of NMC-Cyt was confirmed by an additional analysis with a second two dimensional liquid chromatography with mass spectrometry detection. The formation of NMC-dC could be proven indirectly by analysis of five positive samples without hydrolysis. No background exposure of NMCCyt could be detected in the general population. The obtained data for the biomarkers of DMF for exposed persons should be used to determine which parameter is the most appropriate for biomonitoring of DMF. For the survey of occupational hygiene while handling DMF the parameters NMF and AMCC are recommended. NMF and AMCC reflect the uptake of DMF during a short time due to their half life times of elimination of five and 23 hours, respectively. Haemoglobin-adducts indicate chronic uptake of DMF (120 days). As biochemical effect markers they are especially suited for periodic surveys and health risk assessment of occupationally exposed persons. A DMF-DNA-adduct was detected for the first time in human urine. It enables the assessment of a biochemical effect marker which is closer to the potential carcinogenic effect of a substance than a haemoglobin-adduct. The general application of NMC-Cyt as biomarker has to be further tested. Considering this an improvement of detection limit is desirable so that NMC-Cyt can be assessed in more samples. This improvement can be possibly achieved by employing more sensitive mass spectrometers. The determined DNA-adducts NMC-Cyt and NMC-dC are identical with those formed by methylisocyanate (MIC) in in vitro experiments. Therefore they confirm MIC as intermediate in DMF metabolism. However, it is not yet clear wether MIC directly reacts with DNA or if it binds first to glutathione and the N-methylcarbamoyl function is transfered later. 93 Summary The successfull determination of NMC-dC and NMC-Cyt in human urine proves for the first time the formation of DNA-adducts of DMF in humans. The DNA-adducts prove in turn the genotoxicity of DMF and indicate its mutagenic potential. This allows the assumption that DMF may cause cancer via a genotoxic mechanism. But it is also possible that the intermediate MIC formed in DMF metabolism binds to DNA-repair enzymes, blocks them and so facilitates cancer development. The analytical procedure for the determination of NMC-Cyt provides the necessary tool to further clarify the possible carcinogenic effect of DMF. NMC-Cyt can be applied in epidemiological studies aiming to reveal a correlation between adduct formation and cancer incidences. 94 Literatur 9. Literatur 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Concise International Chemical Assessment Document 31 - N,N-Dimethylformamide, World Health Organisation (WHO), International Labor Organisation (ILO), United Nations Environmental Programme (UNEP), ISBN 92 4 153031 6. 2001. 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Anhang 10.1 Tabelle-Übersichtsartikel zu DNA-Addukten Nachweisverfahren für DNA-Addukte Analysis of DNA adducts using high-performance separation techniques coupled to electrospray ionization mass Andrews [159] spectrometry Analysis of DNA adducts by capillary methods coupled to mass spectrometry: a perspective Appruzzese [263] Ultrasensitive and specific detection methods for exocylic DNA adducts: markers for lipid peroxidation and oxidative Bartsch [124] stress Methodologies for bulky DNA adduct analysis and biomonitoring of environmental and occupational exposures De Kok [125] Separation procedures capable of revealing DNA adducts Esaka [126] Detection of DNA adducts by electron capture mass spectrometry Giese [239] Applications of mass spectrometry for quantitation of DNA adducts Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity Koc [127] Phillips [128] Übersicht zu bestimmten DNA-Addukten Etheno-adduct-forming chemicals: from mutagenicity testing to tumor mutation spectra Capillary electrochromatography-mass spectrometry for the separation and identification of isomeric polyaromatic Barbin [130] Ding [129] hydrocarbon DNA adducts derived from in vitro reactions Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smoking-associated cancers Pfeifer [131] Formation and analysis of heterocyclic aromatic amine-DNA adducts in vitro and in vivo Turesky [132] Spectrum of styrene-induced DNA adducts: the relationship to other biomarkers and prospects in human Vodicka [133] biomonitoring Bedeutung von DNA-Addukten DNA adducts in human carcinogenesis: etiological relevance and structure-activity relationship Bartsch [264] Studies on biomarkers in cancer etiology and prevention: a summary and challenge of 20 years of interdisciplinary Bartsch [134] research New DNA-based biomarkers for oxidative stress and cancer chemoprevention studies Bartsch [135] DNA and protein adducts as markers of genotoxicity Farmer [136] What is the significance of increases in background levels of carcinogen-derived protein and DNA adducts? Some Farmer [265] considerations for incremental risk assessment Studies using specific biomarkers for human exposure assessment to exogenous and endogenous chemical agents Farmer [266] The role of DNA adducts in chemical carcinogenesis Garner [267] DNA adducts, mutations, and cancer Hemminki [137] Endogenous DNA damage and mutation Correlation of DNA adduct levels with tumor incidence: carcinogenic potency of DNA adducts Marnett [138] Otteneder [154] The enemy at the gates? DNA adducts as biomarkers of exposure to exogenous and endogenous genotoxic agents Shuker [139] DNA damage: chemistry, repair, and mutagenic potential Singer [268] DNA adducts as markers of exposure to carcinogens and risk of cancer Vineis [140] DNA-Reparatur Oxidative base damage to DNA: specificity of base excision repair enzymes Cadet [143] Substrate specificities and excision kinetics of DNA glycosylases involved in base-excision repair of oxidative DNA Dizdaroglu damage A mechanistic perspective on the chemistry of DNA repair glycosylases [144] Stivers [142] 107 Schwach polare, nicht polare Verbindungen, Säuren, Basen Sehr polare Analyten C12 mit Trimethylsilyl-Endcapping (propyl) Etherverknüpfte Phenylphase mit hydrophilem, polarem Endcapping C18 mit speziellem polarem Endcapping C18 C8 SynergiTM Max-RP SynergiTM Polar-RP Aqua® C18 XTerra® MS C18 LiChrospher® 60 RP-Select B Polare Analyten, Nukleotide 250×4,6 mm, 5 µm 108 50×4,6 mm, 2,5 µm Breiter Anwendungsbereich u.a. Oligonukleotide Basische Verbindungen 150×2 mm, 5 µm 150×4,6 mm, 4 µm 150×4,6 mm, 4 µm 250×4,6 mm, 4 µm 150×4,6 mm, 3 µm Kleine basische Peptide Nicht polare bis sehr polare Verbindungen C8 150×4,6 mm, 3 µm Zucker, anionische Verbindungen, Verbindungen mit Fähigkeit zur Wasserstoffbrückenbildung C18 mit speziellem polaren Endcapping Amino Luna® NH2 150×4,6 mm, 3 µm 150×4,6 mm, 3 µm Dimension Polare Verbindungen SynergiTM Hydro-RP Cyano Luna® CN Aminverbindungen, polare, aromatische Verbindungen Eignung Luna® C8 (2) Hexylverknüpftes Phenyl Phase Luna® Phenylhexyl Verteilungschromatographie Säule Getestete Säulen, aktive Phasen der Säulen, Eignungsempfehlung des Herstellers, Dimension der verwendeten Säule, (Endcapping:endständige Gruppe) 10.2 Tabelle-Getestete Säulen Anhang Anhang 60 70 80 90 100 110 120 130 150 160 3.0e4 4.0e4 40 50 60 70 80 69.2 67.9 90 100 110 120 113.2 130 140 150 (c) 140 160 m/z 0 40 4.0e4 8.0e4 1.2e5 1.6e5 2.0e5 2.4e5 2.8e5 3.2e5 3.6e5 0 40 50 50 60 60 70 70 71.1 70.0 66.8 69.0 80 80 90 100 100 98.1 97.1 90 94.1 95.1 115.0 150 (d) 140 (b) 140 130 130 120 113.3 110 120 110 112.0 160 150 160 m/z 170 und bei positiver Ionisation (d) m/z 172 109 Produktscans der Molekülionen, NMC-Cyt bei negativer Ionisation (a) m/z 167 und bei positiver Ionisation (b) m/z 169, NMC-Cyt* bei negativer Ionisation (c) 040 2.0e4 4.0e4 6.0e4 1.2e5 42.0 1.0e5 43.0 8.0e4 44.2 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 0 1.0e4 (a) 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 2.0e4 50 109.9 2.0e4 41.9 67.2 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 10.3 Abbildung-Produktscans von N4-Methylcarbamoylcytosin und isotopenmarkiertem N4-Methylcarbamoylcytosin (2-13C, 1,3-15N) Intensität, cps A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30 A31 A32 Nr Einzelwerte Alter BeschäftigungsZeit Jahren 47 16 35 2 34 4 37 14 47 14 34 7 26 4 28 2 43 22 39 7 55 26 45 1 47 25 56 26 37 13 38 13 39 13 36 10 55 27 36 16 48 14 44 15 47 16 45 2 43 14 49 7 34 3 21 1 43 8 24 2 49 25 33 3 NR NR NR R (10) R (20) R (20) NR R (20) R (15) R (10) NR R (20) NR NR R (30) R (NR) R (20) 20 Schnupf R (15) R (20) NR NR R (20) NR R (15) NR R (10) R (20) NR NR R (20) R/NRStatus Kreatin g/L Urin 0,82 1,87 1,49 1,51 1,10 0,34 1,34 2,30 1,63 0,58 1,44 1,58 1,92 1,78 1,15 0,14 0,72 1,97 2,64 0,86 0,67 1,34 1,15 1,44 0,34 2,59 2,35 2,50 1,20 1,63 0,96 1,78 10.4 Ergebnisse des Biomonitorings Kollektiv 1 NMC-Valin nmol/g Globin 177 142 211 412 157 83 95 219 129 64 198 158 62 26 74 133 132 106 68 138 31 99 97 41 47 161 212 129 56 157 54 110 NMF mg/L Urin 60 10 49 45 30 2 5 28 17 7 7 10 6 48 10 2 5 6 13 9 5 10 7 4 2 8 32 21 32 41 25 28 AMCC mg/L Urin 11 29 84 42 25 2 11 116 26 13 7 8 13 5 22 1 6 26 10 7 4 12 1 5 2 39 35 11 7 33 7 54 NMC-C pmol/L Urin 500 294 190 232 660 184 1023 233 607 773 <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG NMF mg/g Kreatinin 73 5 33 30 27 5 4 12 10 12 5 6 3 27 9 13 6 3 5 10 8 7 6 3 5 3 14 8 27 25 26 16 AMCC mg/g Kreatinin 14 16 56 28 23 6 9 51 16 22 5 5 7 3 20 4 9 13 4 9 6 9 1 4 7 15 15 5 6 20 7 30 NMC-C pmol/g Kreatinin 609 157 128 154 600 542 763 101 372 1333 <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG 110 Anhang Alter BeschäftigungsZeit Jahren 21 0 56 27 40 12 9 8 36 5 55 26 R/NRStatus Kreatin g/L Urin 0,14 2,64 1,41 0,67 1,44 2,54 NMC-Valin nmol/g Globin 26 412 124 76 119 215 NMF mg/L Urin 2 60 18 16 10 48 AMCC mg/L Urin 1 116 21 25 11 67 NMC-C pmol/L Urin <NWG 1023 147 271 <NWG 711 NMF mg/g Kreatinin 3 73 14 14 9 31 AMCC mg/g Kreatinin 1 56 14 13 9 39 R/NR-Status:Raucher/Nichtraucherstatus (Zahl der Zigaretten), Schnupf:Schnupftabak, NWG:Nachweisgrenze, MIN:Minimalwert, MAX:Maximalwert, SD:Standardabweichung MIN MAX Mittelwert SD Median 95. Perzentil Statistik NMC-C pmol/g Kreatinin <NWG 1333 149 305 <NWG 679 111 Anhang Anhang 10.5 Ergebnisse des Biomonitorings Kollektiv 2 Einzelwerte Nr. P-X B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 B31 B32 B33 B34 B35 B36 B37 B38 B39 B40 B41 B42 B43 B44 B45 B46 B47 B48 B49 B50 7-2 11-1 11-2 14-1 15-1 18-2 21-1 22-1 22-2 23-1 25-1 25-2 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 4-1 4-2 5-1 5-2 6-1 6-2 7-1 8-1 8-2 9-1 9-2 10-1 10-2 12-1 12-2 13-1 13-2 14-2 15-2 16-1 16-2 17-1 17-2 18-1 19-1 19-2 20-1 20-2 21-2 23-2 24-1 24-2 Alter BeschäftigungsZeit Jahren 40 8 31 6 31 6 50 15 42 14 47 18 44 20 50 15 50 15 41 9 43 14 43 14 31 10 31 10 35 15 35 15 40 21 40 21 50 21 50 21 40 9 40 9 49 28 49 28 40 8 45 20 45 20 49 19 49 19 54 21 54 21 50 22 50 22 28 11 28 11 50 15 42 14 36 15 36 15 51 17 51 17 47 18 51 23 51 23 48 14 48 14 44 20 41 9 41 14 41 14 Anzahl der Schichten 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 6 7 1 2 1 2 2 1 1 2 1 3 1 1 2 2 1 2 3 2 1 2 1 3 1 6 6 5 1 1 4 2 3 7 1 3 4 1 R/NRStatus Kreatin g/L NMF mg/L NMC-C pmol/L NR NR NR R (>20) R (20) NR NR NR NR R (20) NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR R (20) R (20) R (30) R (30) NR NR NR NR NR NR NR NR NR R (6) R (6) R (>20) R (20) R (15) R (15) NR NR NR NR NR NR NR NR R (20) R (15) R (15) 0,19 1,04 1,10 1,10 1,91 0,25 1,28 0,52 0,91 0,96 1,58 0,89 3,99 1,57 0,79 0,45 1,83 1,06 0,21 1,41 1,13 0,97 1,69 1,76 1,39 0,86 1,87 0,40 1,71 0,52 1,20 1,01 0,99 1,65 2,83 1,30 1,38 1,18 1,27 1,01 1,27 0,24 1,43 0,53 0,86 0,69 1,43 0,79 0,81 1,59 3 150 71 8 10 1 7 20 17 7 2 2 61 92 2 5 5 20 3 1 2 7 12 6 23 9 24 29 38 3 11 18 2 4 21 4 14 15 4 7 12 2 13 2 10 4 3 1 33 11 65 131 684 65 256 119 226 77 119 155 280 155 <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG NMF mg/g Kreatinin 15 144 64 7 5 4 5 38 18 7 1 3 15 58 2 10 3 18 12 0 1 7 7 3 17 10 13 73 22 5 9 18 2 3 7 3 10 13 3 7 9 7 9 4 12 6 2 1 40 7 NMC-C pmol/g Kreatinin 344 126 622 59 134 476 177 149 131 161 177 174 <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG 112 Anhang Statistik Alter BeschäftigungsZeit Jahren 31 6 MIN 54 28 MAX 42 16 Mittelwert 8 5 SD 40 15 Median 23 95. Perzentil 52 Anzahl der Schichten 1 7 2 2 2 6 R/NRStatus Kreatin g/L NMF mg/L NMC-C pmol/L 0,19 3,99 1,18 0,66 1,10 1,89 1 150 16 26 7 66 <NWG 684 47 116 <NWG 242 NMF mg/g Kreatinin 0 144 15 24 7 62 NMC-C pmol/g Kreatinin <NWG 622 55 126 <NWG 269 P-X: Person-1./2. Probe, R/NR-Status:Raucher/Nichtraucherstatus (Zahl der Zigaretten), NWG:Nachweisgrenze, MIN:Minimalwert, MAX:Maximalwert, SD:Standardabweichung 10.6 Ergebnisse des Biomonitorings Kontrollkollektiv Einzelwerte Nr. Geschlecht C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 m m m m m m m m m m m w w w w w w w w w w w w w Alter Jahren 39 64 47 13 36 29 28 30 29 36 26 57 62 22 39 26 29 13 45 24 39 35 40 25 R/NR-Status Alter Jahren 13 64 35 33 13 61 R/NR-Status NR NR NR NR NR R NR R R NR NR NR NR R R NR R NR NR NR NR R NR NR Kreatinin g/L Urin 2,94 1,36 0,96 2,07 1,18 1,01 1,31 2,01 0,73 0,31 0,68 0,96 0,89 0,83 0,75 1,65 2,06 1,04 0,85 2,2 1,57 1,29 0,07 0,77 NMC-C pmol/L Urin <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG Kreatinin g/L Urin 0,07 2,94 1,23 1,03 0,66 2,18 NMC-C in pmol/L Urin <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG <NWG Statistik Geschlecht MIN MAX Mittelwert SD Median 95. Perzentil m:männlich, w:weiblich, R/NR-Status:Raucher/Nichtraucherstatus, MIN:Minimalwert, NWG:Nachweisgrenze, MAX:Maximalwert, SD:Standardabweichung 113