Functionof the novelGTP-bindingprotein - ETH E

Diss. ETH No. 15611
Functionof the novel GTP-bindingprotein
Noey2: An inhibitor of Raf-1 signalling
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTEOF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presentedby
Matthias Andreas Beck
Dipl. Biochem. (FU-Berlin)
born 07.05.1974
Citizen of
Germany
accepted on the recommendation of:
Prof. Dr. A.
Helenius,examiner
Dr. R. Kroschewski, co-examiner
Prof. Dr. S. Werner, co-examiner
2004
Zusammenfassung
N0EY2 wurde als Gen identifiziert, welches die Krebsentstehung
Das Gen N0EY2 kodiert für ein
Proteinen der Ras
Protein,
welches Homologie
negativ beeinflussenkann.
zu
kleinen GTP-bindenden
Superfamilie aufweist. Bisher ist wenig über die zelluläre Funktion von
exprimiert, aber
abwesend in vielen Ovar-KrebsZellinien.Wenn man es in Krebs-Zellen über-exprimiert, die
kein Noey2 enthalten, bewirkt es eine Verlangsamung des Zellwachstums. Somit ist Noey2
möglicherweise ein Tumor Suppressor. Ausserdem wurde gefunden, dass Noey2 die vom
epidermalen Wachstumsfaktor(EGF) induzierte Phosphorylierung der extrazellulärem Signal
regulierten Kinase (Erk) vermindert. Dies deutet darauf hin, dass Noey2 den Signalweg zur
Aktivierung von Erk behindert.
Noey2
bekannt. Es ist in
Brustepithelzellen,
im Pancreas und im Ovar
näher
zu
Noey2
erhalten,
monomeren GTP-bindenden Proteins
Diese Arbeit versuchtdie zelluläreFunktion des
bestimmen und Aufschlüsse über den molekularen Mechanismus zu
ndurch den Noey2 seine Funktion ausübt. Zu diesem Zweckwurde
versucht, ein Zellsystem
identifizieren, in welchem Noey2 exprimiert wird. mRNA für Noey2 wurde in vielen
Zelllinien detektiert, Noey2 Protein liess sich aber in keiner der getesteten Zelllinien mit
spezifischen, affinen Antikörpern nachweisen. Noey2 ist daher sehr wahrscheinlich nur in
zu
geringen Mengen in immortalisierten
möglicherweise stark reguliert.
sehr
Zellen vorhanden oder die Translation
Untersuchungen, bei denen Noey2 zusammen mit der katalytischen Domäne von
Raf-1 und Erk über-exprimiertwurde, zeigten, dass Noey2 die Signalweiterlei-tung von der
Weitere
aktiven Kinase Raf-1
zu
Erk behindert. Dieser inhibierende Einfluss ist wahrscheinlich
darauf zurückzuführen, dass Noey2 direkt
Bindung von Noey2 an Raf-1 wurde
mit Ras, einem Aktivator von
an
mehrere Domänen von Raf-1 bindet. Diese
in vivo und in vitro bestätigt.
N-terminale, regulatorische Hälfte von Raf-1
Interaktion von Ras mit Raf-1 (Aminosäuren 1-331)
Raf-1, an
binden, wobei die Noey2 Bindung die
Noey2 kann gleichzeitig
die
verstärkt.
Noey2 ist an der Plasma-Membran
versehen,
lokalisiert. Es ist C-terminal mit einem Isoprenoid-Anker
der für die Membranlokalisation von
Determinantefür die Membranlokalisation
Noey2 notwendigist. Hier wurde eine zweite
beschrieben, welche in
Aminosäuren von Noey2 gefunden wurde und ebenfalls
von
nötig
den 34 N-terminalen
ist für die Membranlokalisation
Noey2.
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Noey2
ist somit ein Protein, welches
an
der Plasmamembran lokalisiert
ist,
dem
Kompartiment,in dem die Aktivierung von Raf-1 stattfindet. Noey2 behindert den Prozess
der Aktivierung oder die Aktivität der Protein Kinase Raf-1 und verhindert so
Signaltransduktion durch
Raf-1
an
Erk. Daher könnte
bindenden Proteins Ras im Brust-Epithel sein.
Noey2
ein
Antagonist
des GTP-
Summary
NOEY2 has been identified as a gene that can negatively regulate the developmentof Cancer.
NOEY2 encodes a protein that shows homology to proteins of the Ras superfamily of small
Noey2 is unknown. It is expressed in
breast epithelium, pancreas and the ovary. Its expression is lost in many ovarian Cancers and
it slows down cellular growth of Cancer cells when re-expressed. Thus, Noey2 is a putative
tumor suppressor. Furthermore, it has been shown that Noey2 inhibits the epidermal growth
factor (EGF)-inducedposphorylationof the extracellular signal regulated Kinase (Erk). This
finding supports the idea mat Noey2 inhibits signals that lead to the activation of Erk.
GTP-binding proteins. The
exaet cellular function of
elueidating of the cellular function of the small GTP-binding protein
Noey2 and at gaining insights into the molecular mechanism of how Noey2 exerts its
function. To this end it was tried to identify a cell system in which Noey2 is expressed.
Noey2 mRNA was found in many cell lines, whereas Noey2 protein could not be detected
This thesis aims at
with
specific
affine antibodies. In immortalised cell lines
present only in minute
amounts or
its translationis
Noey2
therefore
seems
to
be
probably tightly regulated.
Further investigations involving over-expressionof Noey2, the catalytic domain of Raf-1 and
Erk showed that Noey2 inhibits downstream signalling of active Raf-1. This inhibition was
probably due to direct binding of Noey2 to several domains of Raf-1, as shown by in vivo and
experiments.Noey2 and Ras, a known activator of Raf-1, can bind simultaneouslyto
the Raf-1 N-terminal regulatory half and binding of Noey2 facilitates binding of Ras to Raf-1
in vitro
N-terminus.
plasma membrane-localised protein. Lipid modification at the C-terminus is
necessary for its membrane localisation. Here a second determinant required for Noey2
plasma membrane-localisation was found that is represented by the 34 amino-terminal
Noey2 is
a
residues.
Noey2 is localised at the plasma membrane, the compartment, where Raf-activation
occurs. Noey2 either inhibits the activation of Raf-1 and/or inhibits the activity of Raf-1 and
suppresses signal transduetion through Raf-1 to Erk. Furthermore, a model is presented
according to which Noey2 may be an antagonist of Ras signalling in breast epithelium.
Thus